We thank the Scientific Computing and Imaging Institute of the University of Utah for use of FluoRender software (R01GM09815). This work was supported by grants from the Glaucoma Research Foundation, Melsa M. and Frank Theodore Barr Foundation and the US National Institute of Health, (R01EY020878 and R01EY023621) to M.L.V., and (R01EY017182 and R01EY017950) to B.K.A.

Imagerie in vivo est effectuée dans des installations exemptes d&#39;agents pathogènes en utilisant des protocoles approuvés par le Comité de protection des animaux et l&#39;utilisation institutionnelle à l&#39;Université de l&#39;Utah. Remarque: Ce protocole d&#39;imagerie est utilisé pour des souris rapporteurs dans lequel la microglie rétiniennes et les monocytes / macrophages infiltrants expriment la protéine fluorescente verte (GFP) sous le contrôle du locus du récepteur de la fractalkine (CX3CR1). 1. imagerie in vivo de la rétine GFP + microglie par microscopie confocale à balayage laser ophtalmologique (ALSC) <ol><li> Allumez le système de chauffage contrôlé par l&#39;eau, mettre à stabiliser la température de la souris entre 35-37 ºC durant la procédure, et de connecter deux coussins chauffants. <ol><li> Démarrer le système confocal ophtalmoscope laser à balayage (ALSC) (figure 2A). Ouvrez le programme d&#39;ALSC, entrez les informations qui permettra d&#39;identifier la souris individuelle et en une courbure cornéenne de 2 mm (menu Données du patient). </li></ol></li><li> Préparez-vous à imaGing. Adapter en toute sécurité un grand champ 55º lentille propre objectif sur son socket. Préparer la plate-forme d&#39;imagerie de ophtalmoscope en obtenant un coussin chauffant recouvert de papier propre. Utilisez des pinces pour aplatir le tampon et le papier et les empêcher de bloquer le mouvement de l&#39;objectif. </li><li> Anesthésier les souris par injection intraperitoneale de 1,3% de 2,2,2-tribromoéthanol et 0,8% d&#39;alcool tert-amylique (250 mg / kg de poids corporel; 0,5 ml / 25 g de poids corporel) en utilisant une aiguille G 30½ monté sur un 1 ml à usage unique seringue. Souris revenir à sa cage, gardé sur un coussin chauffant. NOTE: La livraison de l&#39;anesthésie par injection contre l&#39;inhalation permet un positionnement plus facile de la souris pour l&#39;imagerie et un libre accès pour les yeux, libre de cônes de nez et les tubes. </li><li> Une fois l&#39;animal arrête de bouger et ne répond pas au pincement de la queue, de provoquer la dilatation des pupilles avec Tropicamide et la phényléphrine (0,5% chacun), en positionnant l&#39;animal couché et couvrant à la fois les yeux avec des gouttes pour 7 min. </li><li> Après 5 min, placer la souris sujettes au centre de la plate-forme de ophtalmoscope, et lentilles de contact ajustement sur les deux yeux, en appliquant une pression minimale. NOTE: Les lentilles de contact sont petites et fragiles, mais peuvent être manipulés avec soin avec les doigts, bien forceps peuvent être utilisés à la place 40. L&#39;utilisation de lentilles de contact est facultative, mais recommandée, car elle minimise la sécheresse oculaire et préserve la transparence de la cornée lors de l&#39;imagerie. </li><li> Après 7 minutes, orienter la souris avec l&#39;œil droit face à l&#39;objectif et l&#39;orbite parallèle à la lentille de l&#39;objectif, en gardant l&#39;animal effrénée près du bord de la plate-forme (figure 2B). Pour récupérer des images de la saturation et de l&#39;orientation comparable, de maintenir constamment la distance de l&#39;œil à lentille d&#39;objectif, ainsi que l&#39;alignement de l&#39;œil à la trajectoire de la lumière tout au long de sessions d&#39;imagerie. Clips longues moustaches interférant avec l&#39;observation de l&#39;œil. NOTE: Pour la prochaine 8-10 min, la souris ne se déplace pas ou clignote, et la volonté souffle avec mouvement doucements, qui sont suivis par l&#39;ALSC Eye Tracking ART mode (automatique en temps réel), qui ajuste la position de la tête de balayage sur la base de points de repère du fond d&#39;œil avec un contraste élevé. Passé ce moment-là, les souris commencent à clignoter et haletant, faisant imagerie impraticable. </li><li> Si l&#39;imagerie est réalisée sans utiliser des lentilles de contact, appliquer PBS tombe à deux yeux tous les 2-3 min pour les empêcher de sécher. </li><li> Récupérer une image de fond de la vascularisation de la rétine et de la papille optique, axée sur la rétine interne. <ol><li> Sélectionnez le mode infrarouge (IR) et ajuster les paramètres à 820 nm excitation, 100% de la puissance laser, 40-60% de sensibilité (figure 2C). </li><li> Travailler en mode haute vitesse (12,6 images / sec), de localiser l&#39;œil en utilisant le joystick pour conduire l&#39;ophtalmoscope. A faible grossissement, inspecter la cornée et le cristallin de blessure ou de l&#39;opacité, et exclure des yeux de l&#39;étude avec des défauts ou des blessures qui affecteront l&#39;imagerie de la rétine (figure 3A). </li><li> Localisez la zone de disque optique (la surface dela tête du nerf optique, ONH) en rapprochant l&#39;œil de l&#39;objectif, puis centrer l&#39;image sur elle et verrouiller cette position par vissage de la manette. Cet alignement de l&#39;œil à l&#39;ophtalmoscope est la clé pour obtenir même se concentrer et d&#39;émission à travers l&#39;image. </li><li> Visualiser les plans intérieurs de la rétine, ainsi que la ONH, en utilisant les principaux vaisseaux sanguins situés sur la surface vitréenne de la rétine comme un plan de référence central (59 et 60 D), ou plus profond (55 D) dans les yeux montrant optique excavé les disques. La mise au point optimale devrait résoudre les cellules sanguines circulantes dans les principaux vaisseaux sanguins, avec leur lumière et les murs bien distinctes. </li><li> Optimiser saturation de l&#39;image en ajustant la molette sur le panneau de contrôle à écran tactile, jusqu&#39;à un halo blanc d&#39;éclairage uniforme couvre dans la plupart du champ 55º de fond autour du disque optique (à l&#39;aide légère surexposition). Ensuite, abaisser la saturation pour optimiser le contraste jusqu&#39;à ce que les cellules sanguines se déplacent le long des grands navires peuvent être clairement résolus. Si sombre focalezones persistent, pas due à des lésions rétiniennes, réaligner l&#39;œil à la caméra jusqu&#39;à ce qu&#39;une image uniformément lumineux est obtenue. Cet ajustement est fondamentale pour capturer ensembles reproductibles d&#39;images en position et la qualité. </li><li> Recueillir une image infrarouge à haute résolution de la rétine centrale (1,4-1,7 mm de diamètre, en fonction de l&#39;âge), avec une moyenne de 30 images en temps réel (4,7 images / s; normalisé), pour améliorer le rapport signal-sur-bruit (figure 2D ). </li></ol></li><li> Immédiatement, acquérir une image de fluorescence de GFP + microglie et / ou monocytes infiltrants localisées aux plans internes de la rétine et de la papille optique. NOTE: L&#39;optimisation de l&#39;image du fond d&#39;oeil IR de la rétine détermine la résolution de l&#39;image de fluorescence de cellules GFP +, ainsi que l&#39;étendue de la rétine interne étalonné. Défaut de concentrer les plans intérieurs de la rétine, qui peut être détectée par une faible résolution de la vascularisation, se traduira par GFP + cellulaires vues grisés (figure 3B). Un mauvais réglage IR saturation affecte correctement et uniformément l&#39;image de fluorescence (FA), présentant des variations d&#39;artefact dans GFP + intensité et la taille des cellules (figure 3C). <ol><li> Swich à la fluorescence mode d&#39;imagerie (FA) dans le panneau de l&#39;écran tactile, en utilisant du bleu, l&#39;excitation de 488 nm laser (de 460 à 490 nm filtre barrière de jeu), et les paramètres d&#39;acquisition (100% de la puissance laser et 100-125% de sensibilité), qui sont maintenues constante pour toutes les souris (figure 2E). </li><li> Recueillir un seul point xy, image de fluorescence bidimensionnelle de la rétine, et de capturer immédiatement une image de fond à la position identique (100x moyenne de balayage; 55º angle de balayage pour les deux images; Figure 2F). </li><li> Capturer une image multipoint en sélectionnant «composite» dans le panneau de contrôle (Figure 2G) et en déplaçant le droit de ophtalmoscope et à gauche, panoramique de la rétine à travers l&#39;axe nasal-temporelle (figure 2H). Remarque: Après la numérisation d&#39;une seule image xy point (s 100xpeut en moyenne), le logiciel automatiquement moyennes nouveaux scans du même et de nouveaux domaines (circonscrites avec un cercle vert pendant la numérisation optimale, ou rouge lorsque l&#39;analyse est impossible), et tous les points xy-positions en temps réel. L&#39;image composite résultant couvre 1,5-1,7 mm sur l&#39;axe horizontal x 3-4 mm de l&#39;axe vertical (55º x 120-124º d&#39;angle de balayage). </li></ol></li><li> Imagerie complète de chaque souris dans les 15 min après l&#39;induction de l&#39;anesthésie, avant de clignoter et redémarre de mouvement. </li><li> Enlever les lentilles de contact, les yeux d&#39;hydrate avec du PBS et le réexpédier vers sa cage réchauffé, vérifier le comportement jusqu&#39;au rétablissement complet de la motilité. </li><li> Pour les études longitudinales utilisant sessions ALSC-imagerie intermittents dans la même souris individuelle, répéter imagerie pas moins de 3 jours d&#39;intervalle pour éviter la toxicité cumulative de l&#39;anesthésie, ainsi que l&#39;irritation de la cornée. </li></ol> 2. direct Traitement et analyse d&#39;images <ol><li> Alignement de l&#39;image séquentielle: <ol><li> Alignerles images du fond d&#39;œil pour une série chronologique de l&#39;oeil en utilisant le même système vasculaire et le disque optique comme des sites d&#39;intérêt. Ouvrez toutes les images dans un programme de présentation du diaporama commerciale, en faisant glisser chaque image au cours de la précédente jusqu&#39;à ce que leurs disques optiques alignés sur le plan xy (l&#39;image du haut apparaît semi-transparent tout en étant traîné), puis faites pivoter l&#39;image du haut jusqu&#39;à ce que son les principaux vaisseaux sanguins se chevauchent avec le système vasculaire dans l&#39;image suivante (mise au point sur des navires les plus éloignés de la papille optique). Notez l&#39;angle de rotation pour chaque image et enregistrer cette série de temps pour référence future, garder la trace de l&#39;identité de la souris et les yeux. </li><li> Aligner la série correspondante d&#39;images de fluorescence xy-point unique en appliquant l&#39;angle enregistré pour corriger la rotation xy à chaque point de temps, en utilisant un programme d&#39;édition graphique de trame. En outre, régler la résolution à 300 dpi (sans mise à l&#39;échelle) et le fond (en mode RVB, sélectionnez Niveaux et goûter à la lumière d&#39;un vaisseau sanguin en noir). Enregistrer ces imagescomme des fichiers TIF, ajoutant &quot;aligné&quot; à leurs noms. </li></ol></li><li> Microglie segmentation cellulaire: <ol><li> Pour identifier les cellules GFP + dans la rétine centrale, ouverte en FluoRender la &quot;aligné&quot; fichier TIF correspondant au premier point dans le temps / l&#39;âge. Agrandir l&#39;image pour remplir l&#39;écran, puis définir la vue Render (composite, orthogonale, interpolée) et ses propriétés (0,58 gamma, 255 point de saturation, 255 luminance, 195 alpha et 1,00 ombrage), sélectionnant les deux canaux de RG que visible (hide B canal en double-cliquant dessus dans le cadre de l&#39;espace de travail; la figure 4A). </li><li> Pour sélectionner des cellules individuelles, seuil du canal rouge (doit être mis en évidence sur le cadre de l&#39;espace de travail), en augmentant le seuil bas jusqu&#39;à ce que la majorité des cellules sont masqués (blanc) avec des processus de recouvrement et de cellules minimales (cyan), tout en maintenant constant le seuil haut (255). La faible valeur de seuil varie entre 100 et 170, en fonction de l&#39;intensité de fluorescence (Figure 4B &lt;/ Strong&gt;). </li><li> Enregistrer ce point de vue avec le canal rouge visible uniquement (commande Capture) comme un nouveau fichier TIF, ajoutant &quot;cellsegm&quot; à son nom d&#39;origine (figure 4C). L&#39;utilisation d&#39;un logiciel d&#39;édition graphique de trame générique, inverser son échelle de gris et d&#39;ajuster la résolution à 300 dpi comme ci-dessus, et enregistrer à nouveau en tant que RVB (figure 4D). REMARQUE: Supprimez les dossiers (projets) créés automatiquement par FluoRender, et sauver le seuil appliqué pour référence future. </li></ol></li><li> Microglie segmentation du soma et morphométrie: <ol><li> Pour identifier GFP + corps cellulaires pour la zone quantification, utiliser un logiciel d&#39;analyse d&#39;image avec des mesures automatisées d&#39;intensité et les capacités de seuil, ainsi que basé sur un seuil objet comptage et mesure. Ouvrez le fichier TIF &quot;de cellsegm&quot;, et sélectionnez la méthode de rééchelonnement (spline) et le canal rouge (cliquez sur l&#39;onglet rouge en RVB). Améliorer la visualisation en décochant &quot;vue canal de couleur&quot; (clic droit sur le RG rougeonglet B), et en sélectionnant &quot;complètent couleurs&quot; (Image / Ajuster l&#39;image) pour inverser l&#39;échelle de gris et de voir les cellules en gris / noir sur fond blanc (figure 4E). </li><li> Calibrer l&#39;image à 1,4-1,7 mm en fonction de l&#39;âge, en traçant une ligne horizontale à travers la totalité de l&#39;image (calibrage, étalonnage rapide). </li><li> Segment cellule individuelle corps cellulaires par l&#39;application d&#39;un seuil d&#39;intensité (Figure 4B). Pour cela, le travail sur le canal RVB rouge et ouvrir la fonction seuil d&#39;intensité (Count objet; sélectionnant commande &quot;update de comptage&quot;) afin de suivre les paramètres bidimensionnels pour chaque région seuillées d&#39;intérêt (ROI) représentant somata individu. </li><li> Définir le seuil d&#39;intensité de l&#39;histogramme d&#39;intensité, en notant le bas de 50 à 60% des niveaux 255, et d&#39;affiner la valeur de seuil finale en évaluant visuellement le chevauchement entre le masque seuil de couleur (bleu) et du périmètre du corps cellulaire (gris) dans les cellules individuelles (Figure 4E). </li><li> Estimer la précision des masques de soma cellulaire pour représenter les dimensions Somal en mesurant la surface avant et après la segmentation en 10 cellules et accepter la plage de seuil sélectionné si les mesures diffèrent moins de 10% (utiliser la barre d&#39;outils binaire et mesures annotées). </li><li> Identifier manuellement ROI de Somal qui comprennent plusieurs cellules et séparent ces éléments (éliminer ou ROI séparés en utilisant les contrôles binaire barre d&#39;outils, ou le catalogue d&#39;objets), tandis que le basculement / désactiver le binaire de visualiser directement les cellules (Figure 4F). </li><li> Classer les cellules microgliales que ROI avec des zones de Somal plus grand et plus petit que 50-60 um 2 à discriminer soma de cellule correspondant à la microglie activé et désactivé la microglie, respectivement, en utilisant la région Restriction. Remarque: chaque sous-ensemble de Somal cellulaire est identifié par une couche binaire pseudocolored différent, et peut être caractérisé en outre d&#39;autres paramètres morphologiques (périméter, la circularité, etc.), ainsi que dans les secteurs de la rétine quantifiée discrets (figure 4G). Enregistrer l&#39;image analysée comme un fichier ND2. </li><li> Vérifier le processus et la complexité de branchement dans les cellules microgliales activées individuelles, en superposant le masque de autosomique et l&#39;image -point unique xy (contraste augmenté de 50%; Figure 4H). Compter manuellement les processus étendant directement à partir du corps cellulaire ou mesurer le diamètre du polygone englobant l&#39;arbre (utiliser la barre d&#39;outils et de mesures binaire annotées). REMARQUE: Les cellules activées manquent de processus ou portent peu (&lt;4) et court (&lt;diamètre Somal 2x) ones, contrairement aux procédés non activées cellulaires, qui comprennent un arbre ramifié et étendue (&gt; 3-10x diamètre de Somal) entourant leur relativement petite soma. </li><li> Identifier manuellement des cellules avec somata inférieure à &lt;20 um 2 et / ou l&#39;expression de GFP sous la limite de détection, qui ne sont donc pas détecté par enintensité seuil. Utilisez la commande de la taxonomie dans les annotations de compter éléments identifiés manuellement. </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Le suivi direct du nombre de cellules de la microglie et morphologique au cours de l&#39;activation d&#39;une maladie neurodégénérative nécessite l&#39;utilisation de procédés d&#39;imagerie non invasifs permettant la visualisation détaillée des caractéristiques de la cellule. Après l&#39;imagerie, les cellules microgliales doivent être isolés (segmenté) pour l&#39;analyse morphométrique par l&#39;utilisation de plusieurs étapes de seuil pour évaluer la taille de autosomique et / ou de la complexité des...

Ces cellules microgliales neuroimmunes qui résident exclusivement dans le système nerveux central (SNC), depuis le développement embryonnaire précoce et tout au long de l&#39;âge adulte. Equipé d&#39;un répertoire complexe de récepteurs, l&#39;activité de la microglie et l&#39;hétérogénéité régionale sont régies par leur interaction bidirectionnelle avec les neurones voisins, gliales, barrière hémato-encéphalique et infiltrant les cellules neuro-inflammatoires 1,2. Fonctions microgliales basales contribuent à l&#39;entretien et la réparation physiologique, comme ils échantillonnent leur territoire pour des perturbations de l&#39;homéostasie 3,4. Pendant une lésion du SNC ou de la maladie, les microglies sont les premiers intervenants à des signaux neuronaux qui déclenchent alors leur transition vers un phénotype réactif, appelé &quot;activé microglie 2,5-7. l&#39;activation de la microglie implique un cycle complexe de gènes et expression de la protéine, qui sont couplés à soma des cellules et processus de redimensionnement et le remodelage 6-9. activation de cellules microgliales, ainsi que la redistribution de la cellule etclustering, peut être accompagnée de l&#39;augmentation globale locale dans le nombre de cellules (de microgliose appelé). Cela peut résulter de la prolifération cellulaire et l&#39;auto-renouvellement, avec ou sans le recrutement de monocytes dérivés du sang 3,4,7,10-14. Dans un large éventail de maladies du SNC, chroniques dépendant de l&#39;âge, soutenue microgliose et l&#39;activation de la microglie maladie parallèle progression 15-19. Comment microglie l&#39;impact neurodégénérescence reste incertaine, principalement parce qu&#39;ils jouent deux rôles neuroprotecteurs et délétères qui peuvent avoir diverses contributions à l&#39;apparition et la progression de la maladie. Études d&#39;imagerie en direct visant à comprendre la maladie chronique du système nerveux central ont surveillé le comportement de la microglie dans le SNC endommagé des modèles animaux et des humains, et a démontré que des altérations microgliales sont début détectable à des stades précoces de la maladie 15-17,19,20. Ainsi, il est essentiel de développer des approches pour détecter et surveiller l&#39;activation des microglies in vivo. Dete non-invasivection des changements régionaux dans l&#39;activation des microglies du cerveau a été créé comme un indicateur important dans vivo de progression de la maladie neurodégénérative, en utilisant l&#39;imagerie moléculaire ou bioluminescence et la tomographie par émission de positons ou imagerie par résonance magnétique 18,21,22. Ces méthodes d&#39;imagerie moléculaire et nucléaire hautement quantitatives et non invasives détectent gliose avec une résolution régionale. Alternativement, deux photons imagerie confocale en CX3CR1 GFP / + souris a permis l&#39;observation de la microglie du cerveau avec une résolution cellulaire 3,4,9,20,23-28. Cependant, cette approche limite à long terme et l&#39;observation répétée d&#39;altérations microgliales chroniques, étant donné le risque potentiel de perturber leur comportement par des procédures d&#39;imagerie cérébrale, même minimalement invasives 29. Alternativement, la rétine offre des conditions optimales pour la visualisation directe, dans vivo et la surveillance répétée de la microglie dans leur niche CNS intact tout au long vieillissement, suite à une blessure aiguë, etpotentiellement au cours de maladies neurodégénératives chroniques. Ainsi, des études récentes ont prouvé la faisabilité d&#39;imagerie à haute résolution de la microglie rétiniennes exprimant la GFP en adaptant la ophtalmoscopie confocale à balayage laser (ALSC) à l&#39;image en direct CX3CR1 GFP de souris / +. Cela a été utilisé pour suivre les variations hebdomadaires GFP + cellulaires numéros dans les souris individuelles pour un maximum de 10 semaines après une lésion aiguë induite ou d&#39;hypertension oculaire 30-36. Nous avons étendu cette approche pour réaliser une imagerie à long terme sur plusieurs mois, et de suivre quantitativement les changements dans l&#39;activation de la microglie basés sur la taille de soma en utilisant une analyse morphométrique. Somal taille a été définie comme une mesure utile de l&#39;activation de la microglie dans les études d&#39;imagerie en direct à deux photons en utilisant la microscopie confocale en tranches corticales pour effectuer l&#39;imagerie in vivo de CX3CR1-GFP + 9 microglie. Ces et d&#39;autres études ont également démontré la corrélation entre la taille de autosomique et les niveaux d&#39;expression de la protéine Iba1, which augmente également avec l&#39;activation 9,37. Ainsi, la microglie activée peut être identifiée dans des souris vivantes, et leur nombre et leur répartition contrôlée dans le temps au cours de la santé et de la maladie du SNC. Ce protocole décrit des méthodes pour ALSC acquisition d&#39;images en direct et d&#39;analyse pour surveiller le nombre de cellules microgliales, la distribution et l&#39;activation morphologique au cours cellules ganglionnaires de la rétine (RGC) de la dégénérescence (Figure 1). Ainsi, cette étude utilise: 1) un modèle de souris du glaucome héréditaire (DBA / 2J) qui subit dépend de l&#39;âge du nerf optique et de la neurodégénérescence rétinienne et présente une variabilité remarquable progression de la maladie entre 5 et 10 mois de 38,39 ans, 2) mois ALSC imagerie in vivo pour la visualisation à long terme de cellules GFP + dans la rétine et du nerf optique non myélinisées de hétérozygotes CX3CR1 GFP / + DBA / 2J souris âgées de 3 à 5 mois, 3) en temps réel une analyse de formation d&#39;image par segmentation et d&#39;un seuil pour isoler des corps cellulaires des cellules et mesure lazone ir. Ces stratégies sont appliquées pour évaluer la cinétique de états d&#39;activation de la microglie rétiniennes durant les premiers stades de glaucome chronique.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="2010">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:617px;">Name</td>
			<td style="width:444px;">Company</td>
			<td style="width:208px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:741px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:617px;">DBA/2J and 
			CX3CR1-GFP/+ mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME</td>
			<td>000671 and 00582</td>
			<td>Mice are breed in-house, introducing new breeders every 3 to 4 generations to prevent genetic drift.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">301/2G needle and 1 ml tuberculin slip-tip syringe</td>
			<td>BD, East Rutherford, NJ</td>
			<td>305106 and 309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:617px;">2,2,2-tribromoethanol, tert-Amyl alcohol 99% and phosphate buffer saline tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>T48402, 152463 and P4417</td>
			<td>Avertin solution (pH 7.3, sterile filtered) must be freshly made solution or stored at 4&#186;C for up to 1 week.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heat therapy T/Pump</td>
			<td>Gaymar Industries, Orchard Park, NY</td>
			<td>TP-650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cotton-tipped applicators</td>
			<td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td>23-400-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tropicamide 1%&#160;</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb, Rochester, NY</td>
			<td>NDC 24208-585-64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PMMA contact lenses, 1.70-base curve, 3.2 mm total diameter, 0.40 mm-thick center</td>
			<td>Cantor &#38; Nissel Ltd., Northamptonshire, UK</td>
			<td>G003709</td>
			<td>Lenses are rinsed with sterile PBS and stored in polypropylene boxes.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HRA/Spectralis confocal scanning laser ophthalmoscope and Eye Explorer software</td>
			<td>Heidelberg Engineering GmbH, Carlsbad, CA</td>
			<td>Version 1.7.1.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PowerPoint</td>
			<td>Microsoft, Redmond, WA</td>
			<td>Version 14.4.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adobe Photoshop</td>
			<td>Adobe, San Jose, CA</td>
			<td>Version CS3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FluoRender</td>
			<td>Scientific Computing and Imaging Institute, University of Utah</td>
			<td>Version 2.13</td>
			<td>Freeware. http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NIS-Elements C</td>
			<td>Nikon, Melville, NY</td>
			<td>Version 4.30.01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo dynamics of retinal microglial activation during neurodegeneration: confocal ophthalmoscopic imaging and cell morphometry in mouse glaucoma

Microglie, qui sont des cellules neuro SNC-résidents, transforment leur morphologie et la taille en réponse aux dommages CNS, le passage à un état activé avec des fonctions distinctes et les profils d&#39;expression génique. Les rôles de l&#39;activation de la microglie dans la santé, les blessures et la maladie restent encore mal compris en raison de leur régulation dynamique et complexe en réponse à des changements dans leur microenvironnement. Il est donc essentiel de surveiller de manière non invasive et analyser des changements dans l&#39;activation microgliale au fil du temps dans l&#39;organisme intact. Des études in vivo de l&#39;activation de la microglie ont été retardés par des limitations techniques de suivi du comportement des microglies sans altérer l&#39;environnement CNS. Cela a été particulièrement difficile pendant la neurodégénérescence chronique, où les changements à long terme doivent être suivis. La rétine, un organe CNS prêtent à l&#39;imagerie en direct non-invasive, offre un puissant système de visualiser et de caractériser la dynamique de l&#39;activation de la microglie lors de troubles chroniques. l&#39;imagerie in vivo de la rétine de la microglie, en utilisant ophtalmoscopie confocale (ALSC) et souris / + rapporteurs CX3CR1 GFP, de visualiser la microglie avec une résolution cellulaire. Aussi, nous décrivons des méthodes pour quantifier les changements mensuels dans l&#39;activation des cellules et de la densité dans les grands sous-ensembles de cellules (200-300 cellules par la rétine). Nous confirmons l&#39;utilisation de la zone de autosomique une mesure utile pour le suivi en direct de l&#39;activation de la microglie dans la rétine en appliquant automatisé analyse morphométrique basé sur un seuil d&#39;images in vivo. Nous utilisons ces acquisition d&#39;images en direct et des analyses des stratégies pour surveiller les changements dynamiques dans l&#39;activation de la microglie et microgliose durant les premiers stades de la neurodégénérescence rétinienne dans un modèle de souris du glaucome chronique. Cette approche devrait être utile pour enquêter sur les contributions de la microglie à baisse neuronale et axonale dans les troubles chroniques du système nerveux central qui affectent la rétine et du nerf optique.

Nos récentes études in vivo ont utilisé ces méthodes d&#39;acquisition et d&#39;analyse d&#39;image en direct de visualiser et de suivre la cinétique et les modèles de ONH et les changements microgliales rétiniennes durant les premiers stades de glaucome chronique et leur relation à la fin de la neurodégénérescence 59. Ici, nous illustrons un protocole d&#39;acquisition d&#39;image ALSC pour visualiser les cellules microgliales sur une grande surface de la rétine centrale dans les différ...

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In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

activation de cellules microgliales et microgliose sont des réponses clés à la neurodégénérescence chronique. Ici, nous présentons les méthodes pour in vivo, la visualisation à long terme de la rétine CX3CR1-GFP + cellules microgliales par ophtalmoscopie confocale, et pour le seuil et analyses morphométriques d&#39;identifier et de quantifier leur activation. Nous surveillons changements microgliales durant les premiers stades de glaucome liée à l&#39;âge.

En Vivo Dynamique de la rétine microglial activation cours neurodégénérescence: confocale ophtalmoscopique Imaging and Cell Morphometry dans Souris glaucome

Microglia, which are CNS-resident neuroimmune cells, transform their morphology and size in response to CNS damage, switching to an activated state with ...

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In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

10.5K vues.  University of Utah.  activation de cellules microgliales et microgliose sont des réponses clés à la neurodégénérescence chronique. Ici, nous présentons les méthodes pour in vivo, la visualisation à long terme de la rétine CX3CR1-GFP + cellules microgliales par ophtalmoscopie confocale, et pour le seuil et analyses morphométriques d'identifier et de quantifier leur activation. Nous surveillons changements microgliales durant les premiers stades de glaucome liée à l&#...

Vidéo: In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-photon imagerie de l&#39;invasion des cellules tumorales dans un modèle de souris orthotopique du carcinome épidermoïde oral

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

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Médecine

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There is little knowledge about in situ, in vivo, tumor hypoxia during intracranial development of malignant brain tumors because of lack of efficient means to monitor it in these deep-seated orthotopic tumors. Bioluminescence imaging (BLI), based on the detection of light emitted by living cells expressing a luciferase gene, has been rapidly adopted for cancer research, in particular, to evaluate tumor growth or tumor size changes in response to treatment in preclinical animal studies. Moreover, by expressing a reporter gene under the control of a promoter sequence, the specific gene expression can be monitored non-invasively by BLI. Under hypoxic stress, signaling responses are mediated mainly via the hypoxia inducible factor-1&alpha; (HIF-1&alpha;) to drive transcription of various genes. Therefore, we have used a HIF-1&alpha; reporter construct, 5HRE-ODD-luc, stably transfected into human breast cancer MDA-MB231 cells (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay is performed by incubating the transfected cells in a hypoxic chamber (0.1% O2) for 24 hr before BLI, while the cells in normoxia (21% O2) serve as a control. Significantly higher photon flux observed for the cells under hypoxia suggests an increased HIF-1&alpha; binding to its promoter (HRE elements), as compared to those in normoxia. Cells are injected directly into the mouse brain to establish a breast cancer brain metastasis model. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics is initiated 2 wks after implantation and repeated once a week. BLI reveals increasing light signals from the brain as the tumor progresses, indicating increased intracranial tumor hypoxia. Histological and immunohistochemical studies are used to confirm the in vivo imaging results. Here, we will introduce approaches of in vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay, surgical establishment of a breast cancer brain metastasis in a nude mouse and application of in vivo bioluminescence imaging to monitor intracranial tumor hypoxia.

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Bioluminescence imaging of hypoxia inducible factor-1&alpha; activity is applied to monitor intracranial tumor hypoxia development in a breast cancer brain metastasis mouse model.

Dans l&#39;imagerie de bioluminescence in vivo de la tumeur Dynamics hypoxie des métastases cérébrales du cancer du sein dans un modèle murin

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite fluorescent in situ elements through the optical fibers, and then record some of the emitted photons, via the same optical fibers. The light source is a laser that sends the exciting light through an element within the fiber bundle and as it scans over the sample, recreates an image pixel by pixel. As this scan is very fast, by combining it with dedicated image processing software, images in real time with a frequency of 12 frames/sec can be obtained.
We developed a technique to quantitatively characterize capillary morphology and function, using a confocal fluorescence videomicroscopy device. The first step in our experiment was to record 5 sec movies in the four quadrants of the tumor to visualize the capillary network. All movies were processed using software (ImageCell, Mauna Kea Technology, Paris France) that performs an automated segmentation of vessels around a chosen diameter (10 &mu;m in our case). Thus, we could quantify the 'functional capillary density', which is the ratio between the total vessel area and the total area of the image. This parameter was a surrogate marker for microvascular density, usually measured using pathology tools.
The second step was to record movies of the tumor over 20 min to quantify leakage of the macromolecular contrast agent through the capillary wall into the interstitium. By measuring the ratio of signal intensity in the interstitium over that in the vessels, an 'index leakage' was obtained, acting as a surrogate marker for capillary permeability.

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

In this paper, we present a method to analyze tumor microvessels in vivo using dynamic contrast-enhanced fluorescence videomicroscopy. Two quantitative parameters were acquired: functional capillary density reflecting the vascularity of the tumor, and index leakage reflecting the leakiness of the endothelial wall.

Dans l&#39;imagerie in vivo de angiogenèse tumorale en utilisant la fluorescence confocale vidéomicroscopie

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

In vivo 19 F IRM pour le suivi cellulaire

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

Séquentiel<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie des cellules souches / progénitrices ostéogéniques lors de la réparation de la fracture

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. Despite the discovery of key regulators of uterine contractility, this process is still not fully understood. Transgenic mice provide an ideal model in which to study parturition. Previously, the only method to study uterine contractility in the mouse was ex vivo isometric tension recordings, which are suboptimal for several reasons. The uterus must be removed from its physiological environment, a limited time course of investigation is possible, and the mice must be sacrificed. The recent development of radiometric telemetry has allowed for longitudinal, real-time measurements of in vivo intrauterine pressure in mice. Here, the implantation of an intrauterine telemeter to measure pressure changes in the mouse uterus from mid-pregnancy until delivery is described. By comparing differences in pressures between wild type and transgenic mice, the physiological impact of a gene of interest can be elucidated. This technique should expedite the development of therapeutics used to treat myometrial disorders during pregnancy, including preterm labor.

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

This manuscript provides a protocol for implanting telemeters in the mouse for the purpose of measuring intrauterine pressures during pregnancy.

Télémétrie intra-utérine mesurer souris contractile pression<em&gt; In Vivo</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to image cellular events in an intact animal. Additionally, the ability to induce physiological disease states such as stroke in vivo increases its utility. The technique described herein allows for physiological assessment of cellular responses within the CNS following a stroke and can be adapted for other pathological conditions being studied. The technique presented uses laser excitation of the photosensitive dye Rose Bengal in vivo to induce a focal ischemic event in a single blood vessel. 
The video protocol demonstrates the preparation of a thin-skulled cranial window over the somatosensory cortex in a mouse for the induction of a Rose Bengal photothrombotic event keeping injury to the underlying dura matter and brain at a minimum. Surgical preparation is initially performed under a dissecting microscope with a custom-made surgical/imaging platform, which is then transferred to a confocal microscope equipped with an inverted objective adaptor. Representative images acquired utilizing this protocol are presented as well as time-lapse sequences of stroke induction. This technique is powerful in that the same area can be imaged repeatedly on subsequent days facilitating longitudinal in vivo studies of pathological processes following stroke.

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

Here, we describe a semi-invasive optical microscopy approach for the induction of a Rose Bengal photothrombotic clot in the somatosensory cortex of a mouse in vivo. The technical aspects of the imaging procedure are described from induction of a photothrombotic event to application and data collection.

Rose Bengale Photothrombosis par imagerie optique confocal<em&gt; In Vivo</em&gt;: Un modèle de l&#39;unité des maladies du navire

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the brain for visual perception. Damage to RGCs and their axons leads to vision loss and/or blindness. Although the specific cause of glaucoma is unknown, the primary risk factor for the disease is an elevated intraocular pressure. Glaucoma-inducing procedures in animal models are a valuable tool to researchers studying the mechanism of RGC death. Such information can lead to the development of effective neuroprotective treatments that could aid in the prevention of vision loss. The protocol in this paper describes a method of inducing glaucoma - like conditions in an in vivo rat model where 50 &#181;l of 2 M hypertonic saline is injected into the episcleral venous plexus. Blanching of the vessels indicates successful injection. This procedure causes loss of RGCs to simulate glaucoma. One month following injection, animals are sacrificed and eyes are removed. Next, the cornea, lens, and vitreous are removed to make an eyecup. The retina is then peeled from the back of the eye and pinned onto sylgard dishes using cactus needles. At this point, neurons in the retina can be stained for analysis. Results from this lab show that approximately 25% of RGCs are lost within one month of the procedure when compared to internal controls. This procedure allows for quantitative analysis of retinal ganglion cell death in an in vivo rat glaucoma model.

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis.

Glaucomes induisant une procédure dans un<em&gt; In Vivo</em&gt; Modèle de rat et Whole-mount Retina Préparation

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

Appauvrissement des cellules de souris de xénogreffes de tumeurs humaines améliore de manière significative l&#39;analyse en aval des cellules cibles

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, diabetic retinopathy, age-related macular degeneration (AMD) and other ocular inflammatory conditions. It may also help to monitor the therapeutic responses in the eye. The proper labeling of the blood cells, coupled with live-cell imaging of the labeled cells, allows for the investigation of the flow dynamics in the retinal and choroidal circulation. Here, we describe the standardized protocols of 1.5% indocyanine green (ICG) and 1% sodium fluorescein labeling of mice erythrocytes and leukocytes, respectively. Scanning laser ophthalmoscopy (SLO) was applied to visualize the labeled cells in the retinal circulation of C57BL/6J mice (wild type). Both methods demonstrated distinct fluorescently labeled cells in the mouse retinal circulation. These labeling methods can have wider applications in various ocular disease models.

Live-cell imaging of the labeled blood cells in ocular circulation can provide information about inflammation and ischemia in diabetic retinopathy and age-related macular degeneration. A protocol to label blood cells and image the labeled cells in the retinal circulation is described.

Étiquetage des colorants fluorescents des érythrocytes et des leucocytes pour étudier la dynamique du flux dans la circulation de la rétine de la souris

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, ...