El Procedimiento Alvar Gaaud es aplicar estimulación de corriente directa transcraneal en ratones. Esto se logra mediante la generación de corrientes intensas bajas a partir de un generador de corriente directa, y enviarlo directamente al animal a través de electrodos. tDCS se ha investigado como una alternativa terapéutica no farmacológica para los principales trastornos psiquiátricos en los seres humanos, como depresión, esquizofrenia, enfermedad de Alzheimer, AHDH, y autismo.
Además, tDCS es una técnica única debido a su bajo costo, facilidad de uso y perfil no invasivo. Sin embargo, los efectos biológicos de tDCS no se entienden del todo, y no hay consenso con respecto a los parámetros de estimulación, como la intensidad actual, la duración y el azulejo de las áreas cerebrales. Por lo tanto, el uso de órdenes mínimas es esencial para un estudio exhaustivo de tales mecanismos, lo que conducirá a una mejor comprensión de la eficacia clínica de tDCS a través de la adquisición y análisis de datos celulares y moleculares del comportamiento.
Actualmente hay dos configuraciones de electrodos para tDCS, denominadas estimulación anodal y cathodal. En la estimulación anodal, las corrientes se entregan directamente a la cabeza del animal, a través del cuerpo del animal, y en el cátodo colocado en el tórax del animal. Mientras que en la estimulación catódica la corriente entra a través del tórax del animal, viaja hasta su cabeza y hacia el cátodo.
En ambas situaciones, un generador de corriente controla la intensidad actual y la duración de la estimulación. Mientras se produce una calidad de contacto e inferir comentarios. Hay muchas configuraciones diferentes para el posicionamiento activo.
Por lo tanto, todo el eje tridimensional debe tenerse en cuenta. En este protocolo se implantó un electrodo de cabeza de un milímetro en bregma enraado, en la línea lateral a media del cráneo, y el electrodo del cuerpo se posicionó en el pecho del animal. Debido a una simulación de corto período, se recomendó utilizar una acción rápida y anestesia a corto plazo, como isoflurano vaporizado.
Este procedimiento se compone de dos pasos críticos. Colocación de electrodos y estimulación de corriente directa transcraneal. Los instrumentos quirúrgicos fueron esterilizados con pre-mantenimiento a 440 grados Celsius.
Los hisopos de algodón se autoclavieron a 20 libras por pulgada cuadrada a 121 grados centígrados durante 20 minutos. Gire el controlador de plataforma térmica a 37 grados centígrados. Pesar el animal, y calcular la dosis adecuada para la inducción de la anestesia.
Utilice una mezcla de ketamina y xilazina a una dosis de 100 miligramos por kilogramo de ketamina, y 8 miligramos por kilogramo de xilazina. Tamaño de la aguja 31G. El animal debe dormirse en un plazo de 2 a 3 minutos.
Use una afeitadora eléctrica o una maquinilla de afeitar para afeitar el sitio quirúrgico. Coloque el animal en el aparato estereotaxico sobre la placa calefactora precalentada. Sostenga la cabeza del animal e inserte las barras de la oreja de la punta en cada una de las orejas del animal, para fijarla a la plataforma esteterotaxica.
Verifique que no haya desplazamiento lateral de la cabeza, y poco movimiento vertical cambiando lentamente la cabeza del animal. Deslice suavemente la máscara de anestesia sobre la nariz del ratón y fíjelo en su lugar apretando el tornillo. Aplique pomada ocular en los ojos del animal para evitar el secado de la córnea durante la cirugía.
Utilice un hisopo de algodón para preparar el sitio quirúrgico con tres exfoliantes alternos de yodo de povidona, o 2%clorohexidina y 70%ethinol. Utilice un par de pinzas para verificar la adopción de la anestesia apretando ligeramente los dedos de los dedos del animal, y verificando las leyes del reflejo de pellizcar general de la abstinencia de animal. Haga una incisión unos tres milímetros después de la oreja del animal, y deténgase en la línea del ojo.
El sitio de la incisión debe tener aproximadamente un centímetro de longitud para ser lo suficientemente grande como para recibir el implante. Raspa suavemente el cráneo con un rascador óseo para mejorar la adherencia del pegamento y el cemento. Esto debe hacerse a mano ligera con la intención de crear micro-arañazos.
Coloque cuidadosamente los ganchos quirúrgicos en la piel suelta para mantener un campo quirúrgico abierto y liberarlo de obstrucciones, como la piel y el pelaje. Use un hisopo de algodón estéril para secar suavemente el cuero cabelludo del animal. Utilice un microscopio de disección para visualizar la parte superior del cráneo del animal.
Coloque una aguja en el soporte esterotaxico y localice el bregma. Coloque la aguja directamente sobre la cabeza del animal tocando ligeramente el bregma. Utilice el bregma como referencia para ajustar las coordenadas del área de interés.
Fije el implante en el soporte estereotaxico. Coloque el implante sobre la cabeza del animal y óselo lentamente sobre la región de interés. Utilice una aguja para esparcir una gota, aproximadamente 35 microlitros, de superpegamento en el espacio del implante.
Mueva lentamente el soporte hacia abajo hasta que toque el cráneo. Asegúrese de que el espacio del implante esté completamente en contacto con la superficie. Preparar el cemento quirúrgico de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Después de un posicionamiento preciso, aplique tres capas delgadas y uniformes de cemento a través del cráneo, y en la parte inferior del implante. Aplique drop per drop mediante un pincel de aplicación. Las capas deben formar una estructura en forma de U para un mayor soporte estructural del implante.
Deje la rosca de tornillo del implante limpia de cemento para permitir una conexión suave y sin obstáculos. Deje que cada capa se seque durante aproximadamente cuatro minutos. Después del secado, retire cuidadosamente el soporte hasta que se desprenda completamente del implante.
Tenga siempre mucho cuidado al manipular el implante, ya que podría ser destruido accidentalmente del cráneo del animal. Hidrata la piel y el lugar de la incisión del animal con un hisopo de algodón empapado en solución salina. Corte la piel sobre la base del implante.
Utilice un par de pinzas para unir el tejido y cierre la incisión con una gota de pegamento quirúrgico de tejido por punto 2 centímetros de tejido. Infiltrar de 1 a 2%lidocaína en el lugar de la incisión y los tejidos subyacentes. Hidratar al animal con 500 microlitros de anillo de lactato simultáneamente.
Coloque el ratón en una jaula de una sola casa precalentada de 37 grados Celsius. Construir un pequeño plato de pellets de alimentos húmedos en la jaula, para un fácil acceso a los alimentos en las siguientes horas. Registre el peso post quirúrgico del animal.
El animal debe administrarse con ketoprofeno. 5 miligramos por kilogramo simultáneamente después de la cirugía y durante los próximos dos días. Asegúrese de que el estimulador tDCS esté completamente cargado.
Conecte los cables de ánodo y cátodo al estimulador tDCS y hágalos disponibles cerca del sitio de simulación. Fije el electrodo de tipo pin al soporte esteterotaxico. Ajuste la plataforma térmica a 37 grados centígrados.
Encienda el caudalímetro de oxígeno en el sistema de anestesia por inhalación a 1 litro por minuto. Coloque el ratón en la cámara de inducción de anestesia. Encienda el vaporizador de isoflurano al 3%Permitir que el animal se someta a efectos de isoflurano durante cuatro minutos.
Mientras el animal está en la cámara de inducción, utilice una jeringa estéril para llenar el electrodo del cuerpo con una solución salina del 0,9%. Retire al animal de la cámara de inducción y coloque su pecho sobre el electrodo del cuerpo. Deslice suavemente la máscara de anestesia sobre la nariz del ratón y fíjelo en su lugar.
Bajar la salida de isoflurano a 1.5%Llenar el implante y el electrodo tipo pin con solución salina. Adjúntalos cuidadosamente. Ajuste el tiempo de estimulación y la intensidad actual de acuerdo con su protocolo.
Verifique la calidad del contacto en el sistema tDCS más adelante. Inicie la estimulación. Observe la rampa actual durante 20 segundos hasta el valor seleccionado.
Y mantenerse en su lugar por el tiempo establecido. Luego, al final de la sección bajando de nuevo. Active el botón de espinilla para controlarlo.
Observe la rampa actual durante 20 segundos hasta el valor seleccionado. Y luego abajo uno por el resto del período de estimulación, con una rampa final al valor seleccionado, al final, con un aumento consecutivo hacia abajo. Una de las secciones de estimulación está completa, transfiera cuidadosamente al animal a una jaula precale calentada de 37 grados Celsius durante 10 minutos.
Este protocolo utiliza tDCS para estimular la corteza cerebral del ratón un milímetro antes del bregma. Este gráfico muestra la expresión estadística y génica después del protocolo de estimulación tDCS. Usando una intensidad de corriente de 0,35 miliamperios durante 10 minutos por día.
El implante tCDS presentó auto viable desde el primer día hasta el quinto sin diferencia significativa entre los días en calidad de contacto. Hay una variedad de protocolos de estimulación tCDS en cerebros modelo. Los protocolos deben elegirse de acuerdo con las particularidades de su experimento se basa en.
Zona de estimulación, intensidad actual, duración de la sesión y posicionamiento de electrodos. En este protocolo en particular, nuestro objetivo era modular la corteza motora a través de nuestro conocido tDCS con la corriente de 350 microamperios durante 10 minutos. Después de ver este video usted será capaz de realizar tDCS en ratones.
Cuando alguien practica la cirugía puede tomar hasta cuatro minutos por animal. Es esencial tener en cuenta las pautas de cuidado animal al utilizar los ratones durante la operación y seguir el cuidado postquirúrgico a los animales para que los animales se mantengan saludables durante el estudio. También recomendamos esperar de cinco a siete días después de la colocación del implante para realizar los experimentos, ya que la respuesta fisiológica del animal al trauma puede interferir con los resultados biológicos.
