Los autores desean agradecer a Lonza Walkersville por su ayuda con el conocimiento del sistema cerrado, diseño de la bolsa, el préstamo de selladores de bolsa y soldadores, así como la creación de la bolsa a los esquemas HyperStack.

1. Buque HyperStack - Gas Permeable Antecedentes Tecnología de Materiales <ol><li> El buque es un buque HyperStack multicapa para el cultivo de un sistema cerrado de las células que se basa en el intercambio de gases a través de una película de gas 76.2micron polímero permeable para el metabolismo celular. </li><li> El buque HyperStack diferencia de más embarcaciones tradicionales de cultivo celular en el que no tiene un &quot;espacio de cabeza&quot; por encima de las células en el interior del buque. En vez de contener este &quot;espacio libre&quot; para el intercambio de gas dentro del recipiente, los productos de gas permeable con espacios de aire (conocido como &quot;traqueal&quot; espacios) debajo de cada cámara de la cultura que está abierta a la atmósfera. </li><li> Este espacio traqueal permite a las células que crecen en cada compartimiento de cultivo de células de la embarcación para que el intercambio de gas equivalente. </li><li> La película de gas permeable permite el intercambio de gases que se produzcan al mismo tiempo mantener un ambiente estéril. Todas las manipulaciones de fluidos para cada una de las múltiples capas se producen a través de una puerta de entrada única. </li></ol> 2. Buque HyperStack Resumen de Componente <ol><li> El Stackette es el compartimiento de cultivo de células individuales que se compone de la placa superior y la película de gas permeable. Las células se cultivan en este compartimento. </li><li> El colector de líquido se conecta cada una de las 12 capas stackette juntos dentro de un módulo HyperStack. Los módulos están conectados con la tubería a la formación de vasos en múltiplos de 12 capas. El colector permite al usuario realizar una manipulación de fluidos a todo el buque. </li><li> El distribuidor de aire también conecta las capas stackette juntos, pero es utilizado para desplazar el aire del recipiente de líquido cuando se producen incorporaciones. Contiene una línea de llenado para su uso durante el llenado. </li><li> El espacio de la tráquea es el espacio al aire libre entre cada capa stackette, lo que permite el intercambio de gases que se produzcan a través de películas permeables al gas cada capa. </li><li> La tubería de manejo de líquidos está conectado al colector de líquidos y se usa para hacer todas las manipulaciones del sistema cerrado de fluidos. Este componente se puede personalizar. </li><li> El tubo de ventilación conectado al colector de aire, contiene un filtro de aire, y se utiliza para liberar el exceso de aire mientras se mantiene la esterilidad. </li><li> La tubería de persecución tiene un filtro y la abrazadera y se conectan a la tubería de manejo de líquidos y se utilizan para evacuar el líquido de la tubería de manejo de líquidos después de llenar el vaso. </li><li> El manipulador de la pila Corning o CSM es un dispositivo de manipulación para ayudar en la colocación de los vasos en las posiciones correctas durante el uso. </li><li> La cuña de relleno es un acero inoxidable ayudar a utilizar cuando rellenar manualmente los vasos HyperStack. </li></ol> 3. Los resultados de difusión de gas a través del cine permeables al gas usada en los recipientes HyperStack <ol><li> En los sistemas tradicionales de crecimiento de las células con espacio de cabeza de ventilación, el oxígeno en los medios de comunicación se ha agotado un promedio de 50% más de 3 días de cultivo. (Figura 1) </li><li> En el sistema de crecimiento de las células mismas, el gradiente de oxígeno en una altura de 3 mm de los medios de comunicación es casi un 50% mayor en los medios de comunicación hasta la salida del espacio de cabeza de lo que está en la capa de células. (Figura 2) </li><li> La difusión de oxígeno a través de la película de gas permeable 76.2micron poliestireno es igual a la difusión a través de 2,6 mm de los medios de comunicación. La película permeable a los gases utilizados en los vasos HyperStack permite el intercambio de gases a ocurrir en la capa de células. </li><li> El% de oxígeno en el espacio de la tráquea de los vasos HyperStack se mantiene constante en las células crecen a la confluencia. (Figura 3) </li></ol> 4. Los medios de preparación de bolsas <ol><li> El HyperStack-12 vasos de capa se 1.3L de los medios de comunicación y la HyperStack-36 vasos de 3,9 litros de capa tiene los medios de comunicación. </li><li> Antes de la inoculación de sus medios de comunicación en bolsa, si el suero se va a utilizar, el tubo de soldadura de la bolsa de suero a la bolsa de los medios de comunicación y mezclar bien. </li><li> Abrazadera de aproximadamente 300 ml de los medios de comunicación en la bolsa utilizando pinzas bolsa grande. Esto asegurará que todas las células inoculadas se utilizan durante el llenado y no se quedan en la bolsa de los medios de comunicación. Coloque la bolsa de los medios de comunicación en el stand de la bolsa. </li></ol> 5. Medios de inoculación <ol><li> Llene una jeringa con un tubo conectado con la suspensión celular. Soldadura del tubo 3 / 16 &quot;tubo de la jeringa que contiene una suspensión de células a la bolsa de los medios de comunicación. </li><li> Se inyecta la suspensión celular en la bolsa de los medios de comunicación y mezclar bien. </li></ol> 6. Rellene Procedimiento <ol><li> Tubo de soldadura de la bolsa inoculados los medios de comunicación a la embarcación HyperStack de 3 / 8 &quot;tubería de manejo de líquidos. (Con estéril Conecta o multiusos se conecta (PSM), también puede conectar la bolsa de los medios de comunicación en la vasija). </li><li> Cerrar las pinzas en el manejo de líquidos y las trompas de caza en el HyperStack. </li><li> Coloque el HyperStack 36 buques en la capa de CSM en la posición de carga, conectar el tubo de ventilación del filtro en la abrazadera de sujeción en el CSM. Apriete la tapa y mover el CSM a la posición de llenado. Al poner el barco en la posición de llenado correcto, el filtro de aire se encuentra en la posición más alta para evitar que se moje durante la operación de relleno. El ángulo de 10 ° permite equilibrción del líquido a las capas durante el llenado. El buque capa HyperStack-12 situado en el lado de la cuña de relleno está en la posición correcta para el relleno. </li><li> Aire claro de la línea de llenado mediante la colocación de la bolsa en el mismo nivel que el buque HyperStack (no más). Mantener la abrazadera de la manguera perseguir cerrado, abra la pinza de manipulación tubo de líquidos y la pinza de bolsa de los medios de comunicación para permitir que el líquido entre en el buque. </li><li> Uso del soporte bolsa, aumentar la bolsa de los medios de comunicación para ayudar al flujo de la suspensión de células en el vaso. </li><li> Llenar el depósito hasta que todos los medios inoculados entra en el recipiente, el de 300 ml de los medios de comunicación todavía debe permanecer en la parte superior de la bolsa de los medios de comunicación. Retire la abrazadera de la bolsa de los medios de comunicación para seguir llenando el vaso. Como líquido se aproxima el colector de aire superior, disminuir la tasa de relleno mediante la reducción de la bolsa de los medios de comunicación a fin de prevenir sobre el relleno. Lentamente que el nivel de líquido a la línea de llenado y la abrazadera de la manguera de manejo de líquidos. </li></ol> 7. Procedimiento para el aislamiento de bloqueo de líquido en las capas <ol><li> Llevar el buque HyperStack en el CSM en la posición de aislamiento para los dos conjuntos de colectores se encuentran en la posición más alta y más baja la bolsa de los medios de comunicación por debajo de la altura de la nave. El HyperStack-12 vasos de capa se pueden levantar en la posición de aislamiento mediante la colocación de una mano en el costado del barco y usa la otra para levantar la cuña de relleno. </li><li> Con el filtro de perseguir a cabo en una posición vertical, abra la abrazadera de la manguera persecución. Se eliminará o perseguir a los medios de comunicación en el tubo de manejo de líquidos en la bolsa de los medios de comunicación. Una vez que la tubería está vacía, cierre la pinza en el tubo de la bolsa de los medios. </li><li> Mantener el filtro del tubo de persecución en una posición vertical, abra la pinza en el tubo de manejo de líquidos en el HyperStack para permitir que el líquido restante para entrar y equilibrar en el vaso. Esperar 1-2 minutos para que esto ocurra. </li><li> A su vez el buque HyperStack en el CSM para que los colectores están a la izquierda. Inferior del buque a la posición de carga en el CSM. Balanceo de la embarcación-12 HYPEStack capa ligeramente a la izquierda permitirá la eliminación de la cuña de relleno. Cerrar las pinzas en ambos la persecución y el tubo de manejo de líquidos. </li><li> La bolsa de los medios de comunicación ahora puede ser removido de la embarcación, o puede permanecer unidos para su uso posterior en el procedimiento de la cosecha. Para guardar el adjunto bolsa de los medios de comunicación, rollo de la bolsa vacía y cualquier otro medio que queda en la bolsa, y de lugar en las bandas de retención en la bandeja de almacenamiento del buque HyperStack. </li><li> Mover el barco HyperStack a la incubadora. Al llevar a la atención de buques deben tomar para evitar que el líquido penetre en el filtro de ventilación de aire. Esto se logra por el depósito al final del colector de la HyperStack ligeramente hacia arriba. </li></ol> 8. Protocolo de Cosecha <ol><li> Para comenzar el procedimiento de la cosecha, la soldadura del tubo de la solución de disociación celular y bolsas de apagar juntos para formar el conjunto de la bolsa de recolección. Asegurar que todas las pinzas de la línea están cerrados. (El uso de dibujos animados para demostrar) </li><li> Retire vaso HyperStack de la incubadora, la liberación de la bolsa de los medios de comunicación de debajo de las bandas de retención, y pasar el rato en el stand de la bolsa. Colocar el recipiente en el CSM en la posición de carga y apretar la tapa para asegurar la embarcación. Gancho de la tubería de ventilación en la abrazadera de sujeción y mover el CSM a la posición de llenado. </li><li> Asegurarse de que la bolsa de los medios de comunicación en el stand de la bolsa cuelga más bajo que el HyperStack, abrir la pinza en el tubo de la bolsa los medios de comunicación y la tubería del buque de manejo de líquidos para permitir que los medios de comunicación de flujo en la bolsa adjunta. </li><li> Una vez que el buque está a punto ¾ vacío, cambiar la configuración de CSM en la posición de vacío final. Cuando el buque HyperStack y tubos de manejo de líquidos están vacías, levantar el tubo para perseguir a los medios de comunicación más allá de la pinza en el tubo de la bolsa pasó medios de comunicación, a continuación, cierre tanto de la pinza del tubo de manejo de líquidos y la pinza en el tubo de la bolsa pasó de los medios. </li><li> Vuelva a colocar la bolsa pasó los medios de comunicación con el conjunto de bolsa de recolección de soldadura de tubos y elevar la altura de la asamblea celular bolsa de disociación por encima de la altura de la HyperStack utilizando el soporte de la bolsa. </li><li> Coloque el CSM en la posición de equilibrio. Abrir el tubo de disociación celular solución pinza y la transferencia de la solución en el HyperStack. Cuando se complete la transferencia, cierre las abrazaderas en el tubo de manejo de líquidos y el tubo de disociación celular solución. </li><li> Traiga CSM a la posición de carga. Mediante la celebración de la palanca de posicionamiento horizontal abierta, agite suavemente el lado del depósito a otro usando la rueda, la distribución de la solución sobre las capas de células. El buque de vez en cuando puede ser devuelto a la posición de equilibrio durante el balanceo de mantener una distribución equitativa de la solución. Puede que no sea visualmente evidente que las capas están completamente cubiertas, pero la solución de disociación se distribuyen por igual en toda la superficie de las células. Una vez que la solución ha sido adecuadamente distribuido, comunicado de la palanca de la CSM para bloquear el HyperStack en la posición de carga. Deje el HyperStack en esta posicióndurante el tiempo necesario para la disociación de las células. </li><li> Una vez que las células se han desprendido, con turbidez como una guía, mueva el CSM en la posición de equilibrio. Se debe tener cuidado de no digerir más de las células. Abra la pinza de la bolsa de enfriamiento y el líquido HyperStack pinza de la línea de manejo para que los medios de saciar a entrar en el buque. Cierre la pinza del tubo de manejo HyperStack líquido una vez se complete la transferencia. </li><li> Volver al CSM a la posición de carga y mantenga la palanca de posicionamiento horizontal de roca el lado del depósito a otro. </li><li> Uso del soporte bolsa, bajar la posición del conjunto de bolsa de la cosecha por debajo del nivel de la HyperStack. Ajuste el CSM en la posición vacía, abrir el recipiente de líquido del tubo de sujeción y manejo de la transferencia de la solución de células en la bolsa de apagar. Volver al CSM a la posición de carga y desconexión de la bolsa de montaje de la cosecha de la embarcación con un sellador de tubo. La solución celular está listo para su procesamiento. </li></ol> 9. Resultados representante <ul><li> Momento de la cosecha debe ser optimizado cuando se convierte de una superficie de poliestireno estándar de gas a la superficie de poliestireno permeable. Las células tienden a liberar más rápidamente en el producto HyperStack. </li><li> Para ver las células bajo un microscopio los tubos de ventilación y manejo de líquidos debe ser fijada apagado. Colocar el recipiente HyperStack al revés, con los colectores hacia abajo, en la platina del microscopio. </li><li> Medidas de prevención se pueden tomar para evitar que se moje los filtros durante el uso que hará que deje de funcionar. Por no más de llenar el vaso HyperStack y mantener la ventilación y el tubo de persecución elevada cuando las pinzas están abiertas, no mojar debe ocurrir. </li><li> La presión de las pinzas cerradas en el tubo hace que permanecen cerradas después de que las pinzas se abren. Pellizcar el tubo en la dirección opuesta, lo abrirá. </li><li> Tiempo de los medios de comunicación de flujo de entrada y salida del buque HyperStack a través de la alimentación por gravedad se basa en la diferencia de altura media entre el nivel superior de los medios de comunicación en el vaso HyperStack y el nivel superior de los medios de comunicación en el contenedor de los medios de comunicación. La mayor distancia, más rápido será el flujo. El caudal máximo está limitado por la calificación de los filtros para 1.5L/min. </li><li> Mantener un volumen adecuado llenar el vaso HyperStack evitará la formación de burbujas de aire en las cámaras de crecimiento de las células. Las burbujas de aire puede ocurrir debido a la toma de muestras o en incubación en un entorno unhumidified debido a la pérdida de agua por evaporación. La cantidad y frecuencia de muestreo, así como las condiciones de incubación se determinará si el exceso de líquidos deben ser añadidos por el usuario final. </li></ul><img src="/files/ftp_upload/2499/2499fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. El agotamiento del oxígeno de los medios de comunicación en un recipiente de cultivo celular estándar. La figura muestra la disminución en mg / L de oxígeno a nivel de las células durante 3 días. <img src="/files/ftp_upload/2499/2499fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Gradiente de oxígeno en los medios de comunicación en un recipiente de cultivo celular estándar. La figura muestra el mg / L de oxígeno es mayor en los medios de comunicación a la intersección del espacio de cabeza que en la capa de células. <img src="/files/ftp_upload/2499/2499fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Porcentaje de oxígeno en el espacio de la tráquea de la HyperStack durante el crecimiento celular. La figura muestra que más de 96 horas, el porcentaje de oxígeno entre las capas, lo que proporciona a cada parte inferior de gases de película permeable, se mantiene constante. Esto demuestra la capacidad de las células para el acceso de oxígeno durante el crecimiento de la confluencia.

El buque HyperStack permeables a los gases de tecnología está cubierta por la Patente de EE.UU. #: 7745209. Los autores son empleados de Corning Life Sciences, Inc, que produce el instrumento utilizado en este artículo.

Buques HyperStack ha crecido con éxito ingeniería, pilas y madre. Adiciones de líquido en el vaso se han realizado a través de conexiones bolsa aséptica por gravedad y por bombeo de un recipiente estéril, los medios de comunicación. El buque ofrece un aumento de 2,5 veces mayor que en el área de crecimiento frente a un producto de la placa de apilado de la huella volumétrica mismo. El HyperStack-12 tiene 6.000 cm 2 área de crecimiento, el HyperStack-36 cuenta con 18.000 cm 2 área de crecimiento, y el HyperStack 120 cuenta con 60.000 cm 2 de área de crecimiento. Al aumentar la superficie, los usuarios son capaces de producir más células de la misma población celular o lote y reducir la variabilidad. También son capaces de ahorrar espacio y / o mano de obra mediante el uso de menos buques para lograr la salida de la misma célula, o aumentar la producción de células sin la adición de las personas, suites para salas blancas, o incubadoras. El sistema se produce con métodos de bajo de partículas de montaje y sin el uso de adhesivos. Se trata de un sistema cerrado que es confeccionado con juegos de tubos y filtros, triple bolsa y siempre estériles.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>1.5L Bagged Media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>TBD</td>
<td>1350ml media + 150ml serum (if required)</td>
</tr>
<tr>
<td>4.0L Bagged Media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>TBD</td>
<td>3600ml media + 400ml serum (if required)</td>
</tr>
<tr>
<td>HYPERStack Vessel-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>10012</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HYPERStack Vessel-36</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>10036</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Filling Wedge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>10040</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stack Manipulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>TBD</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HyQtainer Sub-Assembly Sampling Device</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>HyClone/LonzA</td>
<td>SH3B0324.01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>600ml Bagged Media Quencher (10% FBS IMDM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>TBD</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>600ml Cell Dissociation Solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>TBD</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

closed system cell culture protocol using hyperstack vessels with gas permeable material technology

Cultivo a gran volumen de células adherentes se encuentra estandarizado en productos apilados placa de crecimiento celular cuando microportadores cuentas no son una elección óptima. Vasos HyperStack permitir escala un sistema cerrado a partir de los productos apilados corriente de placa y entrega&gt; 2,5 veces más células de la huella volumétrica mismo. Los vasos HyperStack función a través de materiales permeables al gas que permite el intercambio de gases que se produzcan, por lo tanto, eliminando la necesidad de espacio libre interior de un buque. La eliminación de espacio libre permite que el compartimiento donde el crecimiento celular se produce a minimizar para reducir el espacio, permitiendo que más capas de la superficie de crecimiento de las células dentro de la huella volumétrica mismo. Para muchas aplicaciones, tales como la terapia celular o la producción de vacunas, un sistema cerrado es necesario para el crecimiento celular y la cosecha. El buque HyperStack permite la adición de células y el reactivo y la eliminación a través de tubos de las bolsas de los medios de comunicación u otros métodos. Este protocolo se explicará la tecnología detrás de los materiales permeables al gas utilizado en los vasos HyperStack, los resultados de difusión de gas para satisfacer las necesidades metabólicas de las células, células del sistema cerrado protocolos de crecimiento, y los distintos métodos de recolección.

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Closed System Cell Culture Protocol Using HYPERStack Vessels with Gas Permeable Material Technology

Una introducción a la tecnología, el protocolo y el manejo de los vasos Corning HyperStack y accesorios utilizados para el alto rendimiento de la cultura de células adherentes. El protocolo se mostrará cómo utilizar los vasos sistema cerrado para la recolección de células cada vez más de los productos actuales de la placa de apilado.

Sistema de célula cerrada Cultura protocolo mediante buques HyperStack con la tecnología de materiales permeables al gas

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice.   ...

closed-system-cell-culture-protocol-using-hyperstack-vessels-with-gas

Research

JoVE Journal

Biology

18.7K vistas.  Corning Life Science. Una introducción a la tecnología, el protocolo y el manejo de los vasos Corning HyperStack y accesorios utilizados para el alto rendimiento de la cultura de células adherentes. El protocolo se mostrará cómo utilizar los vasos sistema cerrado para la recolección de células cada vez más de los productos actuales de la placa de apilado.

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Principles of Site-Specific Recombinase (SSR) Technology

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular biology. Site-specific recombinases are proteins that bind to distinct DNA target sequences. The Cre/lox system was first described in bacteriophages during the 1980's. Cre recombinase is a Type I topoisomerase that catalyzes site-specific recombination of DNA between two loxP (locus of X-over P1) sites. The Cre/lox system does not require any cofactors. LoxP sequences contain distinct binding sites for Cre recombinases that surround a directional core sequence where recombination and rearrangement takes place. When cells contain loxP sites and express the Cre recombinase, a recombination event occurs. Double-stranded DNA is cut at both loxP sites by the Cre recombinase, rearranged, and ligated ("scissors and glue"). Products of the recombination event depend on the relative orientation of the asymmetric sequences.
SSR technology is frequently used as a tool to explore gene function. Here the gene of interest is flanked with Cre target sites loxP ("floxed"). Animals are then crossed with animals expressing the Cre recombinase under the control of a tissue-specific promoter. In tissues that express the Cre recombinase it binds to target sequences and excises the floxed gene. Controlled gene deletion allows the investigation of gene function in specific tissues and at distinct time points. Analysis of gene function employing SSR technology --- conditional mutagenesis -- has significant advantages over traditional knock-outs where gene deletion is frequently lethal.

Principles of Site-Specific Recombinase SSR Technology

The advent of site-specific recombinase (SSR) technology and the Cre/lox system has led to numerous advances in molecular biology, and has proven itself as a valuable tool for assessing gene function in transgenic animals. This interview discusses the mechanism of site specific recombination by Cyclization recombinase (Cre) and how the use of this enzyme has led to the development of conditional mutagenesis, which has significant advantages over traditional knock out strategies.

Principios de la recombinasa específica de sitio (RSS) Tecnología

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular ...

Investigación

Biología

Engineering Cell-permeable Protein

The protein transduction technique enables the direct delivery of biologically active material into mammalian cells [for review see 1,2]. For this one can make use of the translocating ability of so-called cell penetrating peptides (CPPs), also designated as protein transduction domains (PTDs). The TAT-CPP derived from the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Tat (trans-activator of transcription) protein has been widely used. The positively charged TAT promotes cell permeability thereby overcoming the barriers of the cellular membrane by endocytosis or/and direct membrane penetration2. In combination with a nuclear localization signal (NLS) fusion proteins are able to enter the nucleus exhibiting functionality. Our video presentation demonstrates, as an exemplification for the engineering of cell-permeable proteins, the construction, production and application of a cell-permeable version of the DNA-modifying enzyme Cre.
Cre is a site-specific recombinase that is able to recognize and recombine 34 base pair loxP sites in mammalian cells in vitro and in vivo. Therefore the Cre/loxP system is widely used to conditionally induce mutations in the genome of living cells3,4. The delivery of active Cre recombinase to cells, however, represents a limitation.
We describe the pSESAME vector system, which allows a direct insertion of the gene-of-interest and provides a platform to rapidly clone different domains and tags used within the vector in a convenient and standardized manner. Rearranging of the different tags has been shown to modify the biochemical properties of the fusion proteins providing a possibility to achieve higher yield and better solubility. We demonstrate how to express and purify recombinant cell-permeant proteins in and from E. coli. The functionality of the recombinant Cre protein is finally validated in cell culture by assessing its intracellular recombinase activity.

Protein transduction enables the direct delivery of biologically active proteins into cells. In contrast to conventional methods such as DNA transfection or viral transduction this non-invasive paradigm allows highly efficient cellular manipulation in a titratable manner circumventing cellular toxicity and the risk of oncogenic transformation by permanent genetic modification.

Ingeniería penetran en las células de proteínas

The protein transduction technique enables the direct delivery of biologically active material into mammalian cells [for review see 1,2]. For this one can ...

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development and growth of mammalian embryos are critically dependent on the function of the placenta, WEC technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages during embryonic day (E) 6.5-E12.5 in the mouse or E8.5-E14.5 in the rat 2, 3, 4. In WEC, we can directly target desired areas of embryos using fine glass capillaries because embryos can be manipulated under the microscope. Therefore, rodent WEC is very useful technique when we want to study dynamic developmental processes of postimplanted mammalian embryos. Up to date, several types of WEC systems have been developed 1. Among those, the rotator-type bottle culture system is most popular and suitable for long-term culture of embryos at midgestation, i.e., after E9.5 and E11.5 in the mouse and rat, respectively 1. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat WEC after E12.5 using a refined model of the original rotator system, which was designed by New and Cockroft 5, 6, and introduce various applications of WEC technique for studies in mammalian developmental biology.

Whole embryo culture technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat whole embryo culture after E12.5 using the rotator-type bottle culture system.

El método de cultivo de embriones de roedores enteros utilizando el sistema de tipo de botella rotador Cultura

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

Determining Cell Number During Cell Culture using the Scepter Cell Counter

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and accuracy. Cell counts are important for monitoring cell health and proliferation rate, assessing immortalization or transformation, seeding cells for subsequent experiments, transfection or infection, and preparing for cell-based assays. It is important that cell counts be accurate, consistent, and fast, particularly for quantitative measurements of cellular responses.
Despite this need for speed and accuracy in cell counting, 71% of 400 researchers surveyed1 who count cells using a hemocytometer. While hemocytometry is inexpensive, it is laborious and subject to user bias and misuse, which results in inaccurate counts. Hemocytometers are made of special optical glass on which cell suspensions are loaded in specified volumes and counted under a microscope. Sources of errors in hemocytometry include: uneven cell distribution in the sample, too many or too few cells in the sample, subjective decisions as to whether a given cell falls within the defined counting area, contamination of the hemocytometer, user-to-user variation, and variation of hemocytometer filling rate2.
To alleviate the tedium associated with manual counting, 29% of researchers count cells using automated cell counting devices; these include vision-based counters, systems that detect cells using the Coulter principle, or flow cytometry1. For most researchers, the main barrier to using an automated system is the price associated with these large benchtop instruments1.
The Scepter cell counter is an automated handheld device that offers the automation and accuracy of Coulter counting at a relatively low cost. The system employs the Coulter principle of impedance-based particle detection3 in a miniaturized format using a combination of analog and digital hardware for sensing, signal processing, data storage, and graphical display. The disposable tip is engineered with a microfabricated, cell- sensing zone that enables discrimination by cell size and cell volume at sub-micron and sub-picoliter resolution. Enhanced with precision liquid-handling channels and electronics, the Scepter cell counter reports cell population statistics graphically displayed as a histogram.

The Scepter Cell Counter is a handheld automated device that can be used to count cells, monitor cell diameter and volume, and be used to check the health and quality of cellular populations from one culture to the next.

Determinar el número de células durante el cultivo celular utilizando el contador de células Cetro

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and ...

A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids can lead to severe side effects. Test systems are needed to search for novel compounds influencing glucocorticoid signaling in vivo or to determine unwanted effects of compounds on the glucocorticoid signaling pathway. We have established a transgenic zebrafish assay which allows the measurement of glucocorticoid signaling activity in vivo and in real-time, the GRIZLY assay (Glucocorticoid Responsive In vivo Zebrafish Luciferase activitY). The luciferase-based assay detects effects on glucocorticoid signaling with high sensitivity and specificity, including effects by compounds that require metabolization or affect endogenous glucocorticoid production. We present here a detailed protocol for conducting chemical screens with this assay. We describe data acquisition, normalization, and analysis, placing a focus on quality control and data visualization. The assay provides a simple, time-resolved, and quantitative readout. It can be operated as a stand-alone platform, but is also easily integrated into high-throughput screening workflows. It furthermore allows for many applications beyond chemical screening, such as environmental monitoring of endocrine disruptors or stress research.

We describe the procedure and data analysis of a chemical screening system for glucocorticoid stress hormone signaling using zebrafish larvae: the Glucocorticoid Responsive In vivo Zebrafish Luciferase activitY (GRIZLY) assay. The assay sensitively and specifically detects effects on glucocorticoid signaling by compounds that require metabolization or affect endogenous glucocorticoid production.

Un procedimiento de detección química de glucocorticoides Señalización con un sistema indicador de pez cebra Larva luciferasa

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are produced by differentiated thyrocytes, organized in closed spheres called follicles, while calcitonin is synthesized by C-cells, interspersed in between the follicles and a dense network of blood capillaries. Although adult thyroid architecture and functions have been extensively described and studied, the formation of the &#8220;angio-follicular&#8221; units, the distribution of C-cells in the parenchyma and the paracrine communications between epithelial and endothelial cells is far from being understood.
This method describes the sequential steps of mouse embryonic thyroid anlagen dissection and its culture on semiporous filters or on microscopy plastic slides. Within a period of four days, this culture system faithfully recapitulates in vivo thyroid development. Indeed, (i) bilobation of the organ occurs (for e12.5 explants), (ii) thyrocytes precursors organize into follicles and polarize, (iii) thyrocytes and C-cells differentiate, and (iv) endothelial cells present in the microdissected tissue proliferate, migrate into the thyroid lobes, and closely associate with the epithelial cells, as they do in vivo.
Thyroid tissues can be obtained from wild type, knockout or fluorescent transgenic embryos. Moreover, explants culture can be manipulated by addition of inhibitors, blocking antibodies, growth factors, or even cells or conditioned medium. Ex vivo development can be analyzed in real-time, or at any time of the culture by immunostaining and RT-qPCR.
In conclusion, thyroid explant culture combined with downstream whole-mount or on sections imaging and gene expression profiling provides a powerful system for manipulating and studying morphogenetic and differentiation events of thyroid organogenesis.

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.

Un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Sistema de Cultura para estudiar el desarrollo de la tiroides

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding primary 3D epithelial structures in vitro. Both the architecture and physiological properties of these &#39;mini-guts&#39;, also called organoids, closely resemble their in vivo counterparts. This makes them an attractive model system for the small intestinal epithelium. Using retroviral transduction, functional genetics can now be performed by conditional gene overexpression or knockdown. This video demonstrates the procedure of organoid culture, the generation of retroviruses, and the retroviral transduction of organoids to assist phenotypic analysis of the small intestinal epithelium in vitro. This novel organotypic model system in combination with retroviral mediated gene expression provides a valuable tool for rapid analysis of gene function in vitro without the need of costly and time-consuming generation for transgenic animals.

This protocol explains primary Lgr5-positve organoid culture and the subsequent performance of retroviral transduction. This enables Cre-inducible overexpression or knockdown of the delivered transgene and allows functional studies to be carried out in the novel in vitro organotypic model system.

Un Protocolo de vídeo de la infección retroviral en Primaria Intestinal organoide Cultura

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Zinc-finger domains are intrinsically cell-permeable and capable of mediating protein delivery into a broad range of mammalian cell types. Here, a detailed step-by-step protocol for implementing zinc-finger technology for intracellular protein delivery is presented.

Proteína entrega directa de células de mamíferos Utilización de Células permeable Cys<sub&gt; 2</sub&gt; -Su<sub&gt; 2</sub&gt; Dominios de zinc-finger

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

Desarrollo de un Sistema de inserción Co-cultivo de dos tipos celulares en ausencia de la célula-célula Contacto

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the invasion of non-indigenous species. However, an exact identification of field predator-prey interactions is difficult in many cases. These analyses are often based on a visual evaluation of gut content or the analysis of stable isotope ratios (&#948;15N and &#948;13C). Such methods require comprehensive knowledge about, respectively, morphologic diversity or isotopic signature from individual prey organisms, leading to obstacles in the exact identification of prey organisms. Visual gut content analyses especially underestimate soft bodied prey organisms, because maceration, ingestion and digestion of prey organisms make identification of specific species difficult. Hence, polymerase chain reaction (PCR) based strategies, for example the use of group-specific primer sets, provide a powerful tool for the investigation of food web interactions. Here, we describe detailed protocols to investigate the gut contents of macroinvertebrate consumers from the field using group-specific primer sets for nuclear ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA). DNA can be extracted either from whole specimens (in the case of small taxa) or out of gut contents of specimens collected in the field. Presence and functional efficiency of the DNA templates need to be confirmed directly from the tested individual using universal primer sets targeting the respective subunit of DNA. We also demonstrate that consumed prey can be determined further down to species level via PCR with unmodified group-specific primers combined with subsequent single strand conformation polymorphism (SSCP) analyses using polyacrylamide gels. Furthermore, we show that the use of different fluorescent dyes as labels enables parallel screening for DNA fragments of different prey groups from multiple gut content samples via automated fragment analysis.

Most common gut content analyses of macroinvertebrates are visual. Requiring intense knowledge about morphological diversity of prey organisms, they miss soft bodied prey and, due to strong comminution of prey, are nearly impossible for some organisms, including amphipods. We provide detailed, novel genetic approaches for macroinvertebrate prey identification in the diet of amphipods.

Protocolo de laboratorio para análisis genéticos de contenido intestinal de macroinvertebrados acuáticos con grupo-específica rDNA cartillas

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...