N.G. è il destinatario di borse di studio della "Fondation pour la Recherche Médicale FRM" francese e della Fondazione Philipp; R.S. è supportato dalla Lucile Packard Foundation for Children's Health e dal numero di premio STANFORD NIH/NCRR CTSA UL1 RR025744; P.S. è sostenuta da una Borsa max Kade della Fondazione Max Kade e dall'Accademia austriaca delle scienze e da una Borsa di studio Schroedinger del Fondo scientifico austriaco (FWF): J3399-B21; S.J.G. riconosce il sostegno dei National Institutes of Health grants U19 AI104209, NS 080062 e del Tobacco-Related Disease Research Program presso l'Università della California; L.L.R. riconosce il sostegno della Arthritis National Research Foundation (ANRF) e della Sovvenzione nazionale per gli istituti sanitari K99AI110645.

Tutta la cura e la sperimentazione degli animali sono state condotte nel rispetto delle linee guida dei National Institutes of Health e con l'approvazione specifica dell'Institutional Animal Care and Use Committee della Stanford University.
1. Generazione e caratterizzazione di mastociti coltivati derivati dal midollo osseo (BBMCMC).
Nota: I BBMCMC donatori devono essere generati da cellule del midollo osseo dello stesso background genetico dei topi riceventi carenti di MC. I BBMCMC donatori di derivazione maschile non sono adatti per l'innesto di topi femmine. I BBMCMC donatori di derivazione femminile si innesteranno con successo sia nei riceventi maschi che in quello femminile.
<ol><li>Estrazione del midollo osseo.<ol>
<li>Versare la salina sterile tamponata con fosfato (PBS) in 6 piastre di coltura del pozzo (1 pozzo per topo) e posizionarla sul ghiaccio.</li>
		<li>Immergere gli strumenti di dissezione in etanolo al 70% per la sterilizzazione.</li>
		<li>Eutanasia dei topi donatori per inalazione dianidride carbonica(CO 2) seguita da lussazione cervicale, quindi spruzzare i topi con il 70% di etanolo nei siti di manipolazione.</li>
		<li>Utilizzare strumenti sterili di dissezione per estrarre le ossa di femore, tibia e fibula senza tagliare epifisi ossee.</li>
		<li>Mentre si fissano le ossa con una flesso, raschiare via tutto il tessuto dalle ossa (e scartare la fibula) usando forbici sterili (o lame bisturi). Posizionare le ossa in PBS sul ghiaccio fino a quando tutte le ossa non vengono raccolte.</li>
		<li>Eseguire tutti i passaggi rimanenti nella cappa di coltura dei tessuti sterili. Utilizzando strumenti sterili, fissare le ossa con le forcep e tagliare entrambe le epifisi per esporre la cavità midollare.</li>
		<li>Utilizzando siringhe da 3 ml e aghi da 30 G e mezzo di lavaggio a freddo (Dulbecco Modified Eagle Medium [DMEM] integrato con siero di vitello fetale al 10% [FCS, inattivato dal calore], 2 mM L-glutammina, soluzione antibiotico-antimicotica all'1%, 50 μM Β-mercaptoetanolo), lavare il midollo osseo rosso in una piastra di Petri.</li>
		<li>Utilizzare la stessa siringa per dissociare i grappoli di cellule del midollo osseo lavato mediante ripetute aspirazione ed espulsione delicata.</li>
		<li>Mettere in piscina il midollo osseo femorale e tibiale di ogni topo in un tubo di centrifuga da 15 ml. Riempire il tubo con mezzo di lavaggio a freddo per lavare le cellule del midollo osseo e centrifugare a 400 x g per 5 min a 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Cultura BMCMC.<ol>
<li>Rimuovere il supernatante e recuperare le cellule del midollo osseo a pellet in 10 ml di mezzo di coltura (DMEM integrato con siero fetale al polpaccio al 10% [FCS, inattivato termicamente], 2 mM L-glutammina, soluzione antibiotico-antimicotica all'1%, 50 μM Β-mercaptoetanolo e 20% di supporto condizionato alle cellule WEHI-3 [come fonte di IL-3; in alternativa utilizzare il topo ricombinante IL-3 a 10 ng/ml]).</li>
		<li>Posizionare le cellule nel pallone di coltura tissutale di dimensioni appropriate(ad esempio,T25 per 1 topo, T75 per 2 topi, ecc.).</li>
		<li>1-2 giorni dopo la placcatura delle cellule, trasferire cellule medie e sospese (lasciando detriti e cellule aderenti attaccate al fondo del pallone) in un nuovo pallone e aggiungere un mezzo di coltura fresco (10 ml/ topo).</li>
		<li>Durante le settimane successive, nutrire le cellule ogni 3-4 giorni (aggiungere 10 ml di mezzo di coltura per topo). Mantenere la densità cellulare tra 2,5 x 105-1 x 106 cellule/ml. Trasferire le cellule non aderenti in un nuovo pallone una volta alla settimana fino a quando non sono presenti cellule aderenti nel pallone di coltura. Testare la maturità delle cellule (vedi sotto) prima dell'uso per saggi in vitro o innesto in topi a basso consumo di MC. NOTA: La differenziazione completa dei BBMCMC richiederà 4-6 settimane.</li>
	</ol></li>
	<li>Valutazione della maturità di BMCMC.<ol>
<li>
Usando la citometria a flusso.
		<ol>
<li>Lavare le celle (5 x 104-5 x 105 celle/condizione) con tampone FACS ghiacciato (PBS, 0,5% FCS) in tubo inferiore rotondo in polistirolo da 5 ml. Centrifuga a 400 x g per 5 min a 4 °C. Aspira il supernatante.</li>
			<li>Diluire gli anticorpi monoclonali anti-mouse CD16/32 (clone 93 o 2.4G2) 1:200 (2,5 μg/ml) nel tampone FACS. Aggiungere 10 μl ad ogni pellet e ripresorsi con un breve vortice. Incubare 5 minuti sul ghiaccio per bloccare l'attacco Fc. NOTA: proteggere i campioni dalla luce diretta per tutti i passaggi rimanenti.</li>
			<li>Fieerythrin coniugato diluire (PE) l'anti-mouse Coniugato Fc εRI α (clone MAR-1) 1:200 (1 μg/ml) e l'isotiocianato di fluoresceina (FITC) COjugate anti-mouse KIT (CD117; clone 2B8) 1:200 (2,5 μg/ml) ("soluzione di colorazione"), o i rispettivi anticorpi di controllo dell'isotipo etichettati nel buffer FACS ("soluzione di controllo dell'isotipo").</li>
			<li>Dividere metà delle celle bloccate dal passaggio 1.3.1.2) in un tubo inferiore rotondo in polistirolo aggiuntivo e aggiungere 20 μl di "soluzione di colorazione" in un tubo e 20 μl di "soluzione di controllo dell'isotipo" nell'altro tubo. Incubare 30 minuti sul ghiaccio.</li>
			<li>Aggiungere 3 ml di tampone FACS ghiacciato e centrifugare a 400 x g per 5 min a 4 °C. Scartare il supernatante e resospendare il pellet in tampone FACS da 300 μl contenente 1 μg/ml di ioduro di propidio (PI, per l'identificazione di cellule morte). Procedere all'analisi della citometria del flusso (vedere figura 2A).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Usando la colorazione blu toluidina.<ol>
<li>Lavare 1 x 105 celle una volta con PBS per centrifugazione a 400 x g per 5 minuti a temperatura ambiente, quindi aspirare e rimorsire le cellule in 200 μl di PBS.</li>
			<li>Trasferire la sospensione cellulare in un citofunnel preparato collegato a uno scivolo del microscopio e procedere con la citocentrifugazione usando un citocentrifugo (40 x g per 5 min).</li>
			<li>Scivoli ad aria secca per 10 minuti e disegnare un cerchio di cera intorno alle celle utilizzando una penna PAP. Aggiungere la soluzione blu toluidina allo 0,1% per coprire le cellule. Incubare per 1 minuto. Lavare gli scivoli in acqua corrente del rubinetto per 1 minuto, quindi asciugare l'aria per 10 minuti.</li>
			<li>Copre le celle di sospensione utilizzando il supporto di montaggio. Procedere all'analisi del microscopio luminoso (vedere figura 2B)</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. Innesto di topi carenti di mast cell con BBMCMC.
<ol><li>Innesto dell'orecchio per iniezione intradermica (d.d.). NOTA: Per il trasferimento adottivo di BBMCMC nella pinna dell'orecchio di topi a disinnesto mc, si consiglia di eseguire due iniezioni di 1 x 106 cellule ciascuna (per un totale di 2 x 106 cellule) per pinna dell'orecchio. L'innesto intradermico dei BBMCMC nell'apice dell'orecchio dei topi a disinfezione MC è stato utilizzato da molti investigatori in diversi modelli, tra cui modelli di anafilassi cutanea passiva (PCA)24,27,difesa ospite contro i veleno28e reazioni di ipersensibilità cronica (CHS)29,30.<ol>
<li>Contare e rimosodire le celle a 4 x 107 BCMC/ml (1 x 106 BBMCMC/ 25 μl) in DMEM freddo. Trasferire la soluzione BMCMC in una siringa da 1 ml dotata di un ago da 30 G. Tenere sul ghiaccio fino all'iniezione.</li>
		<li>Anestetizzare topi mc carenti di 4-6 settimane usando isoflurane (2,5% v/v). Controllare la profondità dell'anestesia con il dito del dito del giorno, regolare l'isoflurane se indicato e continuare a monitorare la respirazione e la risposta delle dita dei piedi durante tutta la procedura. Applicare unguento oftalmico con una punta Q per prevenire la secchezza degli occhi.</li>
		<li>Con l'indice, creare pressione verticale sulla faccia dorsale dell'pinna dell'orecchio per esporre ed allungare la faccia ventrale.</li>
		<li>Eseguire due iniezioni di 25 μl di soluzione BMCMC in due diversi siti della faccia ventrale della pinna dell'orecchio, la prima iniezione al centro dell'orecchio e la seconda iniezione verso la punta della pinna dell'orecchio. Attendere 4-6 settimane dopo l'innesto d.d. prima di eseguire esperimenti in vivo. Nota: Nella nostra esperienza, a quel punto il numero di MC/mm2 di derma nella parte centrale dell'pinna dell'orecchio è generalmente simile a quello nella posizione corrispondente nei topi di tipo selvatico,mentre il numero di MC/mm 2 nella periferia dell'pinna dell'orecchio è in genere sostanzialmente inferiore a quello dei corrispondenti topi di tipo selvatico27,28. Questo dovrebbe essere tenuto presente quando si progettano esperimenti con tali topi innestati mc(ad esempio,gli agenti con possibili effetti sulla funzione MC dovrebbero essere iniettati nella parte centrale dell'pinna dell'orecchio e l'analisi degli effetti di tali trattamenti dovrebbe concentrarsi anche su quell'area).</li>
	</ol></li>
	<li>Innesto della cavità peritoneale mediante iniezione intraperitoneale (i.p.). NOTA: Il trasferimento adottivo di BBMCMC nella cavità peritoneale dei topi a basso consumo di MC richiederà un'iniezione di 2 x 106 cellule per topo. Tali iniezioni di IBC in topi a basso consumo di MC sono state utilizzate da molti gruppi per studiare i ruoli dei MC peritoneali in vari modelli, inclusi i modelli di difesa ospite contro i veleno31 o la sepsi batterica32,33.<ol>
<li>Contare il numero appropriato di cellule e rimosi a 1 x 107 BCMC/ml (2 x 106 BCMC/ 200 μl) in DMEM freddo. Trasferire la soluzione BMCMC in una siringa da 1 ml dotata di un ago da 25 G. Tenere sul ghiaccio fino all'iniezione.</li>
		<li>Eseguire 1 iniezione di soluzione BMCMC da 200 μl nella cavità peritoneale di topi mc-carenti di 4-6 settimane. Attendere 4-6 settimane dopo l'innesto di i.p. prima di eseguire esperimenti in vivo.</li>
	</ol></li>
	<li>Innesto per iniezione endovenosa (v.v.). NOTA: Il trasferimento adottivo di BBMCMC mediante iniezione i.v. in topi a disinnesto mc richiederà un'iniezione di 5 x 106 cellule per topo. Iniezioni endovenose (v.v.) di BBMCMC in topi a disinfezione MC sono state utilizzate da molti gruppi per studiare il ruolo delle MC in vari modelli di malattia, tra cui modelli di infezione della vescica34,asma35,fibrosipolmonare 36e artrite mediata da anticorpi37.<ol>
<li>Contare il numero appropriato di cellule e rimosi a 2,5 x 107 BCMC/ml (5 x 106 BCMC/200 μl) in DMEM freddo. Trasferire la soluzione BMCMC in una siringa da 1 ml dotata di un ago da 30 G. Tenere sul ghiaccio fino all'iniezione.</li>
		<li>Anestetizzare topi mc carenti di 4-6 settimane usando isoflurane (2,5% v/v). Controllare la profondità dell'anestesia con il dito del dito del giorno, regolare l'isoflurane se indicato e continuare a monitorare la respirazione e la risposta delle dita dei piedi durante tutta la procedura. Applicare unguento oftalmico con una punta Q per prevenire la secchezza degli occhi.</li>
		<li>Eseguire un'iniezione di 200 μl di soluzione BMCMC nella vena di coda (o, in alternativa, nella vena retro-orbitale) di un topo a disinvolto MC. Attendere 12 settimane dopo l'innesto di i.v. prima di eseguire esperimenti in vivo.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Analisi dei topi a disinnestati carenti di cellule d'albero.
<ol><li>Analisi dell'innesto dell'orecchio.<ol>
<li>Alla fine dell'esperimento, eutanasiare i topi per inalazione di CO2 seguita da lussazione cervicale.</li>
		<li>Isolare la pinna dell'orecchio e fissarla in formalina tamponata al 10% (vol/vol) durante la notte a 4 °C. Incorporare pinna fissa dell'orecchio in paraffina, tagliare sezioni di 4 μm di pinna dell'orecchio e montare su scivoli di vetro.</li>
		<li>Macchiare gli scivoli con una soluzione blu toluidina allo 0,1% per 1 minuto a temperatura ambiente. Lavare gli scivoli in acqua del rubinetto per 1 minuto, quindi asciugare l'aria per 10 minuti a temperatura ambiente.</li>
		<li>Le diapositive di coverslip con supporto di montaggio, quindi contano il numero di MC innestati per sezioni pinnae utilizzando un microscopio a luce. Valutare l'efficienza di innesto confrontando la percentuale e la distribuzione di TC nella pelle dell'orecchio dei topi innestati rispetto ai topi di tipo selvatico.</li>
	</ol></li>
	<li>Analisi dell'innesto della cavità peritoneale.<ol>
<li>Valutazione del numero di mastociti nella cavità peritoneale.<ol>
<li>Alla fine dell'esperimento, eutanasiare i topi per inalazione di CO2 seguita da lussazione cervicale. Rimuovere con cura la pelle ventrale dei topi senza rompere la cavità peritoneale.</li>
			<li>Iniettare 5 ml di PBS a temperatura fredda o ambiente nella cavità peritoneale utilizzando una siringa da 5 ml dotata di un ago da 25 G. Utilizzare PBS freddo per ridurre il rischio di attivazione delle cellule peritoneali (questo è molto importante quando si valuta la degranulazione MC peritoneale o i livelli di alcuni prodotti derivati da MC nel liquido di lavaggio peritoneale). Eseguire un massaggio dell'addome per 20 secondi per raccogliere le cellule peritoneali.</li>
			<li>Aspirare lentamente il lavaggio peritoneale utilizzando una siringa da 5 ml dotata di un ago da 22 G. Registrare il volume di lavanda aspirata (si prevede di recuperare fino all'80% del volume iniettato).</li>
			<li>Trasferire il liquido di lavanda peritoneale in un tubo inferiore rotondo in polistirolo da 5 ml e centrifugare a 400 x g per 5 min a 4 °C. Aspira il supernatante. Recuperare il pellet in PBS freddo da 400 μl.</li>
			<li>Contare il numero totale di cellule peritoneali usando una camera emocitometrica. Utilizzare metà della sospensione cellulare per un'analisi della citometria di flusso (come descritto al passaggio 1.3.1), per valutare la percentuale e l'espressione marcatore delle TC innestati nella cavità peritoneale. Moltiplicare il numero totale di celle peritoneali per la percentuale di TC per ottenere il numero assoluto di TC peritoneali.</li>
			<li>Eseguire una citocentrifugazione con le cellule rimanenti come descritto al passaggio 1.3.2.2. Scivoli ad aria secca per 10 minuti a temperatura ambiente e disegnare un cerchio di cera intorno alle celle utilizzando una penna PAP.</li>
			<li>Coprire le celle con soluzione di colorazione May-Grünwald non diluita per 5 minuti, seguita da lavaggio in PBS per 5 minuti, entrambe a temperatura ambiente. Coprire le cellule con macchia di Giemsa diluita 1:20 con acqua deionizzata e incubare 20 minuti a temperatura ambiente. Lavare gli scivoli 2 volte in acqua del rubinetto per 1 minuto, quindi asciugare l'aria.</li>
			<li>Copre le celle di rilipano utilizzando il supporto di montaggio e calcola la percentuale di MC innestati utilizzando un microscopio a luce (contando almeno 400 celle totali). Valutare l'efficienza di innesto confrontando la percentuale di TC nella lavanda peritoneale dei topi innestati rispetto ai topi di tipo selvatico.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Valutazione delle mastociti nelle finestre mesenteriche.<ol>
<li>Seguendo il gabinetto peritoneale descritto nel passaggio 3.2.1, aprire la membrana peritoneale per esporre il tratto intestinale dei topi. Disporre da 4 a 5 finestre mesenteriche per mouse su una diapositiva.</li>
			<li>Fissare le diapositive per 1 ora in soluzione di Carnoy (3:2:1 vol/vol/vol di etanolo, cloroformio e acido acetico glaciale) a temperatura ambiente. Scivoli ad aria asciutta e rimuovere l'intestino (le finestre mesenteriche fisse rimarranno attaccate alle diapositive).</li>
			<li>Macchiare i preparati per 20 minuti a temperatura ambiente con soluzione di colorazione Csaba (Blu alciano / Safranina O).<ol>
<li>Per fare 500 ml di macchia di Csaba, preparare 500 ml di tampone di acetato mescolando 100 ml di soluzione di acetato di sodio da 1 M con 120 ml di 1 M HCl. Quindi, sciogliere 90 mg di Safranina [identifica "MC maturi" in rosso], 1,8 g blu alciano [identifica "MC immaturi" in blu] e 2,4 g di solfato di ammonio ferrico NH4Fe(SO4)2 in 500 ml di tampone di acetato.</li>
			</ol>
</li>
			<li>Le diapositive di coverslip con supporto di montaggio, quindi contano il numero di MC innestati per finestra mesenterica utilizzando un microscopio a luce. Valutare l'efficienza di innesto confrontando la percentuale e la distribuzione di TC nelle finestre mesenteriche dei topi innestati rispetto ai topi di tipo selvatico.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Analisi dell'innesto I.v.<ol>
<li>Al termine dell'esperimento, eutanasiare i topi per inalazione di CO2 seguita da lussazione cervicale e raccogliere tessuti di interesse(ad esempio polmone, pelle o milza) e fissarsi durante la notte in formalina tamponata al 10% (vol/vol) a 4 °C.</li>
		<li>Incorporare tessuti fissi in paraffina, tagliare sezioni da 4 μm e montare su vetrini. Macchiare gli scivoli con una soluzione blu toluidina allo 0,1% per 1 minuto a temperatura ambiente. Lavare gli scivoli in acqua del rubinetto per 1 minuto, quindi asciugare all'aria gli scivoli per 10 minuti.</li>
		<li>Coverslip scorre utilizzando il supporto di montaggio e valuta il numero e la distribuzione dei MC innestati per sezioni di tessuto utilizzando un microscopio a luce.</li>
	</ol></li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Quasi 30 anni dopo la sua descrizioneiniziale 38,l'approccio'mast cell knock-in'continua a fornire preziose informazioni su ciò che i PC possono fare o non possono fare in vivo. Si pensava che le funzioni dei TC fossero limitate al loro ruolo nell'allergia. I dati generati utilizzando l'approccio "mast cell knock-in" hanno cambiato questa visione, fornendo prove che i MC possono, tra le altre funzioni, svolgere ruoli critici nella difesa dell'ospitecontro alcuni agenti patogeni...

Le mastociti (MC) sono cellule ematopoietiche che derivano da progenitori pluripotenti del midolloosseo 1-3. A seguito dell'egressione del midollo osseo, i progenitori di MC migrano in vari tessuti dove si sviluppano in MC maturi sotto l'influenza di fattori dicrescita locali 1-3. I MC residenti nei tessuti si trovano strategicamente nelle interfacce host-ambiente, come la pelle, le vie aeree e il tratto gastrointestinale, dove si comportano come una prima linea di difesa contro gli insultiesterni 3-6. I MC sono spesso sottoclassificato in base alle loro caratteristiche fenotipiche "basale" e alle loro posizioni anatomiche. Nei topi sono stati descritti due tipi di TC: I MAT (CTMC) di tipo tessuto connettivo e i MC mucosi (MMC)1-3,7,8. I CTMC si trovano spesso intorno alle vene e vicino alle fibre nervose e risiedono in cavità sierosali, mentre gli MLC occupano posizioni intraepiteliali nell'intestino e nella mucosarespiratoria 1-3.
Numerose metodologie sono state applicate per studiare le funzioni biologiche dei MC9-13. Molti gruppi si sono concentrati su approcci in vitro utilizzando linee cellulari (come le linee MC umane HMC114 o LAD215,16),MC derivati in vitro (come MC17derivati dal sangue periferici umani o derivati dal midollo osseo del topo MC coltivati [BCMCC]18, MC coltivati derivati dalla pelle fetale [FCMCC]19 e MC peritoneali derivati da cellule [PCPC]20) o MC isolati ex vivo provenienti da diversi siti anatomici. Tutti questi modelli sono ampiamente utilizzati per studiare i dettagli molecolari della biologia MC, come le vie di segnalazione coinvolte nell'attivazione MC. Tuttavia, un aspetto importante della biologia delle CCI è che le loro caratteristiche fenotipiche e funzionali(ad esempio,contenuto di proteasi del granulo citoplasmatico o risposta a diversi stimoli) possono essere modulate dalla posizione anatomica e dal microambiente2,7. Poiché l'esatta miscela di tali fattori che si incontrano in vivo può essere difficile da riprodurre in vitro,favoriamo l'utilizzo di approcci in vivo per ottenere informazioni sulle funzioni9 delle TC.
Esistono diversi ceppi di topi con carenza genetica di MC, come i topi WBB6F1-Kit W/W-v o C57BL/6-Kit W-sh/W-sh. Questi topi mancano di espressione e/o attività di KIT (CD117), il recettore per il principale fattore di crescita MC fattore di crescita fattore di cellule staminali (SCF)21,22. Di conseguenza, questi topi hanno una profonda carenza di MC ma hanno anche anomalie fenotipiche aggiuntive legate alle loro mutazioni delkit c- (nei topi WBB6F1-Kit W/W-v) o agli effetti della grande inversione cromosomica che si traduce in una ridotta espressione delkit c- (nei topi C57BL/6-Kit W-sh/W-sh) 9,10,12,23. Più recentemente, diversi ceppi di topi con carenza di MC costitutiva indipendente dalkitc- sono stati segnalati24-26. Tutti questi topi e alcuni nuovi tipi aggiuntivi di topi inducibili a disinvolto mc sono stati recentemente esaminati indettaglio 9,10,13.
Qui descriviamo i metodi per la generazione di MC coltivati derivati dal midollo osseo del topo (BBMCMC), il loro trasferimento adottivo in topi a disacienti mc e l'analisi del numero e della distribuzione di MC trasferiti adottivamente in diversi siti anatomici. Questo cosiddetto metodo "mast cell knock-in" può essere utilizzato per valutare le funzioni dei MC e dei prodotti derivati da MC in vivo. Discutiamo dei vantaggi e dei limiti di questo metodo, alla luce degli approcci alternativi sviluppati negli ultimi anni.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Antibiotic-Antimycotic Solution</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>30-004-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 ml Syringe</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>309656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm x 10 mm Dish</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>430588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Polystyrene Round Bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid Glacial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A35-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue 8GX</td>
			<td>Rowley Biochemical Danver</td>
			<td>33864-99-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 6R Centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD16/32 (clone 93) Purified</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-0161-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1 ml TB Syringe</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 22G x1 (0.7 mm x 25 mm) Needles</td>
			<td>BD Precision Glide Needle</td>
			<td>205155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 25G 5/8 Needles</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 30G x1/2 Needles</td>
			<td>BD Precision Glide</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue MAX Jr, 15 ml Polypropylene Conical Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal 60 Mounting Medium</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>8310-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin3</td>
			<td>Shandon</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DakoCytomation pen</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1x</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>15-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E 7023-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Heat Inactivated</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F4135-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Conjugated IgG2b K Rat Isotype Control</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-4031-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein Isotiocyanate (FITC) Conjugated Anti-mouse KIT (CD117; clone 2B8)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-1171-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Giemsa Stain Modified</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>GS-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>29405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>May-Grunwald Stain</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>MG-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell 6 well plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>35 3046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus BX60 Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast Plus Tissue Embedding Medium</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>23-021-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Conjugated IgG Armenian Hamster Isotype Control</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4888-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered-Saline (PBS) 1x</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phycoerythrin (PE) Conjugated Anti-mouse FceRIa (clone MAR-1)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-5898-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide Staining Solution</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-6990-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL-3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>213-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranin-o Certified</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flasks T25 25 cm2</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>353109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flasks T75 75 cm2</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>353110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue 1 % Aqueous</td>
			<td>LabChem-Inc</td>
			<td>LC26165-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse SCF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-03</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing the functions of mast cells in vivo using 'mast cell knock-in' mice

Le mastociti (MC) sono cellule ematopoietiche che risiedono in vari tessuti e sono particolarmente abbondanti in siti esposti all'ambiente esterno, come la pelle, le vie aeree e il tratto gastrointestinale. Meglio noti per il loro ruolo dannoso nelle reazioni allergiche dipendenti dall'IgE, i MC sono anche emersi come attori importanti nella difesa dell'ospite contro il veleno e invadendo batteri e parassiti. Il fenotipo e la funzione MC possono essere influenzati da fattori microambientali che possono differire a seconda della posizione anatomica e/o in base al tipo o allo stadio di sviluppo delle risposte immunitarie. Per questo motivo, noi e altri abbiamo favorito approcci in vivo rispetto ai metodi in vitro per ottenere informazioni sulle funzioni MC. Qui descriviamo i metodi per la generazione di MC coltivati derivati dal midollo osseo del topo (BCMCC), il loro trasferimento adottivo in topi geneticamente carenti di MC e l'analisi del numero e della distribuzione di MC trasferiti adottivamente in diversi siti anatomici. Questo metodo, chiamato approccio"mast cell knock-in", è stato ampiamente utilizzato negli ultimi 30 anni per valutare le funzioni dei MC e dei prodotti derivati da MC in vivo. Discutiamo dei vantaggi e dei limiti di questo metodo, alla luce degli approcci alternativi sviluppati negli ultimi anni.

Una panoramica dell'approccio "mast cell knock-in" è mostrata nella Figura 1, e include la generazione di BBMCC, il numero di cellule che dovrebbero essere innestati i.p., i.d. o i.v. in topi mc-carenti (il numero può essere variato se indicato in base al progetto sperimentale) e l'intervallo tra l'innesto e l'esperimento a seconda del sito di iniezione (anche questo intervallo può variare, se indicato; ad esempio, ilcontenuto di mediatori immagazzinati nei granuli citoplasmatici MC ...

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Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using &#039;Mast Cell Knock-in&#039; Mice

Descriviamo un metodo per la generazione di mastociti derivate in vitro, il loro innesto in topi carenti di mastociti, e l'analisi del fenotipo, dei numeri e della distribuzione delle mastociti innestati in diversi siti anatomici. Questo protocollo può essere utilizzato per valutare le funzioni delle mastociti in vivo.

Analisi delle funzioni delle mastociti in vivo usando topi ' Mast Cell Knock-in'

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

10.1K Views.  Stanford University School of Medicine. Descriviamo un metodo per la generazione di mastociti derivate in vitro, il loro innesto in topi carenti di mastociti, e l'analisi del fenotipo, dei numeri e della distribuzione delle mastociti innestati in diversi siti anatomici. Questo protocollo può essere utilizzato per valutare le funzioni delle mastociti in vivo.