Este trabajo fue apoyado por becas-R01 CA169354 &#160; y R01-047822 &#160; de los Institutos Nacionales de Salud y un Premio al Mérito del Departamento de Asuntos de Veteranos (BCE). RKP fue apoyado por el NIH T32 CA009287-30A1, un Premio de la ASCO Investigador Joven, California Breast Cancer Research Proyecto de Becas, y la Sociedad Americana del Cáncer Mentored Investigación Académico de subvención; BAZ fue apoyado por el NIH subvención AI079320. JM fue apoyado por becas del NIH T-32 becas de formación T32-AI07290- 25, T32-AI07290-24 y la Sociedad Americana del Cáncer beca post-doctoral PF-12-052-01-CSM.

NOTA: Todos los experimentos con animales se realizaron de conformidad con Stanford aprobado, Palo Alto VA HCS, y los Institutos Nacionales de Salud directrices AnimalCare Institucional y el empleo Comisión. 1. Preparación para la Recolección y Procesamiento (Tiempo Requerido: ~ 10 a 15 min) <ol><li> Inocular las células de melanoma murino B16F0 (0,5-1 x 10 6) por vía subcutánea en o cerca de la línea media del abdomen femenino en ratones C57BL / 6 como se describió anteriormente 6. Alternativamente, inocular células tumorales en sitios anatómicos adicionales (por ejemplo, flanco, almohadilla de grasa mamaria, etc). NOTA: Cualquier número de tumores (implanta o espontánea) se puede utilizar y se evaluó usando este protocolo. Por ejemplo, otros comúnmente utilizados tumores singénicos en ratones C57BL / 6 incluyen la línea de colon MC38, carcinoma pulmonar de Lewis (LLC), y la línea de próstata TRAMP-C2. Mientras xenoinjertos humanos en ratones inmunodeficientes inoculados también se pueden evaluar de esta manera, debe tenerse en cuenta que el profiles de los leucocitos infiltrantes de tumor serán necesariamente ser alterados de acuerdo con el estado inmunodeficiente del ratón huésped. <ol><li> Utilice medios completos (por ejemplo RPMI que contiene 10% de SFB y aditivos) u otra solución buffer proteica adecuada (por ejemplo HBSS o PBS + 1% FBS o 1% BCS). Enfríe los medios de comunicación o tampón a 4 ° C antes de la eutanasia. </li></ol></li><li> Configure tubos de recogida y filtros para tumores resecados; colocarlos en hielo. <ol><li> Utilice un tubo cónico de 50 ml por tumor a resecarse. Introduzca un filtro suspensión celular 40-70 micras en cada uno. Como alternativa, utilice tubos de 15 ml cónicos con malla de filtro de metal. Utilice un émbolo de la jeringa 5 ml o un bolígrafo de espesor para crear un filtro en forma de copa en la parte superior del tubo de 15 ml. </li></ol></li><li> Elaborar instrumentos para la resección del tumor y la transformación; utilizar pinzas quirúrgicas y tijeras finas para resecar tumores y procesos. Utilice etanol al 70% para limpiar los instrumentos entre las muestras resecciones / tumorales. Por número mayor omuestras f (por ejemplo,&gt; 10), se recomienda el procesamiento simultáneo de múltiples muestras de investigadores para evitar diferencias significativas en el tiempo de procesamiento entre las muestras tumorales. </li></ol> 2. Tumor Resección (Tiempo Requerido: ~ 5 min / tumor) <ol><li> La eutanasia B16 ratones portadores de tumores de forma individual utilizando dióxido de carbono u otro método aprobado. </li><li> Asegure el ratón en una etapa quirúrgica. Rocíe el área del tumor con un 70% de etanol y limpiar el exceso de fuera; esto ayuda a prevenir la propagación de cualquier pelo presente. Para no ratones nude, afeitar el área de la piel alrededor del tumor antes de la resección, según sea necesario. </li><li> El uso de pinzas y tijeras, resecar el tumor subcutáneo en bloque, incluyendo la bañan y la piel circundante. La cantidad de &quot;margen&quot; piel tomada se puede variar, pero normalmente resecar 2-3 mm de la piel alrededor del tumor. <ol><li> Pesar tumores resecados (+/- piel circundante) en este punto. Coloque la sección de piel / tumor resecado en el filtro asegurado dentro de la pltubo cónico astic. </li></ol></li></ol> 3. Preparación de una suspensión de Tumores Single Cell (Tiempo Requerido: ~ 7.5 min / tumor) <ol><li> Use pinzas y tijeras para picar tumor y suprayacente / piel circundante. Picar la muestra con tijeras hasta que todos los grandes sectores de tejido son procesados ​​en 1-2 mm secciones. NOTA: Por lo general, los tumores enteros son procesados; alternativamente, para los tumores más grandes, secciones representativas de tumores podrían ser picados y procesados. </li><li> El uso de un émbolo de una jeringa desechable de 5 o 10 ml, desagregar mecánicamente el tejido tumoral picada contra el filtro garantizado. </li><li> Usando una pipeta, se lava el tejido tumoral procesada con 5-10 ml de medio frío o tampón. Esto eliminará las células individuales a través del filtro. </li><li> Repita los dos pasos anteriores varias veces, asegurándose de que el número y volumen de los lavados totales son aproximadamente los mismos para los tumores de tamaño similar. <ol><li> Después de lavar el tejido tumoral procesada, observarpequeños fragmentos de piel y / u otro tejido conectivo deben ser dejados atrás en el filtro. </li><li> Alternativamente, para tumores en los que la desagregación mecánica sola puede no ser suficiente, la digestión con colagenasa y / u otras enzimas puede realizarse antes del procedimiento de picar carne. Esto permitirá una más completa suspensión de células individuales. Sin embargo, cabe señalar que este tipo de protocolos de digestión pueden afectar la expresión del antígeno de superficie de 20, por lo que se debe tener cuidado en la interpretación de estos resultados. </li></ol></li><li> Lavar y sedimentar las células mediante la adición de medios / tampón y centrifugación a 4 ° C 500 xg durante 5 min. </li></ol> 4. La tinción de FACS Suspensión Single Cell (Tiempo Requerido: ~ 30 a 60 min) <ol><li> Resuspender las células en tampón FACS de hielo frío (PBS + 1% FBS). </li><li> Contar las células viables usando azul de tripano y un hemacitómetro, o contador de células automatizado. </li><li> Determinar el rendimiento de células viables total por volumen. Esta información puede utilizarse para extrapolarnúmero absoluto de leucocitos infiltrantes de tumores en combinación con los datos de FACS. </li><li> Determinar el número de células que se tiñeron y se analizó por FACS. Esto será influenciada por varios factores (por ejemplo, tumor de tipo histológico, la edad y tamaño del tumor, porcentaje medio de la infiltración de leucocitos, etc.). NOTA: En el melanoma B16, encontramos un bajo porcentaje de tumor infiltrante leucocitos (TIL; &lt;5%) en comparación con las células tumorales. Así, al menos 1 x 10 6 total del tumor (tumor + leucocitos infiltrantes) las células se recogieron típicamente a través de FACS para el análisis. <ol><li> Usando los datos de conteo de tripano-manchado, volumen calculado de las células a teñirse para FACS. Por ejemplo, si TIL constituyen típicamente de 5% del total de células tumorales (muchas de las células tumorales habrá muerto en la tinción de tripano), factor esto en el número total de tumor suspensión de células individuales a ser teñido. </li><li> Para subconjuntos de leucocitos menos comunes, por ejemplo, CCR9 + PDC) utilizar un mayor número de células totales tumorales (por ejemplo, 2-3 x 10 6) para la tinción de FACS, dada la baja frecuencia relativa de estas células en la suspensión de células individuales. </li></ol></li><li> Manchar la suspensión de células individuales del tumor para FACS. <ol><li> Para la discriminación en vivo / muerto, utilizar una mancha que se puede fijar o la mancha no se puede fijar (por ejemplo, yoduro de propidio) se puede utilizar. Si las células se tiñen sin discriminación en vivo / muerto, la precaución debe ser informado dado el potencial de la unión no específica de los anticuerpos. </li><li> Manchar la suspensión celular para subconjuntos de leucocitos específicos usando un protocolo de tinción estándar FACS. Células de bloqueo para reducir anticuerpo unión no específica con PBS / FBS que contiene 1% de suero de rata y el bloque de Fc (anti-CD16 / 32) durante 10 min antes de la tinción con anticuerpos específicos de antígeno. Incluir los anticuerpos de control de isotipo adecuados para garantizar la tinción es específica. </li><li> En este punto, después de la tinción FACS es completa, fijar muestras con 4% de formaldehído u otro agente fijador similar. Almacene las muestras a 4 ° C en el dark (para evitar la extinción de fluoróforos) hasta el momento de la recolección y análisis. NOTA: El almacenamiento de muestras fijadas durante largos períodos de tiempo puede resultar en la alteración de la señal y la intensidad de los fluoróforos 21. </li><li> Recoger las muestras en un citómetro de flujo. Flujo óptimo citómetro configuraciones variará dependiendo del tipo de instrumento y configuración láser / detector. NOTA: Además, no puede ser la variabilidad entre los experimentos, incluso si se utiliza la misma máquina. Por lo tanto, realice la configuración de la máquina adecuada (por ejemplo, usando bolas de calibración) para asegurar el ajuste de compensación apropiada antes de la recolección y análisis de cada experimento FACS. </li></ol></li><li> Análisis de subgrupos leukoctye <ol><li> Utilizando FACS software de análisis de datos, para analizar los datos. Para una mancha en vivo / muerto, comience colocando puertas en las células muertas. Use anticuerpo contra un marcador específico de leucocitos (por ejemplo, anti-CD45) para identificar leucocitos dentro de las células vivas. <ol><li> Después de esto, utilizar varios gatiesquemas de NG para identificar subconjuntos específicos, dependiendo del protocolo de tinción. Por ejemplo, para identificar a las células T CD4 +, seleccione la región SSC lo de la población CD45 + y seleccionar las células CD19-CD3 +; a partir de estas células T CD4 + puede ser identificado 22. </li></ol></li><li> Analizar datos y presentarlos en un número de maneras diferentes para garantizar la coherencia e identificar patrones o tendencias (es decir, utilizar el total de números, porcentajes, o ratios de cuantificar subconjuntos). NOTA: Por ejemplo, nos fijamos en las células CD45 + vivo total como porcentaje de las células tumorales totales recaudados (Figura 1). Adicionalmente, a continuación, se calculó el porcentaje de cada subconjunto de leucocitos (por ejemplo, células T CD4 +) dentro del tumor y comparamos estos como proporciones entre los grupos control y de ensayo (Figura 3). </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Realización de análisis detallado de la microambiente tumoral es crítico en la determinación de los mecanismos y efectos de inmunomodulación. Con la creciente presencia de inmunoterapia en el ámbito clínico en humanos, la comprensión del impacto de estos agentes en los leucocitos infiltrantes de tumores se está convirtiendo en indispensable en la definición de su mecanismo de acción. En los seres humanos, a menudo existen dificultades clínicas y / o logísticas para obtener y analizar el tejido tumoral para ...

El equilibrio entre el crecimiento del tumor y la promoción y la regresión es, en parte, depende de la balanza de leucocitos infiltrantes de tumores favor y en contra presentes en el microambiente 1,2. Con el fin de estudiar el microambiente tumoral (TME) y, específicamente, identificar las subpoblaciones de leucocitos de infiltración, hemos desarrollado un método para la evaluación de tumores subcutáneos en un modelo de tumor murino. La importancia de estudiar el microambiente tumoral es bien conocido y apoyado en la literatura. Numerosos estudios han demostrado que el equilibrio de las células inmunes pro- y anti-infiltrantes de tumores puede afectar los resultados del crecimiento del tumor, no sólo en el ratón, sino también los estudios en humanos (revisado en 3,4). Por ejemplo, Curiel et al. Mostró que empeoraron los resultados clínicos en pacientes con cáncer de ovario se correlacionaron con la presencia de aumento de porcentajes de células infiltrantes de tumor T reguladoras CD4 + (Tregs) 5. Nuestro propio trabajo también mostró el efecto de un novel de leucocitos quimioatrayente de la proporción de subconjuntos de leucocitos en un modelo de melanoma de ratón 6, que también se correlaciona con una disminución de crecimiento del tumor. Por lo tanto, los análisis detallados de los subconjuntos de leucocitos dentro de un tumor es ahora más ampliamente reconocidos y cada vez más importante. Hay muchas maneras de evaluar el microambiente tumoral para la infiltración de leucocitos; por ejemplo grupos han diseñado ratones transgénicos para expresar diversas proteínas fluorescentes en orden a la imagen de la TME 7, inmunohistoquímica clásica e inmunofluorescencia de secciones conservadas 8, incluyendo varias técnicas de imagen como la resonancia magnética, PET, microscopía confocal 09.11 - algunas de ellas con la capacidad de monitorear intravitally 10,12. Éstos se pueden utilizar con diversos agentes de formación de imágenes moleculares, tales como nanopartículas 13 o agentes de contraste nuevos 14 que etiquetan las células inmunes. Nuestro método es un enfoque basado en citometría de flujo y tiene varias ventajas.En primer lugar, todo el microambiente tumoral se puede muestrear; en el momento de análisis, todo el tumor subcutáneo y la periferia circundante se resecaron quirúrgicamente para su procesamiento. Esto elimina cualquier sesgo potencialmente muestreo dentro de un mismo tumor y le da un análisis más &quot;global&quot; del tumor en su conjunto. En segundo lugar, el uso de citometría de flujo multicolor para analizar los subconjuntos de leucocitos nos permite medir más específicamente el fenotipo de la infiltración de leucocitos. Dependiendo del número de colores utilizados, subconjuntos muy específicos pueden ser identificados. Esto es importante ya que hay varios subconjuntos de leucocitos dentro de un tipo de célula particular - o incluso en una clasificación general subtipo - que tienen funciones dispares que son potencialmente significativo en la determinación del destino del tumor. Por ejemplo, las células dendríticas plasmacitoides (PDC) han sido implicados en la inmunidad anti-tumor 15. Sin embargo, el subconjunto de CCR9 + PDC ha demostrado ser tolerogénico 16, y el desplazamiento de la balanza de un subconjunto de este tipo puede tener un impacto en el crecimiento del tumor. Nuestro método es apropiado para la administración subcutánea u otros tumores que pueden ser resecados en bloque. En nuestras manos, los tumores se resecaron uniformemente en el momento de la eutanasia. Sin embargo, es concebible, como se ha hecho en algunos estudios, que un tumor subcutáneo podría ser completamente resecado con el cierre de la piel circundante en una cirugía de supervivencia 17, permitiendo así una evaluación adicional del animal. El análisis se realiza a continuación, en el tumor resecado. Por lo tanto, los resultados representan un único punto de tiempo en el desarrollo del tumor. Aunque esto permite una mirada detallada en el microambiente, también es una imagen estática de lo que es, sin duda, un proceso dinámico. Sin embargo, los leucocitos aislados (por ejemplo, a través de la separación magnética o gradiente de densidad), entonces se puede analizar por separado del epitelio y el estroma del tumor, o utilizado en otros ensayos funcionales, para definir aún más su fenotipo, como ha sido Previormente descrito 18. Este método, entonces, sería útil para cualquier investigadores interesados ​​en la comprensión de la composición de los leucocitos en el microambiente del tumor en un punto de tiempo dado, ya sea en la configuración del curso natural de la enfermedad, o después de una perturbación terapéutico específico. Aunque no se ha hecho por nosotros, variaciones de este procedimiento podría también, potencialmente, ser utilizados para analizar partes específicas de un tumor en el aislamiento. Por ejemplo, dado el tamaño del tumor, la zona periférica (s) podría ser disecado de distancia desde el núcleo central, posiblemente necróticas del tumor para dar el investigador una visión más espacialmente segregado del microambiente del tumor. En el floreciente campo de la inmunología tumoral, habrá sin duda un número exponencialmente creciente de estudios que evalúan nuevos agentes inmunomoduladores en modelos tumorales murinos. Varios informes han puesto de manifiesto las diferencias en función de los leucocitos específica dentro del tumor frente al periférico enambiente. Por ejemplo, Shafer-Weaver et al. Mostró en un modelo de ratón que las células específica de antígeno T efectoras CD8 +, mientras que activo en la periferia, se transformaron en células T supresoras CD8 +, una vez que la trata en el microambiente tumoral 19. Esto fue en parte debido a TGFß, pero otros factores tienden a estar involucrados también. Por lo tanto, la evaluación de subconjuntos de leucocitos - números y proporciones, así como el estado funcional - dentro del propio tumor dará una representación más precisa del efecto de una inmunomodulación en particular sobre el destino tumor. Nuestra técnica permite el análisis detallado del tumor y proporciona al investigador la oportunidad de identificar más de cerca los cambios en las poblaciones de leucocitos que los enfoques anteriores.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="916">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Name of the Material/Equipment</td>
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			<td height="21" style="height:21px;">RPMI</td>
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			<td>http://cellgro.com; keep on ice</td>
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			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td>http://cellgro.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 ml conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>fischersci.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">40 micron filter</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08-771-1</td>
			<td>fischersci.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>14-823-35</td>
			<td>fischersci.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">surgical scissors/forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5910</td>
			<td>roboz.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>MT-21-030-CM</td>
			<td>http://cellgro.com; keep on ice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">trypan blue</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>MT-25-900-CI</td>
			<td>fischersci.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hemacytometer</td>
			<td>Hausser Scientifice&#160;</td>
			<td>02-671-54&#160;</td>
			<td>fischersci.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Live/Dead stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L34957</td>
			<td>lieftechnologies.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FlowJo software</td>
			<td>TreeStar, Inc</td>
			<td></td>
			<td>flowjo.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of tumor-infiltrating leukocyte subsets in a subcutaneous tumor model

Células inmunes especializadas que se infiltran en el microambiente tumoral regulan el crecimiento y la supervivencia de neoplasia. Las células malignas deben eludir o subvertir las respuestas inmunitarias antitumorales con el fin de sobrevivir y prosperar. Los tumores se aprovechan de una serie de diferentes mecanismos de inmunidad &quot;escape&quot;, incluyendo la contratación de tolerogénica DC, las células T reguladoras inmunosupresores (Treg), y células supresoras de origen mieloide (MDSC) que inhiben las respuestas antitumorales citotóxicos. Por el contrario, las células inmunes efectoras anti-tumor pueden ralentizar el crecimiento y expansión de tumores malignos: células dendríticas inmunoestimuladoras, células asesinas naturales que albergan la inmunidad anti-tumor innata, y células T citotóxicas todos pueden participar en la supresión de tumores. El equilibrio entre pro y anti-tumorales leucocitos determina en última instancia, el comportamiento y el destino de las células transformadas; una multitud de estudios clínicos en humanos han apoyado esto. Así, el análisis detallado de subconjuntos de leucocitos dentro deel microambiente tumoral se ha vuelto cada vez más importante. Aquí, se describe un método para el análisis de subconjuntos de leucocitos infiltrantes presentes en el microambiente tumoral en un modelo de tumor de ratón. Las células tumorales de melanoma de ratón B16 se inocularon por vía subcutánea en ratones C57BL / 6. En un momento determinado, los tumores y la piel circundante fueron resecadas en bloque y se procesan en suspensiones de células individuales, que luego se tiñeron de múltiples colores citometría de flujo. Usando una variedad de marcadores de subconjuntos de leucocitos, hemos sido capaces de comparar los porcentajes relativos de la infiltración de subconjuntos de leucocitos entre el control y los tumores chemerin expresan. Los investigadores pueden utilizar una herramienta para estudiar la presencia inmune en el microambiente tumoral y cuando se combina con mediciones del tamaño de la pinza tradicionales de crecimiento del tumor, potencialmente les permita dilucidar el impacto de los cambios en la composición inmunológico sobre el crecimiento tumoral. Dicha técnica se puede aplicar a cualquier modelo de tumor en el que el tumor y su microambiente cun ser resecados y procesados.

Nuestros resultados mostraron que la sobre-expresión forzada de chemerin en tumores murinos B16 aumentó el porcentaje de leucocitos infiltrantes de tumores (TIL). Además, se identificaron cambios en la relación relativa de subconjuntos de leucocitos representados en el microambiente tumoral asociado con la expresión chemerin. Vuelva a imprimir con permiso de Pachynski et al. 6. La Figura 1 muestra que hubo un incremento significativo en CD45 + células...

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Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

This protocol describes a method for the detailed evaluation of leukocyte subsets within the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Chemerin-expressing B16 melanoma cells were implanted subcutaneously into syngeneic mice. Cells from the tumor microenvironment were then stained and analyzed by flow cytometry, allowing for detailed leukocyte subset analyses.

Evaluación de tumor infiltrante de leucocitos subconjuntos en un modelo de tumor subcutáneo

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or ...

evaluation-tumor-infiltrating-leukocyte-subsets-subcutaneous-tumor

Research

JoVE Journal

Medicine

19.9K vistas.  Washington University School of Medicine. This protocol describes a method for the detailed evaluation of leukocyte subsets within the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Chemerin-expressing B16 melanoma cells were implanted subcutaneously into syngeneic mice. Cells from the tumor microenvironment were then stained and analyzed by flow cytometry, allowing for detailed leukocyte subset analyses. 