We thank the Scientific Computing and Imaging Institute of the University of Utah for use of FluoRender software (R01GM09815). This work was supported by grants from the Glaucoma Research Foundation, Melsa M. and Frank Theodore Barr Foundation and the US National Institute of Health, (R01EY020878 and R01EY023621) to M.L.V., and (R01EY017182 and R01EY017950) to B.K.A.

The authors have nothing to disclose.

ניטור חי של מספר תא microglial והפעלה מורפולוגיים במחלה ניוונית של מערכת עצבים מחייב השימוש בשיטות הדמיה לא פולשנית המאפשרות הדמיה מפורטת של תכונות תא. לאחר הדמיה, תאי microglial חייבים להיות מבודדים (מפולח) לניתוח morphometric על ידי שימוש בצעדי סף מרובים כדי להעריך גודל somal ו / או מ?...

Microglia הם תאי neuroimmune שבאופן בלעדי מתגוררים במערכת העצבים המרכזית (CNS) מאז התפתחות עוברית המוקדמת וברחבי בגרות. מצויד ברפרטואר מורכב של קולטנים, פעילות microglial וההטרוגניות אזורית מוסדרות על ידי יחסי הגומלין שלהם עם תאי עצב דו-כיווניים שכנים, גליה, מחסום דם-מוח וחדירת תאי neuroinflammatory 1,2. פונקציות microglial בסיסיות תורמות לתחזוקה ותיקון פיסיולוגיים, כפי שהם לטעום את הטריטוריה שלהם להפרעות ב3,4 הומאוסטזיס. במהלך פציעה במערכת העצבים המרכזית או מחלה, מיקרוגלים הם המגיבים הראשונים לאותות עצביים שלאחר מכן יפעילו את המעבר שלהם לפנוטיפ תגובה, המכונה &quot;מופעל מיקרוגלים 2,5-7. הפעלת Microglia כרוכה מחזור מורכב של גנים והחלבונים ביטוי, שהם מצמידים לסומה תא ושינוי גודל תהליך שיפוץ 6-9. הפעלת מיקרוגלים, כמו גם חלוקה מחדש תא ואשכולות, יכולים להיות מלווה העלייה הכוללת המקומית במספר התאים (microgliosis מכונה). זה יכול להיגרם כתוצאה מהתפשטות תאים והתחדשות עצמית, עם או בלי גיוס של מונוציטים דם נגזרות 3,4,7,10-14. במגוון רחב של מחלות של מערכת העצבים המרכזית כרוניות תלוי גיל, ספג microgliosis ומחלה מקבילה הפעלת מיקרוגלי התקדמות 15-19. איך מיקרוגלי ניוון מוחיים השפעה עדיין לא ברור, בעיקר בגלל שהם משחקים שני תפקידי neuroprotective ומזיקים שעשויות להיות תרומה מגוונת להופעת מחלה והתקדמות. מחקרי הדמיה חיה להבנת מחלה של מערכת העצבים המרכזית כרונית במעקב התנהגות microglial במערכת העצבים המרכזית הפגומה של מודלים של בעלי חיים ובני אדם, והראו כי שינויי microglial מתחילים להבחין בשלבים המוקדמים של מחלה 15-17,19,20. לפיכך, חשוב לפתח גישות כדי לזהות ולעקוב אחר הפעלת microglial in vivo. Dete לא פולשניסיפורת של שינויים אזוריים בהפעלת מיקרוגלי המוח הוקמה כחשוב במחוון vivo של התקדמות מחלה ניוונית של מערכת עצבים, באמצעות הדמיה מולקולרית או טומוגרפיה פליטת אור ופליטת פוזיטרונים או הדמיה בתהודה מגנטית 18,21,22. שיטות הדמיה מולקולרית וגרעינית כמותי מאוד ולא פולשני אלה לזהות דבקים עם רזולוציה אזורית. לחלופין, ההדמיה confocal שני פוטונים בCX3CR1 GFP / + עכברים אפשרה התצפית של מיקרוגליה מוח עם רזולוציה סלולרית 3,4,9,20,23-28. עם זאת, גישה זו מגבילה לטווח ארוך ותצפית חוזרת ונשנית של שינויי microglial כרוניים, בהתחשב בסיכון הפוטנציאלי של הפרעת ההתנהגות שלהם על ידי נהלי הדמיה מוחית אפילו פולשנית 29. לחלופין, הרשתית מציעה תנאים אופטימליים לישירים, בהדמית vivo וניטור חוזר ונשנה של מיקרוגליה בנישה של מערכת העצבים המרכזית בשלמותם לאורך הזדקנות, בעקבות פציעה אקוטית, ופוטנציאל במחלות ניווניות כרוניות. כך, מחקרים שנעשו לאחרונה הוכיחו את הכדאיות של הדמיה ברזולוציה הגבוהה של מיקרוגליה רשתית להביע GFP ידי התאמת ophthalmoscopy סריקת confocal הלייזר (cSLO) לתמונה החי CX3CR1 GFP / + עכברים. זה נעשה שימוש כדי לעקוב אחר שינויים שבועיים במספרי GFP + תא בעכברים בודדים לתקופה של עד 10 שבועות בעקבות פציעה נגרמה בחריפות או לחץ תוך עיני מוגבר 30-36. הרחבנו גישה זו כדי לבצע הדמיה לטווח ארוך על פני כמה חודשים, וכמותית לעקוב אחר שינויים בהפעלת מיקרוגליה מבוססים על גודל סומה באמצעות ניתוח morphometric. גודל Somal הוגדר כמדד שימושי של הפעלת מיקרוגליה במחקרי הדמיה חיים באמצעות מיקרוסקופ confocal שני פוטונים בפרוסות בקליפת המוח לבצע בהדמיה vivo של CX3CR1-GFP + מיקרוגלים 9. מחקרים אלה ואחרים הפגינו גם המתאם בין גודל somal והרמות של ביטוי חלבון Iba1, ש&quot;שich גם עולה עם הפעלה 9,37. לפיכך, מיקרוגלים מופעלים יכולים להיות מזוהים בעכברים חיים, והמספרים והפצתם במעקב לאורך זמן בבריאות מערכת העצבים המרכזית ומחלות. פרוטוקול זה מתאר שיטות לרכישת cSLO חי תמונה וניתוח לעקוב אחר מספרים סלולריים microglial, הפצה והפעלה מורפולוגיים בניוון רשתית תא גנגליון (RGC) (איור 1). כך, מחקר זה משתמש ב: 1) מודל עכבר של גלאוקומה בירושה (DBA / י 2) שעוברת עצב ראייה תלוי גיל וניוון של מערכת עצבים ורשתית תערוכות שונות מדהים בהתקדמות מחלה בין 5 ל 10 חודשים של גיל 38,39, 2) חודשי cSLO in vivo הדמיה להדמיה לטווח ארוך של ה- GFP + תאים ברשתית ועצב הראייה unmyelinated של ה- GFP / + DBA / י 2 עכברים הטרוזיגוטיים Cx3cr1 בגילי 3-5 חודשים, 3) ניתוח הדמיה לחיות בפילוח וthresholding לבודד תאי סומא ומידהאזור IR. אסטרטגיות אלו מיושמות על מנת להעריך את קינטיקה של מדינות הפעלת microglial רשתית בגלאוקומה כרונית בשלבים מוקדמים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="2010">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:617px;">Name</td>
			<td style="width:444px;">Company</td>
			<td style="width:208px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:741px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:617px;">DBA/2J and 
			CX3CR1-GFP/+ mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME</td>
			<td>000671 and 00582</td>
			<td>Mice are breed in-house, introducing new breeders every 3 to 4 generations to prevent genetic drift.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">301/2G needle and 1 ml tuberculin slip-tip syringe</td>
			<td>BD, East Rutherford, NJ</td>
			<td>305106 and 309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:617px;">2,2,2-tribromoethanol, tert-Amyl alcohol 99% and phosphate buffer saline tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>T48402, 152463 and P4417</td>
			<td>Avertin solution (pH 7.3, sterile filtered) must be freshly made solution or stored at 4&#186;C for up to 1 week.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heat therapy T/Pump</td>
			<td>Gaymar Industries, Orchard Park, NY</td>
			<td>TP-650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cotton-tipped applicators</td>
			<td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td>23-400-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tropicamide 1%&#160;</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb, Rochester, NY</td>
			<td>NDC 24208-585-64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PMMA contact lenses, 1.70-base curve, 3.2 mm total diameter, 0.40 mm-thick center</td>
			<td>Cantor &#38; Nissel Ltd., Northamptonshire, UK</td>
			<td>G003709</td>
			<td>Lenses are rinsed with sterile PBS and stored in polypropylene boxes.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HRA/Spectralis confocal scanning laser ophthalmoscope and Eye Explorer software</td>
			<td>Heidelberg Engineering GmbH, Carlsbad, CA</td>
			<td>Version 1.7.1.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PowerPoint</td>
			<td>Microsoft, Redmond, WA</td>
			<td>Version 14.4.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adobe Photoshop</td>
			<td>Adobe, San Jose, CA</td>
			<td>Version CS3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FluoRender</td>
			<td>Scientific Computing and Imaging Institute, University of Utah</td>
			<td>Version 2.13</td>
			<td>Freeware. http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NIS-Elements C</td>
			<td>Nikon, Melville, NY</td>
			<td>Version 4.30.01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo dynamics of retinal microglial activation during neurodegeneration: confocal ophthalmoscopic imaging and cell morphometry in mouse glaucoma

<html> מיקרוגלים, שהם תאים במערכת העצבים המרכזית neuroimmune-תושב, להפוך המורפולוגיה והגודל שלהם בתגובה לנזק במערכת העצבים המרכזית, מעבר למצב מופעל עם פונקציות שונות ופרופילי ביטוי גנים. התפקידים של הפעלת microglial בבריאות, פציעה ומחלה נשארים הבינו באופן חלקי בשל הרגולציה הדינמית והמורכבת שלהם בתגובה לשינויים במייקרו-הסביבה שלהם. לכן, זה הוא קריטי לצג הלא פולשני ולנתח שינויים בהפעלת microglial לאורך זמן באורגניזם שלם. במחקרי vivo של הפעלת microglial עוכבו על ידי מגבלות טכניות להתנהגות microglial מעקב מבלי לשנות את הסביבה במערכת העצבים המרכזית. זה היה מאתגר במיוחד בניוון מוחיה כרוני, שבו שינויים לטווח ארוך חייבים להיות במעקב. הרשתית, איבר של מערכת העצבים המרכזית ניתנים להדמית חיה לא פולשנית, מציעה מערכת חזקה לדמיין ולאפיין את הדינמיקה של הפעלת מיקרוגליה בהפרעות כרוניות. התחת = &quot;jove_content&quot;&gt; פרוטוקול זה מתאר שיטות לטווח ארוך הדמיה, in vivo של מיקרוגליה רשתית, באמצעות ophthalmoscopy confocal (cSLO) ועכברים / + כתב CX3CR1 GFP, לדמיין microglia עם רזולוציה סלולרית. כמו כן, אנו מתארים שיטות לכמת את השינויים חודשיים בהפעלת תא וצפיפות בתת תא גדול (200-300 תאים לכל רשתית). אנו מאשרים את השימוש בשטח somal כמדד שימושי למעקב חי של הפעלת microglial ברשתית על ידי יישום ניתוח morphometric מבוסס סף אוטומטי של תמונות בvivo. אנו משתמשים ברכישת תמונה בשידור חי אלה ומנתח את אסטרטגיות לעקוב אחר השינויים הדינמיים בהפעלה וmicrogliosis microglial במהלך שלבים המוקדמים של ניוון של מערכת עצבי רשתית במודל עכבר של גלאוקומה כרונית. גישה זו צריכה להיות שימושית כדי לחקור את תרומתם של מיקרוגליה לירידה עצבית והפרעות במערכת העצבים המרכזית בaxonal כרוניות המשפיעות על הרשתית ועצב ראייה.

האחרון במחקרי vivo שלנו השתמשו בשיטות רכישת תמונה וניתוח חיות אלה כדי לחזות ולעקוב אחר קינטיקה ודפוסי ONH ושינויי microglial רשתית בגלאוקומה כרונית ומערכת היחסים שלהם בשלבים מוקדמים למאוחר ניוון מוחיים 59. כאן אנו מדגימים פרוטוקול רכישת תמונת cSLO לדמיין תאי microglial ?...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma at JoVE.co

In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

הפעלת המיקרוגלים וmicrogliosis הן תגובות מפתח לניוון של מערכת עצבים כרוניות. כאן, אנו מציגים שיטות לin vivo, הדמיה לטווח הארוך של תאים ברשתית microglial CX3CR1-GFP + על ידי ophthalmoscopy confocal, ולסף וmorphometric מנתח לזהות ולכמת ההפעלה שלהם. אנו עוקבים אחר שינויי microglial בגלאוקומה הקשורות לגיל שלבים מוקדמים.

בVivo הדינמיקה של רשתית microglial הפעלה במהלך מוחיה: Confocal Ophthalmoscopic הדמיה וMorphometry הסלולרי בעכבר גלאוקומה

Microglia, which are CNS-resident neuroimmune cells, transform their morphology and size in response to CNS damage, switching to an activated state with ...

in-vivo-dynamics-retinal-microglial-activation-during

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

10.5K Views.  University of Utah.  הפעלת המיקרוגלים וmicrogliosis הן תגובות מפתח לניוון של מערכת עצבים כרוניות. כאן, אנו מציגים שיטות לin vivo, הדמיה לטווח הארוך של תאים ברשתית microglial CX3CR1-GFP + על ידי ophthalmoscopy confocal, ולסף וmorphometric מנתח לזהות ולכמת ההפעלה שלהם. אנו עוקבים אחר שינויי microgl...

Video: In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-פוטון הדמיה של הפלישה תאים סרטניים במודל עכבר orthotopic של קרצינומה של תאים קשקשיים אוראלי

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There is little knowledge about in situ, in vivo, tumor hypoxia during intracranial development of malignant brain tumors because of lack of efficient means to monitor it in these deep-seated orthotopic tumors. Bioluminescence imaging (BLI), based on the detection of light emitted by living cells expressing a luciferase gene, has been rapidly adopted for cancer research, in particular, to evaluate tumor growth or tumor size changes in response to treatment in preclinical animal studies. Moreover, by expressing a reporter gene under the control of a promoter sequence, the specific gene expression can be monitored non-invasively by BLI. Under hypoxic stress, signaling responses are mediated mainly via the hypoxia inducible factor-1&alpha; (HIF-1&alpha;) to drive transcription of various genes. Therefore, we have used a HIF-1&alpha; reporter construct, 5HRE-ODD-luc, stably transfected into human breast cancer MDA-MB231 cells (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay is performed by incubating the transfected cells in a hypoxic chamber (0.1% O2) for 24 hr before BLI, while the cells in normoxia (21% O2) serve as a control. Significantly higher photon flux observed for the cells under hypoxia suggests an increased HIF-1&alpha; binding to its promoter (HRE elements), as compared to those in normoxia. Cells are injected directly into the mouse brain to establish a breast cancer brain metastasis model. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics is initiated 2 wks after implantation and repeated once a week. BLI reveals increasing light signals from the brain as the tumor progresses, indicating increased intracranial tumor hypoxia. Histological and immunohistochemical studies are used to confirm the in vivo imaging results. Here, we will introduce approaches of in vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay, surgical establishment of a breast cancer brain metastasis in a nude mouse and application of in vivo bioluminescence imaging to monitor intracranial tumor hypoxia.

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Bioluminescence imaging of hypoxia inducible factor-1&alpha; activity is applied to monitor intracranial tumor hypoxia development in a breast cancer brain metastasis mouse model.

בתחום ההדמיה vivo של פליטת אור Dynamics היפוקסיה גידול של גרורות סרטן השד המוח במודל של עכברים

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite fluorescent in situ elements through the optical fibers, and then record some of the emitted photons, via the same optical fibers. The light source is a laser that sends the exciting light through an element within the fiber bundle and as it scans over the sample, recreates an image pixel by pixel. As this scan is very fast, by combining it with dedicated image processing software, images in real time with a frequency of 12 frames/sec can be obtained.
We developed a technique to quantitatively characterize capillary morphology and function, using a confocal fluorescence videomicroscopy device. The first step in our experiment was to record 5 sec movies in the four quadrants of the tumor to visualize the capillary network. All movies were processed using software (ImageCell, Mauna Kea Technology, Paris France) that performs an automated segmentation of vessels around a chosen diameter (10 &mu;m in our case). Thus, we could quantify the 'functional capillary density', which is the ratio between the total vessel area and the total area of the image. This parameter was a surrogate marker for microvascular density, usually measured using pathology tools.
The second step was to record movies of the tumor over 20 min to quantify leakage of the macromolecular contrast agent through the capillary wall into the interstitium. By measuring the ratio of signal intensity in the interstitium over that in the vessels, an 'index leakage' was obtained, acting as a surrogate marker for capillary permeability.

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

In this paper, we present a method to analyze tumor microvessels in vivo using dynamic contrast-enhanced fluorescence videomicroscopy. Two quantitative parameters were acquired: functional capillary density reflecting the vascularity of the tumor, and index leakage reflecting the leakiness of the endothelial wall.

בהדמית vivo של אנגיוגנזה גידול באמצעות הקרינה Confocal Videomicroscopy

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

בF-MRI 19 vivo למעקב סלולרי

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

עוקב<em&gt; בvivo</em&gt; הדמיה של תאי גזע / אב osteogenic במהלך תיקון שבר

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. Despite the discovery of key regulators of uterine contractility, this process is still not fully understood. Transgenic mice provide an ideal model in which to study parturition. Previously, the only method to study uterine contractility in the mouse was ex vivo isometric tension recordings, which are suboptimal for several reasons. The uterus must be removed from its physiological environment, a limited time course of investigation is possible, and the mice must be sacrificed. The recent development of radiometric telemetry has allowed for longitudinal, real-time measurements of in vivo intrauterine pressure in mice. Here, the implantation of an intrauterine telemeter to measure pressure changes in the mouse uterus from mid-pregnancy until delivery is described. By comparing differences in pressures between wild type and transgenic mice, the physiological impact of a gene of interest can be elucidated. This technique should expedite the development of therapeutics used to treat myometrial disorders during pregnancy, including preterm labor.

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

This manuscript provides a protocol for implanting telemeters in the mouse for the purpose of measuring intrauterine pressures during pregnancy.

טלמטריה תוך רחמי למדידת לחץ עכבר התכווצות<em&gt; In vivo</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to image cellular events in an intact animal. Additionally, the ability to induce physiological disease states such as stroke in vivo increases its utility. The technique described herein allows for physiological assessment of cellular responses within the CNS following a stroke and can be adapted for other pathological conditions being studied. The technique presented uses laser excitation of the photosensitive dye Rose Bengal in vivo to induce a focal ischemic event in a single blood vessel. 
The video protocol demonstrates the preparation of a thin-skulled cranial window over the somatosensory cortex in a mouse for the induction of a Rose Bengal photothrombotic event keeping injury to the underlying dura matter and brain at a minimum. Surgical preparation is initially performed under a dissecting microscope with a custom-made surgical/imaging platform, which is then transferred to a confocal microscope equipped with an inverted objective adaptor. Representative images acquired utilizing this protocol are presented as well as time-lapse sequences of stroke induction. This technique is powerful in that the same area can be imaged repeatedly on subsequent days facilitating longitudinal in vivo studies of pathological processes following stroke.

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

Here, we describe a semi-invasive optical microscopy approach for the induction of a Rose Bengal photothrombotic clot in the somatosensory cortex of a mouse in vivo. The technical aspects of the imaging procedure are described from induction of a photothrombotic event to application and data collection.

רוז בנגל Photothrombosis ידי דימות אופטי Confocal<em&gt; In vivo</em&gt;: דגם של שבץ כלי אחד

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the brain for visual perception. Damage to RGCs and their axons leads to vision loss and/or blindness. Although the specific cause of glaucoma is unknown, the primary risk factor for the disease is an elevated intraocular pressure. Glaucoma-inducing procedures in animal models are a valuable tool to researchers studying the mechanism of RGC death. Such information can lead to the development of effective neuroprotective treatments that could aid in the prevention of vision loss. The protocol in this paper describes a method of inducing glaucoma - like conditions in an in vivo rat model where 50 &#181;l of 2 M hypertonic saline is injected into the episcleral venous plexus. Blanching of the vessels indicates successful injection. This procedure causes loss of RGCs to simulate glaucoma. One month following injection, animals are sacrificed and eyes are removed. Next, the cornea, lens, and vitreous are removed to make an eyecup. The retina is then peeled from the back of the eye and pinned onto sylgard dishes using cactus needles. At this point, neurons in the retina can be stained for analysis. Results from this lab show that approximately 25% of RGCs are lost within one month of the procedure when compared to internal controls. This procedure allows for quantitative analysis of retinal ganglion cell death in an in vivo rat glaucoma model.

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis.

גלאוקומה וישכנע נוהל בבית<em&gt; In vivo</em&gt; מודל עכברוש ואת כל הר רשתית הכנה

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

חסך בתאי עכבר מן xenografts גידול האנושי משפר משמעותי ניתוח במורד זרם של תאי יעד

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, diabetic retinopathy, age-related macular degeneration (AMD) and other ocular inflammatory conditions. It may also help to monitor the therapeutic responses in the eye. The proper labeling of the blood cells, coupled with live-cell imaging of the labeled cells, allows for the investigation of the flow dynamics in the retinal and choroidal circulation. Here, we describe the standardized protocols of 1.5% indocyanine green (ICG) and 1% sodium fluorescein labeling of mice erythrocytes and leukocytes, respectively. Scanning laser ophthalmoscopy (SLO) was applied to visualize the labeled cells in the retinal circulation of C57BL/6J mice (wild type). Both methods demonstrated distinct fluorescently labeled cells in the mouse retinal circulation. These labeling methods can have wider applications in various ocular disease models.

Live-cell imaging of the labeled blood cells in ocular circulation can provide information about inflammation and ischemia in diabetic retinopathy and age-related macular degeneration. A protocol to label blood cells and image the labeled cells in the retinal circulation is described.

פלואורסצנטי Dye תיוג של Erythrocytes ו leukocytes ללימוד דינמיקה זרימה של זרימת עכבר הרשתית

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, ...