This work was funded by a National Health and Medical Research Council (NHMRC) Project Grant 568721 (SRT) and, in part, by a UNSW Faculty of Medicine Faculty Research Grant (MDR).

1. Généralités cellules endothéliales Culture <ol><li> Culture des cellules bovines endotheliales aortiques (passages 4-9) sur des flacons de culture tissulaire revêtues de gélatine (couche de surface de culture de tissu avec 0,1% p / v de gélatine dans du PBS à température ambiante pendant 15 min) dans EGM-2 médias (à l&#39;EGM-2 balle Kit contenant 5% de sérum bovin foetal, des facteurs de croissance et tous les suppléments fournies par le fabricant, à l&#39;exception de l&#39;hydrocortisone). </li><li> Lorsque les cellules sont confluentes à court (environ 3 jours après le semis, après une 1: split 4), la récolte des cellules par traitement avec 0,05% p / v de trypsine / 0,02% p / v d&#39;EDTA dans du PBS à 37 ° C. Après la majorité des cellules ont détaché, ajouter complets EGM-2 médias pour étancher la trypsine puis centrifugeuse (100 xg, 5 min). </li><li> Préparation des cellules pour des études sur l&#39;adhérence de novo de cellules endotheliales vers la fibronectine (Expérience 1: Section 2) et le de-adhérence ultérieure des cellules endothéliales avec une adhérence établie sur ce substrat (expérience 2: Section 3). <ol><li> Laver récoltésles cellules une fois avec du exempt de sérum de Milieu 199 contenant 1% p / v d&#39;albumine de sérum bovin (BSA) et re-centrifugation (100 x g, 5 min). </li><li> Re-suspendre les cellules dans un milieu sans sérum 199 contenant 1% p / v de BSA à 2,5 x 10 5 cellules / ml (mesures d&#39;impédance cellule-substrat) ou 5 x 10 5 cellules / ml (analyses imagerie des cellules vivantes) et maintenir à 37 ° C avant utilisation. NOTE: Les réponses d&#39;adhérence de cellules sont très sensibles aux différences de température (par exemple, en raison des effets de convection) si tous les équipements et solutions utilisés pour manipuler et traiter les cellules pendant les protocoles suivants doivent être maintenus à une température constante de 37 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Expérience 1: Quantification De Novo Endothelial Cell Adhesion sur la fibronectine autochtones et MPO-oxydé (Cell-substrat Impédance) REMARQUE: Expérience 1 examine la mesure dans laquelle MPO médiation oxydation de fibronectine compromet sa capacité à soutenir de novo </em&gt; Adhésion des cellules endothéliales en suspension. <ol><li> Manteau fibronectine sur 96 puits or cellule-substrat tableaux impédance de microélectrodes. Ajouter 80 pl / puits de bovin purifié fibronectine à 5 ug / ml dans PBS, incuber pendant deux heures à 37 ° C et retirer la solution. </li><li> Incuber les surfaces revêtues de fibronectine avec MPO pour permettre la liaison de la MPO lié à la surface de la fibronectine. Ajouter 80 ul / puits de MPO purifié neutrophile humaine à 20 nm dans une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) et incuber pendant 0,5 heures à 37 ° C. </li><li> Laver les surfaces deux fois avec HBSS pour éliminer toute MPO non lié. </li><li> Ajouter H 2 O 2 (0 à 10 uM de concentration finale) dans des puits de la plaque de matrice de microélectrodes contenant 80 pl / puits de HBSS pour initier catalysée par la MPO, l&#39;oxydation de la fibronectine HOCl-dépendante et incuber pendant 0,5 heures à 37 ° C. </li><li> Pour examiner l&#39;effet des inhibiteurs ou modulateurs de réactions catalysées MPO pertinents (par exemple, alternative enzyme MPOles substrats, les inhibiteurs de l&#39;enzyme ou des antioxydants; voir 9 pour plus de détails), les ajouter à la HBSS immédiatement avant H 2 O 2 plus. </li><li> Après 0,5 h, traiter les surfaces avec de la méthionine pour étancher espèces oxydantes de surface liée résiduels, ce est-chloramines liés aux protéines réactives, qui peuvent exercer des activités cellulaires de confusion. Ajouter 10 mM méthionine dans 80 ul HBSS par puits et incuber pendant 10 min à 37 ° C. </li><li> Bloquer surfaces avec de la BSA. Ajouter 80 pl / puits de BSA à 0,2% p / v dans PBS, incuber pendant deux heures à 37 ° C et retirer la solution. REMARQUE: des régions de surface non revêtues résiduels appuieront l&#39;adhésion cellulaire et en bloquant ceux-ci avec une protéine non-adhésif (par exemple, BSA) veille à ce que les réponses d&#39;adhérence cellulaire dépendent étroitement de la matrice de cellules-adhésif purifié utilisé, dans ce cas, la fibronectine. </li><li> Laver les surfaces deux fois avec HBSS. REMARQUE: Aucun des traitements de surface précédentes affecte sensiblement cellule-substrat readings. </li><li> cellules endothéliales suspension de semences (ajouter 200 pl / puits à environ 2,5 x 10 5 cellules / ml, préparés dans un milieu sans sérum contenant 199 BSA 1%, voir 1.3) sur les surfaces revêtues de fibronectine indigènes ou MPO-oxydés. </li><li> Immédiatement après l&#39;ensemencement des cellules (à savoir, avant tout attachement des cellules et la diffusion), monter la plaque de réseau de microélectrodes sur l&#39;orifice d&#39;incubateur (logée dans un incubateur à 37 ° C en présence de 5% CO 2). <ol><li> Utilisation du logiciel de l&#39;instrument immédiatement prendre un «blanc» pour normaliser la lecture ultérieure impédance cellule-substrat («indice de la cellule») des valeurs aux valeurs de fond initiales obtenues en l&#39;absence d&#39;adhésion cellulaire. </li><li> Initier acquisition de données d&#39;index cellulaire continue (minimum d&#39;une cellule indice lecture / min). </li></ol></li><li> Incuber les cellules à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 2 heures, période de temps pendant laquelle l&#39;attachement des cellules et la diffusion maximale est obtenue; ce qui se traduit parun plafonnement des valeurs d&#39;index de cellule (voir la figure 3A). NOTE: L&#39;expérience précédente (Expérience 1) examine la façon initiale MPO oxydation médiée par la fibronectine limite la capacité des cellules endotheliales à établir l&#39;adhérence des cellules sur ce substrat. L&#39;expérience (Experiment 2) suivante examine comment l&#39;oxydation de la fibronectine MPO médiation favorise diminutions dans la cellule-matrice adhérence (ce est à dire, de-adhérence) dans les cellules endothéliales avec adhérence établie sur ce substrat. Les traitements de ces deux expériences sont essentiellement identiques, sauf pour le temps d&#39;oxydation à médiation par MPO fibronectine (à savoir, avant l&#39;adhésion cellulaire - Expérience 1, après l&#39;adhésion cellulaire - Expérience 2). </li></ol> 3. Expérience 2: Quantification des cellules endothéliales De-adhérence de fibronectine en réponse à MPO médiation fibronectine oxydation (Impédance Cell-substrat et imagerie de cellules vivantes) <ol><li> Manteau fibronectine sur 96 puits microélectrodes d&#39;or unerrays pour des mesures d&#39;impédance cellule-substrat (ajouter 80 ul / puits de la fibronectine à 5 ug / ml dans du PBS et on incube pendant 2 heures à 37 ° C) ou des plaques de culture cellulaire à fond de verre de 35 mm pour les analyses d&#39;imagerie des cellules (ajouter 2 ml / boîte de fibronectine à 5 ug / ml dans du PBS et on incube pendant 2 heures à 37 ° C). </li><li> Bloquer surfaces avec de la BSA. Ajouter BSA à 0,2% p / v dans du PBS à des volumes indiqués dans 3,1 et incuber pendant 2 heures à 37 ° C. </li><li> Incuber surfaces avec MPO pour permettre la liaison du MPO à la fibronectine. Ajouter 20 nM MPO humaine purifiée dans du HBSS les volumes indiqués dans 3,1 et incuber pendant 0,5 heures à 37 ° C. </li><li> Laver les surfaces deux fois avec HBSS pour éliminer toute MPO non lié. </li><li> cellules endothéliales de semences en suspension (préparés Milieu 199 contenant 1% p / v de BSA sans sérum; voir 1.3) sur les surfaces revêtues de fibronectine indigènes ou MPO-portant. <ol><li> Ajouter 200 ul / puits à 2,5 x 10 5 cellules / ml à 96 puits cellule-substrat tableaux impédance de microélectrodes. </li> &lt;li&gt; Ajouter 2 ml / boîte à 5 x 10 5 cellules / ml à 35 mm à fond de verre plats de culture cellulaire. </li></ol></li><li> Immédiatement après l&#39;ensemencement des cellules (ce est à dire, avant toute fixation des cellules et la diffusion): <ol><li> Mont 96 des plaques de matrice de microélectrodes sur le Port impédance incubateur cellulaire substrat (logé dans un incubateur à 37 ° en présence de 5% de CO 2) et prendre des lectures «en blanc» pour lancer l&#39;acquisition continue de données d&#39;index cellulaire (cf. Section 2.10 ). </li><li> Transfert à fond de verre 35 mm boîtes de culture cellulaire à un incubateur à 37 ° C en présence de 5% CO 2. </li></ol></li><li> Incuber les cellules à 37 ° C pendant 2 heures pour permettre la fixation des cellules et maximale d&#39;écartement (voir section 2.11). </li><li> Retirez brièvement les (lectures d&#39;index de la cellule de pause à ce stade) de 96 puits de plaque de matrice de microélectrodes ou 35 mm à fond de verre cellulaire boîte de culture de la 37 ° C incubateur, retirez surnageant cellulaire et ajouter réchauffé (37 ° C) HBSS (volumes que per étape 3.1). REMARQUE: HBSS est employée lorsque l&#39;on étudie MPO-réactions d&#39;oxydation catalysée place de milieux de culture complète que celle-ci contient des espèces oxydables qui interfèrent avec les réactions d&#39;oxydation. </li><li> Pour examiner l&#39;effet des inhibiteurs / modulateurs des réactions catalysées par la MPO (substitution des substrats enzymatiques, des inhibiteurs enzymatiques ou des antioxydants ou des inhibiteurs) de signalisation cellulaire (par exemple, 40 uM blebbistatin pour inhiber la contractilité actomyosine), ajouter ces maintenant. </li><li> Placer immédiatement la plaque de matrice de microélectrodes de nouveau dans les (lectures d&#39;index cellulaire re-commence à ce point) 37 ° port incubateur C ou le verre de 35 mm à fond plat de culture cellulaire de retour dans le 37 ° C incubateur, et permettent aux cellules de se équilibrer dans le HBSS pendant 0,5 heure. NOTE: Après 0,5 h équilibrage dans HBSS, les valeurs de l&#39;indice de la cellule se stabilisent à des valeurs légèrement inférieures; lorsque les cellules pré-incubation avec des substrats d&#39;enzyme, l&#39;enzyme et les inhibiteurs de la signalisation des cellules ou des antioxydants, assurer d&#39;abord que tHese ne affecte pas significativement les valeurs obtenues après équilibrage. </li><li> Initier MPO-catalysée, l&#39;oxydation de la fibronectine HOCl-dépendante et dé-adhérence. <ol><li> Pour les études d&#39;impédance de cellules en utilisant 96 des plaques de matrice de microélectrodes: <ol><li> Retirer la plaque de matrice de microélectrodes de l&#39;incubateur et de pause des mesures d&#39;indice de la cellule. </li><li> Ajouter H 2 O 2 (concentration finale de 0 à 10 uM) à la HBSS et mélanger doucement par pipetage répété. </li><li> Immédiatement, re-fixer le réseau de microélectrodes de retour sur l&#39;orifice d&#39;incubateur à 37 ° C et à nouveau commencer l&#39;acquisition de valeurs d&#39;index de cellule. </li></ol></li><li> Pour les études d&#39;imagerie des cellules vivantes en utilisant 35 mm boîte de culture de cellules de verre à fond: <ol><li> Retirer la boîte de culture de l&#39;incubateur et monter sur une scène 37 ° C chauffée d&#39;un microscope confocal inversé équipé d&#39;un objectif 63X d&#39;eau avec optique DIC appropriés pour l&#39;enregistrement de films de cellules vivantes. </li><li> Focus sur les cellules etoptimiser l&#39;optique DIC (éclairage de Köhler, biais retard et décalage caméra / de gain; pour plus de détails, voir 13). </li><li> Initier film DIC et enregistrer des lectures de base de cellules non traitées pendant 1 min. </li><li> Ajouter H 2 O 2 (concentration finale de 0-10 uM) et mélanger délicatement par pipetage répété. Re-concentrer le microscope (si nécessaire) et continuer l&#39;enregistrement de films DIC des cellules traitées pour la période de temps requise. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Analyse et présentation des données <ol><li> Données d&#39;impédance cellule-substrat <ol><li> Exporter des données brutes (indice de la cellule en fonction du temps) dans un tableur. </li><li> Pour les études cellule de-adhérence (Expérience 2: Section 3), normaliser les données en définissant des valeurs enregistrées immédiatement avant le début de l&#39;oxydation de la fibronectine MPO-médiation à une valeur de 1 (ce est à dire, immédiatement avant l&#39;ajout de H 2 O 2 en 3.11 .1.1). NOTE: Cela garantit que, par rapportchangements dans les valeurs de l&#39;indice de cellules induites par l&#39;oxydation de la fibronectine MPO médiation ne sont pas masqués par de petites différences initiales dans les valeurs de l&#39;indice de cellule absolue entre les puits. <ol><li> Les données actuelles que des parcelles de l&#39;indice normalisé de cellules (axe des y) en fonction du temps (axe des x). </li></ol></li></ol></li><li> Données d&#39;imagerie de cellules vivantes (études cellule de-adhésion dans l&#39;expérience 2: article 3) <ol><li> Ouvrez DIC vivent les films d&#39;imagerie cellulaire enregistrées immédiatement avant et après l&#39;ouverture de l&#39;oxydation de la fibronectine MPO médiation dans un programme d&#39;analyse d&#39;image standard (par exemple, logiciel ImageJ). </li><li> Dans au moins deux films distincts DIC sélectionner au hasard plusieurs cellules et mesurer leur surface projetée en images séquentielles (par exemple, à des intervalles de 1 min) en traçant manuellement leur bord de la membrane et de quantifier le nombre de pixels fermés. </li><li> Exportation des données brutes (surface cellulaire projetée en fonction du temps) à une feuille de calcul Excel et normaliser les données de la zone cellulaire en fixant des valeurs enregistrées immédiatement avantl&#39;initiation de l&#39;oxydation de la fibronectine à médiation MPO à une valeur de 1 (ce est à dire, immédiatement avant l&#39;addition de H 2 O 2 dans 3.11.2.3). </li><li> Les données actuelles comme une parcelle de la zone normalisée cellulaire (axe des y) en fonction du temps (axe des x). </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Wu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+focal+adhesions+and+barrier+function.">Endothelial focal adhesions and barrier function.</a> J Physiol. 569, 359-366 (2005).</li><li>Geiger, B., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+and+function+of+matrix+adhesions.">Molecular architecture and function of matrix adhesions.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (2011).</li><li>Rees, M. D., Kennett, E. C., Whitelock, J. M., Davies, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+damage+to+extracellular+matrix+and+its+role+in+human+pathologies.">Oxidative damage to extracellular matrix and its role in human pathologies.</a> Free Radic Biol Med. 44, 1973-2001 (2008).</li><li>Cox, T. R., Erler, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+and+homeostasis+of+the+extracellular+matrix:+implications+for+fibrotic+diseases+and+cancer.">Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer.</a> Dis Model Mech. 4, 165-178 (2011).</li><li>Baldus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+transcytosis+of+myeloperoxidase+confers+specificity+to+vascular+ECM+proteins+as+targets+of+tyrosine+nitration.">Endothelial transcytosis of myeloperoxidase confers specificity to vascular ECM proteins as targets of tyrosine nitration.</a> J Clin Invest. 108, 1759-1770 (2001).</li><li>Baldus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+mapping+of+pulmonary+and+vascular+nitrotyrosine+reveals+the+pivotal+role+of+myeloperoxidase+as+a+catalyst+for+tyrosine+nitration+in+inflammatory+diseases.">Spatial mapping of pulmonary and vascular nitrotyrosine reveals the pivotal role of myeloperoxidase as a catalyst for tyrosine nitration in inflammatory diseases.</a> Free Radic Biol Med. 33, 1010-1019 (2002).</li><li>Thomas, S. R., Witting, P. K., Drummond, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+control+of+endothelial+function+and+dysfunction:+molecular+mechanisms+and+therapeutic+opportunities.">Redox control of endothelial function and dysfunction: molecular mechanisms and therapeutic opportunities.</a> Antioxid Redox Signal. 10, 1713-1765 (2008).</li><li>Rees, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloperoxidase-derived+oxidants+selectively+disrupt+the+protein+core+of+the+heparan+sulfate+proteoglycan+perlecan.">Myeloperoxidase-derived oxidants selectively disrupt the protein core of the heparan sulfate proteoglycan perlecan.</a> Matrix Biol. 29, 63-73 (2010).</li><li>Rees, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+subendothelial+matrix+oxidation+by+myeloperoxidase+triggers+myosin+II-dependent+de-adhesion+and+alters+signaling+in+endothelial+cells.">Targeted subendothelial matrix oxidation by myeloperoxidase triggers myosin II-dependent de-adhesion and alters signaling in endothelial cells.</a> Free Radic Biol Med. 53, 2344-2356 (2012).</li><li>Solly, K., Wang, X., Xu, X., Strulovici, B., Zheng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+real-time+cell+electronic+sensing+(RT-CES)+technology+to+cell-based+assays.">Application of real-time cell electronic sensing (RT-CES) technology to cell-based assays.</a> Assay Drug Dev Technol. 2, 363-372 (2004).</li><li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromotion+of+mammalian+cells+measured+electrically.">Micromotion of mammalian cells measured electrically.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7896-7900 (1991).</li><li>Vissers, M. C., Thomas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypochlorous+acid+disrupts+the+adhesive+properties+of+subendothelial+matrix.">Hypochlorous acid disrupts the adhesive properties of subendothelial matrix.</a> Free Radic Biol Med. 23, 401-411 (1997).</li><li>Ziv, N. E., Schiller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Interference+Contrast+(DIC)+Imaging+of+Living+Cells.">Differential Interference Contrast (DIC) Imaging of Living Cells.</a> CSH Protoc. 2007, (2007).</li><li>Kennett, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxynitrite+modifies+the+structure+and+function+of+the+extracellular+matrix+proteoglycan+perlecan+by+reaction+with+both+the+protein+core+and+the+heparan+sulfate+chains.">Peroxynitrite modifies the structure and function of the extracellular matrix proteoglycan perlecan by reaction with both the protein core and the heparan sulfate chains.</a> Free Radic Biol Med. 49, 282-293 (2010).</li><li>Sen, S., Ng, W. P., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractility+dominates+adhesive+ligand+density+in+regulating+cellular+de-adhesion+and+retraction+kinetics.">Contractility dominates adhesive ligand density in regulating cellular de-adhesion and retraction kinetics.</a> Ann Biomed Eng. 39, 1163-1173 (2011).</li><li>Wildt, B., Wirtz, D., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+subcellular+release+for+studying+the+dynamics+of+cell+detachment.">Programmed subcellular release for studying the dynamics of cell detachment.</a> Nat Methods. 6, 211-213 (2009).</li></ol>

Les auteurs ne ont aucune divulgation à faire.

L&#39;adhérence cellule-matrice et processus de-adhérence peuvent être quantifiés avec précision en temps réel avec une haute résolution temporelle utilisant une impédance cellulaire substrat et imagerie des cellules vivantes analyses. Ces approches en temps réel fournissent un avantage majeur sur les analyses point final de l&#39;adhésion cellulaire, qui fournissent une mauvaise résolution temporelle. En quantifiant avec précision rapides réponses de-adhésion avec haute résolution temporelle, ces analyse...

Adhésives contacts stables entre les cellules et leur matrice extracellulaire environnante sont nécessaires pour le maintien de l&#39;homéostasie tissulaire. Par exemple, l&#39;adhésion des cellules endothéliales à la matrice sous-endothéliale dans les vaisseaux sanguins joue un rôle critique dans le maintien de l&#39;intégrité de la couche endothéliale et sa fonction de régulation homéostatique comme une barrière semi-perméable vasculaire 1. Le cytosquelette d&#39;actine est mécaniquement couplé à l&#39;adhésif molécules de la matrice sur les sites d&#39;adhérence cellule-matrice et des contacts d&#39;adhésif à l&#39;interface cellule-matrice jouent un rôle important dans la détermination de la position de la membrane cellulaire en résistant à des forces de traction actomyosine centralement dirigées. Stimuli extracellulaires qui modifient cellule-matrice adhérence modifierait nécessairement l&#39;équilibre des forces à l&#39;interface cellule-matrice, un événement qui est rapidement &quot;senti&quot; par des protéines de signalisation mécano-sensibles, résultant dans la transduction du &quot;outside-in de signalisation&quot;. Ce pari diaphonieWeen cellules et leur matrice extracellulaire environnante joue un rôle clé dans le contrôle de la forme des cellules, la motilité, la fonction, la prolifération et la survie 2. Les processus physiopathologiques variés (le développement embryonnaire, l&#39;inflammation, la cicatrisation des plaies et les métastases du cancer) sont caractérisées par le remodelage dynamique de substrats de la matrice d&#39;adhésif par des oxydants et / ou des enzymes dégradant la matrice 3,4. Par exemple, l&#39;adhésif protéines de la matrice sous-endothéliale des vaisseaux sanguins (par exemple, la fibronectine) sont impliqués que les principaux objectifs de la modification ou de la dégradation dans les maladies inflammatoires humaines en raison de la production localisée d&#39;oxydants réactifs (par exemple, l&#39;acide hypochloreux, HOCl) par l&#39;enzyme de leucocytes dérivés myéloperoxydase (MPO), qui se accumule dans le sous-endothelium vasculaire au cours de la maladie inflammatoire (figure 1) 9/5. Changements dans la cellule-matrice adhérence induites par MPO-oxydants dérivés et autres stimuli de matrice modifier sont likely à jouer un rôle important dans la modification de l&#39;homéostasie vasculaire au cours de divers processus pathologiques, par exemple, par modification de la signalisation des cellules endotheliales, la morphologie et la viabilité, ce qui perturbe la fonction endothéliale et l&#39;intégrité de la barrière. Toutefois, les réponses de signalisation morphologiques et cellulaires de cellules adhérentes à des modifications de la matrice extracellulaire commencent seulement à être compris. Pour comprendre comment les modifications de la matrice dictent l&#39;évolution de la dynamique d&#39;adhésion cellulaire et voies de signalisation cellulaire d&#39;adhésion dépendant, les techniques sont tenus que de quantifier avec précision les changements dans la cellule-matrice adhérence en temps réel, avec une haute résolution temporelle. Ici, nous décrivons complémentaire impédance cellule-substrat et des techniques d&#39;imagerie des cellules vivantes qui répondent à ces critères et qui fournissent une plate-forme pour quantifier l&#39;adhésion cellulaire et des processus de-adhérence d&#39;une manière non-invasive. Nous montrons comment ces cellules impédance-substrat et imagerie des cellules vivantes Approdouleurs peuvent être facilement utilisés pour (i) suivre la dynamique de l&#39;attachement des cellules et la diffusion (ce est à dire, de novo adhésion cellulaire) sur des substrats de matrice natifs et modifiés, et (ii) pour mesurer la dynamique de détachement cellulaire matrice (c.-de-adhérence ) par des cellules adhérentes exposés à des stimuli de matrice modificateurs. Le système xCELLigence cellule-substrat impédance biocapteur fournit une mesure en continu de la zone de contact cellule-matrice par la quantification de l&#39;impédance électrique à la surface de 96 puits réseaux de microélectrodes de l&#39;or et exprime ces mesures d&#39;impédance électrique comme &quot;indice de cellule&quot;, une valeur sans dimension qui est en grande partie proportionnelle à la surface de contact de substrat de cellule 10 (figure 2), tout en étant également sensibles aux variations de la distance moyenne entre le (isolante) membrane cellulaire et la surface d&#39;électrode 11. Une augmentation supplémentaire de valeurs de l&#39;indice de la cellule est également atteint lors de la formation du serrée contacts cellule-cellule that restreindre courant paracellulaires, 11 des conditions qui ne existent pas dans les expériences décrites dans cette étude. Mesure de la surface projetée des cellules individuelles au fil du temps par analyse d&#39;image de time-lapse contraste d&#39;interférence différentiel (DIC) des films fournit une mesure complémentaire de changements dans le domaine de contact cellule-substrat et fournit des informations supplémentaires concernant la nature exacte et la dynamique de la changements morphologiques quantifiés par la méthode de l&#39;impédance cellule-substrat. Plus précisément, nous décrivons l&#39;application de ces approches pour contrôler la manière dont l&#39;oxydation des adhésifs protéines de la matrice sous-endothéliale (par exemple, la fibronectine) (i) MPO-médiée réduit l&#39;adhérence de novo de cellules endothéliales en suspension sur de la fibronectine purifiée et (ii) déclenche cellule-matrice de -adhesion dans les cellules endothéliales avec adhérence établie sur la fibronectine. En effectuant la signalisation cellulaire parallèle des analyses au fil du temps en utilisant Biochem pertinentesdosages iCal (par exemple, Western blot), les relations temporelles et causales entre les processus adhérence / de-adhésion et les changements associés à la signalisation cellulaires événements d&#39;adhésion dépendant peuvent être déterminées. Ces approches ont été récemment utilisés pour démontrer que l&#39;oxydation de la matrice extracellulaire catalysée par les dépôts sous-endothéliaux de MPO déclenche une perte rapide de la cellule-matrice adhésion des cellules endothéliales qui est entraîné par des forces contractiles actomyosine préexistants 9. Fait important, en permettant à la relation temporelle entre les changements à la fois dans l&#39;adhérence cellulaire et de signalisation à déterminer l&#39;adhésion cellulaire dépendante, ces approches ont identifié que la modification de la matrice MPO induite et cellulaire de-adhérence déclenche changements de signalisation cellulaires voies importantes d&#39;adhérence dépendant notamment Src kinase dépendante de la phosphorylation paxilline et chaîne légère de myosine II phosphorylation (Figure 1) 9. Ce mode de signalisation redox dépendantes, invÉSOLUTION l&#39;activation des événements de signalisation intracellulaire par des réactions d&#39;oxydation extracellulaires qui perturbent l&#39;adhérence cellule-matrice, représente un nouveau mode de signalisation cellulaire appelée &quot;outside-in signalisation redox&quot; (figure 1) 9. En général, ceux-ci complémentaire biocapteur de l&#39;impédance cellule-substrat et des approches d&#39;imagerie des cellules devraient être utiles pour révéler comment différents stimuli ou des agents matriciels modificateurs de route changements dans la dynamique de l&#39;adhérence cellulaire, la morphologie et de signalisation au sein de différents types de cellules adhérentes soumises à une grande variété de paramètres expérimentaux. Le protocole suivant décrit comment quantifier l&#39;impact de l&#39;oxydation de la matrice MPO médiation de novo sur l&#39;adhérence des cellules endothéliales (Experiment 1) et la cellule de-adhésion endothéliale (Experiment 2) des processus. MPO se lie avec avidité à la fibronectine et d&#39;autres protéines de la matrice extracellulaire sous-endothéliaux et nous adhésiveses peroxyde d&#39;hydrogène (H 2 O 2) pour convertir les ions chlorure (Cl -) à la très réactif chloration oxydante de l&#39;acide hypochloreux (HOCl), qui réagit à proximité de ces protéines de la matrice et perturbe les propriétés adhésives de la cellule (Figure 1) 8,9, 12.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1328">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:223px;">Company</td>
			<td style="width:151px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:551px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">96 well gold cell-substrate impedance microelectrode array</td>
			<td style="width:223px;">ACEA Biosciences / Roche</td>
			<td style="width:151px;">E-Plate 96</td>
			<td>single-use plate used for performing cell-based assays on the xCELLigence system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">blebbistatin</td>
			<td style="width:223px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">B0560</td>
			<td>selective inhibitor of non-muscle myosin-II</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Bovine Aortic Endothelial Cells, cryopreserved&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Lonza</td>
			<td style="width:151px;">BW-6001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:223px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">05470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGM-2 BulletKit</td>
			<td style="width:223px;">Lonza</td>
			<td style="width:151px;">CC-3162</td>
			<td>endothelial cell growth media kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Fibronectin, lyophilized powder</td>
			<td style="width:223px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">F-4759</td>
			<td>from bovine plasma</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Fluorodish 35 mm glass-bottomed cell culture dish</td>
			<td style="width:223px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:151px;">FD35-100</td>
			<td>Cell cuture dish with optical quality glass bottom for imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Gelatin from bovine skin</td>
			<td style="width:223px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">G9391</td>
			<td>cell culture substratum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:151px;">14025076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Hydrogen peroxide</td>
			<td style="width:223px;">Merck</td>
			<td style="width:151px;">107298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Medium-199</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:151px;">11150-059</td>
			<td>serum-free cell media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Methionine</td>
			<td style="width:223px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">M9500</td>
			<td>quenches chlorinating oxidants generated by myeloperoxidase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Myeloperoxidase, Human Polymorphonuclear Leukocytes</td>
			<td style="width:223px;">Millipore</td>
			<td style="width:151px;">475911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:405px;">RTCA MP Instrument / xCELLigence cell substrate impedance system</td>
			<td style="width:223px;">ACEA Biosciences / Roche</td>
			<td style="width:151px;">-</td>
			<td>Consists of RTCA Analyzer, RTCA (Multiple Plate) MP Station and RTCA Control Unit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Trypsin-EDTA (0.5%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using cell-substrate impedance and live cell imaging to measure real-time changes in cellular adhesion and de-adhesion induced by matrix modification

L&#39;adhérence cellule-matrice jouent un rôle clé dans le contrôle de la morphologie cellulaire et de signalisation. Les stimuli qui perturbent l&#39;adhérence cellule-matrice (par exemple, la myéloperoxydase et d&#39;autres oxydants de matrice modificateur / enzymes libérées au cours de l&#39;inflammation) sont impliqués dans le déclenchement des changements pathologiques dans la fonction cellulaire, le phénotype et la viabilité dans un certain nombre de maladies. Ici, nous décrivons comment impédance cellule-substrat et les approches d&#39;imagerie des cellules peuvent être facilement utilisés pour quantifier avec précision les changements en temps réel dans l&#39;adhésion cellulaire et de-adhérence induite par modification de la matrice (en utilisant des cellules endothéliales et myéloperoxydase comme un stimulus de matrice modifier physiopathologique) avec une résolution temporelle élevée et d&#39;une manière non-invasive. Le système de l&#39;impédance cellule-substrat xCELLigence quantifie en continu la zone d&#39;adhérence cellule-matrice, en mesurant l&#39;impédance électrique à l&#39;interface cellule-substrat dans les cellules cultivées sur des réseaux de microélectrodes or. L&#39;analyse des images du time-lapse différenLes films tiel de contraste d&#39;interférence de quantifier l&#39;évolution de la surface projetée de cellules individuelles dans le temps, représentant les changements dans la zone de contact cellule-matrice. Les deux techniques de quantifier avec précision les changements rapides aux processus d&#39;adhésion cellulaire et de-adhérence. Impédance Cell-substrat sur les tableaux de microélectrodes biocapteurs fournit une plate-forme pour des mesures robustes, à haut débit. Analyse imagerie des cellules vivantes fournir des détails supplémentaires concernant la nature et la dynamique des changements morphologiques quantifiés par des mesures d&#39;impédance cellule-substrat. Ces approches complémentaires fournissent de précieuses informations sur la façon dont la modification oxydative myéloperoxydase catalysée subcellulaires composants de la matrice extracellulaire déclenche des changements rapides dans l&#39;adhésion cellulaire, la morphologie et de signalisation dans les cellules endothéliales. Ces approches sont également applicables pour l&#39;étude de la dynamique d&#39;adhésion cellulaire en réponse à des stimuli autres modificateurs de matrice et des cellules adhérentes connexes (par exemple, des cellules épithéliales).

Quantification en temps réel des cellules endotheliales de-adhérence de fibronectine, en réponse à l&#39;oxydation de la fibronectine MPO médiée (Expérience 2). L&#39;ensemencement des suspensions de cellules endotheliales sur native (MPO libre) fibronectine ou MPO portant les résultats de la fibronectine dans l&#39;attachement cellulaire maximale et d&#39;étalement moins de 2 heures, tel que jugé par un plafonnement des valeurs d&#39;index de cellule de la mesure de l&#39;impédance du substr...

Watch this Scientific Journal Video about Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification at JoVE.

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Ici, nous présentons un protocole de quantifier en permanence les processus d&#39;adhésion cellulaire et de-adhésion avec haute résolution temporelle d&#39;une manière non-invasive par l&#39;impédance cellulaire substrat et imagerie des cellules vivantes analyses. Ces approches révèlent la dynamique des processus adhésion cellulaire / de-adhérence déclenchées par modification de la matrice et de leur relation temporelle à des événements de signalisation adhérence dépendant.

Utilisant une impédance Cell-substrat et imagerie de cellules vivantes pour mesurer les changements en temps réel dans adhésion cellulaire et De-adhérence induites par Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

using-cell-substrate-impedance-live-cell-imaging-to-measure-real-time

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.8K vues.  University of New South Wales.  Ici, nous présentons un protocole de quantifier en permanence les processus d'adhésion cellulaire et de-adhésion avec haute résolution temporelle d'une manière non-invasive par l'impédance cellulaire substrat et imagerie des cellules vivantes analyses. Ces approches révèlent la dynamique des processus adhésion cellulaire / de-adhérence déclenchées par modification de la matrice et de leur relation temporelle à des événements de signalisation ad...

Vidéo: Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification