Este trabajo fue apoyado por una Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá (NSERC) Descubrimiento de Grant # 40352, Campus de Alberta por Presidente del Programa Innovación, Programa de Investigación de Alzheimer Alberta a MHM, y CRSNG crear en BIF beca de doctorado y AIHS beca de postgrado en MK. Agradecemos a Pu Min Wang para el desarrollo de este protocolo y para el entrenamiento quirúrgico y Behroo Mirza Agha y Di Shao para la cría.

<html> El siguiente protocolo sigue la Universidad de Lethbridge Cuidado de Animales (ACC) directrices, y se lleva a cabo de acuerdo con las normas del Consejo Canadiense de los Animales (CCAC). 1. Preparación <ol><li> Para los períodos de estudio prolongados, autoclave todos los suministros quirúrgicos abiertos y asegurar que se mantiene la esterilidad durante toda la cirugía. Si se requieren múltiples cirugías, autoclave entre cirugías. </li><li> Asegúrese de que hay un montón de tampón de cerebro en la mano (por lo menos 50 ml). La solución está compuesta de cloruro de 134 mM de sodio, de potasio 5,4 mM, 1 mM cloruro de magnesio hexahidratado, 1,8 mM de dihidrato de cloruro de calcio, y 5 mM de HEPES de sodio, pH equilibrado a 7,4 con cloruro de 5 M de hidrógeno. </li><li> Coloque el ratón en una cámara de inducción y anestesiar con 3 - 4% de isoflurano. Siga con 1,0 - 2,0% de isoflurano para el mantenimiento durante la cirugía. Además de reducir hasta un mínimo de 0,4 a 0,8% durante la exploracións = &quot;xref&quot;&gt; 5, 13, 14, 15, proporcionado anestesia adecuada se mantiene. Estos bajos niveles de anestesia requieren la supervisión vigilante y frecuente del ratón (aproximadamente cada 5 min) para asegurar que permanece arrefléxica a los estímulos dolorosos. NOTA: La deshidratación puede llegar a ser problemática debido a la alta proporción de superficie a volumen del ratón y agravada por el uso prolongado de isoflurano. <ol><li> Utilice inyecciones subcutáneas de solución salina, 0,1 ml por 10 g de peso corporal, cada 1 - 2 h. Cuando adecuadamente hidratado, el ratón orinar una vez cada 1 - 2 h. </li></ol></li><li> Vigilar de cerca el ratón para asegurar la anestesia consistentes a lo largo de la cirugía y de imagen. No deje desatendido el ratón y cuidar de que nunca recupere la conciencia. </li><li> Transferir el ratón anestesiado a la cabeza porta-configuración y el lugar en una almohadilla de calefacción termo-regulación ajustado a 37 ° C. Asegurar los teet superioresh en un soporte de los dientes. </li><li> Girar la cabeza del ratón hacia la izquierda aproximadamente 30 ° para exponer el lado lateral derecho de la cabeza y asegure la cabeza del ratón con el extremo romo de barras del oído (Figura 1A). </li><li> Aplicar pomada oftálmica para evitar el secado de la córnea. </li><li> Para reducir el edema cerebral, inyectar dexametasona (4 mg / kg) por vía intramuscular. </li><li> Limpiar la piel sobre el área quirúrgica con hisopos de algodón humedecido en 4% de clorhexidina (3 veces) y 70% de etanol (3 veces). Use cada hisopo de algodón sólo una vez. </li><li> Don guantes quirúrgicos y cubrir el animal con una envoltura de plástico adhesivo. Proporcionar anestésico local mediante la inyección de lidocaína (8 - 10 mg / kg; 2% epinefrina) por vía subcutánea sobre el sitio de la craneotomía. Espere entre 3 - 5 min para que el fármaco sea absorbido en el tejido. </li></ol> 2. Extracción de la piel y retraer el músculo del cráneo <ol><li> Realizar casi todos estos procedimientos mientras se visualiza el cráneo bajo unamicroscopio de disección (por ejemplo, 0,7 - 4.5X de potencia, dependiendo de la situación). </li><li> Levante la piel de 1 mm a la izquierda de la línea media (justo detrás de la oreja) con unas pinzas y hacer una pequeña incisión horizontal con tijeras quirúrgicas. </li><li> Hacer un 5 - corte lateral 6 mm hacia la oreja derecha, y luego se corta hacia el extremo rostral de la cabeza. </li><li> En el punto de incisión inicial, insertar las tijeras y cortar 10 mm rostral. </li><li> Cortar la piel alrededor de la oreja derecha y cerca del ojo derecho para exponer el lado derecho del cráneo y el músculo temporal. Asegúrese de que la parte más ancha de la zona expuesta es al menos 7 mm. Recorte la piel aún más si el área quirúrgica tiene que ampliarse. </li><li> Fijar la piel alrededor de la incisión poniendo unas gotas de pegamento de cianoacrilato de butilo entre el cráneo y la piel. Asegúrese de que el tejido ha sido previamente secado con aplicadores con punta de algodón o tejidos laminados para aumentar la eficacia del adhesivo. </li><li> El uso de un hisopo de algodón, frotar la superficiedel cráneo en un movimiento circular para eliminar el periostio del cráneo. Asegúrese de que no quede ninguno por secado del cráneo por completo. </li><li> Usando tijeras de primavera y fórceps, separar el músculo temporal del cráneo; cortar y retraer el músculo lateralmente hasta alcanzar el hueso escamoso (Figura 1C). Tenga mucho cuidado de no dañar la vena temporal superficial que corre a lo largo del nivel del hueso escamoso cerca del ojo, de lo contrario podría ocurrir una hemorragia. </li><li> Control de sangrado con espuma de gel pre-empapado en tampón cerebro. Para una hemorragia seria utilizar un cauterizador de calor. Caída de butil cianoacrilato pegamento en los puntos de hemorragia después del tratamiento con el cauterizador calor. Asegúrese de que la zona se seca previamente mediante el uso de aplicadores con punta de algodón o tejidos laminados para aumentar la eficacia del adhesivo. </li></ol> 3. La craneotomía NOTA: El cirujano debe seguir siendo diligente durante la extracción del cráneo yDura para evitar complicaciones innecesarias. pasos para solucionar problemas se incluyen si se presenta complicaciones. <ol><li> Marcar la ubicación de bregma ya sea con un marcador de punta fina o cortar una cinta pequeña pieza triangular y señalar una esquina en bregma (Figura 2A) para orientar las regiones cerebrales subyacentes. </li><li> Antes de la colocación de la placa de cabeza asegurar el cráneo esté completamente seco. El cráneo se transmitirá rápidamente seca después de la aplicación de la espuma de gel empapada en tampón cerebro, si se necesita más de secado, utilice hisopos con punta de algodón. Este paso es crucial para la fijación placa de cabeza (Figura 1B). NOTA: Si hay periostio izquierda en el cráneo, o si el cráneo no está seca antes de pegar en la placa de cabeza, es probable que se desprenda. Si esto ocurre, retire con cuidado la placa de cabeza y empezar de nuevo. El sangrado puede ocurrir durante este proceso; permitir que unos pocos minutos para que se coagule, y luego eliminar suavemente. No se recomienda que este proceso se repitió dos veces más. </li> &lt;li&gt; Aplicar pegamento de cianoacrilato de etilo alrededor del borde inferior de la placa de cabeza 16, y la cola de la placa de cabeza por encima del área de craneotomía (Figura 1D y figura 2A). </li><li> Llenar el espacio de abertura entre la placa y la cabeza del cráneo con cemento dental dejando sólo el área expuesta craneotomía. Esperar a que el cemento dental para secar y endurecer, típicamente de 5 - 10 min (Figura 2B). <ol><li> Una vez ajustado el cemento, llenar brevemente el bien con tampón de cerebro y permitir a remojo durante 3 - 5 min. Utilice un tejido laminado para eliminar el tampón de cerebro antes de perforar (Figura 2C). </li></ol></li><li> Esquema de la zona quirúrgica mediante la ligera anotando la superficie del cráneo con un taladro dental. Use un taladro neumático (ajustado al máximo de 20 PSI), con un FG ¼ rebabas, y controlado con un pedal de velocidad variable. </li><li> trazar suavemente la perforación a lo largo de la puntuación original de profundizar en ella, esegurar el taladro no penetra a través del cráneo en el cerebro (Figura 2D). Por turnos cada pocos minutos entre la perforación y frotando la superficie del cráneo con los tejidos laminados humedecidos. Esto reducirá calentamiento y secado del cráneo de la fricción mecánica y la exposición prolongada. NOTA: El cráneo se transmitirá rápidamente seca después de la aplicación de la espuma de gel húmedo. Si se necesita más de secado, utilice hisopos con punta de algodón. Precaución: El cráneo es irregular en espesor. Por ejemplo, la cresta parietal-temporal es el área más gruesa, mientras que las regiones del cráneo cerca de la línea media y monumentos escamoso son relativamente delgadas. </li><li> Durante la perforación, comprobar periódicamente si el pandeo del cráneo presionando suavemente sobre ella con fórceps o la broca de perforación que no se mueve. Cuando el hueso comienza a ceder, dejar de perforación y sumerja toda la ventana en tampón cerebro. NOTA: Si la sangre se precipita fuera de un área, se puede sugerir que la duramadre se ha dañado. Si este es el caso, colocar una semi-húmedo de espuma de gel sobre el área y trato de absorber la sangre mientras se aplica una presión suave a la espuma de gel con un hisopo de punta de algodón. </li><li> Espere por lo menos 5 min antes de la retirada del cráneo para ablandar el hueso y para reducir la posibilidad de la duramadre que se pega al hueso, haciendo que el proceso de eliminación de cráneo más fácil. </li><li> Realizar el proceso de eliminación del cráneo, mientras que el cráneo se sumerge en tampón cerebro. NOTA: Si una porción del cráneo permanece obstinadamente unido, una hoja de bisturí # 11 se puede utilizar para marcar suavemente el cráneo. Tenga mucho cuidado para no romper la hoja a través del cráneo y en el cerebro. </li><li> Comenzando desde el borde anterior, palanca suavemente el cráneo flojo de la duramadre el uso de fórceps. NOTA: Si una pequeña cantidad de sangrado se produce durante el proceso de eliminación cráneo, eliminar el tampón con una pipeta de transferencia o una jeringa, y luego vuelva a colocar con tampón nuevo. </li><li> Una vez que el hueso está suelto y &quot;flotantes&quot; en la duramadre, sujete firmemente el hueso con unas pinzas y levantar el hueso dela duramadre. Asegúrese de que el hueso no penetra en el cerebro. </li><li> Para controlar el sangrado, el rollo de esquina de un tejido en un punto y eliminar la mayor parte de la memoria intermedia del pozo craneal. Aplicar rápidamente espuma de gel, pre-empapados en tampón, a la zona de sangrado mientras que la adición de una presión muy ligera con un hisopo de punta de algodón. NOTA: El sangrado por lo general viene desde el borde del hueso o la superficie de la duramadre; ambos casos son normales y el sangrado se detendrá rápidamente si no hay vasos sanguíneos principales están dañados. Si el sangrado continúa, la sangre puede llenar toda la ventana, formando una hoja de coágulo sobre la superficie de imágenes. <ol><li> Para quitar la hoja de coágulo, cuidadosamente recoger piezas de sangre coagulada de la zona de formación de imágenes mientras se deja el coágulo de sangre intacta alrededor de la fuente del vaso sanguíneo roto. Tenga cuidado de no eliminar el coágulo de sangre procedente de la fuente de sangrado ya que esto puede causar aún más la pérdida de sangre. Irrigar la superficie del cerebro con tampón de cerebro para eliminar cualquier sangre. </li><li> Tenga cuidado de no tocar ladelicado tejido cerebral o la adición de material extraño al cerebro; repetir hasta que el sangrado se ha detenido, durante aproximadamente 2 - 5 min (Figura 2E). NOTA: En este punto, la craneotomía está listo para la preparación de la ventana craneal (ver paso 5). Si es necesario, retire la duramadre antes de implantar la ventana craneal (ver paso 4). </li></ol></li></ol> 4. Eliminación Dura NOTA: la eliminación Dura requiere extremo cuidado y puede tomar más de 15 minutos. <ol><li> Dibuje el exceso de tampón de la craneotomía. Mientras se mantiene una superficie húmeda, agarra un pequeño trozo de duramadre con fórceps y rasgar suavemente la duramadre. </li><li> El uso de fórceps y tijeras de primavera de rasgar y cortar la duramadre con suavidad. </li><li> Caer más memoria intermedia del cerebro en la superficie del cerebro para flotar la duramadre y evitarlo separado del cerebro. Continúe hasta que todos duramadre se retira del sitio ventana del cráneo. Cuando se realiza correctamente el cerebro parece ser muy limpio, con distinta blvasos OOD y sin manchas (comparar Figura 2E con 2F). Precaución: Algunas áreas de la duramadre están asociadas a las pequeñas arteriolas en la superficie del cerebro (por ejemplo, cerca de la línea media proximal a la zona de asociación parietal), y la eliminación de tales pueden romperse la arteriola. En tales casos, puede ser mejor dejar un pequeño trozo de duramadre intacta sobre la parte superior de la arteriola. El variador de velocidad no puede penetrar esa zona pequeña, pero esto se prefiere tener hemorragia mayor. </li><li> Fix la superficie del cerebro en agarosa tan pronto como sea posible para minimizar el movimiento de pulsación y para prevenir una mayor hinchazón (ver paso 5). </li></ol> 5. Preparar craneal ventana <ol><li> Pulverizar la cubierta de vidrio con 70% de etanol y el uso de un bote de aire para secar suavemente. Asegúrese de que el cristal está completamente limpio, sin manchas o polvo presente. </li><li> Preparar 1,3% de agarosa por calentamiento de 200 mg de polvo de agarosa disueltos en 15 ml de tampón de cerebro. Ajuste el microwAVE a alta y el calor durante 10 - 15 s a la vez, se agita suavemente en el medio, hasta que se disuelve todo el agar. Nota: Asegúrese de que no burbujas o partículas están presentes, ya que estos interfieren con formación de imágenes. </li><li> Coloque un termómetro en la agarosa caliente y enfriar la agarosa hasta justo encima de la temperatura de solidificación (~ 40 ° C). NOTA: correr agua fría sobre el exterior del recipiente de agarosa puede acelerar el proceso de enfriamiento. Remover suavemente de forma continua para asegurar que no burbujas o partículas están presentes. </li><li> Inmediatamente antes de aplicar el agar, eliminar el tampón cerebro del pozo craneal. Elaborar la agarosa con una pipeta de transferencia y soltar la agarosa directamente sobre el cerebro. colocar rápidamente la hoja de la cubierta sobre la superficie y fijación de la hoja de la cubierta con agarosa gotas en las esquinas. </li></ol> 6. La eutanasia NOTA: los cirujanos En nuestra experiencia, este procedimiento toma experimentado al menos 3 - 4 cirugías de práctica para alcanzar más de un 90%tasa de éxito. Menos cirujanos experimentados pueden requerir aún más práctica. Durante la craneotomía o durotomía, el cerebro puede sufrir daños, tales como si los punzones de perforación a través del hueso en el cerebro. Algunos daños menores en el borde de la craneotomía puede ser permisible. Sin embargo, si el cerebro no se ve &quot;limpia&quot; con los vasos sanguíneos no dañados de color rojo brillante y la corteza blanca, puede necesitar ser terminado el experimento. Los ejemplos de preparaciones pobres son aquellos con los vasos sanguíneos muertos, o cuando la corteza está marcado con vasos sanguíneos rotos o dañados. Si alguno de estos síntomas están presentes, el experimento improbable dió datos de alta calidad. Si la cirugía / experimento tuvo éxito o no, con humanidad sacrificar al ratón en la realización del experimento. <ol><li> Profundamente anestesiar con al menos 3,5% de isoflurano. A continuación, dar una inyección intraperitoneal de pentobarbital de sodio a 300 mg / kg. Idealmente, si la aguja se inserta en el hígado, la muerte será muy rápida (&lt;1 min). </li><li> Si se requiere perfusión, verificar que el animal está profundamente anestesiados antes de proceder (véase el paso 1.3). </li><li> Alternativamente, si no se requiere la perfusión, espere un mínimo de 5 minutos y compruebe que el ratón está muerto. Confirmar la ausencia de la respiración, los latidos del corazón, así como una falta de retirada del dolor y los reflejos corneales. También, observar por pálida coloración azul / blanco de las extremidades y el oscurecimiento de los vasos sanguíneos más de la corteza. </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo innovador para una gran ventana craneal permite imágenes simultáneas sobre las áreas temporal y parietal de la corteza cerebral. Combinado con formación de imágenes ópticas, se puede ayudar a revelar la dinámica neurales dentro de las áreas corticales durante la actividad espontánea y estímulo-inducida. Este craneotomía expansiva también expone una gran extensión de la red vasculatura cortical, incluyendo el extremo proximal de la arteria cerebral media (MCA), permitiendo de imágene...

La craneotomía es un procedimiento estándar utilizado por los neurólogos para revelar una porción del cerebro. Desde los albores de la electrofisiología, la craneotomía ha permitido avances sin precedentes en el campo de la neurociencia. mapeo densa de la corteza cerebral con electrodos ha llevado a probar hipótesis experimentos y teorías basadas en estos mapas. Hemos entrado recientemente una nueva era en la que se está utilizando la craneotomía para formación de imágenes in vivo de cortical flujo de sangre 1, 2, 3 y la arquitectura neurovascular 4, lo que permite la visualización en tiempo real de la actividad cortical dentro de las áreas expuestas 5, 6, 7. Aunque muchos estudios utilizan craneotomías combinados con técnicas de formación de imágenes ópticas en vivo para estudiar la estructura y función de las neuronas corticales, células gliales, y corvasculatura tical 8, 9, más investigaciones están limitados por pequeñas áreas de corteza expuesta (pero ver 10). El propósito de este protocolo es proporcionar un método para crear una gran craneotomía lateral, la exposición de la corteza cerebral de la línea media en el hueso escamoso, y que se extiende más allá de bregma y lambda. Esta gran craneotomía permite la visualización simultánea de las cortezas de asociación (retroesplenial, cingulada y parietal), el motor primario y secundario, somatosensorial, visual, y la corteza auditiva. Este método se ha acoplado previamente con imágenes de colorante sensible al voltaje (VSDI) para investigar cómo múltiples áreas corticales interactúan entre sí durante la actividad espontánea y estímulos inducidos cortical 5, 11, 12. Los aspectos más desafiantes de este procedimiento incluyen el posicionamiento de la cabezadel animal, la fijación de la placa de cabeza, y evitar la hemorragia mientras se separa el músculo temporal desde el hueso parietal. También se debe tomar durante los procesos de perforación y de eliminación de cráneo como las curvas de cráneo en un ángulo oblicuo.

<table><tbody><tr><td>Heating Pad</td><td>FHC</td><td>40-90-2</td><td></td></tr><tr><td>Fine Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-09</td><td></td></tr><tr><td>Forceps&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td>2 or more pairs are recommended</td></tr><tr><td>Spring scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00, 15000-10</td><td>1 pair should be designated for dura removal&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Jet tooth shade powder</td><td>LANG Dental</td><td>Jet Tooth Shade Powder</td><td>to be mixed with the Jet Liquid</td></tr><tr><td>Jet tooth shade liquid</td><td>LANG Dental</td><td>Jet Tooth Shade Liquid</td><td>to be mixed wihth the Jet Powder&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Drill Heads - Carbide Burs FG 1/4 389</td><td>Midwest Dental</td><td>385201</td><td></td></tr><tr><td>Agarose Powder</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9793</td><td></td></tr><tr><td>Gelfoam</td><td>Sinclair Dental Canada</td><td>Pfizer Gelfoam</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Western Drug Distribution Centre Ltd</td><td>124125</td><td></td></tr><tr><td>Lidocaine 2% Epinephrine</td><td>Western Drug Distribution Centre Ltd</td><td>125299</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethazone 5&amp;nbsp;mg/mL</td><td>Western Drug Distribution Centre Ltd</td><td>125231</td><td></td></tr><tr><td>Butyl cyanoacrylate glue (VetBond)</td><td>Western Drug Distribution Centre Ltd</td><td>12612</td><td></td></tr></tbody></table>

a large lateral craniotomy procedure for mesoscale wide-field optical imaging of brain activity

La craneotomía es un procedimiento comúnmente realizado para exponer el cerebro para experimentos in vivo. En la investigación de ratón, la mayoría de los laboratorios utilizan un pequeño craneotomía, típicamente 3 mm x 3 mm. Este protocolo presenta un método para crear una ventana craneal sustancialmente mayor 7 mm x 6 mm exponiendo más de un hemisferio cerebral sobre las cortezas temporal y parietal de ratón (por ejemplo, bregma 2.5 a 4.5 mm, lateral 0 - 6 mm). Para realizar esta cirugía, la cabeza debe ser inclinado aproximadamente 30 ° y gran parte del músculo temporal debe ser retraído. Debido a la gran cantidad de eliminación de hueso, este procedimiento es sólo para experimentos agudos con el animal anestesiado durante toda la cirugía y el experimento. La principal ventaja de esta gran ventana craneal lateral innovador es proporcionar acceso simultáneo a las dos áreas medial y lateral de la corteza. Esta gran ventana craneal unilateral puede ser utilizado para estudiar la dinámica de los nervios entre las células,así como entre diferentes áreas corticales mediante la combinación de registros electrofisiológicos de múltiples electrodos, de formación de imágenes de la actividad neuronal (por ejemplo, formación de imágenes, intrínseca o extrínseca), y la estimulación optogenética. Además, este gran craneotomía también expone una gran superficie de los vasos sanguíneos corticales, lo que permite la manipulación directa de la vasculatura cortical lateral.

<html> Para el estudio de las interacciones entre áreas corticales dentro de un solo hemisferio, se utilizó una gran craneotomía extiende a través del seno sagital y 5 - 6 En mm lateral. Esta ventana craneal incluido cortezas de los hemisferios del cerebro derecho (figura 3A) primaria (motor, somatosensorial, visual, auditiva), secundaria (motor, visual), y de asociación (retroesplenial, cingulada, asociación parietal). Para este trabajo se utilizó de ...

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A Large Lateral Craniotomy Procedure for Mesoscale Wide-field Optical Imaging of Brain Activity

Este protocolo presenta un método para crear una gran craneotomía unilateral sobre las regiones temporal y parietal de la corteza cerebral de ratón. Esto es especialmente útil para la formación de imágenes en tiempo real sobre un área expansiva de un hemisferio cortical.

Un procedimiento de craneotomía lateral grande para el campo amplio de mesoescala imágenes ópticas de la actividad cerebral

The craniotomy is a commonly performed procedure to expose the brain for in vivo experiments. In mouse research, most labs utilize a small craniotomy, ...

a-large-lateral-craniotomy-procedure-for-mesoscale-wide-field-optical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.2K vistas.  University of Lethbridge.  Este protocolo presenta un método para crear una gran craneotomía unilateral sobre las regiones temporal y parietal de la corteza cerebral de ratón. Esto es especialmente útil para la formación de imágenes en tiempo real sobre un área expansiva de un hemisferio cortical. 

Video: A Large Lateral Craniotomy Procedure for Mesoscale Wide-field Optical Imaging of Brain Activity

A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging

Imaging techniques are becoming increasingly important in the study brain function. Among them, two-photon laser scanning microscopy has emerged as an extremely useful method, because it allows the study of the live intact brain. With appropriate preparations, this technique allows the observation of the same cortical area chronically, from minutes to months. In this video, we show a preparation for chronic in vivo imaging of the brain using two-photon microscopy. This technique was initially pioneered by Dr. Karel Svoboda, who is now a Howard Hughes Medical Institute Investigator at Janelia Farm. Preparations like the one shown here can be used for imaging of neocortical structure (e.g., dendritic and axonal dynamics),  to record neuronal activity using calcium-sensitive dyes, to image cortical blood flow dynamics, or for intrinsic optical imaging studies. Deep imaging of the neocortex is possible with optimal cranial window surgeries. Operating under the most sterile conditions possible to avoid infections, together with using extreme care to do not damage the dura mater during the surgery, will result in successful and long-lasting glass-covered cranial windows.


This video and protocol demonstrate how to implant a glass-covered cranial window in rodents. These preparations can be used for chronic in vivo two-photon imaging of the neocortex over time scales of months. It may also be used for other types of imaging, including optical intrinsic signal imaging.

Un procedimiento de cirugía craneotomía para imágenes cerebrales crónicas

Imaging techniques are becoming increasingly important in the study brain function. Among them, two-photon laser scanning microscopy has emerged as an ...

Investigación

Biología

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized treatment determination. However, perturbation of the tumor architecture by biopsy and other invasive procedures has been associated with undesired effects on tumor progression, which need to be studied in depth to further improve the clinical benefit of these procedures. Conventional static approaches, which only provide a snapshot of the tumor, are limited in their ability to reveal the impact of biopsy on tumor cell behavior such as migration, a process closely related to tumor malignancy. In particular, tumor cell migration is the key in highly aggressive brain tumors, where local tumor dissemination makes total tumor resection virtually impossible. The development of multiphoton imaging and chronic imaging windows allows scientists to study this dynamic process in living animals over time. Here, we describe a method for the high-resolution longitudinal imaging of brain tumor cells before and after a biopsy in the same living animal. This approach makes it possible to study the impact of this procedure on tumor cell behavior (migration, invasion, and proliferation). Furthermore, we discuss the advantages and limitations of this technique, as well as the ability of this methodology to study changes in the cancer cell behavior for other surgical interventions, including tumor resection or the implantation of chemotherapy wafers.

Here we describe a method for high-resolution time-lapse multiphoton imaging of brain tumor cells before and after invasive surgical intervention (e.g., biopsy) within the same living animal. This method allows studying the impact of these invasive surgical procedures on tumor cells&#39; migratory, invasive, and proliferative behavior at a single cell level.

Imagen intravital longitudinal del comportamiento de las células tumorales cerebrales en respuesta a una biopsia quirúrgica invasiva

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Investigación sobre el cáncer

Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, direction5-7, ocular dominance8,9 and binocular disparity9. Orientation selectivity is the most widely studied feature and a continuous map with a quasi-periodic layout for preferred orientation is present across the entire primary visual cortex10,11. Integrating the synaptic, cellular and network contributions that lead to stimulus selective responses in these functional maps requires the hybridization of imaging techniques that span sub-micron to millimeter spatial scales. With conventional intrinsic signal optical imaging, the overall layout of functional maps across the entire surface of the visual cortex can be determined12. The development of in vivo two-photon microscopy using calcium sensitive dyes enables one to determine the synaptic input arriving at individual dendritic spines13 or record activity simultaneously from hundreds of individual neuronal cell bodies6,14. Consequently, combining intrinsic signal imaging with the sub-micron spatial resolution of two-photon microscopy offers the possibility of determining exactly which dendritic segments and cells contribute to the micro-domain of any functional map in the neocortex. Here we demonstrate a high-yield method for rapidly obtaining a cortical orientation map and targeting a specific micro-domain in this functional map for labeling neurons with fluorescent dyes in a non-rodent mammal. With the same microscope used for two-photon imaging, we first generate an orientation map using intrinsic signal optical imaging. Then we show how to target a micro-domain of interest using a micropipette loaded with dye to either label a population of neuronal cell bodies or label a single neuron such that dendrites, spines and axons are visible in vivo. Our refinements over previous methods facilitate an examination of neuronal structure-function relationships with sub-cellular resolution in the framework of neocortical functional architectures.

A method is described for labeling neurons with fluorescent dyes in predetermined functional micro-domains of the neocortex. First, intrinsic signal optical imaging is used to obtain a functional map. Then two-photon microscopy is used to label and image neurons within a micro-domain of the map.

Etiquetado dirigida de neuronas en una versión concreta de Micro-funcional de dominio de la neocorteza por combinar la señal intrínseca e Imagen de dos fotones

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, ...

Neurociencias

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT has been used extensively in ophthalmology, dermatology, and gastroenterology1-3. Using a thinned-skull cortical window (TSCW), we employ spectral-domain OCT (SD-OCT) modality as a tool to image the cortex in vivo. Commonly, an opened-skull has been used for neuro-imaging as it provides more versatility, however, a TSCW approach is less invasive and is an effective mean for long term imaging in neuropathology studies. Here, we present a method of creating a TSCW in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

We present a method of creating a thinned-skull cortical window (TSCW) in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Diluido-skull técnica de ventana cortical para<em&gt; En Vivo</em&gt; Tomografía de Coherencia Óptica de imagen

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique  with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT  has ...

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Two-photon imaging, coupled to laser nanodissection, are useful tools to study degenerative and regenerative processes in the central nervous system with subcellular resolution. This protocol shows how to label, image, and dissect single climbing fibers in the cerebellar cortex in vivo.

Laser Nanocirugía del cerebelo Los axones<em&gt; En Vivo</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Focal cerebral ischemia (i.e., ischemic stroke) may cause major brain injury, leading to a severe loss of neuronal function and consequently to a host of motor and cognitive disabilities. Its high prevalence poses a serious health burden, as stroke is among the principal causes of long-term disability and death worldwide1. Recovery of neuronal function is, in most cases, only partial. So far, treatment options are very limited, in particular due to the narrow time window for thrombolysis2,3. Determining methods to accelerate recovery from stroke remains a prime medical goal; however, this has been hampered by insufficient mechanistic insights into the recovery process. Experimental stroke researchers frequently employ rodent models of focal cerebral ischemia. Beyond the acute phase, stroke research is increasingly focused on the sub-acute and chronic phase following cerebral ischemia. Most stroke researchers apply permanent or transient occlusion of the MCA in mice or rats. In patients, occlusions of the MCA are among the most frequent causes of ischemic stroke4. Besides proximal occlusion of the MCA using the filament model, surgical occlusion of the distal MCA is probably the most frequently used model in experimental stroke research5. Occlusion of a distal (to the branching of the lenticulo-striate arteries) MCA branch typically spares the striatum and primarily affects the neocortex. Vessel occlusion can be permanent or transient. High reproducibility of lesion volume and very low mortality rates with respect to the long-term outcome are the main advantages of this model. Here, we demonstrate how to perform a chronic cranial window (CW) preparation lateral to the sagittal sinus, and afterwards how to surgically induce a distal stroke underneath the window using a craniotomy approach. This approach can be applied for sequential imaging of acute and chronic changes following ischemia via epi-illuminating, confocal laser scanning, and two-photon intravital microscopy.

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Surgical occlusion of a distal middle cerebral artery branch (MCAo) is a frequently used model in experimental stroke research. This manuscript describes the basic technique of permanent MCAo, combined with the insertion of a lateral cranial window, which offers the opportunity for longitudinal intravital microscopy in mice.

Ventana lateral crónica craneal Preparación Activa<em&gt; En Vivo</em&gt; Observación Siguiendo distal de la arteria cerebral media oclusión en ratones

Focal cerebral ischemia (i.e., ischemic stroke) may cause major brain injury, leading to a severe loss of neuronal function and consequently to a host of ...

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular plasticity or damage occurring overtime and in relation to neuronal activity or blood flow. In vivo two-photon microscopy allows the study of the structural and functional plasticity of large cellular units in the living brain. In particular, the thinned-skull window preparation allows the visualization of cortical regions of interest (ROI) without inducing significant brain inflammation. Repetitive imaging sessions of cortical ROI are feasible, providing the characterization of disease hallmarks over time during the progression of numerous CNS diseases. This technique accessing the pial structures within 250 &#956;m of the brain relies on the detection of fluorescent probes encoded by genetic cellular markers and/or vital dyes. The latter (e.g., fluorescent dextrans) are used to map the luminal compartment of cerebrovascular structures. Germane to the protocol described herein is the use of an in vivo marker of amyloid deposits, Methoxy-O4, to assess Alzheimer&#39;s disease (AD) progression. We also describe the post-acquisition image processing used to track vascular changes and amyloid depositions. While focusing presently on a model of AD, the described protocol is relevant to other CNS disorders where pathological cerebrovascular changes occur.

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

This manuscript describes a procedure to track the remodeling of the cerebrovasculature during amyloid plaque accumulation in vivo using longitudinal two-photon microscopy. A thinned-skull preparation enables the visualization of fluorescent dyes to assess the progression of cerebrovascular damage in a mouse model of Alzheimer&#39;s disease.

Longitudinal<em&gt; En Vivo</em&gt; Obtención de imágenes de la vasculatura cerebral: Importancia de las enfermedades del sistema nervioso central

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular ...

Medicina

Craniotomy Procedure for Visualizing Neuronal Activities in Hippocampus of Behaving Mice

Imaging neuronal activities at single-cell resolution in awake behaving animals is a very powerful approach for the investigation of neural circuit functions in systems neuroscience. However, high absorbance and scattering of light in mammalian tissue limit intravital imaging mostly to superficial brain regions, leaving deep-brain areas, such as the hippocampus, out of reach for optical microscopy. In this video, we show the preparation and implantation of the custom-made imaging window to enable chronic in vivo imaging of the dorsal hippocampal CA1 region in head-fixed behaving mice. The custom-made window is supplemented with an infusion cannula that allows targeted delivery of viral vectors and drugs to the imaging area. By combining this preparation with wide-field imaging, we performed a long-term recording of neuronal activity using a fluorescent calcium indicator from large subsets of neurons in behaving mice over several weeks. We also demonstrated the applicability of this preparation for voltage imaging with single-spike resolution. High-performance genetically encoded indicators of neuronal activity and scientific CMOS cameras allowed the recurrent visualization of subcellular morphological details of single neurons at high temporal resolution. We also discuss the advantages and potential limitations of the described method and its compatibility with other imaging techniques.

This article demonstrates the preparation of a custom-made imaging window supplemented with infusion cannula and its implantation onto the CA1 region of the hippocampus in mice.

Procedimiento De Craneotomía Para La Visualización De Las Actividades Neuronales En El Hipocampo De Comportarse Ratones

Imaging neuronal activities at single-cell resolution in awake behaving animals is a very powerful approach for the investigation of neural circuit ...

In Vivo Fiber-Coupled Pre-Clinical Confocal Laser-scanning Endomicroscopy (pCLE) of Hippocampal Capillaries in Awake Mice

The goal of this protocol is to describe fiber-optic-bundle-coupled pre-clinical confocal laser-scanning endomicroscopy (pCLE) in its specific application to elucidate capillary blood flow effects during seizures, driven by mural cells. In vitro and in vivo cortical imaging have shown that capillary constrictions driven by pericytes can result from functional local neural activity, as well as from drug application, in healthy animals. Here, a protocol is presented on how to use pCLE to determine the role of microvascular dynamics in neural degeneration in epilepsy, at any tissue depth (specifically in the hippocampus). We describe a head restraint technique that has been adapted to record pCLE in awake animals, to address potential side-effects of anesthetics on neural activity. Using these methods, electrophysiological and imaging recordings can be conducted over several hours in deep neural structures of the brain.

In Vivo Fiber-Coupled Pre-Clinical Confocal Laser-scanning Endomicroscopy pCLE of Hippocampal Capillaries in Awake Mice

Whereas multiphoton imaging is only effective at limited depths from the tissue&#8217;s surface, it is possible to achieve 3 &#181;m resolution imaging at any depth via pCLE. Here, we present a protocol to conduct pCLE imaging to measure microvascular dynamics in the hippocampus of ictal and wild-type mice.

Endomicroscopía preclínica de barrido láser confocal acoplada a fibras (pCLE) in vivo de capilares del hipocampo en ratones despiertos

The goal of this protocol is to describe fiber-optic-bundle-coupled pre-clinical confocal laser-scanning endomicroscopy (pCLE) in its specific application ...

Adquisición de imágenes multicapa con microprisma en animales con la cabeza fija y que se mueven libremente

Long-Term Imaging of Identified Neural Populations using Microprisms in Freely Moving and Head-Fixed Animals

With the advancement of multi-photon microscopy and molecular technologies, fluorescence imaging is rapidly growing to become a powerful approach for studying the structure, function, and plasticity of living brain tissues. In comparison to conventional electrophysiology, fluorescence microscopy can capture the neural activity as well as the morphology of the cells, enabling long-term recordings of the identified neuron populations at single-cell or subcellular resolution. However, high-resolution imaging typically requires a stable, head-fixed setup that restricts the movement of the animal, and the preparation of a flat surface of transparent glass allows visualization of neurons at one or more horizontal planes but is limited in studying the vertical processes running across different depths. Here, we describe a procedure to combine a head plate fixation and a microprism that gives multilayer and multimodal imaging. This surgical preparation not only gives access to the entire column of the mouse visual cortex but allows two-photon imaging in a head-fixed position and one-photon imaging in a freely moving paradigm. Using this approach, one can sample identified cell populations across different cortical layers, register their responses under head-fixed and freely moving states, and track the long-term changes over months. Thus, this method provides a comprehensive assay of the microcircuits, enabling direct comparison of neural activities evoked by well-controlled stimuli and under a natural behavioral paradigm.

Autor destacado: Imágenes comparativas de la actividad neuronal en estados despiertos y de movimiento libre

When integrated with a head-plate and an optical design compatible with both single- and two-photon microscopes, the microprism lens presents a significant advantage in measuring neural responses in a vertical column under diverse conditions, including well-controlled experiments in head-fixed states or natural behavioral tasks in freely moving animals.

Obtención de imágenes a largo plazo de poblaciones neuronales identificadas mediante microprismas en animales que se mueven libremente y con la cabeza fija

With the advancement of multi-photon microscopy and molecular technologies, fluorescence imaging is rapidly growing to become a powerful approach for ...

Un procedimiento de craneotomía lateral grande para el campo amplio de mesoescala imágenes ópticas de la actividad cerebral

Resumen

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Longitudinal

Procedimiento De Craneotomía Para La Visualización De Las Actividades Neuronales En El Hipocampo De Comportarse Ratones

Endomicroscopía preclínica de barrido láser confocal acoplada a fibras (pCLE) in vivo de capilares del hipocampo en ratones despiertos

Obtención de imágenes a largo plazo de poblaciones neuronales identificadas mediante microprismas en animales que se mueven libremente y con la cabeza fija