We thank the Scientific Computing and Imaging Institute of the University of Utah for use of FluoRender software (R01GM09815). This work was supported by grants from the Glaucoma Research Foundation, Melsa M. and Frank Theodore Barr Foundation and the US National Institute of Health, (R01EY020878 and R01EY023621) to M.L.V., and (R01EY017182 and R01EY017950) to B.K.A.

생체 내 이미징은 유타 대학에서 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜을 사용하여 무균 시설에서 수행된다. 참고 :이 영상 프로토콜은 망막 미세 아교 세포 및 침투 단핵구 / 대 식세포가 fractalkine 수용체 궤적 (CX3CR1)의 통제하에 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현하는 기자 마우스에 사용됩니다. 공 초점 주사 레이저 검안경으로 망막 GFP + 미세 아교 세포의 생체 내 이미징 1. (cSLO) <ol><li> 절차를 수행하는 동안 35 ~ 37 ºC 사이의 마우스 온도를 안정화 세트 물 제어 난방 시스템 켜기, 2 개의 가열 패드를 연결합니다. <ol><li> 공 초점 주사 레이저 검안경 (cSLO) 시스템 (그림 2A)를 시작합니다. 각각의 마우스를 확인하고 2mm (환자 데이터 메뉴)의 각막 곡률을 설정합니다 정보를 입력, cSLO 프로그램을 엽니 다. </li></ol></li><li> IMA 준비카. 안전하게 소켓에 깨끗한 55º 넓은 필드 대물 렌즈에 맞게. 깨끗한 종이로 덮여 가열 패드를 확보하여 검안경 이미징 플랫폼을 준비합니다. 패드와 용지를 납작하게하고, 대물 렌즈의 이동을 차단하는 그것들을 유지하는 클립을 사용. </li><li> 1.3 % 2,2,2- tribromoethanol 0.8 % 급 - 아밀 알콜의 복강 내 주사하여 마우스를 마취 (250 ㎎ / ㎏ 체중 0.5 ㎖ / 25g 체중) 1ml의 일회용 끼워 30½ G 바늘을 사용하여 주사기. 새장에 마우스를 반환, 가열 패드에 있었다. 참고 : 흡입에 비해 주사 마취제의 전달 코 콘 튜브의 무료 영상과 눈에 탁 트인 액세스를위한 마우스, 쉽게 배치 할 수 있습니다. </li><li> 동물이 이동 중지하고 꼬리 핀치에 응답하지되면 발생하기 쉬운 동물을 배치하고 7 분의 방울과 두 눈을 취재하여, Tropicamide 및 페닐 (0.5 % 각각)와 동공 팽창을 유도한다. </li><li> 5 분, P 후최소한의 압력을 적용, 두 눈을 통해 검안경 플랫폼의 중심에 발생하기 쉬운 마우스, 맞는 콘택트 렌즈를 레이스. 참고 : 집게 대신 40 사용할 수 있지만 콘택트 렌즈는 작고 연약하지만 조심스럽게 손가락으로 처리 할 수 있습니다. 그것은 눈 건조를 최소화하고 영상 중 각막의 투명성을 유지로 콘택트 렌즈의 사용은 선택 사항이지만 권장합니다. </li><li> 7 분 후, 플랫폼 (도 2B)의 가장자리 근처 무제한 동물성 유지, 대물 렌즈와 대물 렌즈에 평행 한 궤도 대향 우안으로 마우스의 방향. 비교 채도와 방향의 이미지를 수집하기 위해, 항상 대물 렌즈의 눈으로부터의 거리뿐만 아니라, 세션에 걸쳐 이미징 광 경로에 눈의 정렬을 유지한다. 눈의 관찰을 방해 긴 수염 클립. 참고 : 다음 8-10 분 동안, 마우스를 이동하거나 점멸, 부드러운 움직임과 의지 호흡하지 않을 것이다콘트라스트가 높은 안저 랜드 마크를 기반으로 스캔 헤드 위치를 조정 cSLO 눈 추적 ART (자동 실시간) 모드에 의해 추적 사항. 그 때 과거, 마우스는 이미지가 허무하게 헥헥 및 점멸하기 시작. </li><li> 촬상 콘택트 렌즈를 사용하지 않고 수행되는 경우, PBS가 양쪽 눈으로 건조되는 것을 방지하기 위해 매 2-3 분 방울 적용. </li><li> 망막 혈관 및 시신경 유두의 안저 화상을 수집 내측 망막에 초점을 맞추었다. <ol><li> 적외선 모드 (IR)를 선택하고 820 nm의 여기, 100 % 레이저 파워, 40 % -60 %의 민감도 (그림 2C)로 설정을 조정합니다. </li><li> 고속 모드 (12.6 프레임 / 초)에서 작동 검안경을 구동하기 위해 조이스틱을 이용하여 눈의 위치를​​. 저배율에서 부상이나 불투명도의 각막과 렌즈를 검사하고, 망막 (그림 3A)를 이미징 영향을 미칠 것 결함이나 부상으로 연구 눈에서 제외합니다. </li><li> 시신경 유두 면적 (의 표면을 찾습니다가까이 눈에 목표를 가져 와서 시신경, 시신경 유두는) 다음의 이미지 중심과 조이스틱을 돌려서이 위치를 잠급니다. 검안경으로 눈이 정렬도 얻을 이미지를 가로 질러 초점을 방출하는 열쇠입니다. </li><li> 발굴 된 광섬유를 나타내는 눈 기준 초점면 (59, 60 D) 또는 깊이 (55 D)로서 망막 vitreal 표면 상에 위치 된 주요 혈관을 사용하여, 시신경 유두뿐만 아니라, 망막의 내측 평면을 시각화 디스크. 최적의 초점은 명확하게 구별되는 자신의 루멘과 벽, 주요 혈관 내에서 혈액 세포를 순환 해결해야한다. </li><li> 균일 한 밝기의 흰색 할로 (약간의 노출 과다 사용) 시신경 주위 55º 안저 필드의 대부분에 걸쳐까지, 터치 스크린 제어 패널에 다이얼을 조정하여 화상의 채도를 최적화. 다음으로, 주요 혈관을 따라 이동하는 혈액 세포가 분명히 확인할 수있을 때까지 콘트라스트를 최적화하기 위해 채도를 낮추는. 초점 어두운 경우지역되지 인해 망막 손상, 균일하게 밝은 이미지가 얻어 질 때까지 카메라에 눈을 다시 정렬, 지속. 이 조정은 위치와 품질의 이미지의 재현 세트를 캡처하는 데 필수적입니다. </li><li> 실시간 30 프레임 (47 프레임 / 초 정규화)를 평균화 (나이에 따라 직경 1.4-1.7 mm)을 중심 망막의 고해상도 IR 이미지 수집 신호 대 잡음비를 개선하기 위해, (도 2D ). </li></ol></li><li> 즉시, GFP + 미세 아교 세포 및 / 또는 시신경 유두 및 망막의 안쪽면에 국소 침윤 단핵구의 형광 화상을 취득. 주 : 망막의 IR 안저 화상의 최적화 GFP + 세포의 형광 이미지의 해상도뿐만 아니라 내측 스팬 망막의 정도를 결정한다. 혈관의 가난한 해상도를 감지 할 수있는 망막의 안쪽면에 초점을하지 않을 경우, 흐리게 GFP + 세포 뷰 (그림 3B)가 발생합니다. IR 사투를 조정하지 않으면배급은 정확하고 균일하게 GFP + 세포의 강도와 크기 (그림 3C)에서 인공적인 변화를 도입, 형광 이미지 (FA)에 영향을줍니다. <ol><li> 유지 블루, 488 nm의 레이저 여기 (460-490 nm의 배리어 필터 세트), 및 수집 설정 (100 % 레이저 파워와 100~125% 감도)를 사용하여, 상기 터치 스크린 패널의 촬상 모드 (FA)을 형광하도록 Switch가 아래로 내려가 모든 마우스 (그림 2E)의 정수입니다. </li><li> 하나의 XY 점, 망막의 bidimensional 형광 이미지를 수집하고 즉시 동일한 위치에 안저 이미지를 캡처 (100X 스캔 평균, 두 이미지를 55º 스캔 각도도 2 층). </li><li> 코 - 시간 축 (그림 2H)에서 망막 패닝, 제어판 (그림 2G)에서 &quot;복합&quot;를 선택하고 검안경을 오른쪽으로 이동 왼쪽으로 다중 이미지를 캡처합니다. 주 : 단일 XY 포인트 이미지를 스캔 한 후 (100 배의실시간으로 소프트웨어가 자동으로 최적의 스캔, 스캔이 실행할 수없는 경우 빨간색 동안 평균 녹색 원과 접하는 같은 새로운 영역 (새로운 검사) 및 스티치 모든 XY-위치) 평균 수 있습니다. 얻어진 합성 화상이 종축 (X 55º 120-124º 주사 각도)에 수평축 X 3-4mm 1.5-1.7 mm에 걸쳐있다. </li></ol></li><li> 깜박임 운동 다시 시작하기 전에 마취를 유도 한 후 15 분 이내에 각 마우스의 전체 영상. </li><li> PBS로 콘택트 렌즈, 수화물 눈을 제거하고 운동의 전체 복구 될 때까지 동작을 확인, 그 예열 케이지에 동물을 반환합니다. </li><li> 동일한 개인 마우스에서 간헐적 cSLO 이미징 세션을 사용하여 종 연구의 경우, 마취의 누적 독성뿐만 아니라 각막에 자극을 피하기 위해 더 적은 3 일 간격 이미지를 반복합니다. </li></ol> 2. 라이브 영상 처리 및 분석 <ol><li> 순차 이미지 정렬 : <ol><li> 정렬랜드 마크로 혈관계 및 광학 디스크를 사용하여 같은 눈의 시계열위한 안저 화상. 상용 슬라이드 쇼 프리젠 테이션 프로그램에서, 자신의 광학 디스크 xy- 평면에 정렬 될 때까지 하나를 전 (상단 이미지를 드래그하면서 반투명 표시), 그때까지 상단 이미지를 회전을 통해 각각의 이미지를 드래그하여 모든 이미지를 열고 그 주요 혈관 (먼 시신경 유두에서 선박에 초점) 아래의 이미지에 혈관과 중복. 각 이미지의 회전 각도를 기록하고 마우스와 눈의 신원을 추적하는 데, 나중에 참조 할 수 있도록이 시계열을 저장합니다. </li><li> 각 시점에서 XY 회전을 보정하는 기록 각도인가 래스터 그래픽 에디터 프로그램을 사용하여 단일의 XY 점 형광 화상의 대응하는 일련 맞추고. 또한, 300 (스케일링)없이 dpi의와 배경에 해상도를 조정 (RGB 모드, 레벨 선택과 검은 색으로 혈관의 내강 샘플). 이러한 이미지를 저장TIF 파일로, 자신의 이름으로 &quot;정렬&quot;을 추가. </li></ol></li><li> 소교 세포 분할 : <ol><li> FluoRender에서 열린 중앙 망막에 이른 시점 / 연령에 해당하는 &quot;정렬&quot;TIF 파일을 GFP + 세포를 식별합니다. 화면에 맞게 이미지를 확대 한 다음 (숨기기 볼과 RG 채널 모두를 선택, 렌더링 뷰 (복합, 직교는, 보간)과 속성 (0.58 감마, 255 포화 점, 255 휘도, 195 알파 1.00 음영)을 정의 두 번 클릭하여 작업 공간 프레임을하여 B 채널도 4A). </li><li> 상수 높은 임계 값을 유지하면서 세포의 대부분은, 최소한의 중복 및 세포 프로세스 (시안) (흰색)을 마스크 때까지 낮은 임계 값을 증가시켜, (작업 공간 프레임에 강조해야 함) 개별 셀, 임계 빨강 채널을 선택하려면 (255). 낮은 임계치는 형광 강도 (도 4B &lt;에 따라, (100) 및 (170) 사이에서 변화/ STRONG&gt;). </li><li> 원래 이름 (그림 4C)에 &quot;cellsegm&quot;을 추가, 새로운 TIF 파일로 볼 수 빨강 채널 만 (캡처 명령)이보기를 저장합니다. 일반 래스터 그래픽 편집기 소프트웨어를 사용하여, 자사의 그레이 스케일을 반전 상기와 같이 300 DPI에 해상도를 조정하고, RGB (그림 4D)로 다시 저장합니다. 참고 : 자동 FluoRender에 의해 생성 된 폴더 (프로젝트)를 삭제하고, 나중에 참조 할 수 있도록 적용 임계 값을 저장합니다. </li></ol></li><li> 미세 아교 소마 세분화 및 형태 계측 : <ol><li> 영역 부량 GFP + 세포 인 somata를 식별하기 위해 자동화 된 세기 측정과 임계 기능뿐만 아니라, 임계 값 기반 객체 카운팅 및 측정과 이미지 분석 소프트웨어를 사용한다. &quot;cellsegm&quot;TIF 파일을 열고 스케일링 방법 (스플라인)과 빨강 채널을 선택 RGB (빨간색 탭을 클릭합니다). &quot;색에보기 채널&quot;을 선택 취소하여 시각화 개선 (빨간색 RG를 마우스 오른쪽 단추로 클릭B 탭) 및 &quot;색상을 보완&quot;을 선택 (이미지 / 그레이 스케일을 반전 흰색 배경 (그림 4E) 위에 검정색 / 회색 세포를 볼 수) 이미지를 조정합니다. </li><li> 전체 이미지 (교정, 빠른 교정)을 가로 지르는 수평선을 그려, 나이에 따라 1.4-1.7 mm로 이미지를 보정합니다. </li><li> 강도 임계 값 (그림 4B)을 적용하여 세그먼트 개별 세포 인 somata. 이를 위해, 빨간색 RGB 채널 작업과는 임계 강도 기능을 엽니 다 (객체 개수; &quot;카운트 업데이트&quot;명령을 선택) 개별 인 somata을 나타내는이자 (ROI)의 각 임계 된 지역 bidimensional 매개 변수를 추적하기 위해. </li><li> 255 레벨 중 낮은 50~60% 선택 시각적 임계 색 마스크 (청색) 및 셀 소마 경계 (회색)에서 서로 중첩을 평가하여 최종 임계치 값을 정제하여, 휘도 히스토그램의 강도 임계치를 정의 각 셀 (Figure 4E). </li><li> 측정은 10 % 미만 (이진 툴바 및 주석이 측정 값을 사용하여)을 다른 경우 10 세포에서 분할 전 면적을 측정하여 이후 somal 치수를 나타내며, 상기 선택된 임계 값 범위를 사용할 셀 소마 마스크의 정밀도를 추정한다. </li><li> 수동으로 여러 셀을 포함하고 직접 세포 (그림 4 층)를 시각화하는 바이너리를 ON / OFF 전환하면서 이러한 요소 (이진 도구 모음 컨트롤, 또는 개체 카탈로그를 사용하여 제거하거나 별도의 ROI) 분리 somal의 ROI를 식별. </li><li> somal 영역이 크고보다 작은 50 ~ 60 μm의 2가 활성화 된 미세 아교 세포에 해당하는 세포 인 somata를 차별 및 면적 제한을 사용하여, 각각 미세 아교 세포를 비활성화 할 수와 로아와 같은 미세 아교 세포를 분류. 참고 : 각 셀 somal 부분 집합이 다른 모조 착색 이진 층으로 식별하고, 또한 다른 형태 학적 매개 변수에 대한 특징으로 할 수있다 (perime터, 원형 등)뿐만 아니라 이산 망막 섹터 (도 4G) 내에서 정량화. ND2 파일로 분석 된 이미지를 저장합니다. </li><li> somal 마스크 및 단일 XY N&#39;- 포인트 이미지를 오버레이하여 개별 활성 소교 세포에서 처리 및 분기 복잡성을 확인 (도 4H 대비 50 % 증가). 수동으로 직접 셀 소마에서 연장 프로세스를 계산 또는 아버 (이진 도구 모음 및 주석이 측정을 사용)를 포괄하는 다각형의 직경을 측정한다. 주 : 활성 세포 프로세스 부족 또는 몇 베어 (&lt;4) 및 짧은 (&lt;2 배 somal 직경)들, 분지 및 광범위한 아버를 포함 비활성 셀 공정 대조적 (&gt; 3-10x somal 직경) 비교적 그들의 주변 작은 소마. </li><li> 따라서 수동에 의해 검출되지되는 검출 한계 아래 인 somata 미만 &lt;20 ㎛의 2 및 / 또는 GFP 발현으로 세포를 식별긴장의 임계. 수동으로 식별 요소를 계산하는 주석의 분류 명령을 사용하십시오. </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

신경 퇴행성 질환 중 소교 세포의 수와 활성 형태의 실시간 모니터링은 세포 기능의 상세한 시각화를 허용 비 침습성 영상화 방법의 사용을 요구한다. 촬상 후, 소교 세포는 미세 아교 세포의 활성화를위한 판독 somal 같은 크기 및 / 또는 공정의 복잡성을 평가하기 위해 여러 단계의 임계치를 이용하여 형태 학적 분석을 위해 (분단) 고립되어야한다. 이 프로토콜에서는, 우리는 cSLO를 사용하여 라이...

미세 아교 세포는 독점적으로 초기 배아 발달 이후 성인기에 걸쳐 중추 신경계 (CNS)에있는 신경 면역 세포이다. 수용체의 복잡한 레퍼토리를 장착, 미세 아교 활동 및 지역 이질성이 인접 신경 아교 세포, 혈액 - 뇌 장벽 및 신경 염증성 세포 1,2 침투 자신의 양방향 상호 작용에 의해 조절된다. 그들이 항상성의 3,4의 섭동에 대한 자신의 영토를 샘플로 기저 소교 기능, 생리 유지 보수 및 수리에 기여한다. CNS의 부상 또는 질병 중, 미세 아교 세포는 반응 표현형에 자신의 전환을 트리거 신경 신호의 첫 번째 조치는 &quot;미세 아교 세포 2,5-7 활성화 되나. 미세 아교 세포의 활성화는 세포 소마와 프로세스 크기 조정 및 6-9 리모델링에 연결되는 유전자 및 단백질 발현의 복잡한 사이클을 포함한다. 미세 아교 세포의 활성화뿐만 아니라, 셀 재분배클러스터링은, 셀의 수 (라 microgliosis)에서 로컬 전반적인 증가를 수반 할 수있다. 이것은 또는 혈액 유래 단핵구 3,4,7,10-14 모집없이 세포 증식과 자기 갱신에서 발생할 수 있습니다. 연령 의존적 만성 CNS 질병의 광범위한 범위에서 microgliosis 및 미세 아교 세포 활성화 평행 질병 진행을 유지 15-19. 어떻게 미세 아교 세포 충격 신경 퇴행하는 것은 그들이 질병의 발병과 진행에 다양한 기여를 할 수 있습니다 모두 신경과 해로운 역할을 주로하기 때문에, 확실하지 않다. 만성 중추 신경계 질환을 이해하기위한 라이브 영상 연구는 동물 모델과 인간의 손상된 중추 신경계의 소교 동작을 모니터링하고, 미세 아교 변경이 초기 질병 단계 15-17,19,20에서 검출 시작이라는 것을 증명하고있다. 따라서, 검출 및 생체 내에서 활성화를 소교 모니터링하는 방법을 개발하는 것이 중요하다. 비 침습적 DETE뇌 미세 아교 세포의 활성화에 지역 변경 ction의는 분자 영상 또는 생물 발광 및 양전자 방출 단층 촬영이나 자기 공명 영상 18,21,22를 사용하여, 신경 퇴행성 질병 진행의 생체 지표에 중요한로 설립되었다. 이러한 고도로 정량적 및 비 침습적 분자 핵 촬상 방법은 지역 신경교 증 해상도를 검출한다. 또한, CX3CR1 GFP / + 마우스의 두 광자 공 초점 영상은 세포 해상도 3,4,9,20,23-28와 뇌 미세 아교 세포의 관찰을 허용했다. 그러나이 방법은 심지어 최소 침습 뇌 영상 절차 (29)에 의해 행동을 방해의 잠재적 위험 주어진 장기 만성 소교 변화의 반복 관찰을 제한한다. 또한, 망막 급성 손상 후 생체 내 시각화 직접위한 최적의 조건, 노화에 걸쳐 자신의 본래 중추 신경계의 틈새에서 미세 아교 세포의 반복 모니터링을 제공하며,잠재적으로 만성 신경 퇴행성 질환 중. 따라서, 최근 연구에 촛점 이미지 스캐닝 레이저 검안경 (cSLO) 라이브 CX3CR1 GFP / + 마우스를 적응시킴으로써 GFP를 발현하는 망막 미세 아교 세포의 고해상도 영상의 가능성을 증명했다. 이것은 급성 유도 상해 또는 안구 고혈압 30-36 다음 최대 10 주 동안 개인 마우스의 GFP + 세포 수의 주간 변화를 추적하는 데 사용되었습니다. 우리는 몇 개월 이상 장기 촬상을 수행 한 정량적 형태 계측 분석을 사용하여 소마 크기에 기초하여 미세 아교 세포의 활성의 변화를 추적하기 위해이 방법을 확장 하였다. Somal 크기 CX3CR1-GFP + 9 미세 아교 세포의 생체 내 이미징 수행 피질 슬라이스 개의 광자 공 초점 현미경을 사용하여 실시간 이미징 실험의 미세 아교 세포 활성화의 유용한 메트릭으로 정의 하였다. 이들 및 다른 연구에서도 WH, somal 사이즈 Iba1 단백질 발현 수준 간의 상관 관계를 증명무형 문화 유산도 활성화 9,37 증가한다. 따라서, 활성화 된 미세 아교 세포는 살아있는 마우스에서 확인 될 수 있으며, 그 수 및 분포는 CNS 상태 및 질환의 시간 경과를 모니터링. 이 프로토콜은 cSLO 라이브 이미지 수집 및 분석을위한 방법은 미세 아교 세포 수, 망막 신경절 세포 (RGC) 변성 (그림 1) 동안의 분포와 형태 학적 활성을 모니터링에 대해 설명합니다. 따라서, 본 연구에서는 사용 : 1) 연령에 따라 시신경 및 망막 신경 퇴행 및 겪는 상속 녹내장 (DBA / 2J)의 마우스 모델의 나이 (38, 39)의 5 10개월 사이에서 질병의 진행에 놀라운 변화를 보여주고, 2) 월 장기 망막에 GFP + 세포의 시각화 3-5 개월 세포 인 somata 및 측정을 분리하는 분할 및 임계 3) 라이브 영상 분석 세 이형 Cx3cr1 GFP / + DBA / 2J 마우스의 무수 시신경에 대한 cSLO 생체 내 이미징적외선 영역입니다. 이러한 전략은 만성 녹내장의 초기 단계에서 망막 미세 아교 활성화 상태의 동역학을 평가하기 위해 적용된다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="2010">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:617px;">Name</td>
			<td style="width:444px;">Company</td>
			<td style="width:208px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:741px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:617px;">DBA/2J and 
			CX3CR1-GFP/+ mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME</td>
			<td>000671 and 00582</td>
			<td>Mice are breed in-house, introducing new breeders every 3 to 4 generations to prevent genetic drift.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">301/2G needle and 1 ml tuberculin slip-tip syringe</td>
			<td>BD, East Rutherford, NJ</td>
			<td>305106 and 309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:617px;">2,2,2-tribromoethanol, tert-Amyl alcohol 99% and phosphate buffer saline tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>T48402, 152463 and P4417</td>
			<td>Avertin solution (pH 7.3, sterile filtered) must be freshly made solution or stored at 4&#186;C for up to 1 week.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heat therapy T/Pump</td>
			<td>Gaymar Industries, Orchard Park, NY</td>
			<td>TP-650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cotton-tipped applicators</td>
			<td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td>23-400-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tropicamide 1%&#160;</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb, Rochester, NY</td>
			<td>NDC 24208-585-64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PMMA contact lenses, 1.70-base curve, 3.2 mm total diameter, 0.40 mm-thick center</td>
			<td>Cantor &#38; Nissel Ltd., Northamptonshire, UK</td>
			<td>G003709</td>
			<td>Lenses are rinsed with sterile PBS and stored in polypropylene boxes.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HRA/Spectralis confocal scanning laser ophthalmoscope and Eye Explorer software</td>
			<td>Heidelberg Engineering GmbH, Carlsbad, CA</td>
			<td>Version 1.7.1.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PowerPoint</td>
			<td>Microsoft, Redmond, WA</td>
			<td>Version 14.4.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adobe Photoshop</td>
			<td>Adobe, San Jose, CA</td>
			<td>Version CS3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FluoRender</td>
			<td>Scientific Computing and Imaging Institute, University of Utah</td>
			<td>Version 2.13</td>
			<td>Freeware. http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NIS-Elements C</td>
			<td>Nikon, Melville, NY</td>
			<td>Version 4.30.01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo dynamics of retinal microglial activation during neurodegeneration: confocal ophthalmoscopic imaging and cell morphometry in mouse glaucoma

CNS 상주 신경 면역 세포 인 미세 아교 세포는 별개의 기능 및 유전자 발현 프로파일과 액티브 상태로 전환하는, CNS 손상에 응답하여 자신의 형태와 크기를 변환. 건강, 상해 및 질병에 미세 아교 활성화의 역할은 불완전 인해 미세 환경의 변화에​​ 따라 자신의 역동적이고 복잡한 규정을 이해 남아 있습니다. 이에 따라, 비 침습적으로 모니터에 중요하며, 본래 유기체 경시 소교 활성의 변화를 분석한다. 생체 내에서 활성화를 소교 연구 CNS 환경을 바꾸지 않고 동작 추적 소교 기술적 한계에 의해 지연되어왔다. 이는 장기간 변화 추적해야 만성 신경 퇴화, 특히 도전 중에있다. 망막, 비 침습적 라이브 영상 의무가 중추 기관, 시각화 및 만성 질환 중 미세 아교 세포 활성화의 역학을 특성화 할 수있는 강력한 시스템을 제공합니다. 생체 내 이미징, 세포 해상도와 미세 아교 세포를 시각화, 공 촛점 검안경 (cSLO) 및 CX3CR1 GFP / + 기자 마우스를 사용하는 방법을 설명합니다. 또한, 우리는 대 세포 하위 집합의 세포 활성화와 밀도의 월별 변화 (망막 당 200-300 세포)를 정량화하는 방법을 설명합니다. 우리는 생체 화상의 자동 임계 값 기반 형태 계측 분석을 적용하여 망막 미세 아교 활성화의 실시간 추적을 위해 유용한 메트릭으로서 somal 영역의 사용을 확인한다. 우리는이 라이브 화상 취득을 사용 만성 녹내장의 마우스 모델에서 망막 신경 퇴행의 초기 단계에서 미세 아교 활성화 및 microgliosis의 동적 변화를 모니터링하기위한 전략을 분석한다. 이 방법은 망막과 시신경에 영향을 미치는 만성 중추 신경계 질환에서 신경 세포와 축삭 감소에 미세 아교 세포의 기여를 조사하는 데 유용합니다.

우리의 최근 생체 내에서 연구 시각화하고 늦게 신경 퇴행 59 만성 녹내장과의 관계의 초기 단계 반응 속도와 시신경 유두와 망막 미세 아교 변화의 패턴을 추적하는이 라이브 이미지 수집 및 분석 방법을 사용했다. 여기에서 우리는 개인의 젊은 이형 Cx3CR1-GFP의 DBA / 2J 망막의 중심 망막 (그림 5)의 넓은 지역에 걸쳐 미세 아교 세포를 시각화하는 cSLO 영상 획득 프로토콜?...

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In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

미세 아교 세포의 활성화 및 microgliosis 만성 신경 퇴행의 핵심 반응이다. 여기, 우리는 생체 내, 공 초점 검안경으로 망막 CX3CR1-GFP + 미세 아교 세포의 장기 시각화를위한 방법을 제시하고, 임계 값 및 형태 계측 학적 대한 식별과 활성화를 정량화 분석한다. 우리는 연령과 관련된 녹내장의 초기 단계 소교 변경 사항을 모니터링 할 수 있습니다.

마우스 녹내장에 공 촛점 안저 이미징 및 세포 형태 계측 : 신경 퇴행 중 망막 미세 아교 활성화의 생체 역학

Microglia, which are CNS-resident neuroimmune cells, transform their morphology and size in response to CNS damage, switching to an activated state with ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

10.5K 조회수.  University of Utah.  미세 아교 세포의 활성화 및 microgliosis 만성 신경 퇴행의 핵심 반응이다. 여기, 우리는 생체 내, 공 초점 검안경으로 망막 CX3CR1-GFP + 미세 아교 세포의 장기 시각화를위한 방법을 제시하고, 임계 값 및 형태 계측 학적 대한 식별과 활성화를 정량화 분석한다. 우리는 연령과 관련된 녹내장의 초기 단계 소교 변경 사항을 모니터링 할 수 있습니다. 

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Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

구강 편평 세포 암종의 Orthotopic 마우스 모델에서 종양 세포 침략의 다중 광자 이미징

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

연구

의학

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There is little knowledge about in situ, in vivo, tumor hypoxia during intracranial development of malignant brain tumors because of lack of efficient means to monitor it in these deep-seated orthotopic tumors. Bioluminescence imaging (BLI), based on the detection of light emitted by living cells expressing a luciferase gene, has been rapidly adopted for cancer research, in particular, to evaluate tumor growth or tumor size changes in response to treatment in preclinical animal studies. Moreover, by expressing a reporter gene under the control of a promoter sequence, the specific gene expression can be monitored non-invasively by BLI. Under hypoxic stress, signaling responses are mediated mainly via the hypoxia inducible factor-1&alpha; (HIF-1&alpha;) to drive transcription of various genes. Therefore, we have used a HIF-1&alpha; reporter construct, 5HRE-ODD-luc, stably transfected into human breast cancer MDA-MB231 cells (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay is performed by incubating the transfected cells in a hypoxic chamber (0.1% O2) for 24 hr before BLI, while the cells in normoxia (21% O2) serve as a control. Significantly higher photon flux observed for the cells under hypoxia suggests an increased HIF-1&alpha; binding to its promoter (HRE elements), as compared to those in normoxia. Cells are injected directly into the mouse brain to establish a breast cancer brain metastasis model. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics is initiated 2 wks after implantation and repeated once a week. BLI reveals increasing light signals from the brain as the tumor progresses, indicating increased intracranial tumor hypoxia. Histological and immunohistochemical studies are used to confirm the in vivo imaging results. Here, we will introduce approaches of in vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay, surgical establishment of a breast cancer brain metastasis in a nude mouse and application of in vivo bioluminescence imaging to monitor intracranial tumor hypoxia.

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Bioluminescence imaging of hypoxia inducible factor-1&alpha; activity is applied to monitor intracranial tumor hypoxia development in a breast cancer brain metastasis mouse model.

유방암 뇌 전이의 종양 Hypoxia 역학 생체내의 Bioluminescence 이미징에서는 마우스 모델에서

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite fluorescent in situ elements through the optical fibers, and then record some of the emitted photons, via the same optical fibers. The light source is a laser that sends the exciting light through an element within the fiber bundle and as it scans over the sample, recreates an image pixel by pixel. As this scan is very fast, by combining it with dedicated image processing software, images in real time with a frequency of 12 frames/sec can be obtained.
We developed a technique to quantitatively characterize capillary morphology and function, using a confocal fluorescence videomicroscopy device. The first step in our experiment was to record 5 sec movies in the four quadrants of the tumor to visualize the capillary network. All movies were processed using software (ImageCell, Mauna Kea Technology, Paris France) that performs an automated segmentation of vessels around a chosen diameter (10 &mu;m in our case). Thus, we could quantify the 'functional capillary density', which is the ratio between the total vessel area and the total area of the image. This parameter was a surrogate marker for microvascular density, usually measured using pathology tools.
The second step was to record movies of the tumor over 20 min to quantify leakage of the macromolecular contrast agent through the capillary wall into the interstitium. By measuring the ratio of signal intensity in the interstitium over that in the vessels, an 'index leakage' was obtained, acting as a surrogate marker for capillary permeability.

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

In this paper, we present a method to analyze tumor microvessels in vivo using dynamic contrast-enhanced fluorescence videomicroscopy. Two quantitative parameters were acquired: functional capillary density reflecting the vascularity of the tumor, and index leakage reflecting the leakiness of the endothelial wall.

형광 공 초점 Videomicroscopy를 사용하여 종양 혈관의 생체 내 이미징

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

세포 추적을위한 생체 19 F MRI에서

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

순차<em&gt; 생체 내</em&gt; 골절 치료시 골 형성 줄기 / 전구 세포의 이미징

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. Despite the discovery of key regulators of uterine contractility, this process is still not fully understood. Transgenic mice provide an ideal model in which to study parturition. Previously, the only method to study uterine contractility in the mouse was ex vivo isometric tension recordings, which are suboptimal for several reasons. The uterus must be removed from its physiological environment, a limited time course of investigation is possible, and the mice must be sacrificed. The recent development of radiometric telemetry has allowed for longitudinal, real-time measurements of in vivo intrauterine pressure in mice. Here, the implantation of an intrauterine telemeter to measure pressure changes in the mouse uterus from mid-pregnancy until delivery is described. By comparing differences in pressures between wild type and transgenic mice, the physiological impact of a gene of interest can be elucidated. This technique should expedite the development of therapeutics used to treat myometrial disorders during pregnancy, including preterm labor.

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

This manuscript provides a protocol for implanting telemeters in the mouse for the purpose of measuring intrauterine pressures during pregnancy.

자궁 원격 측정은 마우스 수축 압력을 측정하는<em&gt; 생체</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to image cellular events in an intact animal. Additionally, the ability to induce physiological disease states such as stroke in vivo increases its utility. The technique described herein allows for physiological assessment of cellular responses within the CNS following a stroke and can be adapted for other pathological conditions being studied. The technique presented uses laser excitation of the photosensitive dye Rose Bengal in vivo to induce a focal ischemic event in a single blood vessel. 
The video protocol demonstrates the preparation of a thin-skulled cranial window over the somatosensory cortex in a mouse for the induction of a Rose Bengal photothrombotic event keeping injury to the underlying dura matter and brain at a minimum. Surgical preparation is initially performed under a dissecting microscope with a custom-made surgical/imaging platform, which is then transferred to a confocal microscope equipped with an inverted objective adaptor. Representative images acquired utilizing this protocol are presented as well as time-lapse sequences of stroke induction. This technique is powerful in that the same area can be imaged repeatedly on subsequent days facilitating longitudinal in vivo studies of pathological processes following stroke.

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

Here, we describe a semi-invasive optical microscopy approach for the induction of a Rose Bengal photothrombotic clot in the somatosensory cortex of a mouse in vivo. The technical aspects of the imaging procedure are described from induction of a photothrombotic event to application and data collection.

공 초점 광학 이미징에 의해 로즈 벵갈 Photothrombosis<em&gt; 생체</em&gt; : 단일 선박 스트로크의 모델

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the brain for visual perception. Damage to RGCs and their axons leads to vision loss and/or blindness. Although the specific cause of glaucoma is unknown, the primary risk factor for the disease is an elevated intraocular pressure. Glaucoma-inducing procedures in animal models are a valuable tool to researchers studying the mechanism of RGC death. Such information can lead to the development of effective neuroprotective treatments that could aid in the prevention of vision loss. The protocol in this paper describes a method of inducing glaucoma - like conditions in an in vivo rat model where 50 &#181;l of 2 M hypertonic saline is injected into the episcleral venous plexus. Blanching of the vessels indicates successful injection. This procedure causes loss of RGCs to simulate glaucoma. One month following injection, animals are sacrificed and eyes are removed. Next, the cornea, lens, and vitreous are removed to make an eyecup. The retina is then peeled from the back of the eye and pinned onto sylgard dishes using cactus needles. At this point, neurons in the retina can be stained for analysis. Results from this lab show that approximately 25% of RGCs are lost within one month of the procedure when compared to internal controls. This procedure allows for quantitative analysis of retinal ganglion cell death in an in vivo rat glaucoma model.

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis.

녹내장 유도 절차<em&gt; 생체</em&gt; 쥐 모델 및 전체 마운트 망막 준비

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

인간 종양 이종 이식에서 마우스 세포의 고갈은 크게 대상 세포의 다운 스트림 분석을 향상

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, diabetic retinopathy, age-related macular degeneration (AMD) and other ocular inflammatory conditions. It may also help to monitor the therapeutic responses in the eye. The proper labeling of the blood cells, coupled with live-cell imaging of the labeled cells, allows for the investigation of the flow dynamics in the retinal and choroidal circulation. Here, we describe the standardized protocols of 1.5% indocyanine green (ICG) and 1% sodium fluorescein labeling of mice erythrocytes and leukocytes, respectively. Scanning laser ophthalmoscopy (SLO) was applied to visualize the labeled cells in the retinal circulation of C57BL/6J mice (wild type). Both methods demonstrated distinct fluorescently labeled cells in the mouse retinal circulation. These labeling methods can have wider applications in various ocular disease models.

Live-cell imaging of the labeled blood cells in ocular circulation can provide information about inflammation and ischemia in diabetic retinopathy and age-related macular degeneration. A protocol to label blood cells and image the labeled cells in the retinal circulation is described.

마우스 망막 순환에서 유동 역학을 연구하기위한 적혈구 및 백혈구의 형광 염료 표지

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, ...