N.G. ha recibido becas de la "Fondation pour la Recherche Médicale FRM" francesa y de la Fundación Philipp; R.S. cuenta con el apoyo de la Fundación Lucile Packard para la Salud infantil y el premio CTSA de los NIH/NCRR de Stanford número UL1 RR025744; P.S. cuenta con el apoyo de una beca Max Kade de la Fundación Max Kade y la Academia Austríaca de Ciencias y una beca Schroedinger del Fondo Austriaco para la Ciencia (FWF): J3399-B21; S.J.G. reconoce el apoyo de las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud U19 AI104209, NS 080062 y del Programa de Investigación de Enfermedades Relacionadas con el Tabaco de la Universidad de California; L.L.R. reconoce el apoyo de la Arthritis National Research Foundation (ANRF) y la subvención K99AI110645 de los Institutos Nacionales de Salud.

Todo el cuidado y la experimentación animal se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud y con la aprobación específica del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Stanford.
1. Generación y Caracterización De Mastocitos Cultivados Derivados De La Médula Ósea (BMCMCs).
Nota: Los BMCMCs dispensadores de aceite se deben generar de las células de la médula del mismo fondo genético que los ratones MC-deficientes receptores. BMCMCs donante Varón-derivado no es conveniente para el engraftment de ratones femeninos. Los BMCMCs donantes derivados de mujeres se injertarán con éxito en receptores masculinos y femeninos.
<ol><li>Extracción de médula ósea.<ol>
<li>Vierta solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS) en 6 placas de cultivo de pozos (1 pozo por ratón) y colóquelo sobre hielo.</li>
		<li>Remoje los instrumentos de disección en etanol al 70% para la esterilización.</li>
		<li>Eutanasia ratones donantes por inhalación de dióxido de carbono (CO2)seguido de dislocación cervical, luego rocíe a los ratones con etanol al 70% en los sitios de manipulación.</li>
		<li>Use instrumentos de disección estériles para extraer los huesos del fémur, la tibia y el peroné sin cortar ninguna epífis ósea.</li>
		<li>Mientras asegura los huesos con un fórceps, raspe todo el tejido de los huesos (y deseche el peroné) usando tijeras estériles (o cuchillas de bisturí). Coloque los huesos en PBS sobre hielo hasta que se recojan todos los huesos.</li>
		<li>Lleve a cabo todos los pasos restantes en la campana de cultivo de tejido estéril. Usando instrumentos estériles, asegure los huesos con fórceps y corte ambas epífimas para exponer la cavidad medular.</li>
		<li>Usando jeringas de 3 ml y agujas de 30 G, y medio de lavado en frío (Dulbecco Modified Eagle Medium [DMEM] complementado con suero fetal de terneros al 10% [FCS, inactivado por calor], 2 mM de L-glutamina, 1% de solución antibiótico-antimicótica, 50 μM de Β-mercaptoetanol), enjuague la médula ósea roja en una placa de Petri.</li>
		<li>Use la misma jeringa para disociar los grupos de células de médula ósea enrojecidas por aspiración y eyección suaves repetidas.</li>
		<li>Piscina de médula ósea femoral y tibial de cada ratón en un tubo de centrífuga de 15 ml. Llene el tubo con un medio de lavado en frío para lavar las células de la médula ósea y la centrífuga a 400 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Cultura de BMCMCs.<ol>
<li>Retire el sobrenadante y recupere las células peletadas de la médula ósea en 10 ml de medio de cultivo (DMEM complementado con suero fetal de terneros al 10% [FCS, inactivado por calor], 2 mM de L-glutamina, 1% de solución antibiótica, 50 μM de Β-mercaptoetanol y 20% de medio acondicionado de células WEHI-3 [como fuente de IL-3; alternativamente, use IL-3 de ratón recombinante a 10 ng/ml]).</li>
		<li>Coloque las células en el matraz de cultivo de tejidos de tamaño adecuado(por ejemplo,T25 para 1 ratón, T75 para 2 ratones, etc.).</li>
		<li>1-2 días después del revestimiento de las células, transfiera las células del medio y de suspensión (dejando los restos y las células adherentes pegadas al fondo del matraz) a un nuevo matraz y agregue el medio de cultivo fresco (10 ml / ratón).</li>
		<li>Durante las semanas siguientes, las células de alimentación cada 3-4 días (añadir 10 ml de medio de cultivo por ratón). Mantener la densidad celular entre 2,5 x 105-1 x 106 células/ml. Transfiera las células no adherentes a un nuevo matraz una vez a la semana hasta que no haya células adherentes presentes en el matraz de cultivo. Pruebe la madurez de las células (ver más abajo) antes de su uso para ensayos in vitro o injertos en ratones deficientes en MC. NOTA: La diferenciación completa de BMCMCs tomará 4-6 semanas.</li>
	</ol></li>
	<li>Evaluación de la madurez de BMCMC.<ol>
<li>
Uso de citometría de flujo.
		<ol>
<li>Lave las células (5 x 104-5 x 105 células/condición) con tampón FACS helado (PBS, 0,5% FCS) en tubo inferior redondo de poliestireno de 5 ml. Centrífuga a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Sobrenadante aspirado.</li>
			<li>Diluir anticuerpos monoclonales anti-ratón CD16/32 (clon 93 o 2.4G2) 1:200 (2.5 μg/ml) en tampón FACS. Añadir 10 μl a cada pellet y resuspend por vórtice breve. Incubar 5 min sobre hielo para bloquear la unión a Fc. NOTA: Proteja las muestras de la luz directa para todos los pasos restantes.</li>
			<li>Diluir ficoeritrina (PE) conjugada anti-ratón Fc εRI α (clon MAR-1) 1:200 (1 μg/ml) y fluoresceína isotiocianato (FITC) conjugado anti-ratón KIT (CD117; clon 2B8) 1:200 (2.5 μg/ml) ("solución de tinción"), o los respectivos anticuerpos de control de isotipo etiquetados en el tampón FACS ("solución de control de isotipo").</li>
			<li>Dividir la mitad de las células bloqueadas de la etapa 1.3.1.2) en un tubo inferior redondo de poliestireno adicional y añadir 20 μl de "solución de tinción" en un tubo y 20 μl de "solución de controles de isotipo" en el otro tubo. Incubar 30 min sobre hielo.</li>
			<li>Añadir 3 ml de tampón facs helado y centrífuga a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y resuspiente el pellet en tampón FACS de 300 μl que contenga 1 μg/ml de yoduro de propidio (PI, para la identificación de células muertas). Proceder al análisis de citometría de flujo (ver Figura 2A).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Uso de tinción azul de toluidina.<ol>
<li>Lavar 1 x 105 células una vez con PBS por centrifugación a 400 x g durante 5 min a temperatura ambiente, luego aspirar y resuspend las células en 200 μl de PBS.</li>
			<li>Transfiera la suspensión celular a un citofunnel preparado unido a un portaobjetos de microscopio y proceda con la citocentrifugación usando una citocentrífuga (40 x g durante 5 min).</li>
			<li>Seque al aire los portaobjetos durante 10 minutos y dibuje un círculo de cera alrededor de las células usando una pluma pap. Añadir solución azul de toluidina al 0,1% para cubrir las células. Incubar durante 1 min. Lave los portaobjetos en agua corriente del grifo durante 1 minuto, luego seque al aire los portaobjetos durante 10 min.</li>
			<li>Celdas coverslip utilizando medio de montaje. Proceder al análisis de microscopio de luz (ver Figura 2B)</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. Engraftment de ratones deficientes en mastocitos con BMCMCs.
<ol><li>Injerto de oído por inyección intradérmica (i.d.). NOTA: Para la transferencia adoptiva de BMCMCs en los pabellones auriculares de ratones deficientes en MC, recomendamos realizar dos inyecciones de 1 x 106 células cada una (para un total de 2 x 106 células) por pabellón auricular. El injerto intradérmico de BMCMCs en los pabellones auriculares de ratones con deficiencia de MC ha sido utilizado por muchos investigadores en varios modelos, incluidos modelos de anafilaxia cutánea pasiva (PCA)24,27,defensa del huésped contra venenos28y reacciones de hipersensibilidad crónica (CHS)29,30.<ol>
<li>Contar y resuspend las células a 4 x 107 BMCMCs/ml (1 x 106 BMCMCs/ 25 μl) en DMEM frío. Transfiera la solución de BMCMCs en una jeringa de 1 ml equipada con una aguja de 30 G. Mantenga el hielo hasta la inyección.</li>
		<li>Anestesiar ratones deficientes en MC de 4-6 semanas de edad usando isoflurano (2,5% v/v). Compruebe la profundidad de la anestesia con pellizco en los dedos de los artículos, ajuste el isoflurano si está indicado y continúe supervisando la respuesta respiratoria y del pellizco de los dedos de los dedos durante todo el procedimiento. Aplique ungüento oftálmico con una punta Q para prevenir la sequedad de los ojos.</li>
		<li>Con el dedo índice, cree presión vertical sobre la cara dorsal del pabellón auricular para exponer y estirar la cara ventral.</li>
		<li>Realice dos inyecciones de 25 μl i.d. de solución de BMCMC en dos sitios diferentes de la cara ventral del pabellón auricular, la primera inyección en el centro del oído y la segunda inyección hacia la punta del pabellón auricular. Espere 4-6 semanas después del injerto de i.d. antes de realizar experimentos in vivo. Nota: En nuestra experiencia, en ese momento el número de MCs/mm2 de dermis en la parte central del pabellón auricular generalmente es similar al de la ubicación correspondiente en ratones de tipo salvaje, mientras que el número de MCs/mm2 en la periferia de los pabellones auriculares es típicamente sustancialmente menor que los de los ratones de tipo salvaje correspondientes27,28. Esto debe tenerse en cuenta al diseñar experimentos con tales ratones con mc-engrafted(e.g.,los agentes con efectos posibles sobre la función de la bujía métrica se deben inyectar en la parte central de los pabellones auriculares, y el análisis de los efectos de tales tratamientos debe también centrarse en esa área).</li>
	</ol></li>
	<li>Engraftment peritoneal de la cavidad por la inyección intraperitoneal (i.p.). NOTA: La transferencia adoptiva de BMCMCs en la cavidad peritoneal de ratones MC-deficientes requerirá una inyección de 2 x 106 células por ratón. Tales inyecciones de i.p. de BMCMCs en ratones con deficiencia de MC han sido utilizadas por muchos grupos para estudiar el papel de los MCs peritoneales en varios modelos, incluidos los modelos de defensa del huésped contra los venenos31 o la sepsis bacteriana32,33.<ol>
<li>Contar el número adecuado de células y resuspend a 1 x 107 BMCMCs/ml (2 x 106 BMCMCs/ 200 μl) en DMEM frío. Transfiera la solución de BMCMCs en una jeringa de 1 ml equipada con una aguja de 25 G. Mantenga el hielo hasta la inyección.</li>
		<li>Realizar 1 inyección de 200 μl de solución de BMCMCs en la cavidad peritoneal de ratones deficientes en MC de 4-6 semanas de edad. Espere 4-6 semanas después del injerto de i.p. antes de realizar experimentos in vivo.</li>
	</ol></li>
	<li>Engraftment por la inyección intravenosa (i.v.). NOTA: La transferencia adoptiva de BMCMCs por inyección de i.v. en ratones con deficiencia de MC requerirá una inyección de 5 x 106 células por ratón. Las inyecciones intravenosas (i.v.) de BMCMCs en ratones con deficiencia de MC han sido utilizadas por muchos grupos para estudiar el papel de los MCs en varios modelos de enfermedades, incluidos los modelos de infección vesical34,asma35,fibrosis pulmonar36y artritis mediada por anticuerpos37.<ol>
<li>Contar el número adecuado de células y resuspend a 2,5 x 107 BMCMCs/ml (5 x 106 BMCMCs/200 μl) en DMEM frío. Transfiera la solución de BMCMCs en una jeringa de 1 ml equipada con una aguja de 30 G. Mantenga el hielo hasta la inyección.</li>
		<li>Anestesiar ratones deficientes en MC de 4-6 semanas de edad usando isoflurano (2,5% v/v). Compruebe la profundidad de la anestesia con pellizco en los dedos de los artículos, ajuste el isoflurano si está indicado y continúe supervisando la respuesta respiratoria y del pellizco de los dedos de los dedos durante todo el procedimiento. Aplique ungüento oftálmico con una punta Q para prevenir la sequedad de los ojos.</li>
		<li>Realice una inyección de 200 μl de solución de BMCMC en la vena de la cola (o, alternativamente, la vena retro-orbital) de un ratón deficiente en MC. Espere 12 semanas después del injerto de i.v. antes de realizar experimentos in vivo.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Análisis de ratones deficientes en mastocitos en injertados.
<ol><li>Análisis del engraftment del oído.<ol>
<li>Al final del experimento, eutanasia ratones por inhalación de CO2 seguido de dislocación cervical.</li>
		<li>Aísle los pabellones auriculares y fije en formalina tamponada al 10% (vol/vol) durante la noche a 4 °C. Incruste pinnas de oreja fijas en parafina, corte secciones de 4 μm de pinnas de oreja y monte en diapositivas de vidrio.</li>
		<li>Manche los portaobjetos con una solución azul de toluidina al 0,1% durante 1 min a temperatura ambiente. Lave los portaobjetos en agua del grifo durante 1 minuto, luego los portaobjetos secos al aire durante 10 minutos a temperatura ambiente.</li>
		<li>Portaobjetos de cubrebocas utilizando el medio de montaje, luego cuente el número de MCs engrafted por secciones de pines usando un microscopio de luz. Evalúe la eficacia del engraftment comparando el porcentaje y la distribución de MCs en la piel del oído de ratones engrafted contra ratones del tipo salvaje.</li>
	</ol></li>
	<li>Análisis del engraftment de la cavidad peritoneal.<ol>
<li>Evaluación del número de mastocitos en la cavidad peritoneal.<ol>
<li>Al final del experimento, eutanasia ratones por inhalación de CO2 seguido de dislocación cervical. Retire cuidadosamente la piel ventral de los ratones sin romper la cavidad peritoneal.</li>
			<li>Inyecte 5 ml de PBS frío o a temperatura ambiente en la cavidad peritoneal usando una jeringa de 5 ml equipada con una aguja de 25 G. Utilice PBS frío para reducir el riesgo de activación de las células peritoneales (esto es muy importante al evaluar la degranulación peritoneal de mc o los niveles de algunos productos derivados de MC en el líquido de lavado peritoneal). Realizar un masaje del abdomen durante 20 segundos para cosechar las células peritoneales.</li>
			<li>Aspirar lentamente el lavado peritoneal usando una jeringa de 5 ml equipada con una aguja de 22 G. Registre el volumen de lavado aspirado (espere recuperar hasta el 80% del volumen inyectado).</li>
			<li>Transferir líquido de lavado peritoneal a un tubo inferior redondo de poliestireno de 5 ml y centrífuga a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Sobrenadante aspirado. Recuperar el pellet en PBS frío de 400 μl.</li>
			<li>Contar el número total de células peritoneales utilizando una cámara de hemocitómetro. Utilice la mitad de la suspensión celular para un análisis de citometría de flujo (como se describe en el paso 1.3.1), para evaluar el porcentaje y la expresión de marcadores de MCs engrafted en la cavidad peritoneal. Multiplique el número total de células peritoneales por el porcentaje de MCs para obtener el número absoluto de MCs peritoneales.</li>
			<li>Realizar una citocentrifugación con las células restantes como se describe en el paso 1.3.2.2. Seque al aire los portaobjetos durante 10 minutos a temperatura ambiente y dibuje un círculo de cera alrededor de las células usando una pluma pap.</li>
			<li>Cubra las células con solución de tinción de May-Grünwald sin diluir durante 5 min, seguida de lavado en PBS durante 5 min, ambos a temperatura ambiente. Cubrir las células con tinción de Giemsa diluida 1:20 con agua desionizada e incubar 20 min a temperatura ambiente. Lave los portaobjetos 2 veces en agua del grifo durante 1 minuto, luego los portaobjetos secos al aire.</li>
			<li>Cubre las células que utilizan el medio de montaje y calcula el porcentaje de MCs injertados utilizando un microscopio de luz (contando al menos 400 células en total). Evalúe la eficiencia del injerto comparando el porcentaje de MCs en el lavado peritoneal de ratones injertados versus ratones de tipo salvaje.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Evaluación de mastocitos en las ventanas mesentéricas.<ol>
<li>Tras el lavado peritoneal descrito en el paso 3.2.1, se abre la membrana peritoneal para exponer el tracto intestinal de los ratones. Organice de 4 a 5 ventanas mesentéricas por mouse en una diapositiva.</li>
			<li>Fije las guías durante 1 hora en solución de Carnoy (3:2:1 vol/vol/vol de etanol, cloroformo y ácido acético glacial) a temperatura ambiente. Seque al aire los portaobjetos y retire el intestino (las ventanas mesentéricas fijas permanecerán unidas a los portaobjetos).</li>
			<li>Manche las preparaciones durante 20 minutos a temperatura ambiente con solución de tinción de Csaba (Azul alciano / Safranin O).<ol>
<li>Para hacer 500 ml de tinción de Csaba, preparar 500 ml de tampón de acetato mezclando 100 ml de solución de acetato de sodio 1 M con 120 ml de HCl de 1 M. Encuadernar hasta 500 ml con agua desionizada y ajustar el pH a 1,42. A continuación, disuelva 90 mg de Safranin [identifica 'MCs maduros' en rojo], 1,8 g de azul alciano [identifica 'MCs inmaduros' en azul] y 2,4 g de sulfato férrico de amonio NH4Fe (SO4)2 en 500 ml de tampón de acetato.</li>
			</ol>
</li>
			<li>Cubreboganes con medio de montaje, luego cuente el número de MCs engrafted por ventana mesentérica usando un microscopio de luz. Evalúe la eficiencia del injerto comparando el porcentaje y la distribución de los MCs en las ventanas mesentéricas de ratones engrafted contra ratones de tipo salvaje.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>I.v. análisis del engraftment.<ol>
<li>Al final del experimento, eutanasiar ratones por inhalación de CO2 seguida de dislocación cervical, y cosechar tejido de interés (porejemplo, pulmón, piel o bazo) y fijar durante la noche en 10% (vol / vol) formol tamponado a 4 ° C.</li>
		<li>Incruste tejidos fijos en la parafina, corte secciones de 4 μm y monte en portaobjetos de vidrio. Manche los portaobjetos con una solución azul de toluidina al 0,1% durante 1 min a temperatura ambiente. Lave los portaobjetos en agua del grifo durante 1 minuto, luego seque al aire los portaobjetos durante 10 min.</li>
		<li>Cubreboganes con medio de montaje y evaluar el número y la distribución de los MCs injertados por secciones de tejido utilizando un microscopio de luz.</li>
	</ol></li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Casi 30 años después de su descripción inicial38, el enfoque'mast cell knock-in'sigue proporcionando información valiosa sobre lo que los MCs pueden o no pueden hacer in vivo. Las funciones de MCs eran de largo probablemente limitadas a su papel en alergia. Los datos generados utilizando el enfoque'mast cell knock-in'han cambiado esta visión, al proporcionar evidencia de que los MCs pueden, entre otras funciones, desempeñar papeles críticos en la defensa del huésped contra ci...

Los mastocitos (MCs) son células hematopoyéticas que surgen de progenitores pluripotentes de la médula ósea1-3. Después de la egressión de la médula ósea, los progenitores de las MCs migran a varios tejidos donde se convierten en MCs maduros bajo la influencia de factores de crecimiento locales1-3. Los MCs residentes en tejidos están estratégicamente ubicados en interfaces huésped-ambiente, como la piel, las vías respiratorias y el tracto gastrointestinal, donde se comportan como una primera línea de defensa contra los insultos externos3-6. Los MCs se subclasifiquen a menudo basados en sus características fenotípicas de la "línea de fondo" y sus localizaciones anatómicas. En ratones, se han descrito dos tipos de MCs: "tipo tejido conectivo" MCs (CTMCs) y MCs de la mucosa (MMCs)1-3,7,8. Los CTMCs a menudo se encuentran alrededor de las vénulas y cerca de las fibras nerviosas, y residen en cavidades serosales, mientras que los MMCs ocupan ubicaciones intraepiteliales en el intestino y la mucosa respiratoria1-3.
Se han aplicado numerosas metodologías para estudiar las funciones biológicas de las MCs9-13. Muchos grupos se han centrado en enfoques in vitro utilizando líneas celulares (como las líneas de MC humanas HMC114 o LAD215,16),MCs derivados in vitro (como MCs derivados de sangre periférica humana17,o MCs cultivados derivados de médula ósea de ratón [BMCMCs]18,MCs cultivados derivados de la piel fetal [FSCMCs]19 y MCs derivados de células peritoneales [PCMCs]20)o MCs aislados ex vivo de diferentes sitios anatómicos. Todos estos modelos son ampliamente utilizados para estudiar los detalles moleculares de la biología mc, tales como vías de señalización implicadas en la activación mc. Sin embargo, un aspecto importante de la biología de los MCs es que sus características fenotípicas y funcionales (porejemplo,el contenido de proteasa de gránulos citoplasmáticos o la respuesta a diferentes estímulos) pueden ser moduladas por la ubicación anatómica y el microambiente2,7. Dado que la mezcla exacta de tales factores que se encuentran in vivo puede ser difícil de reproducir in vitro,favorecemos el uso de enfoques in vivo para obtener información sobre las funciones de los MCs9.
Existen varias cepas de ratón con deficiencia genética de MC, como los ampliamente utilizados WBB6F1-Kit W/W-v o C57BL/6-Kit W-sh/W-sh ratones. Estos ratones carecen de expresión y/o actividad de KIT (CD117), el receptor del principal factor de crecimiento MC factor de células madre (SCF)21,22. Como resultado, estos ratones tienen una profunda deficiencia de MC, pero también tienen anomalías fenotípicas adicionales relacionadas con sus mutacionesc-kit (en los ratones WBB6F1-Kit W/W-v) o con los efectos de la gran inversión cromosómica que resulta en una reducción de la expresión de c-kit (en los ratones C57BL/6-Kit W-sh/W-sh) 9,10,12,23. Más recientemente, se han reportado varias cepas de ratones con deficiencia de MC constitutiva independiente dec-kit24-26. Todos estos ratones y algunos nuevos tipos adicionales de ratones inducibles deficientes en MC han sido revisados recientemente en detalle9,10,13.
Aquí, se describen los métodos para la generación de ratón derivado de la médula ósea MCs cultivados (BMCMCs), su transferencia adoptiva en ratones deficientes en MC, y el análisis de los números y la distribución de MCs transferidos adoptivamente en diferentes sitios anatómicos. Este método llamado "knock-in de mastocitos" se puede utilizar para evaluar las funciones de los MC y los productos derivados de MC in vivo. Discutimos las ventajas y las limitaciones de este método, a la luz de los acercamientos alternativos que se han desarrollado en los últimos años.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Antibiotic-Antimycotic Solution</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>30-004-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 ml Syringe</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>309656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm x 10 mm Dish</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>430588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Polystyrene Round Bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid Glacial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A35-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue 8GX</td>
			<td>Rowley Biochemical Danver</td>
			<td>33864-99-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 6R Centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD16/32 (clone 93) Purified</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-0161-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1 ml TB Syringe</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 22G x1 (0.7 mm x 25 mm) Needles</td>
			<td>BD Precision Glide Needle</td>
			<td>205155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 25G 5/8 Needles</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 30G x1/2 Needles</td>
			<td>BD Precision Glide</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue MAX Jr, 15 ml Polypropylene Conical Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal 60 Mounting Medium</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>8310-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin3</td>
			<td>Shandon</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DakoCytomation pen</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1x</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>15-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E 7023-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Heat Inactivated</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F4135-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Conjugated IgG2b K Rat Isotype Control</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-4031-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein Isotiocyanate (FITC) Conjugated Anti-mouse KIT (CD117; clone 2B8)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-1171-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Giemsa Stain Modified</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>GS-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>29405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>May-Grunwald Stain</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>MG-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell 6 well plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>35 3046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus BX60 Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast Plus Tissue Embedding Medium</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>23-021-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Conjugated IgG Armenian Hamster Isotype Control</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4888-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered-Saline (PBS) 1x</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phycoerythrin (PE) Conjugated Anti-mouse FceRIa (clone MAR-1)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-5898-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide Staining Solution</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-6990-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL-3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>213-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranin-o Certified</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flasks T25 25 cm2</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>353109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flasks T75 75 cm2</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>353110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue 1 % Aqueous</td>
			<td>LabChem-Inc</td>
			<td>LC26165-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse SCF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-03</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing the functions of mast cells in vivo using 'mast cell knock-in' mice

Los mastocitos (MCs) son células hematopoyéticas que residen en diversos tejidos, y son especialmente abundantes en sitios expuestos al medio externo, como la piel, las vías respiratorias y el tracto gastrointestinal. Mejor conocidos por su papel perjudicial en las reacciones alérgicas dependientes de IgE, los MCs también han surgido como actores importantes en la defensa del huésped contra el veneno y las bacterias y parásitos invasores. El fenotipo y la función del mc pueden ser influenciados por los factores microambientales que pueden diferir según la localización anatómica y/o basado en el tipo o la etapa del desarrollo de inmunorespuestas. Por esta razón, nosotros y otros hemos favorecido los acercamientos in vivo sobre métodos ines vitro para ganar la penetración en funciones de la bujía métrica. Aquí, se describen los métodos para la generación de ratón derivado de la médula ósea cultivada MCs (BMCMCs), su transferencia adoptiva en ratones genéticamente deficientes en MC, y el análisis de los números y la distribución de MCs transferidos adoptivamente en diferentes sitios anatómicos. Este método, denominado el enfoque'mast cell knock-in', se ha utilizado ampliamente en los últimos 30 años para evaluar las funciones de los MC y los productos derivados de MC in vivo. Discutimos las ventajas y las limitaciones de este método, a la luz de los acercamientos alternativos que se han desarrollado en los últimos años.

En la Figura 1se muestra una visión general del enfoque de'knock-in de mastocitos'e incluye la generación de BMCMCs, el número de células que deben injertrse i.p., i.d. o i.v. en ratones deficientes en MC (el número puede variar si se indica en función del diseño experimental) y el intervalo entre el injerto y el experimento dependiendo del sitio de inyección (este intervalo también puede variar, si se indica; por ejemplo,el contenido de mediadores almacenados en los gránulos ...

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Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using &#039;Mast Cell Knock-in&#039; Mice

Describimos un método para la generación de células de mástil derivadas in vitro, su engraftment en ratones célula-deficientes del mástil, y el análisis del fenotipo, de los números y de la distribución de las células de mástil engrafted en diversos sitios anatómicos. Este protocolo se puede utilizar para evaluar las funciones de los mastocitos in vivo.

Análisis De Las Funciones De Los MastOcitos In Vivo Usando ' MastCell Knock-in' Ratones

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

10.1K vistas.  Stanford University School of Medicine. Describimos un método para la generación de células de mástil derivadas in vitro, su engraftment en ratones célula-deficientes del mástil, y el análisis del fenotipo, de los números y de la distribución de las células de mástil engrafted en diversos sitios anatómicos. Este protocolo se puede utilizar para evaluar las funciones de los mastocitos in vivo.

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Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

A raíz de la celda de destino en<em&gt; E. coli</em&gt; Después de la infección por fagos Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Investigación

Inmunología e Infección

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

La inducción de la enfermedad de injerto contra huésped y<em&gt; En Vivo</em&gt; T Monitoreo Celular Utilizando un modelo murino MHC de concordancia

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a process that results in the exocytosis of allergic mediators. Modulation of mast cell degranulation by drugs and toxicants may have positive or adverse effects on human health. Mast cell function has been dissected in detail with the use of rat basophilic leukemia mast cells (RBL-2H3), a widely accepted model of human mucosal mast cells3-5. Mast cell granule component and the allergic mediator &#946;-hexosaminidase, which is released linearly in tandem with histamine from mast cells6, can easily and reliably be measured through reaction with a fluorogenic substrate, yielding measurable fluorescence intensity in a microplate assay that is amenable to high-throughput studies1. Originally published by Naal et al.1, we have adapted this degranulation assay for the screening of drugs and toxicants and demonstrate its use here.
Triclosan is a broad-spectrum antibacterial agent that is present in many consumer products and has been found to be a therapeutic aid in human allergic skin disease7-11, although the mechanism for this effect is unknown. Here we demonstrate an assay for the effect of triclosan on mast cell degranulation. We recently showed that triclosan strongly affects mast cell function2. In an effort to avoid use of an organic solvent, triclosan is dissolved directly into aqueous buffer with heat and stirring, and resultant concentration is confirmed using UV-Vis spectrophotometry (using &#949;280 = 4,200 L/M/cm)12. This protocol has the potential to be used with a variety of chemicals to determine their effects on mast cell degranulation, and more broadly, their allergic potential.

Mast cell degranulation, the release of allergic mediators, is important in allergy, asthma, and parasite defense. Here we demonstrate techniques1 for assessing effects of drugs and toxicants on degranulation, methodology recently utilized to exhibit the powerful inhibitory effect of antibacterial agent triclosan2.

Un ensayo de microplacas para evaluar los efectos químicos sobre RBL-2H3 mástil degranulación: Efectos de Triclosan y sin uso de un disolvente orgánico

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly synthesized allergic, inflammatory and immunoregulatory mediators. MCs&#8217; mediators affect multiple tissues and organs culminating in allergic and immune responses. The synthesis, storage and release of the MC mediators are highly regulated. The pre-formed mediators are packed in cytoplasmic secretory granules&#160;(SG) that fuse with the plasma membrane and release their content by regulated exocytosis. We present a protocol, based on the co-expression of a gene of interest with a reporter gene that is targeted to the SGs and is released in a regulated fashion alongside the endogenous SG mediators. The protocol enables high resolution four dimensional confocal analyses of the MC SGs and monitoring their timeline from biogenesis to triggered exocytosis. Thus, using this protocol for screening genes of interest for their phenotypic and functional impact allows deciphering the molecular mechanisms that govern the biogenesis and exocytosis of the MC SGs and identifying the regulators involved. Thereby, further insights into the cellular mechanisms that account for MCs function in health and disease should be provided.

The goal of the present&#160;protocol was to develop a method that will allow functional genomic analyses of mast cell secretion. The protocol is based on quantitative assessment of the release of a fluorescent reporter gene cotrasfected with the gene of interest and real time&#160;analyses of the secretory granule&#39;s morphology.

Investigando mastocitos secretora gránulos; de Biosíntesis de la exocitosis

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

La evaluación de la función retiniana Microglial fagocítica<em&gt; En Vivo</em&gt; El uso de un ensayo basado en citometría de flujo

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol specifically intended to measure antigen-specific killing without an infection. This protocol is designed and describes methods to overcome these limitations by allowing for the detection of antigen-specific killing of a target cell by CD8+ T cells in vivo. This is accomplished by merging a vaccination model with a traditional CFSE-labeled target killing assay. This combination allows the researcher to assess the antigen-specific CTL potential directly and quickly as the assay is not dependent upon tumor growth or infection. In addition, the readout is based on flow cytometry and so should be readily accessible to most researchers. The major limitation of the study is identifying the timeline in vivo that is appropriate to the hypothesis being tested. Variations in antigen strength and mutations in the T cells that may result in differential cytolytic function need to be carefully assessed to determine the optimal time for cell harvest and assessment. The appropriate concentration of peptide for vaccination has been optimized for hgp10025-33 and OVA257-264, but further validation would be needed for other peptides that may be more appropriate to a given study. Overall, this protocol allows a quick assessment of killing function in vivo and can be adapted to any given antigen.

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

The goal of this protocol is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model.

En Vivo Ensayo para la detección de la función citolítica de células T específicas de antígeno utilizando un modelo de vacunación

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic immune response. The activation of MCs via the cross-linking of surface IgE bound to high affinity IgE receptor (Fc&#949;RI), as well as through the stimulation of several other receptors, initiates the rise of the free intracellular Ca2+ level ([Ca2+]i) that promotes the release of inflammatory and allergic mediators. The identification of molecular constituents involved in these signaling pathways is crucial for understanding the regulation of MC function. In this article, we describe a protocol for the isolation of murine connective tissue type MCs by peritoneal lavage and cultivation of peritoneal MCs (PMCs). Cultures of MCs from various knockout mouse models by this methodology represent a useful approach to the identification of proteins involved in MC signaling pathways. In addition, we also describe a protocol for single cell Fura-2 imaging as an important technique for the quantification of Ca2+ signaling in MCs. Fluorescence-based monitoring of [Ca2+]i is a reliable and commonly used approach to study Ca2+ signaling events, including store-operated calcium entry, which is of utmost importance for MC activation. For the analysis of MC degranulation, we describe a &#946;-hexosaminidase release assay. The amount of &#946;-hexosaminidase released into the culture medium is considered as a degranulation marker for all three different secretory subsets described in MCs. &#946;-hexosaminidase can easily be quantified by its reaction with a colorigenic substrate in a microtiter plate colorimetric assay. This highly reproducible technique is cost-effective and requires no specialized equipment. Overall, the provided protocol demonstrates a high yield of MCs expressing typical MC surface markers, displaying typical morphological and phenotypic features of MCs, and demonstrating highly reproducible responses to secretagogues in Ca2+-imaging and degranulation assays.

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Here, we present a protocol to isolate and cultivate murine peritoneal mast cells. We also describe two protocols for their functional characterization: a fluorescent imaging of intracellular free Ca2+ concentration and a degranulation assay based on colorimetric quantification of the released &#946;-hexosaminidase.

Aislamiento de mastocitos de peritoneo derivado y su caracterización funcional con Ca2 +-proyección de imagen y pruebas de degranulación

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a formidable defense against invading pathogens via diverse mechanisms. One major goal of vaccination is to induce protective antigen-specific antibodies to prevent life-threatening infections. Both thymus-dependent (TD) and thymus-independent (TI) antigens can elicit robust antigen-specific IgM responses and can also induce the production of isotype-switched antibodies (IgG, IgA and IgE) as well as the generation of memory B cells with the help provided by antigen presenting cells (APCs). Here, we describe a protocol to characterize TD and TI Ig isotype responses in mice using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). In this protocol, TD and TI Ig responses are elicited in mice by intraperitoneal (i.p.) immunization with hapten-conjugated model antigens TNP-KLH (in alum) and TNP-polysaccharide (in PBS), respectively. To induce TD memory response, a booster immunization of TNP-KLH in alum is given at 3 weeks after the first immunization with the same antigen/adjuvant. Mouse sera are harvested at different time points before and after immunization. Total serum Ig levels and TNP-specific antibodies are subsequently quantified using Ig isotype-specific Sandwich and indirect ELISA, respectively. In order to correctly quantify the serum concentration of each Ig isotype, the samples need to be appropriately diluted to fit within the linear range of the standard curves. Using this protocol, we have consistently obtained reliable results with high specificity and sensitivity. When used in combination with other complementary methods such as flow cytometry, in vitro culture of splenic B cells and immunohistochemical staining (IHC), this protocol will allow researchers to gain a comprehensive understanding of antibody responses in a given experimental setting.

In this paper, we describe a protocol to characterize T-dependent and T-independent immunoglobulin (Ig) isotype responses in mice using ELISA. This method used alone or in combination with flow cytometry will allow researchers to identify differences in B cell-mediated Ig isotype responses in mice following T-dependent and T-independent antigen immunization.

Caracterización de las respuestas de isotipo de inmunoglobulina dependiente del timo y timo-independiente en ratones usando el análisis enzima-ligado del inmunosorbente

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Generation of Knock-out Primary and Expanded Human NK Cells Using Cas9 Ribonucleoproteins

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging in primary NK cells. For example, transgene delivery using lentiviral or retroviral transduction resulted in a limited yield of genetically-engineered NK cells due to substantial procedure-associated NK cell apoptosis. We describe here a DNA-free method for genome editing of human primary and expanded NK cells using Cas9 ribonucleoprotein complexes (Cas9/RNPs). This method allowed efficient knockout of the TGFBR2 and HPRT1 genes in NK cells. RT-PCR data showed a significant decrease in gene expression level, and a cytotoxicity assay of a representative cell product suggested that the RNP-modified NK cells became less sensitive to TGF&#946;. Genetically modified cells could be expanded post-electroporation by stimulation with irradiated mbIL21-expressing feeder cells.

Here, we present a protocol to genetically modify primary or expanded human natural killer (NK) cells using Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs). By using this protocol, we generated human NK cells deficient for transforming growth factor&#8211;b receptor 2 (TGFBR2) and hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).

Generación de células NK humano primario y ampliado de Knock-out utilizando ribonucleoproteínas Cas9

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging ...

Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice

T Follicular Helper (Tfh) cells are an independent CD4+&#160;T cell subset specialized in providing help for germinal center (GC) development and generation of high-affinity antibodies. In influenza virus infection, robust Tfh and GC B cell responses are induced to facilitate effective virus eradication, which confers a qualified mouse model for Tfh-associated study. In this paper, we described protocols in detection of basic Tfh-associated immune response during influenza virus infection in mice. These protocols include: intranasal inoculation of influenza virus; flow cytometry staining and analysis of polyclonal and antigen-specific Tfh cells, GC B cells and plasma cells; immunofluorescence detection of GCs; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) of influenza virus-specific antibody in serum. These assays basically quantify the differentiation and function of Tfh cells in influenza virus infection, thus providing help for studies in elucidating differentiation mechanism and manipulation strategy.

This paper describes protocols of evaluating Tfh and GC B response in mouse model of influenza virus infection.