1. Configuración del sistema <ol><li> F-7000 espectrofotómetro de fluorescencia equipado con fotomultiplicador gama alta sensibilidad ampliada de I-928F detector. </li><li> F-7000 Accesorios: Rodamina B, difusor de luz, el filtro de color rojo y debajo de los estándares fuente de luz se utiliza para generar los factores de corrección del espectro para el instrumento. </li><li> Accesorio de rendimiento cuántico de medida, que incluye: 60 mm de esfera de integración, los azulejos de óxido de aluminio blanco, Spectralon blanco estándar, las células en polvo (2ea), polvo de óxido de aluminio y el software de rendimiento cuántico. </li><li> Programa generador de informes y la plantilla adecuada será utilizada para el cálculo de las coordenadas de cromaticidad. </li></ol> 2. Configuración del sistema <ol><li> Encienda el Hitachi F-7000 espectrofotómetro de fluorescencia y permitir que la lámpara de xenón se caliente durante una hora. Comience a utilizar el compartimento de la muestra estándar (portacubetas) instalado en el instrumento. </li></ol> 3. Adquisition de la integración de los factores de corrección de la Esfera Al medir los factores de corrección esfera de integración, el software selecciona automáticamente los parámetros de la prueba de medición que figuran en la Tabla 1. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Condiciones analíticas </td></tr><tr><td> Medición </td><td> Espectros </td></tr><tr><td> El modo de escaneo </td><td> Sincrónico </td></tr><tr><td> Modo de datos </td><td> Fluorescencia </td></tr><tr><td> EM WL </td><td> 200 nm </td></tr><tr><td> EX Inicio WL </td><td> 200 nm </td></tr><tr><td> WL Fin EX </td><td> 900 nm </td></tr><tr><td> Velocidad de escaneo </td><td> 240 nm / min </td></tr><tr><td> Retrasar </td><td> 5,0 s </td></tr><tr><td> Hendidura EX </td><td> 5,0 nm </td></tr><tr><td> EM Slit </td><td> 20 nm </td></tr><tr><td> PMT de tensión </td><td> 250 V </td></tr><tr><td> Espectro corregido </td><td> EN </td></tr><tr><td> Respuesta </td><td> Auto </td></tr></tbody></table> Tabla 1. 3,1. Adquisición de datos de difusores <ol><li> Coloque el difusor en el compartimiento estándar de la muestra y cerrar el compartimento de la muestra. </li><li> Haga clic en la ventana de medición de rendimiento cuántico de factor de corrección y, a continuación, sobre la medición del difusor. </li><li> Introduzca el nombre de archivo: &quot;IS_factor_F70_diffuser&quot; para los datos de difusor y haga clic en Aceptar (vídeo 1). </li><li> Después de la medición, el archivo se guardará en la &quot;correcta&quot; la carpeta de soluciones de FL. La figura 1 es un ejemplo de los datos de medición del difusor. </li></ol> 3,2. Adquisición de factor de corrección para ninguna de las muestras (de referencia) &lt;ol&gt; <li> Retire el compartimiento de la muestra estándar del instrumento, tienda de difusor, a continuación, instalar la esfera de integración. </li><li> Llenar la celda en polvo con el polvo de óxido de aluminio hasta una altura de al menos 25 mm a asegurarse de que el polvo cubre completamente el puerto de la esfera de integración. Toque en el fondo de la celda con cuidado para compactar el polvo. </li><li> Coloque la loseta de óxido de aluminio blanco en el puerto de referencia (P2) de la esfera de integración (la que da el monocromador de emisión) y la célula de polvo con óxido de aluminio en el puerto de la muestra (P1) de la esfera de integración (la que da el monocromador de excitación ). </li><li> Haga clic en la ventana de rendimiento cuántico de medida Corrección del factor, a continuación, sobre la integración de Medición Esfera (sin muestra) (vídeo 2). </li><li> El software le recordará para fijar las muestras. Introduzca el nombre de &quot;IS con ninguna de las muestras&quot; y haga clic en Aceptar. </li><li> Después de la medición, el archivo se guardará en la carpeta &quot;Correc<html> t &quot;Soluciones de FL. Figura 2 es un ejemplo de la esfera de integración con ningún dato de muestra de medición. </li></ol> 3,3. Adquisición de factor de corrección en la presencia de una muestra: <ol><li> Quitar la celda con el polvo de óxido de aluminio y sustituirla por la norma Spectralon blanco. (La norma Spectralon debe estar mirando hacia el monocromador de excitación (P1)). </li><li> Haga clic en la ventana de rendimiento cuántico de medida Corrección del factor y luego sobre la integración de Medición Esfera (con la muestra). El software le recordará para fijar el material de reflectancia estándar para la medición. </li><li> Introduzca el nombre de: &quot;¿Es con la muestra&quot; de la esfera de integración con la muestra de archivo de datos y haga clic en Aceptar (Video 3). </li><li> Después de la medición, el archivo se guardará en la &quot;correcta&quot; la carpeta de soluciones de FL. La figura 3 es un ejemplo de la esfera de integración con los datos de medición de la muestra. </li></ol>&quot;&gt; NOTA: En caso de que necesite usar los filtros de corte para bloquear la luz segundo fin de la dispersión en el lado de las emisiones que interfieren con el pico de fluorescencia, se tendrá que medir una línea de base con el difusor y sólo el difusor y el filtro adecuado Estos. archivos de datos será utilizada por el software en el cálculo de rendimiento cuántico. En la práctica, se recomienda la medición de todos los filtros de corte, como parte de la configuración inicial del sistema. 4. Ejemplo de medición (salicilato de sodio en polvo) Medición rendimiento cuántico implica la adquisición de un espectro de emisión por tanto sin la muestra (de referencia) y en presencia de una muestra. Seleccione los parámetros de medición de análisis de la siguiente manera: <ol><li> Haga clic en el &quot;método&quot; y en el análisis de longitud de onda pestaña General, seleccione el modo de medición e introduzca la información pertinente sobre el operador y accesorios(Video 4). </li><li> Haga clic en el &quot;Instrumento&quot; e inserta los parámetros de medición para el instrumento como se muestra en la Tabla 2 (vídeo 5). </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Condiciones analíticas </td></tr><tr><td> Medición </td><td> Espectros </td></tr><tr><td> El modo de escaneo </td><td> Emisión </td></tr><tr><td> Modo de datos </td><td> Fluorescencia </td></tr><tr><td> EX WL </td><td> 350 nm </td></tr><tr><td> EM Inicio WL </td><td> 330 nm </td></tr><tr><td> EM Fin WL </td><td> 600 nm </td></tr><tr><td> Velocidad de escaneo </td><td> 1200 nm / min </td></tr><tr><td> Retrasar </td><td> 0 s </td></tr><tr><td> Hendidura EX </td><td> 5,0 nm </td></tr><tr><td> EM Slit </td><td> 5,0 nm </td></tr><tr><td> PMT de tensión </td><td> 350 V </td></tr><tr><td> Espectro corregido </td><td> EN </td></tr><tr><td> Respuesta </td><td> Auto </td></tr><tr><td> Espectro corregido </td><td> EN </td></tr></tbody></table> Tabla 2. <ol start="3"><li> No hay parámetros adicionales son necesarios en este momento ya que los ajustes del monitor, Procesamiento y Reporte de la ficha se puede hacer después de los datos se ha medido. Sólo vamos a revisar y haga clic en el botón Aceptar, con el fin de establecer los parámetros de medición seleccionadas en el instrumento (Video 6). </li><li> Como una opción, configuración seleccionada se podría guardar para uso futuro. Vamos a proceder ahora la medición del óxido de aluminio estándar de referencia con excitación directa. </li><li> Coloque el polvo de células con Al2O3 polvo en el puerto de medición de la muestra (P1) (frente al haz de excitación). </li><li> Haga clic en el botón &quot;muestreo&quot;y escriba el nombre de la muestra: &quot;P1_Baseline_Al2O3&quot;, a continuación, haga clic en la casilla junto a &quot;archivo automático&quot;. Seleccione el nombre de la carpeta y el archivo de los datos: &quot;P1_Baseline_Al2O3&quot;, a continuación, haga clic en &quot;Guardar&quot; y &quot;OK&quot; (Video 7). </li><li> Haga clic en la &quot;medida&quot; botón de la muestra para la medición de Al2O3. (Video 8), después de la ventana de procesamiento de datos se abre, haga clic en la &quot;Escala de Auto Eje&quot; botón de ajuste de la escala, para visualizar el pico de dispersión con la excitación directa (Figura 4). </li><li> Ahora se procederá la medición de la muestra de salicilato de sodio utilizando excitación directa. Haga clic en la &quot;Muestra&quot; y entrar en el icono &quot;Salicilato P1_Sodium&quot; para el nombre de la muestra y el archivo, a continuación, haga clic en el botón OK (Video 9). </li><li> Coloque la muestra de salicilato de sodio en la célula en polvo y en el puerto P1 de la esfera de integración (el puerto frente al haz de luz de excitación) y haga clic en la &quot;Medida&quot; botón. (Video 10) Cuando el proceso de datosción ventana se abre, haga clic en la &quot;Escala automática del Eje&quot; para ajustar la escala y visualizar la dispersión y los picos de fluorescencia. </li><li> En este momento se repite para las mediciones de óxido de aluminio y salicilato de sodio con las muestras colocadas en el puerto P2 de la esfera de integración, con el fin de leer usando excitación indirecta. </li><li> Primero haga clic en la &quot;Muestra&quot; y escriba el nombre de la muestra y el archivo: &quot;P2_Baseline_Al2O3&quot; para los dos (Video 11). </li><li> Mueva el azulejo de óxido de aluminio blanco de P2 a P1 de la esfera de integración y colocar una célula llena de polvo de óxido de aluminio en P2. </li><li> Haga clic en la &quot;medida&quot; para leer la muestra (Video 12). </li><li> Para completar la medición de la muestra que necesitamos para medir la muestra de salicilato de sodio se utiliza irradiación indirecta. En primer lugar, escriba la muestra y los nombres de archivo como en los pasos anteriores. El nombre será el salicilato P2_Sodium (Video 13). </li><li> Coloque la muestra de salicilato de sodio en el puerto P2 de la esfera de integración y haga clic en el botón de medición (Video 14). </li></ol> 5. Quantum cálculo del rendimiento En primer lugar se procederá la carga de los factores de corrección esfera de integración. <ol><li> Haga clic en el botón Cálculo de rendimiento cuántico para abrir el programa de rendimiento de cálculo cuántico (Video 15). </li><li> Haga clic en el botón de rendimiento cuántico Marco Factor de corrección (Video 16). </li><li> Haga clic en la ficha Corrección Esfera Integración y haga clic en la casilla delante de &quot;corrección esfera de integración&quot;, a continuación, haga clic en la ficha Corrección del filtro y asegúrese de que la &quot;corrección Filter&quot; no está seleccionada, haga clic de nuevo en la ficha Corrección de Integración de Esfera (Video 17 ). </li><li> Haga clic en el botón de carga de la medida difusa sección de datos, a continuación, seleccione el archivo &quot;IS_factor_F70 ninguna de las muestras&quot; ( <strong&gt; Vídeo 18). </li><li> Seleccione la opción &quot;IS_factor_F70_diffuser&quot; archivo y haga clic en el botón de carga (Video 19). </li><li> Haga clic en el botón de carga de los datos de medición esfera de integración (sin muestra) sección (Video 20). </li><li> Seleccione la opción &quot;ninguna de las muestras IS_factor_F70&quot; archivo y haga clic en el botón de carga (Video 21). </li><li> Haga clic en el botón de carga de los datos de medición esfera de integración (con la muestra) en la casilla (Video 22). </li><li> Seleccione la opción &quot;IS_factor_F70 con la muestra&quot; archivo y luego en el botón de carga (Video 23). </li><li> Longitud de onda normalizada puede dejarse a 600 nm o ajustarse al valor de longitud de onda donde la corrección esfera de integración es igual a 1. Para ello, asegúrese de que la casilla delante de &quot;Mostrar ventana de cálculo de rendimiento cuántico&quot; está seleccionada y haga clic en el botón OK del &quot;Marco de Quantum Factor de Rendimiento&quot; window, que se cerrará esta ventana (Video 24). </li><li> Ahora haga clic en la &quot;corrección de esfera de integración&quot; de la pestaña &quot;Rendimiento cuántico de cálculo&quot; de la ventana y ajustar el cursor hasta que la lectura de corrección ámbito Integración es &quot;1&quot;, tomando nota de la longitud de onda (Video 25). </li><li> Haga clic en el &quot;Marco rendimiento cuántico de factor de corrección&quot;, y si se requiere cambio de la longitud de onda normalizada a la lectura obtenida en el paso anterior y haga clic en el botón OK (Video 26). </li></ol> El siguiente paso es cargar la base de referencia y archivos de datos de ejemplo <ol start="13"><li> Haga clic en el &quot;rendimiento cuántico de cálculo&quot; ficha (Video 27). </li><li> Carga &quot;de datos sin la muestra&quot; (archivo P1_Baseline_ Al2O3) para la irradiación directa, haga clic en el botón de carga y de carga &quot;de datos con la muestra&quot; (archivo de salicilato de P1_Sodium) para la irradiación directa (Video 28). </li><li&gt; A continuación se procederá a seleccionar la &quot;dispersión&quot; y la &quot;fluorescencia&quot; regiones (Video 29). </li><li> Ahora vamos a calcular el rendimiento cuántico para la irradiación directa de la muestra. Haga clic en el &quot;Cálculo&quot; y leer los resultados (Video 30). Necesitamos estos datos para el cálculo final del rendimiento cuántico de la muestra teniendo en cuenta la excitación indirecta. </li><li> Haga clic en el archivo de texto y guardar los datos bajo el nombre de archivo &quot;QY irradiación directa&quot; (Video 31). </li><li> Uso de archivos de datos y el salicilato de P2_Baseline_Al2O3 P2_Sodium, vamos a calcular el rendimiento cuántico para la excitación indirecta (Video 32) Ahora vamos a guardar estos datos para el cálculo de rendimiento final de Quantum. </li><li> Haga clic en el archivo de texto y guardar el archivo de datos de texto con el nombre de &quot;La irradiación QY indirecta&quot; (Video 33) Ahora vamos a abrir los dos archivos de texto en Excel con los datos de rendimiento cuántico para la direcciónt y excitación indirecta. Finalmente se calcula el rendimiento cuántico para la muestra incluyendo el efecto de excitación indirecta, usando la siguiente fórmula: </li></ol> Φ = Φd-(1-Ad) ø&#39;i Donde: Φ es el rendimiento cuántico corregida teniendo en cuenta la excitación indirecta Φd es el rendimiento cuántico interno con excitación directa. (Interna rendimiento cuántico = cantidad de fluorescencia / Cantidad de luz de excitación absorbida.) Ad es la absortancia para la excitación directa. (Esta es la razón de la cantidad de haz de excitación absorbida por la muestra). (= Absorbancia (Arex - CsEx) / Arex, donde Arex es la cantidad de luz de excitación y CsEx es la cantidad de luz reflejada) Ø&#39;i es el rendimiento cuántico interno con Indirect excitación Φ = 0,536 - (1-0.848) 0,420 Calculado Φ = 0,47216 6. Cálculo de cromaticidad <ol><li> Vamos a utilizar el generador de software Informe opcional junto con una plantilla preparada para el cálculo de cromaticidad. </li><li> Abra el archivo de datos de salicilato P1_Sodium (Video 34). </li><li> Haga clic en &quot;Propiedades&quot;, luego la pestaña &quot;Informe&quot;. En &quot;Salida&quot;, seleccione &quot;hoja de uso del generador de impresión&quot; en el menú desplegable. En &quot;Imprimir artículo&quot; Seleccionar plantilla &quot;FL70Std01_Color chart.xls-&quot; y luego haga clic en el botón &quot;Abrir&quot;. No hay necesidad de seleccionar el rango de longitud de onda y el intervalo, ya que esto se hace automáticamente por el generador de informes (Video 35). </li><li> El siguiente paso es crear el informe. Haga clic en el &quot;Informe&quot; ficha y la macro para crear el informe se ejecuta y guarda en la &quot;Informes&quot; en la carpeta en formato Excel con el nombre de la muestra (Video 36). &lt;<html> / Li&gt; <li> En este momento podemos abrir el informe para ver los datos de color de vídeo (37). </li></ol> 7. Secretos para el éxito <ol><li> Utilice muestras frescas. </li><li> Tenga en cuenta que el material de diferentes fabricantes podrían dar resultados diferentes. </li><li> Toque en el fondo de la celda en polvo para compactar la muestra y presentar una superficie uniforme para la medición. </li><li> Proteger de la luz. Se deterioran con la exposición a la luz. </li><li> Intente utilizar una velocidad más rápida de exploración para minimizar la exposición de la muestra a la luz. </li></ol> 8. Los resultados representativos 8,1. Salicilato de sodio se sabe que tienen un rendimiento cuántico de 0,4 a 0,5 <img src="/files/ftp_upload/3066/3066fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/3066/3066fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . iles/ftp_upload/3066/3066fig2.jpg &quot;alt =&quot; Figura 1 &quot;/&gt; Figura 2. <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/3066/3066fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/3066/3066fig3.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 3. <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/3066/3066fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> .

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Quantum Yield Measurement of Sodium Salicylate. FL080002, 1 (2008).</li><li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+Fluorescence+Spectroscopy.">Principles of Fluorescence Spectroscopy.</a> Science and Business Media, LLC. 60, (2006).</li><li>Horigome, J., Wakui, T., Shirasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Correction+Method+for+Determination+of+Absolute+Fluorescence+Quantum+Yields+of+Solid+Samples+with+a+conventional+Fluorescence+Spectrophotometer.">A Simple Correction Method for Determination of Absolute Fluorescence Quantum Yields of Solid Samples with a conventional Fluorescence Spectrophotometer.</a> Bunseki Kagako. 58 (6), 553-559 (2009).</li></ol>

Luis A. Moreno, es empleado por las tecnologías de Hitachi America alta que produce el instrumento utilizado en este artículo.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Salicilato de sodio en polvo </td><td> Wako </td><td> 191-03142 </td><td> Mol. Peso 160,10 </td></tr></tbody></table>

absolute quantum yield measurement of powder samples

Medición de rendimiento cuántico de fluorescencia se ha convertido en una herramienta importante en la búsqueda de nuevas soluciones en el desarrollo, la evaluación de control de calidad, y la investigación de la iluminación, equipos audiovisuales, material orgánico EL, películas, filtros y sondas fluorescentes para la bio-industria. Rendimiento cuántico se calcula como la relación del número de fotones absorbidos, con el número de fotones emitidos por un material. Cuanto mayor es el rendimiento cuántico, mejor será la eficiencia del material fluorescente. Para las mediciones que aparecen en este video, vamos a utilizar el Hitachi F-7000 espectrofotómetro de fluorescencia equipado con el rendimiento cuántico de medida del programa de accesorios y generador de informes. Toda la información proporcionada se aplica a este sistema. Medición de rendimiento cuántico en las muestras de polvo se realiza siguiendo estos pasos: <ol><li> Generación de factores de corrección de instrumentos para la excitación y emissmonocromadores de iones. Este es un requisito importante para la correcta medición de rendimiento cuántico. Se ha realizado previamente para el rango completo de medición del instrumento y no se muestra en este vídeo debido a limitaciones de tiempo. </li><li> Medición de la integración de los factores de corrección de la esfera. El propósito de este paso es tomar en consideración las características de reflectividad de la esfera de integración utilizado para las mediciones. </li><li> Referencia y medida de la muestra utilizando excitación directa y excitación indirecta. </li><li> Quantum de cálculo de rendimientos con la excitación directa e indirecta. Excitación directa es cuando la muestra se enfrenta directamente el haz de excitación, que sería la configuración normal de medición. Sin embargo, debido a que usamos una esfera de integración, una porción de los fotones emitidos resultantes de la fluorescencia de la muestra son reflejados por la esfera de integración y se volverá a excitar la muestra, por lo que deben tomar en consideración excitación indirecta. Esto es ACCOmplished midiendo la muestra colocada en el puerto frente del monocromador de emisión, el cálculo indirecto rendimiento cuántico y corregir el cálculo directo rendimiento cuántico. </li><li> Se ha corregido el cálculo rendimiento cuántico. </li><li> Las coordenadas de cromaticidad de cálculo mediante el programa Generador de Informes. </li></ol> Los Hitachi F-7000 rendimiento cuántico de medición ofrecen ventajas del sistema para esta aplicación, como sigue: <ul><li> Alta sensibilidad (S / N 800 o mejor RMS). La señal es la banda Raman de agua medido en las condiciones siguientes: longitud de onda 350 nm Ex, Ex de paso de banda y Em nm 5, la respuesta de 2 segundos), el ruido se mide en el máximo del pico Raman. La alta sensibilidad permite la medición de las muestras, incluso con un bajo rendimiento cuántico. El uso de este sistema se han medido los rendimientos cuánticos tan bajas como 0,1 para una muestra de ácido salicílico y tan alto como 0,8 para una muestra de tungstato de magnesio. </li><li> Medición de alta precisión con un rango dinámico de 6 órdenes demagnitud permite mediciones de ambos picos de dispersión nítidas con alta intensidad, así como amplios picos de fluorescencia de baja intensidad en las mismas condiciones. </li><li> Rendimiento de medición de alta y una menor exposición de luz a la muestra, debido a una alta velocidad de escaneado de hasta 60.000 nm / minuto y la función de obturación automática. </li><li> Medición de rendimiento cuántico en un rango de longitudes de onda de 240 a 800 nm. </li><li> Mediciones precisas de los rendimientos cuánticos son el resultado de la recogida de la respuesta del instrumento espectral y la integración de los factores de la esfera de corrección antes de la medición de la muestra. </li><li> Gran selección de los parámetros calculados proporcionados por software específico y fácil de usar. </li></ul> Durante este vídeo mediremos salicilato de sodio en forma de polvo que se sabe que tiene un valor de rendimiento cuántico de 0,4 a 0,5.

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Absolute Quantum Yield Measurement of Powder Samples

En este video vamos a demostrar la medición y el cálculo absoluto de rendimiento cuántico y la cromaticidad coordina directamente en muestras de polvo utilizando el Hitachi F-7000 Sistema de Medición de rendimiento cuántico.

Absoluta Quantum medición del rendimiento de las muestras de polvo

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

27.8K vistas.  Hitachi High Technologies America. En este video vamos a demostrar la medición y el cálculo absoluto de rendimiento cuántico y la cromaticidad coordina directamente en muestras de polvo utilizando el Hitachi F-7000 Sistema de Medición de rendimiento cuántico.

Video: Absolute Quantum Yield Measurement of Powder Samples

Large Volume (20L+) Filtration of Coastal Seawater Samples

The workflow begins with the collection of coastal marine waters for downstream microbial community, nutrient and trace gas analyses. For this method, samples were collected from the deck of the HMS John Strickland operating in Saanich Inlet. This video documents large volume (&ge;20 L) filtration of microbial biomass, ranging between 0.22&mu;m and 2.7&mu;m in diameter, from the water column. Two 20L samples can be filtered simultaneously using a single pump unit equipped with four rotating heads. Filtration is done in the field on extended trips, or immediately upon return for day trips. It is important to record the amount of water passing through each sterivex filter unit. To prevent biofilm formation between sampling trips, all filtration equipment must be rinsed with dilute HCl and deionized water and autoclaved immediately after use. This procedure will take approximately 5 hours plus an additional hour for clean up.

Large Volume 20L+ Filtration of Coastal Seawater Samples

This video documents large volume (&ge;20 L) filtration of microbial biomass, ranging between 0.22&mu;m and 2.7&mu;m in diameter, from the water column.

De gran volumen (20 litros +) Filtración de muestras de agua marina costera

The workflow begins with the collection of coastal marine waters for downstream microbial community, nutrient and trace gas analyses. For this method, ...

Investigación

Biología

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) processes or by exogenous factors, particularly ionizing radiation and radiomimetic compounds. Phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX, is an early response to DNA double-strand breaks1. This phosphorylation event is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Overall, DSB induction results in the formation of discrete nuclear &gamma;H2AX foci which can be easily detected and quantitated by immunofluorescence microscopy2. Given the unique specificity and sensitivity of this marker, analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in biomedical research, particularly in radiation biology and nuclear medicine. The quantitation of &gamma;H2AX foci has been most widely investigated in cell culture systems in the context of ionizing radiation-induced DSBs. Apart from cellular radiosensitivity, immunofluorescence based assays have also been used to evaluate the efficacy of radiation-modifying compounds. In addition, &gamma;H2AX has been used as a molecular marker to examine the efficacy of various DSB-inducing compounds and is recently being heralded as important marker of ageing and disease, particularly cancer3. Further, immunofluorescence-based methods have been adapted to suit detection and quantitation of &gamma;H2AX foci ex vivo and in vivo4,5. Here, we demonstrate a typical immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in mouse tissues.

Quantitation of &amp;#947;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of DNA double-strand breaks on the basis of &gamma;H2AX foci has become an invaluable tool, particularly in radiation biology, for the evaluation of tissue radiosensitivity and effects of radiation modifying compounds. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantitation of &gamma;H2AX foci in tissue samples.

La cuantificación de γH2AX focos en muestras de tejido

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

High-Throughput Measurement and Classification of Organic P in Environmental Samples

Many types of organic phosphorus (P) molecules exist in environmental samples1. Traditional P measurements do not detect these organic P compounds since they do not react with colorimetric reagents2,3. Enzymatic hydrolysis (EH) is an emerging method for accurately characterizing organic P forms in environmental samples4,5. This method is only trumped in accuracy by Phosphorus-31 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (31P-NMR) -a method that is expensive and requires specialized technical training6. We have adapted an enzymatic hydrolysis method capable of measuring three classes of phosphorus (monoester P, diester P and inorganic P) to a microplate reader system7. This method provides researchers with a fast, accurate, affordable and user-friendly means to measure P species in soils, sediments, manures and, if concentrated, aquatic samples. This is the only high-throughput method for measuring the forms and enzyme-lability of organic P that can be performed in a standard laboratory. The resulting data provides insight to scientists studying system nutrient content and eutrophication potential.

This protocol describes a high-throughput method of enzymatic hydrolysis that utilizes a microplate reader to measure and classify soil phosphorus as P monoesters, P diesters and inorganic P. Up to 96 samples can be measured at one time in a standard laboratory.

Alto Rendimiento de medición y clasificación de P orgánico en las muestras ambientales

Many types of organic phosphorus (P) molecules exist in environmental samples1.  Traditional P measurements do not detect these organic P compounds since ...

Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to infection. A common method to measure chemotaxis is the Boyden chamber assay, in which cells and chemoattractant are separated by a porous membrane. As cells migrate through the membrane toward the chemoattractant, they adhere to the underside of the membrane, or fall into the underlying media, and are subsequently stained and visually counted 1. In this method, cells are exposed to a steep and transient chemoattractant gradient, which is thought to be a poor representation of gradients found in tissues 2.
Another assay system, the under-agarose chemotaxis assay, 3, 4 measures cell movement across a solid substrate in a thin aqueous film that forms under the agarose layer. The gradient that develops in the agarose is shallow and is thought to be an appropriate representation of naturally occurring gradients. Chemotaxis can be evaluated by microscopic imaging of the distance traveled. Both the Boyden chamber assay and the under-agarose assay are usually configured as endpoint assays.
The automated ECIS/Taxis system combines the under-agarose approach with Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) 5, 6. In this assay, target electrodes are located in each of 8 chambers. A large counter-electrode runs through each of the 8 chambers (Figure 2). Each chamber is filled with agarose and two small wells are the cut in the agarose on either side of the target electrode. One well is filled with the test cell population, while the other holds the sources of diffusing chemoattractant (Figure 3). Current passed through the system can be used to determine the change in resistance that occurs as cells pass over the target electrode. Cells on the target electrode increase the resistance of the system 6. In addition, rapid fluctuations in the resistance represent changes in the interactions of cells with the electrode surface and are indicative of ongoing cellular shape changes. The ECIS/Taxis system can measure movement of the cell population in real-time over extended periods of time, but is also sensitive enough to detect the arrival of a single cell at the target electrode. 
Dictyostelium discoidium is known to migrate in the presence of a folate gradient 7, 8 and its chemotactic response can be accurately measured by ECIS/Taxis 9. Leukocyte chemotaxis, in response to SDF1&alpha; and to chemotaxis antagonists has also been measured with ECIS/Taxis 10, 11. An example of the leukocyte response to SDF1&alpha; is shown in Figure 1.

The ECIS/Taxis system is an automated, real-time assay that measures cellular chemotaxis. In this assay, cells move beneath a layer of agarose to arrive at a target electrode. Cellular movement is measured by the onset of resistance to AC current 0.

La medición de la quimiotaxis celular con ECIS / taxis

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

Medición de la esperanza de vida en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

A High Yield and Cost-efficient Expression System of Human Granzymes in Mammalian Cells

When cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells recognize tumor cells or cells infected with intracellular pathogens, they release their cytotoxic granule content to eliminate the target cells and the intracellular pathogen. Death of the host cells and intracellular pathogens is triggered by the granule serine proteases, granzymes (Gzms), delivered into the host cell cytosol by the pore forming protein perforin (PFN) and into bacterial pathogens by the prokaryotic membrane disrupting protein granulysin (GNLY). To investigate the molecular mechanisms of target cell death mediated by the Gzms in experimental in-vitro settings, protein expression and purification systems that produce high amounts of active enzymes are necessary. Mammalian secreted protein expression systems imply the potential to produce correctly folded, fully functional protein that bears posttranslational modification, such as glycosylation. Therefore, we used a cost-efficient calcium precipitation method for transient transfection of HEK293T cells with human Gzms cloned into the expression plasmid pHLsec. Gzm purification from the culture supernatant was achieved by immobilized nickel affinity chromatography using the C-terminal polyhistidine tag provided by the vector. The insertion of an enterokinase site at the N-terminus of the protein allowed the generation of active protease that was finally purified by cation exchange chromatography. The system was tested by producing high levels of cytotoxic human Gzm A, B and M and should be capable to produce virtually every enzyme in the human body in high yields.

We describe here a cost-efficient granzyme expression system using HEK293T cells that produces high yields of pure, fully glycosylated and enzymatically active protease.

Un alto rendimiento y sistema de expresión de costo-eficiente de granzimas humanos en células de mamífero

When cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells recognize tumor cells or cells infected with intracellular pathogens, they release their ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of Gi2 (a heterotrimeric G-protein &#945;-subunit) is described in detail.

This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.

Reacción seleccionada Monitoreo espectrometría de masas para Absolute Proteína cuantificación

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and function. The rapid establishment and high recovery from transiently-transfected mammalian cell lines addresses this barrier and is an effective means of expressing proteins that are naturally channeled through the ER and Golgi-mediated secretory pathway. Here is one protocol for protein expression using the human HEK293F and HEK293S cell lines transfected with a mammalian expression vector designed for high protein yields. The applicability of this system is demonstrated using three representative glycoproteins that expressed with yields between 95-120 mg of purified protein recovered per liter of culture. These proteins are the human Fc&#947;RIIIa and the rat &#945;2-6 sialyltransferase, ST6GalI, both expressed with an N-terminal GFP fusion, as well as the unmodified human immunoglobulin G1 Fc. This robust system utilizes a serum-free medium that is adaptable for expression of isotopically enriched proteins and carbohydrates for structural studies using mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. Furthermore, the composition of the N-glycan can be tuned by adding a small molecule to prevent certain glycan modifications in a manner that does not reduce yield.

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.

High Yield La expresión de proteínas recombinantes humanos con la transfección transitoria de células HEK293 en Suspensión

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This approach is appropriate for examining physiological changes in target gene expression levels. However, absolute quantification using better statistical analysis is preferable for a comprehensive assessment of gene expression levels. Absolute quantification is still not in common use. This report describes a protocol for measuring the absolute levels of plasma miRNA, using RT-qPCR with or without pre-amplification.
A fixed volume (200 &#181;L) of EDTA-plasma was prepared from the blood collected from the femoral vein of conscious cynomolgus monkeys (n = 50). Total RNA was extracted using commercially available system. Plasma miRNAs were quantified by probe-based RT-qPCR assays which contains miRNA-specific forward/reverse PCR primer and probe. Standard curves for absolute quantification were generated using commercially available synthetic RNA oligonucleotides. A synthetic cel-miR-238 was used as an external control for normalization and quality assessment. The miRNAs that showed quantification cycle (Cq) values above 35 were pre-amplified prior to the qPCR step.
Among the 8 miRNAs examined, miR-122, miR-133a, and miR-192 were detectable without pre-amplification, whereas miR-1, miR-206, and miR-499a required pre-amplification because of their low expression levels. MiR-208a and miR-208b were not detectable even after pre-amplification. Sample processing efficiency was evaluated by the Cq values of the spiked cel-miR-238. In this assay method, technical variation was estimated to be less than 3-fold and the lower limit of quantification (LLOQ) was 102 copy/&#181;L, for most of the examined miRNAs.
This protocol provides a better estimate of the quantity of plasma miRNAs, and allows quality assessment of corresponding data from different studies. Considering the low number of miRNAs in body fluids, pre-amplification is useful to enhance detection of poorly expressed miRNAs.

This report describes a protocol for measuring the absolute levels of plasma miRNA, using quantitative real-time reverse transcription PCR with or without pre-amplification. This protocol affords better understanding of the quantity of plasma miRNAs and allows qualitative assessment of corresponding data from different studies or laboratories.

Cuantificación absoluta de Plasma niveles de microARN en monos cangrejeros, mediante transcripción reversa en tiempo real cuantitativa PCR

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, implantation of transgenic cells and tiny optical sensors. However, intravenous microinjections into small animals, which are mostly used in biological and veterinary laboratories, are very difficult and require trained personnel. Herein, we demonstrate a robust and efficient method for the introduction of microparticles into the circulatory system of adult zebrafish (Danio rerio) by injection into the fish kidney. To visualize the introduced microparticles in the vasculature, we propose a simple intravital imaging technique in fish gills. In vivo monitoring of the zebrafish blood pH was accomplished using an injected microencapsulated fluorescent probe, SNARF-1, to demonstrate one of the possible applications of the described technique. This article provides a detailed description of the encapsulation of pH-sensitive dye and demonstrates the principles of the quick injection and visualization of the obtained microcapsules for in vivo recording of the fluorescent signal. The proposed method of injection is characterized by a low mortality rate (0-20%) and high efficiency (70-90% success), and it is easy to institute using commonly available equipment. All described procedures can be performed on other small fish species, such as guppies and medaka.

This article demonstrates the principles of a quick, minimally invasive injection of fluorescent microparticles into the circulatory system of small fishes and the in vivo visualization of the microparticles in fish blood.

Simple y eficaz administración y visualización de micropartículas en el sistema circulatorio de peces pequeños con inyección de riñón

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...