N.G.는 프랑스 "퐁디앙 부어 라 레체르체 메디칼 FRM"과 필립 재단의 펠로우십의 수혜자입니다. R.S.는 어린이 건강을 위한 루실 패커드 재단과 스탠포드 NIH/NCRR CTSA 어워드 번호 UL1 RR025744; P.S.는 막스 케이드 재단과 오스트리아 과학 아카데미의 막스 케이드 펠로우십과 오스트리아 과학 기금(FWF) 슈로딩거 펠로우십: J3399-B21의 지원을 받고 있습니다. S.J.G.는 국립 보건원의 지원을 U19 AI104209, NS 080062 및 캘리포니아 대학의 담배 관련 질병 연구 프로그램에서 승인합니다. L.L.R.은 관절염 국립 연구 재단 (ANRF)과 국립 보건 원 보조금 K99AI110645의 지원을 인정합니다.

모든 동물 관리 및 실험은 건강의 국가 학회의 지침과 스탠포드 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 특정 승인을 준수하여 수행되었다.
1. 골수 유래 배양 돛대 세포의 생성 및 특성화 (BMCMC).
참고: 기증자 BMCMC는 받는 사람 MC-결핍 마우스와 동일한 유전 배경의 골수 세포에서 생성되어야 합니다. 남성 유래 기증자 BMCMC는 여성 마우스의 이식에 적합하지 않습니다. 여성 유래 기증자 BMCMC는 성공적으로 남성과 여성 받는 사람 모두에 이식합니다.
<ol><li>골수 추출.<ol>
<li>멸균 인산염 완충식식염(PBS)을 6개의 웰 배양판(마우스당 1음)에 붓고 얼음 위에 놓습니다.</li>
		<li>해부 기기를 70% 에탄올에 담그면 멸균을 위해 몸을 담그십시오.</li>
		<li>이산화탄소(CO2)흡입에 의해 기증자 마우스를 안락사시키고 자궁 경부 탈구로 마우스를 분사한 다음 조작 부위에 70%의 에탄올로 마우스를 분사합니다.</li>
		<li>멸균 해부 기구를 사용하여 뼈 에피피를 자르지 않고 대퇴골, 경골 및 비골 뼈를 추출하십시오.</li>
		<li>집게로 뼈를 고정하는 동안 멸균 가위 (또는 메스 블레이드)를 사용하여 뼈에서 모든 조직을 긁어 내고 비골을 버립니다. 모든 뼈가 수집될 때까지 PBS에 뼈를 얼음 위에 놓습니다.</li>
		<li>멸균 조직 배양 후드에 남아있는 모든 단계를 수행합니다. 멸균 기구를 사용하여 집게로 뼈를 고정하고 두 표피를 잘라 수질 구멍을 노출시합니다.</li>
		<li>3ml 주사기와 30 G 바늘, 차가운 플러싱 배지(Dulbecco 개조 이글 매체 [DMEM]를 10% 태아 송아지 혈청[FCS, 열불활성], 2m L-글루타민, 1% 항생제-항미코틱 솔루션, 50 μM Β-메르카포에탄으로 보충하여, 페트르골에 수골에 빨강골을 넣습니다.</li>
		<li>동일한 주사기를 사용하여 반복된 부드러운 포부와 배출에 의해 플러시 골수 세포 클러스터를 해리합니다.</li>
		<li>각 마우스에서 15ml 원심분리기 튜브로 대퇴골과 경골 골수를 풀. 4°C에서 5분 동안 골수 세포와 원심분리기를 400 x g에서 씻어내는 차가운 홍조 배지로 튜브를 채웁니다.</li>
	</ol></li>
	<li>BMCMC 문화.<ol>
<li>상신체를 제거하고 10 ml의 배양 배지에서 펠릿 골수 세포를 회복합니다(DMEM은 10% 태아 종아리 혈청으로 보충[FCS, 열불성], 2mM L-글루타민, 1% 항생제 항마이코스 용액, 50 μM Β-mercaptoethanol 및 20% WEHI-3 세포 조절 매체 [IL-3의 원천으로; 10 ng/ml에서 재조합 마우스 IL-3을 사용])</li>
		<li>적절한 크기의 조직 배양 플라스크에 세포를 배치(예를 들어,1 마우스용 T25, 2 마우스용 T75 등).</li>
		<li>도금 세포 후 1-2 일, 배지 및 현탁세포 (플라스크의 바닥에 부착 된 파편과 부착 세포를 떠나) 새로운 플라스크에 신선한 배양 배지 (10ml/마우스)를 추가합니다.</li>
		<li>다음 주 동안 3-4일마다 셀을 공급합니다(마우스당 배양 배지 10ml를 추가). 세포 밀도를 2.5 x 105-1 x 106 셀/ml 사이로 유지합니다. 비 부착 된 세포를 배양 플라스크에 부착 된 세포가 없을 때까지 일주일에 한 번 새로운 플라스크로 전달합니다. MC-결핍 마우스로 체외 검사 또는 생을 위해 사용하기 전에 세포의 성숙도를 테스트합니다(아래 참조). 참고: BMCMC의 완전한 차별화는 4-6주가 소요됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>BMCMC 성숙도 평가.<ol>
<li>
유동 세포측정을 사용.
		<ol>
<li>세척 셀 (5 x 104-5 x 105 셀/조건) 얼음 차가운 FACS 버퍼 (PBS, 0.5% FCS) 5 ml 폴리스티렌 라운드 바닥 튜브. 4°C에서 5분 동안 400 x g의 원심분리기. 흡인 슈퍼 네티볼.</li>
			<li>FACS 버퍼에서 항마우스 CD16/32(클론 93 또는 2.4G2) 단일 클론 항체 1:200(2.5 μg/ml)을 희석한다. 각 펠릿에 10 μl을 넣고 간단한 소용돌이로 다시 중단합니다. 얼음에 5분 동안 배양하여 Fc 바인딩을 차단합니다. 참고: 나머지 모든 단계에 대해 샘플을 직접 조명으로부터 보호합니다.</li>
			<li>희석 물리에리트린 (PE) 공주 항 마우스 Fc θRI α (클론 MAR-1) 1:200 (1 μg/ml) 및 플루오레세인 이소티오야네이트 (FITC) 공주 항 마우스 KIT (CD117; 클론 2B8) 1:200 (2.5 μg/ml) ("염색 용액"), 또는 FACS 버퍼에서 각각의 표지된 동형 제어 항체("동색 조절 용액").</li>
			<li>차단된 세포의 절반을 1.3.1.2)에서 추가 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브로 분할하고 한 튜브에 "염색 용액"의 20 μl과 다른 튜브에 "동형 제어 용액"의 20 μl을 추가합니다. 얼음에 30 분 인큐베이션.</li>
			<li>4°C에서 5분 동안 400 x g에서 3ml의 얼음 차가운 FACS 버퍼와 원심분리기를 추가합니다. 1 μg/ml 프로피듐 요오드 (PI, 죽은 세포의 식별을 위해)를 포함하는 300 μl FACS 버퍼에서 슈퍼 나탄을 버리고 펠릿을 다시 중단하십시오. 순환 측정 해석을 흐름으로 진행합니다(그림 2A참조).</li>
		</ol>
</li>
		<li>toluidine 블루 스테인링을 사용 하 여.<ol>
<li>실온에서 5분 동안 400 x g에서 PBS로 1x 105 셀을 한 번 씻은 다음 PBS의 200 μl에서 세포를 흡인 및 재중단합니다.</li>
			<li>세포 현탁액을 현미경 슬라이드에 부착된 준비된 사이토깔로 옮기고 사이토센심분리기(5분 동안 40 x g)를 사용하여 사이토 원심분리기를 진행한다.</li>
			<li>공기 건조 슬라이드 10 분 PAP 펜을 사용 하 여 셀 주위 왁스 원을 그립니다. 세포를 덮기 위해 0.1% Toluidine 블루 용액을 추가합니다. 1 분 동안 인큐베이션. 흐르는 수돗물로 슬라이드를 1분 간 세척한 다음 10분 동안 공기 건조 슬라이드를 세척합니다.</li>
			<li>장착 매체를 사용하여 커버 슬립 셀. 광 현미경 분석 진행(그림 2B참조)</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. BMCMC와 마스트 세포 결핍 마우스의 이식.
<ol><li>인트레이더말(즉, 주사)에 의한 귀 이식. 참고: MC 결핍 마우스의 귀 정점에 BMCmC를 채택하는 경우, 이어 피나 당 각각 1 x 106 셀 (총 2 x 106 셀)의 두 개의 주사를 수행하는 것이 좋습니다. MC-결핍 마우스의 귀 정점에 BMCmC의 인트레이더말 이식은 수동 적인 무호흡 성 과민성 (PCA)24,27,숙주 방어28,만성 과민성 (CHS) 반응29,30의모델을 포함하여 여러 모델에서 많은 조사자들에 의해 사용되었습니다.<ol>
<li>차가운 DMEM에서 4 x 107 BMCmC/ml(1 x 106 BMCmC/ 25 μl)에서 셀을 계산하고 재중단합니다. BMCMC 용액을 30G 바늘이 장착된 1ml 주사기로 옮긴다. 주입 될 때까지 얼음을 유지합니다.</li>
		<li>이소플루란(2.5% v/v)을 이용한 4-6주 된 MC 결핍 마우스를 마취한다. 발가락 핀치에 의해 마취의 깊이를 확인하고, 표시된 경우 이소플루란을 조정하고 시술 내내 호흡과 발가락 핀치 반응을 계속 모니터링하십시오. 안과 연고를 Q-tip으로 바르면 눈의 건조를 방지하십시오.</li>
		<li>검지 손가락으로 귀 피나의 등쪽 면에 수직 압력을 가하여 복부 면을 노출하고 스트레칭합니다.</li>
		<li>BMCMC 용액의 25 μl i.d. 주사를 귀 피나의 복부 면의 두 가지 부위로, 귀 중간에 첫 번째 주사를, 이어 피나 끝을 향한 두 번째 주입을 수행한다. 생체 내 실험을 수행하기 전에 i.d. 이식 후 4-6 주를 기다립니다. 참고: 우리의 경험에서, 그 때까지 귀 피나의 중앙 부분에 진피의 MC/mm2의 수는 일반적으로 야생형 마우스의 해당 위치에서 와 유사하지만, 반면, 귀 피네의 주변에 있는 MC/mm2의 수는 일반적으로 해당 야생형 마우스27,28마리보다실질적으로 낮다. 이러한 MC 이식 마우스를 가진 실험을 설계할 때 염두에 두어야 한다(예를 들어,MC 기능에 가능한 효과 에이전트는 귀 피네의 중앙 부분에 주입 되어야 하며, 이러한 치료의 효과의 분석은 또한 그 영역에 초점을 맞추어야 한다).</li>
	</ol></li>
	<li>복막 구멍 내 (i.p.) 주입에 의한 복막 구멍 이식. 참고: MC 결핍 마우스의 복막 구멍으로 BMCMC를 채택하여 마우스 당 2 x 106 세포의 1개의 주사가 필요합니다. 이러한 i.p. MC-결핍 마우스에 BMCmC를 주사하는 많은 그룹이 다양한 모델에서 복막 MC의 역할을 연구하는 데 사용되어 왔으며, 여기에는 독에 대한 숙주 방어모델(31) 또는 세균패혈증32,33이포함되어 있다.<ol>
<li>적절한 수의 셀수를 계산하고 차가운 DMEM에서 1 x 107 BMCMC/ml(2 x 106 BMCMC/ 200 μl)로 재중단합니다. BMCMC 용액을 25G 바늘이 장착된 1ml 주사기로 옮긴다. 주입 될 때까지 얼음을 유지합니다.</li>
		<li>4-6주 된 MC-결핍 마우스의 복막 구멍에 200 μl BMCMC 용액1주입을 수행한다. 생체 내 실험을 수행하기 전에 i.p. 이식 후 4-6 주를 기다립니다.</li>
	</ol></li>
	<li>정맥 (즉, 주사)에 의한 이식. 참고: MC 결핍 마우스로 i.v. 주입에 의해 BMCmC의 입양 전송은 마우스 당 5 x 106 세포의 1개의 주입을 요구할 것이다. MC-결핍 마우스로 BMCmC를 주사하는 정맥(i.v.) 주사는 방광 감염34,천식35,폐 섬유증36,항체 매개 관절염37의모델을 포함하여 다양한 질병 모델에서 MC의 역할을 연구하기 위해 많은 그룹에 의해 사용되어 왔다.<ol>
<li>적절한 수의 셀수를 계산하고 차가운 DMEM에서 2.5 x 107 BMCMC/ml(5 x 106 BMCMC/200 μl)로 재중단합니다. BMCMC 용액을 30G 바늘이 장착된 1ml 주사기로 옮긴다. 주입 될 때까지 얼음을 유지합니다.</li>
		<li>이소플루란(2.5% v/v)을 이용한 4-6주 된 MC 결핍 마우스를 마취한다. 발가락 핀치에 의해 마취의 깊이를 확인하고, 표시된 경우 이소플루란을 조정하고 시술 내내 호흡과 발가락 핀치 반응을 계속 모니터링하십시오. 안과 연고를 Q-tip으로 바르면 눈의 건조를 방지하십시오.</li>
		<li>MC 결핍 마우스의 꼬리 정맥(또는 또는 레트로 궤도 정맥)에 BMCMC 용액 200 μl을 1회 주입합니다. 생체 내 실험을 수행하기 전에 i.v. 이식 후 12 주를 기다립니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 이식 된 마스트 세포 결핍 마우스의 분석.
<ol><li>귀 이식 분석.<ol>
<li>실험이 끝나면, CO2 흡입으로 마우스를 안락사시키고 자궁 경부 탈구가 뒤따릅니다.</li>
		<li>귀 피네를 분리하고 4 °C에서 하룻밤 동안 10 % (vol/vol) 버퍼링 포르말린으로 고정합니다. 파라핀에 고정 된 귀 피네를 포함, 귀 피네의 4 μm 섹션을 잘라 유리 슬라이드에 마운트.</li>
		<li>실온에서 1 분 동안 0.1 % Toluidine 블루 솔루션으로 슬라이드를 얼룩. 수돗물로 슬라이드를 1분 간 세척한 다음 실온에서 10분 동안 공기 건조 슬라이드를 드실 수 있습니다.</li>
		<li>마운팅 매체를 사용하여 커버슬립 슬라이드를 사용한 다음, 라이트 현미경을 사용하여 피네 섹션당 이식된 MC 수를 계산합니다. 이식된 마우스의 귀 껍질에 있는 MC의 백분율 그리고 분포를 야생형 마우스대 비교하여 이식 효율을 평가합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>복막 구멍 이식 분석.<ol>
<li>복막 구멍에서 마스트 세포 수의 평가.<ol>
<li>실험이 끝나면, CO2 흡입으로 마우스를 안락사시키고 자궁 경부 탈구가 뒤따릅니다. 복막 구멍을 부러뜨리지 않고 마우스의 복부 피부를 주의 깊게 제거하십시오.</li>
			<li>25G 바늘이 장착된 주사기 5ml를 사용하여 복막 구멍에 5 ml의 냉온 또는 실온 PBS를 주입하십시오. 복막 세포를 활성화하는 위험을 줄이기 위해 감기 PBS를 사용하십시오 (복막 용암 액에서 복막 MC 탈과또는 일부 MC 파생 제품의 수준을 평가할 때 매우 중요합니다). 복막 세포를 수확하기 위해 20 초 동안 복부 마사지를 수행하십시오.</li>
			<li>22G 바늘이 장착된 5ml 주사기를 사용하여 수막 용암을 천천히 흡인시합니다. 흡량성 용암의 양을 기록하십시오 (주입 된 볼륨의 최대 80 %까지 회복 될 것으로 예상).</li>
			<li>복막 용암액을 5ml 폴리스티렌 라운드 바닥 튜브로 옮기고 원심분리기를 4°C에서 5분 동안 400 x g로 옮긴다. 흡인 슈퍼 네티볼. 400 μl 감기 PBS에서 펠릿을 복구합니다.</li>
			<li>혈종계 챔버를 사용하여 총 수의 다원세포를 계산합니다. 혈중 세포 측정 분석(단계 1.3.1에 설명된 대로)에 세포 현탁액의 절반을 사용하여 복막 구멍에서 이식된 MC의 백분율 및 마커 발현을 평가한다. MC의 백분율에 따라 회막 셀의 총 수를 곱하여 절대적인 수의 수입니다.</li>
			<li>단계 1.3.2.2에 설명된 바와 같이 나머지 세포와 세포 원심 분리를 수행한다. 실온에서 10분 동안 공기 건조 슬라이드를 사용하고 PAP 펜을 사용하여 셀 주위에 왁스 원을 그립니다.</li>
			<li>희석되지 않은 5월-그룬발트 스테닝 용액을 5분 간 커버한 다음 실온에서 PBS에서 5분 동안 세척합니다. Giemsa 얼룩으로 세포를 덮어 1:20에 탈온화된 물로 희석하고 실온에서 20분 동안 배양합니다. 수돗물로 2번 밀어 넣고 1분 간 세척한 다음 공기 건조 슬라이드를 세척합니다.</li>
			<li>장착 매체를 사용하여 커버슬립 셀을 사용하고, 경현미경을 사용하여 이식된 MC의 백분율을 계산합니다(최소 400개의 총 세포를 계산하여). 생항마우스의 배막용 암포에서 MC의 비율을 야생형 마우스와 비교하여 이식 효율을 평가한다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>막자 창에서 비만 세포의 평가.<ol>
<li>단계 3.2.1에 기술된 복막 용암에 따라 복막을 열어 마우스의 장내를 노출시킵니다. 슬라이드에 마우스 당 4 ~ 5 막연한 창을 정렬합니다.</li>
			<li>카노이 용액(3:2:1 vol/vol/vol of ethanol, 클로로폼 및 빙하 아세트산)에서 1시간 동안 슬라이드를 고정합니다. 공기 건조 슬라이드및 내장을 제거 (고정 된 장간 창은 슬라이드에 부착 된 상태로 유지됩니다).</li>
			<li>Csaba (알시안 블루 / 사프란 O) 염색 용액으로 실온에서 20 분 동안 준비하십시오.<ol>
<li>500ml의 Csaba 얼룩을 만들기 위해 1M HCl 120ml의 아세테이트 용액 100ml를 혼합하여 500ml의 아세테이트 버퍼를 준비하십시오. 그런 다음 90 mg 사프라닌 [빨간으로 '성숙한 MC'를 식별], 1.8 g 알시안 블루 [파란색으로 '미성숙한 MC'를 식별] 및 2.4 g 의 페리 암모늄 황산 NH4Fe (SO4)2 ~ 500 ml의 아세테이트 버퍼.</li>
			</ol>
</li>
			<li>마운팅 매체를 사용하여 커버 슬립 슬라이드, 다음 가벼운 현미경을 사용하여 막연한 창 당 이식 된 MC의 수를 계산합니다. 이식된 마우스의 막질 창에서 MC의 백분율 과 분포를 야생형 마우스와 비교하여 이식 효율을 평가한다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>I.v. 이식 분석.<ol>
<li>실험이 끝나면, 자궁경부 탈구, 수확 조직(예를들어 폐, 피부 또는 비장)에 의해 마우스를 안락사시키고 4°C에서 10%(vol/vol) 완충 된 포르말린으로 하룻밤 을 고정한다.</li>
		<li>파라핀에 고정 된 조직을 포함, 4 μm 섹션을 잘라, 유리 슬라이드에 마운트. 실온에서 1 분 동안 0.1 % Toluidine 블루 솔루션으로 슬라이드를 얼룩. 수돗물로 슬라이드를 1분 간 세척한 다음 공기 건조 슬라이드를 10분 동안 세척합니다.</li>
		<li>커버슬립 슬라이드는 마운팅 매체를 사용하여 슬라이드를 사용하고 가벼운 현미경을 사용하여 조직 섹션당 이식된 MC의 수와 분포를 평가합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

초기 설명 38 년 후 거의30년,'돛대 세포 노크 -in'접근 방식은 MC가 할 수있는 일또는 생체 내에서 할 수없는 일에 대한 귀중한 정보를 계속 제공하고 있습니다. MC의 기능은 오랫동안 알레르기에 있는 그들의 역할에 국한된 것으로 생각되었습니다. '마스트 셀 노크-인'접근법을 이용하여 생성된 데이터는 MC가 특정 병원균4,39또는 독28,31에 대한 호스트 방어에 중요...

비만 세포(MC)는 다능성 골수선조1-3에서발생하는 조혈 세포이다. 골수 회귀에 이어 MC들은 지역성장인자의영향으로 성숙한 MC로 발전하는 다양한 조직으로 이주한다. 조직 거주자 MC는 피부, 기도 및 위장관과 같은 호스트 환경 인터페이스에 전략적으로 위치하며, 외부 모욕에 대한 방어의 첫 번째 선으로행동합니다 3-6. MC는 종종 자신의 "기준"표형 특성과 해부학 위치에 따라 하위 분류된다. 마우스에서는 MC의 두 가지 유형이 설명되었습니다 : "결합 조직 형" MC (CTMC) 및 점막 MC (McC)1-3,7,8. CTMC는 종종 정맥 과 신경 섬유 근처에 위치하고, 혈청 구멍에 거주, MmCs는 창자 및 호흡점막1-3의상피 위치를 차지하는 동안.
9-13MC의생물학적 기능을 연구하기 위해 수많은 방법론이 적용되었다. 많은 그룹은 세포주(인간 MC 라인 HMC114 또는 LAD215,16)를사용하여 체외 접근법에 초점을 맞추고 있으며, 체외 유래 MC(예: 인간 말초 혈액 유래 MC17)또는 마우스 골수 유래 배양MC [BMCMC]18,태아 피부 유래 배양 MC [FSCmC]19 및 수막 세포 유래 MC [PCMC]20)또는 다른 해부학 적 사이트에서 전 생체 외 격리 MC. 이러한 모든 모델은 MC 활성화에 관여하는 신호 경로와 같은 MC 생물학의 분자 세부 사항을 연구하는 데 널리 사용됩니다. 그러나, MC 생물학의 중요한 측면은 그들의 표현성 및 기능적특성(예를 들어,세포질 과립 프로테아제 함량 또는 다른 자극에 대한 반응)이 해부학적 위치 및 미세환경에 의해 변조될 수 있다는 것이다2,7. 생체 내에서 발생하는 이러한 요인의 정확한 혼합물은 시험관 내에서재현하기 어려울 수 있기 때문에, 우리는 MC 기능에 대한 통찰력을 얻기 위해 생체 내 접근 방식을 사용하는 것을선호9.
널리 사용되는 WBB6F1-키트 W/W-v 또는 C57BL/6-키트 W-sh/W-sh 마우스와 같은 유전 MC 결핍을 가진 몇몇 마우스 긴장이 존재합니다. 이들 마우스는 KIT(CD117)의 발현 및/또는 활성이 부족하며, 주 MC 성장 인자 줄기 세포 인자(SCF)21,22에대한 수용체가 부족하다. 그 결과, 이들 마우스는 심오한 MC 결핍을 가지고 있지만, 또한c-키트 돌연변이(WBB6F1-키트 W/W-v 마우스)와 관련된 추가적인 표현성 이상이 있거나 큰 염색체 반전의 영향으로 c-키트 발현(C57BL/6-키트 W-sh/W-sh/W-sh)을 감소시키는 효과가 있다. 최근에는c-kit-독립적인구성 MC 결핍을 가진 마우스의 몇몇 변종은24-26보고되었다. 이러한 모든 마우스와 유도 할 수없는 MC-결핍 마우스의 몇 가지 추가 새로운 유형은 최근 자세히 검토되었습니다9,10,13.
여기서는 마우스골수 유래 배양형 MC(BMCMC) 생성, MC-결핍 마우스로의 입양 전달, 양상분석, 양상분석 등의 방안을 설명하고 있다. 이른바 '마스트 셀 노크인' 방법을 사용하여 MC및 MC 파생 제품의 기능을 생체 내에서 평가할 수 있다. 우리는 최근 몇 년 동안 개발 된 대체 접근 방식에 비추어이 방법의 장점과 한계에 대해 논의합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Antibiotic-Antimycotic Solution</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>30-004-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 ml Syringe</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>309656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm x 10 mm Dish</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>430588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Polystyrene Round Bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid Glacial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A35-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue 8GX</td>
			<td>Rowley Biochemical Danver</td>
			<td>33864-99-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 6R Centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD16/32 (clone 93) Purified</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-0161-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1 ml TB Syringe</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 22G x1 (0.7 mm x 25 mm) Needles</td>
			<td>BD Precision Glide Needle</td>
			<td>205155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 25G 5/8 Needles</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 30G x1/2 Needles</td>
			<td>BD Precision Glide</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue MAX Jr, 15 ml Polypropylene Conical Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal 60 Mounting Medium</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>8310-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin3</td>
			<td>Shandon</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DakoCytomation pen</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1x</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>15-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E 7023-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Heat Inactivated</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F4135-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Conjugated IgG2b K Rat Isotype Control</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-4031-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein Isotiocyanate (FITC) Conjugated Anti-mouse KIT (CD117; clone 2B8)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-1171-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Giemsa Stain Modified</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>GS-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>29405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>May-Grunwald Stain</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>MG-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell 6 well plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>35 3046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus BX60 Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast Plus Tissue Embedding Medium</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>23-021-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Conjugated IgG Armenian Hamster Isotype Control</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4888-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered-Saline (PBS) 1x</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phycoerythrin (PE) Conjugated Anti-mouse FceRIa (clone MAR-1)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-5898-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide Staining Solution</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-6990-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL-3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>213-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranin-o Certified</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flasks T25 25 cm2</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>353109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flasks T75 75 cm2</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>353110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue 1 % Aqueous</td>
			<td>LabChem-Inc</td>
			<td>LC26165-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse SCF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-03</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing the functions of mast cells in vivo using 'mast cell knock-in' mice

비만 세포 (MC)는 다양한 조직에 상주하는 조혈 세포이며, 특히 피부, 기도 및 위장관과 같은 외부 환경에 노출 된 부위에 풍부합니다. IgE 의존성 알레르기 반응에서 해로운 역할로 가장 잘 알려진 MC들은 독과 침입 하는 박테리아와 기생충에 대 한 호스트 방어에 중요 한 선수로 등장 했다. MC 표현형 및 기능은 해부학적 위치에 따라 다를 수 있는 미세 환경적 요인및/또는 면역 반응의 발달의 유형 또는 단계에 따라 영향을 받을 수 있다. 이러한 이유로, 우리와 다른 MC 기능에 대 한 통찰력을 얻기 위해 체 외 메서드를 통해 생체 내 접근에 선호 했다. 여기서는 마우스골수 유래 배양MC(BMCMC), 유전자 MC-결핍 마우스로의 입양 이송, 양상에서 입양된 MC의 수 및 분포 분석 등을 설명하고 있다. '마스트 셀노크인' 접근법이라는 이름의 이 방법은 지난 30년 동안 MC와 MC 파생 제품의 기능을 생체내에서평가하는 데 광범위하게 사용되어 왔다. 우리는 최근 몇 년 동안 개발 된 대체 접근 방식에 비추어이 방법의 장점과 한계에 대해 논의합니다.

'마스트 세포노크-인'접근법의 개요는 도 1에도시되며, BMCmC의 생성, i.p., 즉 mc-결핍 마우스로 이식해야 하는 세포의 수(실험 설계에 따라 표시될 경우 숫자가 달라질 수 있음) 및 주사 부위에 따라 이식 및 실험 사이의 간격을 포함할 수 있습니다(이 에 따라 달라질 수 있습니다.) 예를 들어,MC 세포질 과립에 저장된 중재자의 함량은38시에꾸준히 증가한다.) 도...

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Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using &#039;Mast Cell Knock-in&#039; Mice

우리는 체외 유래 마스트 세포의 생성을 위한 방법, 유방 세포 결핍 마우스로그들의 이식, 및 다른 해부학 적인 사이트에 이식된 유방 세포의 표현형, 숫자 및 분포의 분석을 기술합니다. 이 프로토콜은 생체 내에서 마스트 세포의 기능을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

'마스트 셀 노크-인' 마우스를사용 하 여 생체 내 비만 세포의 기능 분석

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

10.1K 조회수.  Stanford University School of Medicine. 우리는 체외 유래 마스트 세포의 생성을 위한 방법, 유방 세포 결핍 마우스로그들의 이식, 및 다른 해부학 적인 사이트에 이식된 유방 세포의 표현형, 숫자 및 분포의 분석을 기술합니다. 이 프로토콜은 생체 내에서 마스트 세포의 기능을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

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Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

에 셀 운명을 따라<em&gt; E. 대장균</em&gt; 파지 람다에 의해 감염 후

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

연구

면역학 및 감염병학

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

이식 - 대 - 호스트 질병의 유도 및<em&gt; 생체 내</emMHC 검색 손쥐 모델을 사용&gt; T 셀 모니터링

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a process that results in the exocytosis of allergic mediators. Modulation of mast cell degranulation by drugs and toxicants may have positive or adverse effects on human health. Mast cell function has been dissected in detail with the use of rat basophilic leukemia mast cells (RBL-2H3), a widely accepted model of human mucosal mast cells3-5. Mast cell granule component and the allergic mediator &#946;-hexosaminidase, which is released linearly in tandem with histamine from mast cells6, can easily and reliably be measured through reaction with a fluorogenic substrate, yielding measurable fluorescence intensity in a microplate assay that is amenable to high-throughput studies1. Originally published by Naal et al.1, we have adapted this degranulation assay for the screening of drugs and toxicants and demonstrate its use here.
Triclosan is a broad-spectrum antibacterial agent that is present in many consumer products and has been found to be a therapeutic aid in human allergic skin disease7-11, although the mechanism for this effect is unknown. Here we demonstrate an assay for the effect of triclosan on mast cell degranulation. We recently showed that triclosan strongly affects mast cell function2. In an effort to avoid use of an organic solvent, triclosan is dissolved directly into aqueous buffer with heat and stirring, and resultant concentration is confirmed using UV-Vis spectrophotometry (using &#949;280 = 4,200 L/M/cm)12. This protocol has the potential to be used with a variety of chemicals to determine their effects on mast cell degranulation, and more broadly, their allergic potential.

Mast cell degranulation, the release of allergic mediators, is important in allergy, asthma, and parasite defense. Here we demonstrate techniques1 for assessing effects of drugs and toxicants on degranulation, methodology recently utilized to exhibit the powerful inhibitory effect of antibacterial agent triclosan2.

유기 용매를 사용하지 않고 트리클로산의 효과 : RBL-2H3 비만 세포 탈과립에 화학 효과를 평가하는 마이크로 분석 실험

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly synthesized allergic, inflammatory and immunoregulatory mediators. MCs&#8217; mediators affect multiple tissues and organs culminating in allergic and immune responses. The synthesis, storage and release of the MC mediators are highly regulated. The pre-formed mediators are packed in cytoplasmic secretory granules&#160;(SG) that fuse with the plasma membrane and release their content by regulated exocytosis. We present a protocol, based on the co-expression of a gene of interest with a reporter gene that is targeted to the SGs and is released in a regulated fashion alongside the endogenous SG mediators. The protocol enables high resolution four dimensional confocal analyses of the MC SGs and monitoring their timeline from biogenesis to triggered exocytosis. Thus, using this protocol for screening genes of interest for their phenotypic and functional impact allows deciphering the molecular mechanisms that govern the biogenesis and exocytosis of the MC SGs and identifying the regulators involved. Thereby, further insights into the cellular mechanisms that account for MCs function in health and disease should be provided.

The goal of the present&#160;protocol was to develop a method that will allow functional genomic analyses of mast cell secretion. The protocol is based on quantitative assessment of the release of a fluorescent reporter gene cotrasfected with the gene of interest and real time&#160;analyses of the secretory granule&#39;s morphology.

비만 세포 분비 과립을 조사; 생합성에서 세포 외 유출에

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

망막 미세 아교 식세포의 기능을 평가<em&gt; 생체</em&gt;은 유동 세포 계측법 기반 분석을 사용하여

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol specifically intended to measure antigen-specific killing without an infection. This protocol is designed and describes methods to overcome these limitations by allowing for the detection of antigen-specific killing of a target cell by CD8+ T cells in vivo. This is accomplished by merging a vaccination model with a traditional CFSE-labeled target killing assay. This combination allows the researcher to assess the antigen-specific CTL potential directly and quickly as the assay is not dependent upon tumor growth or infection. In addition, the readout is based on flow cytometry and so should be readily accessible to most researchers. The major limitation of the study is identifying the timeline in vivo that is appropriate to the hypothesis being tested. Variations in antigen strength and mutations in the T cells that may result in differential cytolytic function need to be carefully assessed to determine the optimal time for cell harvest and assessment. The appropriate concentration of peptide for vaccination has been optimized for hgp10025-33 and OVA257-264, but further validation would be needed for other peptides that may be more appropriate to a given study. Overall, this protocol allows a quick assessment of killing function in vivo and can be adapted to any given antigen.

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

The goal of this protocol is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model.

Vivo에서 예방 접종 모델을 사용 하는 항 원 특정 T-셀 Cytolytic 함수의 검색에 대 한 분석 결과

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic immune response. The activation of MCs via the cross-linking of surface IgE bound to high affinity IgE receptor (Fc&#949;RI), as well as through the stimulation of several other receptors, initiates the rise of the free intracellular Ca2+ level ([Ca2+]i) that promotes the release of inflammatory and allergic mediators. The identification of molecular constituents involved in these signaling pathways is crucial for understanding the regulation of MC function. In this article, we describe a protocol for the isolation of murine connective tissue type MCs by peritoneal lavage and cultivation of peritoneal MCs (PMCs). Cultures of MCs from various knockout mouse models by this methodology represent a useful approach to the identification of proteins involved in MC signaling pathways. In addition, we also describe a protocol for single cell Fura-2 imaging as an important technique for the quantification of Ca2+ signaling in MCs. Fluorescence-based monitoring of [Ca2+]i is a reliable and commonly used approach to study Ca2+ signaling events, including store-operated calcium entry, which is of utmost importance for MC activation. For the analysis of MC degranulation, we describe a &#946;-hexosaminidase release assay. The amount of &#946;-hexosaminidase released into the culture medium is considered as a degranulation marker for all three different secretory subsets described in MCs. &#946;-hexosaminidase can easily be quantified by its reaction with a colorigenic substrate in a microtiter plate colorimetric assay. This highly reproducible technique is cost-effective and requires no specialized equipment. Overall, the provided protocol demonstrates a high yield of MCs expressing typical MC surface markers, displaying typical morphological and phenotypic features of MCs, and demonstrating highly reproducible responses to secretagogues in Ca2+-imaging and degranulation assays.

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Here, we present a protocol to isolate and cultivate murine peritoneal mast cells. We also describe two protocols for their functional characterization: a fluorescent imaging of intracellular free Ca2+ concentration and a degranulation assay based on colorimetric quantification of the released &#946;-hexosaminidase.

복 막 파생 돛대 세포 및 그들의 기능 특성화 캘리포니아2 +의 격리-이미징 및 Degranulation 분석 실험

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a formidable defense against invading pathogens via diverse mechanisms. One major goal of vaccination is to induce protective antigen-specific antibodies to prevent life-threatening infections. Both thymus-dependent (TD) and thymus-independent (TI) antigens can elicit robust antigen-specific IgM responses and can also induce the production of isotype-switched antibodies (IgG, IgA and IgE) as well as the generation of memory B cells with the help provided by antigen presenting cells (APCs). Here, we describe a protocol to characterize TD and TI Ig isotype responses in mice using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). In this protocol, TD and TI Ig responses are elicited in mice by intraperitoneal (i.p.) immunization with hapten-conjugated model antigens TNP-KLH (in alum) and TNP-polysaccharide (in PBS), respectively. To induce TD memory response, a booster immunization of TNP-KLH in alum is given at 3 weeks after the first immunization with the same antigen/adjuvant. Mouse sera are harvested at different time points before and after immunization. Total serum Ig levels and TNP-specific antibodies are subsequently quantified using Ig isotype-specific Sandwich and indirect ELISA, respectively. In order to correctly quantify the serum concentration of each Ig isotype, the samples need to be appropriately diluted to fit within the linear range of the standard curves. Using this protocol, we have consistently obtained reliable results with high specificity and sensitivity. When used in combination with other complementary methods such as flow cytometry, in vitro culture of splenic B cells and immunohistochemical staining (IHC), this protocol will allow researchers to gain a comprehensive understanding of antibody responses in a given experimental setting.

In this paper, we describe a protocol to characterize T-dependent and T-independent immunoglobulin (Ig) isotype responses in mice using ELISA. This method used alone or in combination with flow cytometry will allow researchers to identify differences in B cell-mediated Ig isotype responses in mice following T-dependent and T-independent antigen immunization.

Thymus 종속 및 독립 Thymus 면역 글로불린 Isotype 반응 효소 연결 된 Immunosorbent 분석 결과 사용 하 여 마우스의 특성

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Generation of Knock-out Primary and Expanded Human NK Cells Using Cas9 Ribonucleoproteins

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging in primary NK cells. For example, transgene delivery using lentiviral or retroviral transduction resulted in a limited yield of genetically-engineered NK cells due to substantial procedure-associated NK cell apoptosis. We describe here a DNA-free method for genome editing of human primary and expanded NK cells using Cas9 ribonucleoprotein complexes (Cas9/RNPs). This method allowed efficient knockout of the TGFBR2 and HPRT1 genes in NK cells. RT-PCR data showed a significant decrease in gene expression level, and a cytotoxicity assay of a representative cell product suggested that the RNP-modified NK cells became less sensitive to TGF&#946;. Genetically modified cells could be expanded post-electroporation by stimulation with irradiated mbIL21-expressing feeder cells.

Here, we present a protocol to genetically modify primary or expanded human natural killer (NK) cells using Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs). By using this protocol, we generated human NK cells deficient for transforming growth factor&#8211;b receptor 2 (TGFBR2) and hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).

Cas9 Ribonucleoproteins를 사용 하 여 노크 아웃 기본 및 확장 된 인간 NK 세포의 생성

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging ...

Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice

T Follicular Helper (Tfh) cells are an independent CD4+&#160;T cell subset specialized in providing help for germinal center (GC) development and generation of high-affinity antibodies. In influenza virus infection, robust Tfh and GC B cell responses are induced to facilitate effective virus eradication, which confers a qualified mouse model for Tfh-associated study. In this paper, we described protocols in detection of basic Tfh-associated immune response during influenza virus infection in mice. These protocols include: intranasal inoculation of influenza virus; flow cytometry staining and analysis of polyclonal and antigen-specific Tfh cells, GC B cells and plasma cells; immunofluorescence detection of GCs; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) of influenza virus-specific antibody in serum. These assays basically quantify the differentiation and function of Tfh cells in influenza virus infection, thus providing help for studies in elucidating differentiation mechanism and manipulation strategy.

This paper describes protocols of evaluating Tfh and GC B response in mouse model of influenza virus infection.