We thank the Scientific Computing and Imaging Institute of the University of Utah for use of FluoRender software (R01GM09815). This work was supported by grants from the Glaucoma Research Foundation, Melsa M. and Frank Theodore Barr Foundation and the US National Institute of Health, (R01EY020878 and R01EY023621) to M.L.V., and (R01EY017182 and R01EY017950) to B.K.A.

En vivo de imágenes se realiza en instalaciones libres de patógenos utilizando los protocolos aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Utah. NOTA: Este protocolo de formación de imágenes se utiliza para reportero ratones en los que la microglía de la retina y la infiltración de monocitos / macrófagos expresan la proteína fluorescente verde (GFP) bajo el control del locus del receptor de fractalquina (CX3CR1). 1. En Vivo Imaging de Retina GFP + Microglia por confocal de barrido láser oftalmoscopia (cSLO) <ol><li> Encienda el sistema de calefacción con control de agua, ajuste para estabilizar la temperatura del ratón entre 35-37 ºC durante el procedimiento, y conectar dos almohadillas térmicas. <ol><li> Inicie el sistema confocal oftalmoscopio láser de exploración (cSLO) (Figura 2). Abra el programa cSLO, introduzca la información que identificará el ratón individual y establecer una curvatura corneal de 2 mm (menú de datos del paciente). </li></ol></li><li> Prepárese para imaging. Encajar de forma segura un 55º de campo amplio lente objetivo limpia en su zócalo. Preparar la plataforma de imágenes oftalmoscopio asegurando una almohadilla eléctrica cubierto con papel limpio. Utilice clips para aplanar la almohadilla y el papel y evitar que se bloquea el movimiento de la lente objetivo. </li><li> Anestesiar el ratón por inyección intraperitoneal de 1,3% 2,2,2-tribromoetanol y 0,8% de alcohol terc-amílico (250 mg / kg de peso corporal; 0,5 ml / 25 g de peso corporal) usando una aguja de 30½ G montado en un desechable 1 ml jeringa. Ratón y vuelta a su jaula, mantenido sobre una almohadilla térmica. NOTA: La entrega de la anestesia mediante inyección contra la inhalación permite fácil posicionamiento del ratón para la imagen y el acceso sin obstáculos a los ojos, sin nariz conos y tubos. </li><li> Una vez que el animal deja de moverse y no responde a la pizca de cola, inducir dilatación de la pupila con tropicamida y fenilefrina (0,5% cada uno), colocando el animal en decúbito prono y cubrir ambos ojos con las gotas de 7 min. </li><li> Después de 5 min, pata el ratón boca abajo en el centro de la plataforma oftalmoscopio, y lentes de contacto se ajustan sobre ambos ojos, la aplicación de presión mínima. NOTA: Las lentes de contacto son pequeñas y frágil, pero pueden ser cuidadosamente manejados con los dedos, aunque fórceps pueden utilizarse en lugar 40. El uso de lentes de contacto es opcional, pero se recomienda ya que minimiza la sequedad ocular y preserva la transparencia corneal durante la exploración. </li><li> Después de 7 min, orientar el ratón con el ojo derecho frente a la lente del objetivo y de la órbita paralela a la lente del objetivo, manteniendo el animal suelto cerca del borde de la plataforma (Figura 2B). Para recoger imágenes de saturación y la orientación comparable, constantemente mantener la distancia del ojo a la lente de objetivo, así como la alineación del ojo a la trayectoria de la luz a lo largo de las sesiones de formación de imágenes. Clip largos bigotes que interfieren con la observación del ojo. NOTA: Para el próximo 8-10 minutos, el ratón no se mueve ni parpadea, y lo hará respirar con movimiento suavetos, que son seguidos por el cSLO seguimiento de los ojos ART modo (automático en tiempo real), que ajusta la posición del cabezal de escaneo basado en hitos del fondo de ojo con alto contraste. Pasado ese tiempo, los ratones comienzan jadeando y parpadeando, haciendo de imágenes poco práctico. </li><li> Si la imagen se realiza sin el uso de lentes de contacto, aplicar PBS cae a ambos ojos cada 2-3 min para evitar que se seque. </li><li> Recolecta la imagen del fondo de ojo de la vascularización de la retina y del nervio óptico, se centró en la retina interna. <ol><li> Seleccione el modo de infrarrojo (IR) y ajustar la configuración a 820 nm de excitación, 100% de potencia del láser, 40-60% de sensibilidad (Figura 2C). </li><li> Trabajar en el modo de alta velocidad (12,6 marco / seg), localice el ojo utilizando el joystick para conducir el oftalmoscopio. A menor aumento, inspeccione la córnea y el cristalino para lesiones o la opacidad, y excluir de los ojos de estudio con defectos o daños que afectarán imágenes de la retina (Figura 3A). </li><li> Localice el área del disco óptico (la superficie dela cabeza del nervio óptico, ONH) por lo que el objetivo más cerca del ojo, luego centrar la imagen en él y bloquear esta posición atornillando el joystick. Esta alineación del ojo para el oftalmoscopio es clave para obtener incluso el enfoque y la emisión a través de la imagen. </li><li> Visualizar los planos internos de la retina, así como la ONH, utilizando los principales vasos sanguíneos situados en la superficie vítrea de la retina como un plano de referencia focal (59 y 60 D), o más profundo (55 D) en los ojos que muestran óptica excavado discos. El enfoque óptimo debería resolver circulante glóbulos dentro de los vasos sanguíneos principales, con su luz y paredes claramente diferenciadas. </li><li> Optimizar la saturación de la imagen ajustando el dial en el panel de control de pantalla táctil, hasta que un halo blanco de iluminación uniforme se extiende en la mayor parte del campo de 55º fundus alrededor del disco óptico (con ligera sobreexposición). A continuación, baje la saturación para optimizar el contraste hasta que las células de la sangre en movimiento a lo largo de los principales vasos pueden ser claramente resueltos. Si oscura focaláreas persisten, no debido a daño en la retina, realinear el ojo a la cámara hasta que se obtiene una imagen brillante de manera uniforme. Este ajuste es fundamental para capturar conjuntos reproducibles de imágenes en la posición y la calidad. </li><li> Se recoge una imagen IR de alta resolución de la retina central (1.4 a 1.7 mm de diámetro, dependiendo de la edad), con un promedio de 30 cuadros en tiempo real (4,7 fotogramas / seg; normalizado), para mejorar la relación señal-ruido (Figura 2D ). </li></ol></li><li> Inmediatamente, adquirir una imagen de fluorescencia de GFP + microglia y / o monocitos infiltrantes localizadas a los planos internos de la retina y la CNO. NOTA: Optimización de la imagen del fondo de ojo IR de la retina determina la resolución de la imagen de fluorescencia de las células GFP +, así como la extensión de la retina interna se extendió. Si no se centrará los planos internos de la retina, que puede ser detectada por la mala resolución de la vasculatura, dará lugar a GFP + células vistas atenuados (Figura 3B). Si no se ajusta satu IRración afecta correcta y uniforme la imagen de fluorescencia (FA), la introducción de variaciones de artefactos en las buenas prácticas agrarias + células intensidad y tamaño (Figura 3C). <ol><li> Swich a la fluorescencia modo de imagen (FA) en el panel de la pantalla táctil, utilizando azul, de excitación 488 nm láser (460-490 nm conjunto filtro de barrera), y los ajustes de adquisición (100% de la potencia del láser y 100-125% de sensibilidad), que se mantienen constante para todos los ratones (Figura 2E). </li><li> Reunir un solo punto xy, imagen de fluorescencia bidimensional de la retina, y la captura de una imagen de fondo de ojo de inmediato en la posición idéntica (100x promedio exploración; 55º ángulo de exploración tanto de imágenes; Figura 2F). </li><li> Capturar una imagen de multipunto seleccionando &quot;compuesto&quot; en el panel de control (Figura 2G) y moviendo el derecho oftalmoscopio y la izquierda, la panorámica de la retina a través del eje-nasal temporal (Figura 2H). NOTA: Después de escanear una sola imagen xy-punto (100x spuede promediar), el software promedios automáticamente nuevos scans de las mismas y las nuevas áreas (circunscritos con un círculo verde durante la exploración óptima, o rojo cuando el análisis es inviable), y todos los puntos de sutura-xy posiciones en tiempo real. La imagen compuesta resultante se extiende por 1.5 a 1.7 mm en el eje horizontal x 3-4 mm en el eje vertical (55º x 120-124º ángulo de exploración). </li></ol></li><li> Imagen completa de cada ratón dentro de los 15 minutos después de la inducción de la anestesia, antes de parpadear y se reinicia de movimiento. </li><li> Quitar las lentes de contacto, ojos de hidratos con PBS y devolver el animal a su jaula calentado, comprobando el comportamiento hasta la recuperación completa de la motilidad. </li><li> Para los estudios longitudinales utilizando intermitentes sesiones cSLO-de formación de imágenes en el mismo ratón individual, repetir de formación de imágenes no menos de 3 días de diferencia para evitar la toxicidad acumulativa de la anestesia, así como irritación de la córnea. </li></ol> 2. Vivo Procesamiento y Análisis de Imágenes <ol><li> Alineación de la imagen secuencial: <ol><li> Alinearlas imágenes de fondo de ojo para una serie temporal de la misma ojo utilizando la vasculatura y disco óptico como puntos de referencia. Abra todas las imágenes en un programa de presentación de diapositivas comercial, arrastrando cada imagen sobre la anterior hasta que sus discos ópticos se alinean en el plano xy (la imagen superior aparece semitransparente mientras era arrastrado), a continuación, gire la imagen superior hasta su los principales vasos sanguíneos se superponen con la vasculatura en la imagen de abajo (se centran en los vasos más alejado del disco óptico). Registre el ángulo de rotación para cada imagen y guardar esta serie de tiempo para futuras referencias, hacer el seguimiento de la identidad del ratón y de los ojos. </li><li> Alinear la serie correspondiente de imágenes de fluorescencia individuales xy de punto mediante la aplicación del ángulo de grabado para corregir la rotación xy en cada punto de tiempo, usando un programa editor gráfico de trama. Además, ajustar la resolución de 300 dpi (sin cambio de escala) y el fondo (en el modo RGB, seleccione Niveles y muestra la luz de un vaso sanguíneo como negro). Guarde estas imágenescomo archivos TIF, añadiendo &quot;alineado&quot; a sus nombres. </li></ol></li><li> Segmentación celular microglial: <ol><li> Para identificar las células GFP + en la retina central, abierta en FluoRender el archivo TIF &quot;alineado&quot; correspondiente al primer punto de tiempo / edad. Ampliar la imagen para ajustarse a la pantalla, a continuación, definir la vista Render (compuesto, ortogonal, interpolado) y sus propiedades (0,58 gamma, 255 punto de saturación, luminancia 255, 195 alfa y 1,00 sombreado), la selección tanto de los canales RG como visible (ocultar canal B haciendo doble clic en él en el marco de área de trabajo; Figura 4A). </li><li> Para seleccionar celdas individuales, umbral del canal rojo (debe ser destacado en el marco de área de trabajo), al aumentar el umbral bajo hasta que la mayoría de las células se enmascaran (blanco) con superposición de células y procesos mínimos (cian), manteniendo constante el umbral alto (255). El bajo valor umbral varía entre 100 y 170, dependiendo de la intensidad de fluorescencia (Figura 4B &lt;/ Strong&gt;). </li><li> Guardar este punto de vista con el canal rojo visible sólo (comando de captura) como un nuevo archivo TIF, y agregó que &quot;cellsegm&quot; a su nombre original (Figura 4C). Usando una trama genérica software de edición gráfica, invierta su escala de grises y ajustar la resolución de 300 dpi que el anterior, y guardar de nuevo como RGB (Figura 4D). NOTA: Elimine las carpetas (proyectos) creados automáticamente por FluoRender, y guardar el umbral aplicado para referencia futura. </li></ol></li><li> Segmentación soma microglial y morfometría: <ol><li> Para identificar GFP + somas de células para el área de la cuantificación, utilizar software de análisis de imagen con las mediciones automatizadas de intensidad y capacidades de umbral, así como a base de umbral objeto de conteo y medición. Abra el archivo TIF &quot;cellsegm&quot; y seleccionar el método de cambio de escala (spline) y el canal rojo (haga clic en la ficha roja en RGB). Mejorar la visualización desmarcando &quot;canal de vista de color&quot; (clic derecho en el RG rojoPestaña B), y seleccionando &quot;complementar los colores&quot; (Imagen / Ajustar imagen) para invertir la escala de grises y ver las celdas en color gris / negro sobre fondo blanco (Figura 4E). </li><li> Calibre la imagen para 1.4 a 1.7 mm dependiendo de la edad, dibujando una línea horizontal a través de toda la imagen (calibración, calibración rápida). </li><li> Segmento somata célula individual mediante la aplicación de umbrales de intensidad (Figura 4B). Para ello, el trabajo en el canal RGB rojo y abrir la función de Intensidad Umbral (Object Count; la selección de comandos &quot;update count&quot;) con el fin de realizar un seguimiento de los parámetros bidimensionales para cada región umbrales concretos de interés (ROI) que representa somata individual. </li><li> Definir el umbral de intensidad en el histograma de intensidad, mediante la selección de la más baja de 50-60% de los niveles 255, y refinando el valor umbral definitiva mediante la evaluación visualmente la superposición entre la máscara de color umbral (azul) y el perímetro soma celular (gris) en células individuales (Figura 4E). </li><li> Estimar la exactitud de las máscaras soma celular para representar las dimensiones Somal midiendo el área antes y después de la segmentación en 10 células y aceptar el rango de umbral seleccionado si las mediciones difieren menos del 10% (use la barra de herramientas binario y Medidas anotados). </li><li> Identificar manualmente ROI Somal que incluyen varias celdas y separan estos elementos (eliminar o ROI separadas utilizando los controles de la barra de herramientas binario, o el catálogo de objetos), mientras que alternar / desactivar el binario para visualizar directamente las células (Figura 4F). </li><li> Clasifique las células microgliales como ROI con áreas Somal más grande y más pequeño que el 50-60 micras 2 discriminar somata celda correspondiente a microglia activada y desactivada microglia, respectivamente, mediante el uso de la zona de restricción. NOTA: Cada subconjunto Somal celda se identifica con una capa binario pseudocoloreada diferente, y puede caracterizarse adicionalmente para otros parámetros morfológicos (périméter, la circularidad, etc.), así como cuantificar dentro de los sectores de la retina discretas (Figura 4G). Guarda la imagen analizada como un archivo ND2. </li><li> Verifique el proceso y la complejidad de ramificación en las células microgliales activadas individuales, mediante la superposición de la máscara Somal y la imagen -point sola xy (contraste aumentó 50%; Figura 4H). Manualmente contar los procesos que se extienden directamente desde el soma celular o medir el diámetro del polígono que abarca el eje (utilizar la barra de herramientas binario y Medidas anotados). NOTA: Activado células carecen de procesos o tienen pocos (&lt;4) y corto (&lt;2x diámetro Somal) queridos, en contraste con los procesos no activadas de células, que comprenden un cenador ramificada y extensa (&gt; 3-10x diámetro Somal) que rodea su relativamente pequeña soma. </li><li> Identificar manualmente células con expresión somata menor que &lt;20 micras 2 y / o GFP por debajo del límite de detección, por lo tanto, que no son detectados por enumbralización intensidad. Utilice el comando Taxonomía en Anotaciones a contar elementos identificados manualmente. </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Monitoreo en vivo del número de células y la activación microglial morfológica durante una enfermedad neurodegenerativa requiere el uso de métodos de imagen no invasivas que permiten la visualización detallada de las características celulares. Después de las imágenes, las células microgliales deben ser aislados (segmentado) para el análisis morfométrico mediante el uso de múltiples pasos de umbral para evaluar el tamaño Somal y / o complejidad del proceso como lecturas para la activación microglia. En est...

La microglía son células neuroimmune que residen exclusivamente en el sistema nervioso central (CNS) desde el desarrollo embrionario temprano y durante la edad adulta. Equipado con un complejo repertorio de receptores, la actividad microglial y la heterogeneidad regional se rigen por su interacción bidireccional con las neuronas vecinas, glia, barrera hematoencefálica y la infiltración de células neuroinflamatorios 1,2. Funciones microgliales basales contribuyen al mantenimiento y reparación fisiológica, ya que prueben su territorio de las perturbaciones en la homeostasis de 3,4. Durante una lesión o enfermedad del SNC, microglia son los primeros en responder a las señales neuronales que luego desencadenan su transición a un fenotipo reactiva, denominado &quot;microglia 2,5-7 activado. La activación de microglía implica un ciclo complejo de genes y la expresión de la proteína, que están acoplados a soma celular y cambiar el tamaño de proceso y la remodelación de 6-9. La activación de la microglia, así como la redistribución celular yclustering, puede ir acompañada del aumento general local en el número de células (denominado microgliosis). Esto puede ser el resultado de la proliferación celular y la auto-renovación, con o sin reclutamiento de monocitos derivados de la sangre 3,4,7,10-14. En una amplia gama de enfermedades del SNC, crónicas dependientes de la edad, sostenida microgliosis y la enfermedad paralela activación microglia progresión 15-19. Cómo microglia neurodegeneración impacto sigue siendo poco clara, principalmente porque desempeñan ambos papeles neuroprotectores y nocivos que pueden tener diversas contribuciones a la aparición de la enfermedad y la progresión. Estudios de imagen en directo dirigidas a la comprensión de la enfermedad crónica del SNC han monitoreado el comportamiento microglial en el SNC dañado de modelos animales y los seres humanos, y ha demostrado que las alteraciones microgliales son principios detectable en las etapas iniciales de la enfermedad 15-17,19,20. Por lo tanto, es fundamental para desarrollar enfoques para detectar y vigilar la activación microglial en vivo. Dete no invasivacción de los cambios regionales en la activación de la microglia cerebral se estableció como un importante indicador en vivo de la progresión de la enfermedad neurodegenerativa, utilizando la imagen molecular o bioluminiscencia y la tomografía por emisión de positrones o la resonancia magnética 18,21,22. Estos métodos de imagen molecular y nuclear altamente cuantitativos y no invasivos detectan gliosis con la resolución regional. Por otra parte, de dos fotones de imagen confocal en CX3CR1 GFP / + ratones ha permitido la observación de la microglía del cerebro con la resolución celular 3,4,9,20,23-28. Sin embargo, este enfoque limita a largo plazo y la observación repetida de alteraciones crónicas microgliales, dado el riesgo potencial de alterar su comportamiento mediante técnicas de imagen cerebral incluso mínimamente invasivos 29. Alternativamente, la retina ofrece las condiciones óptimas para la visualización directa, en vivo y monitoreo repetido de microglia en su intacta nicho SNC largo envejecimiento, después de una lesión aguda, ypotencialmente durante enfermedades neurodegenerativas crónicas. Así, los estudios recientes han demostrado la viabilidad de imágenes de alta resolución de la microglía de la retina que expresan GFP mediante la adaptación de la oftalmoscopía confocal de barrido láser (cSLO) a la imagen en vivo CX3CR1 GFP / + ratones. Esto ha sido utilizado para rastrear los cambios semanales en GFP + el número de células en ratones individuales de hasta 10 semanas después de la lesión aguda inducida o hipertensión ocular 30-36. Hemos extendido este enfoque para realizar las imágenes a largo plazo durante varios meses, y cuantitativamente seguimiento de los cambios en la activación de la microglia en función del tamaño soma usando análisis morfométrico. Tamaño Somal se definió como una métrica útil de la activación de la microglia en los estudios de imagen en vivo de dos fotones usando microscopía confocal en rodajas corticales para realizar imágenes in vivo de CX3CR1-GFP + microglia 9. Estos y otros estudios también demostraron la correlación entre el tamaño Somal y los niveles de expresión de la proteína Iba1, whICH también aumenta con la activación de 9,37. Por lo tanto, microglia activada puede ser identificado en ratones vivos, y su número y distribución monitoreado en el tiempo durante la salud y la enfermedad del SNC. Este protocolo describe métodos para la adquisición de imágenes en vivo cSLO y análisis para controlar el número de células microgliales, la distribución y la activación morfológica durante células ganglionares (RGC) degeneración de la retina (Figura 1). Por lo tanto, este estudio utiliza: 1) un modelo de ratón de glaucoma heredado (DBA / 2J) que sufre nervio óptico dependiente de la edad y la neurodegeneración de la retina y muestra una notable variabilidad en la progresión de la enfermedad entre 5 y 10 meses de edad 38,39, 2) mensual cSLO de formación de imágenes in vivo para la visualización a largo plazo de las células GFP + en la retina y el nervio óptico unmyelinated de heterocigotos CX3CR1 GFP / + ratones DBA / 2J de edad 3-5 meses, 3) análisis de imágenes en vivo por la segmentación y de umbral para aislar somas de células y medida laárea de IR. Estas estrategias se aplican para evaluar la cinética de estados de activación microglial de la retina durante las primeras etapas de glaucoma crónico.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="2010">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:617px;">Name</td>
			<td style="width:444px;">Company</td>
			<td style="width:208px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:741px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:617px;">DBA/2J and 
			CX3CR1-GFP/+ mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME</td>
			<td>000671 and 00582</td>
			<td>Mice are breed in-house, introducing new breeders every 3 to 4 generations to prevent genetic drift.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">301/2G needle and 1 ml tuberculin slip-tip syringe</td>
			<td>BD, East Rutherford, NJ</td>
			<td>305106 and 309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:617px;">2,2,2-tribromoethanol, tert-Amyl alcohol 99% and phosphate buffer saline tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>T48402, 152463 and P4417</td>
			<td>Avertin solution (pH 7.3, sterile filtered) must be freshly made solution or stored at 4&#186;C for up to 1 week.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heat therapy T/Pump</td>
			<td>Gaymar Industries, Orchard Park, NY</td>
			<td>TP-650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cotton-tipped applicators</td>
			<td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td>23-400-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tropicamide 1%&#160;</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb, Rochester, NY</td>
			<td>NDC 24208-585-64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PMMA contact lenses, 1.70-base curve, 3.2 mm total diameter, 0.40 mm-thick center</td>
			<td>Cantor &#38; Nissel Ltd., Northamptonshire, UK</td>
			<td>G003709</td>
			<td>Lenses are rinsed with sterile PBS and stored in polypropylene boxes.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HRA/Spectralis confocal scanning laser ophthalmoscope and Eye Explorer software</td>
			<td>Heidelberg Engineering GmbH, Carlsbad, CA</td>
			<td>Version 1.7.1.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PowerPoint</td>
			<td>Microsoft, Redmond, WA</td>
			<td>Version 14.4.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adobe Photoshop</td>
			<td>Adobe, San Jose, CA</td>
			<td>Version CS3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FluoRender</td>
			<td>Scientific Computing and Imaging Institute, University of Utah</td>
			<td>Version 2.13</td>
			<td>Freeware. http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NIS-Elements C</td>
			<td>Nikon, Melville, NY</td>
			<td>Version 4.30.01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo dynamics of retinal microglial activation during neurodegeneration: confocal ophthalmoscopic imaging and cell morphometry in mouse glaucoma

La microglía, que son células neuroimmune CNS residentes, transforman su morfología y tamaño en respuesta al daño del SNC, el cambio a un estado activado con funciones distintas y perfiles de expresión génica. Los papeles de la activación microglial en la salud, lesiones y enfermedades Todavía no se entiende debido a su regulación dinámica y compleja en respuesta a los cambios en su microambiente. Por lo tanto, es crítico para el monitor de forma no invasiva y analizar cambios en la activación microglial en el tiempo en el organismo intacto. Estudios in vivo de la activación microglial se han retrasado por las limitaciones técnicas para el seguimiento de la conducta microglial sin alterar el entorno del SNC. Esto ha sido particularmente difícil durante la neurodegeneración crónica, donde los cambios a largo plazo deben ser rastreados. La retina, un órgano CNS susceptibles de imágenes en vivo no invasiva, ofrece un potente sistema para visualizar y caracterizar la dinámica de la activación de la microglia durante trastornos crónicos. en vivo de la microglía de la retina, usando oftalmoscopia confocal (cSLO) y ratones / + reportero CX3CR1 GFP, para visualizar la microglia con la resolución celular. Además, se describen los métodos para cuantificar los cambios mensuales en la activación celular y la densidad en grandes subconjuntos de células (200-300 células por la retina). Confirmamos el uso de la zona de Somal como una métrica útil para el seguimiento en directo de la activación microglial en la retina mediante la aplicación de análisis morfométricos basados ​​umbral automatizado de imágenes en vivo. Utilizamos estos adquisición de imágenes en directo y análisis de estrategias para monitorear los cambios dinámicos en la activación microglial y microgliosis durante las primeras etapas de la neurodegeneración de la retina en un modelo murino de glaucoma crónico. Este enfoque debe ser útil para investigar las contribuciones de microglia a declive neuronal y axonal en los trastornos crónicos del sistema nervioso central que afectan a la retina y el nervio óptico.

Nuestros reciente in vivo estudios utilizaron estos métodos de adquisición y análisis de imágenes en vivo de visualizar y realizar un seguimiento de la cinética y los patrones de la CNO y cambios microgliales retina durante las primeras etapas del glaucoma crónico y su relación con finales de neurodegeneración 59. Aquí ilustramos un protocolo de adquisición de imágenes cSLO de visualizar las células microgliales en una gran área de la retina central en individuales jóvenes heterocigotos...

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In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

La activación de la microglia y microgliosis son respuestas clave a la neurodegeneración crónica. A continuación, presentamos los métodos para in vivo, visualización a largo plazo de la retina células microgliales CX3CR1-GFP + por oftalmoscopía confocal y de umbral y los análisis morfométricos para identificar y cuantificar su activación. Hacemos un seguimiento de los cambios microgliales durante las primeras etapas del glaucoma relacionada con la edad.

En Vivo Dinámica de Retina Microglial Activación Durante Neurodegeneración: Confocal oftalmoscópico Imaging y Morfometría celular en el ratón Glaucoma

Microglia, which are CNS-resident neuroimmune cells, transform their morphology and size in response to CNS damage, switching to an activated state with ...

in-vivo-dynamics-retinal-microglial-activation-during

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

10.5K vistas.  University of Utah.  La activación de la microglia y microgliosis son respuestas clave a la neurodegeneración crónica. A continuación, presentamos los métodos para in vivo, visualización a largo plazo de la retina células microgliales CX3CR1-GFP + por oftalmoscopía confocal y de umbral y los análisis morfométricos para identificar y cuantificar su activación. Hacemos un seguimiento de los cambios microgliales durante las primeras etapas del glaucoma relacionada con la eda...

Video: In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-fotón imágenes de invasión de células tumorales en un modelo de ratón ortotópico de carcinoma oral de células escamosas

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Investigación

Medicina

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There is little knowledge about in situ, in vivo, tumor hypoxia during intracranial development of malignant brain tumors because of lack of efficient means to monitor it in these deep-seated orthotopic tumors. Bioluminescence imaging (BLI), based on the detection of light emitted by living cells expressing a luciferase gene, has been rapidly adopted for cancer research, in particular, to evaluate tumor growth or tumor size changes in response to treatment in preclinical animal studies. Moreover, by expressing a reporter gene under the control of a promoter sequence, the specific gene expression can be monitored non-invasively by BLI. Under hypoxic stress, signaling responses are mediated mainly via the hypoxia inducible factor-1&alpha; (HIF-1&alpha;) to drive transcription of various genes. Therefore, we have used a HIF-1&alpha; reporter construct, 5HRE-ODD-luc, stably transfected into human breast cancer MDA-MB231 cells (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay is performed by incubating the transfected cells in a hypoxic chamber (0.1% O2) for 24 hr before BLI, while the cells in normoxia (21% O2) serve as a control. Significantly higher photon flux observed for the cells under hypoxia suggests an increased HIF-1&alpha; binding to its promoter (HRE elements), as compared to those in normoxia. Cells are injected directly into the mouse brain to establish a breast cancer brain metastasis model. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics is initiated 2 wks after implantation and repeated once a week. BLI reveals increasing light signals from the brain as the tumor progresses, indicating increased intracranial tumor hypoxia. Histological and immunohistochemical studies are used to confirm the in vivo imaging results. Here, we will introduce approaches of in vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay, surgical establishment of a breast cancer brain metastasis in a nude mouse and application of in vivo bioluminescence imaging to monitor intracranial tumor hypoxia.

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Bioluminescence imaging of hypoxia inducible factor-1&alpha; activity is applied to monitor intracranial tumor hypoxia development in a breast cancer brain metastasis mouse model.

Imágenes in vivo de tumores bioluminiscencia Dinámica hipoxia de la metástasis cerebral cáncer de mama en un modelo de ratón

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite fluorescent in situ elements through the optical fibers, and then record some of the emitted photons, via the same optical fibers. The light source is a laser that sends the exciting light through an element within the fiber bundle and as it scans over the sample, recreates an image pixel by pixel. As this scan is very fast, by combining it with dedicated image processing software, images in real time with a frequency of 12 frames/sec can be obtained.
We developed a technique to quantitatively characterize capillary morphology and function, using a confocal fluorescence videomicroscopy device. The first step in our experiment was to record 5 sec movies in the four quadrants of the tumor to visualize the capillary network. All movies were processed using software (ImageCell, Mauna Kea Technology, Paris France) that performs an automated segmentation of vessels around a chosen diameter (10 &mu;m in our case). Thus, we could quantify the 'functional capillary density', which is the ratio between the total vessel area and the total area of the image. This parameter was a surrogate marker for microvascular density, usually measured using pathology tools.
The second step was to record movies of the tumor over 20 min to quantify leakage of the macromolecular contrast agent through the capillary wall into the interstitium. By measuring the ratio of signal intensity in the interstitium over that in the vessels, an 'index leakage' was obtained, acting as a surrogate marker for capillary permeability.

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

In this paper, we present a method to analyze tumor microvessels in vivo using dynamic contrast-enhanced fluorescence videomicroscopy. Two quantitative parameters were acquired: functional capillary density reflecting the vascularity of the tumor, and index leakage reflecting the leakiness of the endothelial wall.

Imágenes in vivo de la angiogénesis tumoral usando fluorescencia confocal videomicroscopia

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

In vivo MRI de 19F para el seguimiento de la célula

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

Secuencial<em&gt; En vivo</em&gt; Imagen de células madre / progenitoras osteogénicas durante la reparación de la fractura

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. Despite the discovery of key regulators of uterine contractility, this process is still not fully understood. Transgenic mice provide an ideal model in which to study parturition. Previously, the only method to study uterine contractility in the mouse was ex vivo isometric tension recordings, which are suboptimal for several reasons. The uterus must be removed from its physiological environment, a limited time course of investigation is possible, and the mice must be sacrificed. The recent development of radiometric telemetry has allowed for longitudinal, real-time measurements of in vivo intrauterine pressure in mice. Here, the implantation of an intrauterine telemeter to measure pressure changes in the mouse uterus from mid-pregnancy until delivery is described. By comparing differences in pressures between wild type and transgenic mice, the physiological impact of a gene of interest can be elucidated. This technique should expedite the development of therapeutics used to treat myometrial disorders during pregnancy, including preterm labor.

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

This manuscript provides a protocol for implanting telemeters in the mouse for the purpose of measuring intrauterine pressures during pregnancy.

Telemetría intrauterina para medir la presión del ratón contráctil<em&gt; En Vivo</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to image cellular events in an intact animal. Additionally, the ability to induce physiological disease states such as stroke in vivo increases its utility. The technique described herein allows for physiological assessment of cellular responses within the CNS following a stroke and can be adapted for other pathological conditions being studied. The technique presented uses laser excitation of the photosensitive dye Rose Bengal in vivo to induce a focal ischemic event in a single blood vessel. 
The video protocol demonstrates the preparation of a thin-skulled cranial window over the somatosensory cortex in a mouse for the induction of a Rose Bengal photothrombotic event keeping injury to the underlying dura matter and brain at a minimum. Surgical preparation is initially performed under a dissecting microscope with a custom-made surgical/imaging platform, which is then transferred to a confocal microscope equipped with an inverted objective adaptor. Representative images acquired utilizing this protocol are presented as well as time-lapse sequences of stroke induction. This technique is powerful in that the same area can be imaged repeatedly on subsequent days facilitating longitudinal in vivo studies of pathological processes following stroke.

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

Here, we describe a semi-invasive optical microscopy approach for the induction of a Rose Bengal photothrombotic clot in the somatosensory cortex of a mouse in vivo. The technical aspects of the imaging procedure are described from induction of a photothrombotic event to application and data collection.

Rosa de Bengala Photothrombosis por imagen óptica confocal<em&gt; En Vivo</em&gt;: Un modelo de solo recipiente Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the brain for visual perception. Damage to RGCs and their axons leads to vision loss and/or blindness. Although the specific cause of glaucoma is unknown, the primary risk factor for the disease is an elevated intraocular pressure. Glaucoma-inducing procedures in animal models are a valuable tool to researchers studying the mechanism of RGC death. Such information can lead to the development of effective neuroprotective treatments that could aid in the prevention of vision loss. The protocol in this paper describes a method of inducing glaucoma - like conditions in an in vivo rat model where 50 &#181;l of 2 M hypertonic saline is injected into the episcleral venous plexus. Blanching of the vessels indicates successful injection. This procedure causes loss of RGCs to simulate glaucoma. One month following injection, animals are sacrificed and eyes are removed. Next, the cornea, lens, and vitreous are removed to make an eyecup. The retina is then peeled from the back of the eye and pinned onto sylgard dishes using cactus needles. At this point, neurons in the retina can be stained for analysis. Results from this lab show that approximately 25% of RGCs are lost within one month of the procedure when compared to internal controls. This procedure allows for quantitative analysis of retinal ganglion cell death in an in vivo rat glaucoma model.

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis.

Glaucoma de inducir en un Procedimiento<em&gt; En Vivo</em&gt; Modelo de rata y Todo el montaje-Retina Preparación

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

El agotamiento de las células de ratón a partir de xenoinjertos de tumores humanos mejora significativamente análisis de aguas abajo de las células diana

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, diabetic retinopathy, age-related macular degeneration (AMD) and other ocular inflammatory conditions. It may also help to monitor the therapeutic responses in the eye. The proper labeling of the blood cells, coupled with live-cell imaging of the labeled cells, allows for the investigation of the flow dynamics in the retinal and choroidal circulation. Here, we describe the standardized protocols of 1.5% indocyanine green (ICG) and 1% sodium fluorescein labeling of mice erythrocytes and leukocytes, respectively. Scanning laser ophthalmoscopy (SLO) was applied to visualize the labeled cells in the retinal circulation of C57BL/6J mice (wild type). Both methods demonstrated distinct fluorescently labeled cells in the mouse retinal circulation. These labeling methods can have wider applications in various ocular disease models.

Live-cell imaging of the labeled blood cells in ocular circulation can provide information about inflammation and ischemia in diabetic retinopathy and age-related macular degeneration. A protocol to label blood cells and image the labeled cells in the retinal circulation is described.

Etiquetado de colorantes fluorescentes de eritrocitos y leucocitos para estudiar la dinámica de flujo en la circulación de la retina del ratón

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, ...