This work was supported by the Alzheimer&#8217;s Association (NIRG-10-171721; to U.H.), National Institute of Mental Health (MH096702; to U.H.), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NS081333; to C.M.T.), and pilot study awards from the National Institute on Aging-funded Alzheimer&#8217;s Disease Research Center at Columbia University (AG008702; to J.B. and Y.Y.J.) that also supports the New York Brain Bank. We thank members of the Hengst laboratory for comments and discussions

Todos los animales procedimientos fueron aprobados por el IACUC de la Universidad de Columbia y las directrices aplicables para el cuidado y uso de animales de laboratorio fueron seguidos. Nota: Preparar todos los tampones utilizados para los procedimientos de ISH en RNasa libre de agua o tratada con DEPC. Esta recomendación no es estrictamente necesario después de ISH se ha completado, pero se sugiere que los tampones todavía se preparan en agua doblemente destilada esterilizada en autoclave y / o esterilizados por filtración. 1. Detección de ATF4 mRNA localizada a colinérgica axones en el ratón adulto cerebro usando Hibridación Fluorescente In Situ (FISH) Seguido por inmunohistoquímica <ol><li> Preparación de muestras para las secciones de cerebro congeladas paraformaldehído-fijo <ol><li> Para el siguiente ejemplo, preparar rodajas de cerebro de ratones congelados fijos. <ol><li> En pocas palabras, sacrificar los ratones 9 meses de edad, por la anestesia con ketamina (100 mg kg -1 de peso corporal) y xilazina (10 mg kg -1 weig cuerpoht) seguido de una infusión transcardial de 4% de paraformaldehído en PBS (pH 7,4). </li><li> Retire cerebros y post-fix en paraformaldehído al 4% durante 24 horas a 4 ° C </li><li> Después de la fijación, lavar las muestras tres veces en PBS y cryoprotect en 30% de sacarosa en PBS (pH 7,4) durante 24 horas a 4 o C. </li><li> Cerebros Insertar en octubre congelación compuesto, en serie sección a 20 micras en un criostato y montar en poli-D-lisina tratados portaobjetos de microscopio. Mantenga rodajas de cerebro a -20 ° C hasta su uso. </li></ol></li><li> Eliminar rodajas de cerebro paraformaldehído fijo de congelador y aire seco durante 30 min a TA. </li><li> Lavar tres veces con PBS 1x. </li><li> En una campana de extracción, re-fix cerebro rebanadas 20 min con paraformaldehído al 4% a TA. NOTA: PRECAUCIÓN: 4% de paraformaldehído es tóxico y debe manejarse y desecharse adecuadamente siguiendo los protocolos de seguridad. </li><li> Lavar tres veces con PBS 1x. </li><li> Deshidratar rodajas de cerebro. <ol><li> Preparar 50%, 75% y 100%soluciones de etanol. </li><li> Sumergir los portaobjetos en etanol al 50% durante 5 min a RT. </li><li> Sumergir los portaobjetos en etanol al 75% durante 5 min a RT. </li><li> Sumergir los portaobjetos en etanol al 100% durante 5 min a RT. </li><li> Sumergir los portaobjetos en etanol fresco 100% durante 5 min a RT. Nota: Como alternativa, las diapositivas se pueden almacenar en etanol al 100% a -20 ° C hasta 1 mes. </li></ol></li></ol></li><li> Prueba FISH seguido por inmunohistoquímica utilizando antígeno / ARN desenmascaramiento inducida por calor <ol><li> Antes de comenzar la preparación de todo el material necesario: <ol><li> Calentar el horno de hibridación a 40 ° C y colocar una bandeja que contiene agua destilada en el horno para crear un ambiente humidificado. </li><li> Tome una caja portaobjetos y colocar toallas de papel empapado en agua destilada dentro para humidificar el cuadro diapositiva. Coloque la caja portaobjetos en el horno de hibridación. </li><li> Eliminar sondas (ambas sondas negativos y objetivo) de la nevera y calentar en el horno de hibridación para 10 min. Deja que se enfríen las sondas down a RT. </li><li> Equilibrar reactivos de amplificación AMP 1.4 (incluido en el Kit Fluorescente Multiplex Reactivo) a TA. </li><li> Preparar la solución de recuperación de antígeno: 10 mM de citrato sódico (pH 6), 0,05% de Tween 20. Nota: La solución puede ser almacenada a temperatura ambiente indefinidamente y se utiliza para la tinción futuro. </li><li> Preparar el tampón de lavado 1x diluyendo la solución 50x social (incluido en el Kit Fluorescente Multiplex reactivo) en agua libre de RNasa o tratada con DEPC. NOTA: 1x tampón de lavado se puede almacenar a temperatura ambiente durante 1 mes y se utiliza para la tinción futuro. Tampón de lavado 50x podría precipitar. Si es así, el calor 50x tampón de lavado a 40 ° C durante 10 minutos antes de preparar la solución 1x. </li></ol></li><li> Retirar los portaobjetos de etanol 100% y aire seco durante 5 min a RT. </li><li> Prepara una jarra Coplin que contiene 50 ml de solución de recuperación de antígeno. Sumergir los portaobjetos en solución de recuperación de antígenos y hervir durante 10 minutos en un horno de microondas. NOTA: También se desliza horizontalmente en lugar de 100 mmplato de cristal redondo de diámetro que contiene 100 ml de solución de recuperación. <ol><li> Llenar un vaso de precipitados de 1 litro con agua destilada y colóquelo en el microondas. NOTA: El agua se &quot;amortiguar&quot; el calor al realizar desenmascaramiento. </li><li> Colocar los portaobjetos en solución de recuperación de antígenos dentro del microondas. Hervir desliza a alta potencia durante 5 minutos. Inmediatamente después de las muestras han dejado de ebullición, el calor se desliza de nuevo a alta potencia de descuento del 5 min. </li><li> Enfriar diapositivas a RT. NOTA: CRÍTICA PASO: hervir la duración y el procedimiento deben ser determinados por el usuario, dependiendo de las características de microondas. La más rápida es la ebullición comienza mayores serán las posibilidades de solución de evaporación. En este caso, se recomienda que las muestras se hirvieron durante períodos de tiempo más cortos más de dos veces para completar un tiempo total de desenmascaramiento 10 min. Por el contrario, si calentamiento se realiza a una potencia media o baja, desenmascaramiento puede realizarse una vez por 10 min. Sin embargo, si las muestras no hervir continuously para un total de aproximadamente 10 min, esto podría resultar en desenmascaramiento parcial de tanto el ARN diana y la proteína a detectar. </li></ol></li><li> Lavar los portaobjetos tres veces con PBS 1x. </li><li> Añadir 2 - 3 gotas (~ 100 l) de la sonda dapB ajustado a esos cortes de cerebro utilizados para evaluar la tinción de fondo. Nota: La sonda conjunto dapB dirige a un gen bacteriano y no debe reconocer ninguna ARN de mamífero. </li><li> Añadir 2 - 3 gotas de la sonda de focalización ajustado a esos cortes de cerebro utilizados para detectar el ARN de interés. Nota: un conjunto de sonda focalización residuos 20 - 1381 del ratón ATF4 mRNA se utiliza en este ejemplo. </li><li> Diapositivas Cubra con parafina para evitar la evaporación de la sonda, los colocan en el cuadro de diapositivas humidificado en el interior del horno de hibridación y los incuban a 40 ° C durante 2 horas. NOTA: OPCIONAL: rodajas de cerebro adicionales pueden hibridar con una sonda conjunto dirigido ratón POLR2A y utilizaron como controles positivos. </li><li> Lavar slides dos veces con tampón de lavado 1x durante 2 min a RT. </li><li> Añadir 2-3 gotas de reactivo de amplificación AMP 1-FL para cada rebanada cerebro, cubrir diapositivas con parafilm, colóquelos en la caja portaobjetos y se incuba a 40 ° C durante 30 minutos en el horno de hibridación. </li><li> Lavar los portaobjetos dos veces con tampón de lavado 1x durante 2 min a RT. </li><li> Añadir 2-3 gotas de reactivo de amplificación AMP 2-FL para cada rebanada cerebro, cubrir diapositivas con parafilm, colóquelos en la caja portaobjetos y se incuba a 40 ° C durante 15 minutos en el horno de hibridación. </li><li> Lavar los portaobjetos dos veces con tampón de lavado 1x durante 2 min a RT. </li><li> Añadir 2-3 gotas de reactivo de amplificación AMP 3-FL para cada rebanada cerebro, cubrir diapositivas con parafilm, colóquelos en la caja portaobjetos y se incuba a 40 ° C durante 30 minutos en el horno de hibridación. </li><li> Lavar los portaobjetos dos veces con tampón de lavado 1x durante 2 min a RT. </li><li> Añadir 2-3 gotas de reactivo de amplificación AMP 4-FL para cada rebanada cerebro, cubrir diapositivas con parafina, colóquelos en lacaja de portaobjetos y se incuba a 40 ° C durante 15 minutos en el horno de hibridación. </li><li> Lavar los portaobjetos dos veces con tampón de lavado 1x durante 2 min a RT y dos veces con PBS 1x. </li><li> Añadir 100 a 200 l (o un volumen suficiente para cubrir completamente rebanadas) de una solución de bloqueo que contenía 3 mg / ml de BSA, glicina 100 mM y 0,25% de Triton X-100 en PBS (pH 7,4) a los portaobjetos, cubrir con parafilm y se incubar durante 30 min a TA. </li><li> Añadir 100 a 200 l de anticuerpo anti-ChAT diluido en solución de bloqueo (1/100) a las diapositivas, cubrirlos con parafilm y se incuba durante 2 días a 4 ° C. Asegúrese de que las secciones de cerebro no se sequen. Si es necesario, vuelva a aplicar la solución de anticuerpo anti-chat para cortes de cerebro 24 horas después de la incubación. </li><li> Lavar los portaobjetos tres veces en 1X PBS durante 5 min a TA. </li><li> Añadir 100 a 200 l de anticuerpo secundario conjugado con Alexa adecuado (. Por ejemplo, Alexa-594 burro anti-cabra para este ejemplo en particular) a las diapositivas, cubrir con parafilm y incubcomió durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Lavar los portaobjetos tres veces en 1X PBS durante 5 min a TA. </li><li> Lavar los portaobjetos una vez con agua destilada. </li><li> Monte desliza con medio de montaje que contiene DAPI. </li><li> Visualizar rodajas de cerebro bajo un microscopio de fluorescencia. </li></ol></li></ol> 2. Detección de ATF4 mRNA localizada a axones en muestras de cerebro humano utilizando cromogénico hibridación in situ (CISH) Seguido por Luxol Fast azul y violeta de cresilo Counterstaining <ol><li> Preparación de muestras para muestras de cerebro humano incluidas en parafina fijado en formol <ol><li> Rebanadas Hornear en un horno seco a 60 ° C durante 1 hora. </li><li> Desparafinar rodajas de cerebro en una campana de humos. NOTA: PRECAUCIÓN: Los reactivos son tóxicos y deben manejarse y se desecha siguiendo las pautas de seguridad apropiadas <ol><li> Sumergir los portaobjetos en cámara de compensación alternativa xileno dos veces durante 10 minutos. </li><li> Sumergir los portaobjetos en etanol al 100% dos veces durante 1 min. </li><li> LArodajas de IR-seca 5 min a TA. Nota: Como alternativa, las muestras pueden ser secadas a RT O / N, pero deben utilizarse dentro de las 24 hrs. </li></ol></li></ol></li><li> Diaminobencidina (DAB) a base de ensayo de ISH cromogénico seguido por luxol rápido azul y violeta de cresilo mancha utilizando ARN desenmascaramiento inducida proteasa inducida por el calor y <ol><li> Antes de comenzar la preparación de materiales necesarios: <ol><li> Calentar el horno de hibridación a 40 ° C y colocar una bandeja que contiene agua destilada para crear un ambiente humidificado. </li><li> Tome una caja portaobjetos y colocar toallas de papel empapado en agua destilada dentro para humidificar el cuadro diapositiva. Coloque la caja portaobjetos en el horno de hibridación. </li><li> Prepare 1x Pretrate 2 diluyendo la solución 10x (incluido en el Kit de CISH reactivo) en agua libre de RNasa o tratada con DEPC. Si el pretratamiento se lleva a cabo en una placa caliente, añadir 100 ml de solución de pretratamiento a un plato de vidrio de diámetro 100 mm para aumentar la superficie de contacto entre el plato y la placa caliente (si pretratamientose realiza en un horno de microondas, un tarro Coplin puede utilizarse en lugar como se especifica en 1.2.3). Solución de calor a 100 ° C y mantenerla no más de 30 minutos hirviendo antes de sumergir las muestras. </li><li> Calor sondas negativos y positivos 10 min a 40 ° C y enfriar a temperatura ambiente. </li><li> Equilibrar reactivos de amplificación AMP 1.6 (incluido en el Kit de CISH Reactivo) a TA. </li><li> Preparar el tampón de lavado 1x diluyendo la solución 50x social (incluido en el kit de reactivos CISH) en agua destilada. Nota: 1x tampón de lavado se puede almacenar a temperatura ambiente durante 1 mes y se utiliza para la tinción futuro. </li></ol></li><li> Añadir ~ 4 gotas (~ 120 mu l) de Pretrate 1 a cada rebanada de cerebro, cubrir con parafilm y se incuba a TA durante 10 min. </li><li> Lavar 3 a 5 veces en agua destilada fresca. </li><li> Realizar desenmascaramiento inducida por calor: <ol><li> Diapositivas de traslado hasta el caliente Trate previamente 2 (incluido en el kit de reactivos CISH) de solución y hervir durante 15 minutos. Nota: de ebullición se puede realizar en un plato caliente garantizandoebullición continua o en el microondas siguiendo los pasos críticos especificados en 1.2.3). </li></ol></li><li> Transferir inmediatamente diapositivas a agua destilada y lavar 3 a 5 veces. </li><li> Lavar los portaobjetos 3 a 5 veces en etanol al 100% fresco. </li><li> Rodajas de aire seco 5 min a temperatura ambiente. Nota: O Alternativamente rebanadas se pueden secar / N. </li><li> Realizar desenmascaramiento inducida proteasa-: <ol><li> Añadir 4 gotas de Pretrate 3 (incluido en el kit de reactivos CISH), cubrir con parafilm y se incuba 30 minutos a 40 ° C en el horno de hibridación. </li></ol></li><li> Lavar los portaobjetos de 3 a 5 veces en agua destilada fresca. </li><li> Añadir 4 gotas de la sonda dapB ajustado a esas rodajas de cerebro utilizadas para evaluar la tinción de fondo. </li><li> Añadir 4 gotas de la sonda de focalización ajustado a esos cortes de cerebro utilizados para detectar el ARN de interés. NOTA: Una sonda conjunto dirigido residuos 15 - 1256 del ARNm ATF4 humano se utiliza en este ejemplo. OPCIONAL: rodajas de cerebro adicionales pueden ser hybridized con una sonda conjunto dirigido PPIB humana y se utiliza como controles positivos. </li><li> Coloque las diapositivas en el cuadro de diapositivas y se incuba durante 2 horas. a 40 ° C en el horno de hibridación. </li><li> Lavar los portaobjetos dos veces con tampón de lavado 1x durante 2 min a RT. </li><li> Añadir 4 gotas de AMP 1 reactivo para cada rebanada cerebro, cubrir diapositivas con parafina, colocarlos en la caja de diapositivas y se incuba a 40 ° C durante 30 minutos en el horno de hibridación. </li><li> Lavar los portaobjetos dos veces con tampón de lavado 1x durante 2 min a RT. </li><li> Añadir 4 gotas de AMP 2 reactivo para cada rebanada cerebro, cubrir diapositivas con parafina, colocarlos en la caja de diapositivas y se incuba a 40 ° C durante 15 minutos en el horno de hibridación. </li><li> Lavar los portaobjetos dos veces con tampón de lavado 1x durante 2 min a RT. </li><li> Añadir 4 gotas de AMP 3 reactivo para cada rebanada cerebro, cubrir diapositivas con parafina, colocarlos en la caja de diapositivas y se incuba a 40 ° C durante 30 minutos en el horno de hibridación. </li><li> Lavar los portaobjetos dos veces con 1x erah tampón durante 2 minutos a RT. </li><li> Añadir 4 gotas de AMP 4 reactivo para cada rebanada cerebro, cubrir diapositivas con parafina, colocarlos en la caja de diapositivas y se incuba a 40 ° C durante 15 minutos en el horno de hibridación. </li><li> Lavar los portaobjetos dos veces con tampón de lavado 1x durante 2 min a RT. </li><li> Añadir 4 gotas de AMP 5 reactivo para cada rebanada cerebro, cubrir diapositivas con parafilm y se incuba 30 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Lavar los portaobjetos dos veces con tampón de lavado 1x durante 2 min a RT. </li><li> Añadir 4 gotas de AMP 6 reactivo para cada rebanada cerebro, cubrir diapositivas con parafilm y se incuba 15 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Lavar los portaobjetos dos veces con tampón de lavado 1x durante 2 min a RT. </li><li> Mezclar un volumen igual de BROWN-1 y BROWN-2 reactivos (incluido en el Kit Reactivo de CISH), añadir ~ 120 l de solución a cada rebanada de cerebro, cubrir con parafilm y se incuba 10 min a TA. </li><li> Lavar los portaobjetos dos veces con tampón de lavado 1x durante 2 min a RT y enjuagar una vez en agua destilada. NOTA: Los pasos críticos: los siguientes pasos son fundamentales paraobtener una contratinción axonal óptima sin enmascarar la presencia de gránulos de ARN. </li><li> Antes de realizar contratinción comprobar la presencia de ARNm de interés bajo un microscopio de campo claro. Definir las áreas de referencia en las muestras de cerebro en el que monitorean la presencia de puntos lagrimales durante todo el procedimiento de contraste. </li><li> Luxol Precaliente solución de azul rápido a 60 ° C. </li><li> Coloque los portaobjetos en luxol azul rápido e incubar 30 minutos a 60 ° C </li><li> Enjuague varias veces en agua destilada. </li><li> Dip desliza varias veces en solución de carbonato de litio 0,05% para iniciar la diferenciación. </li><li> Dip desliza dos veces en etanol fresco 75%. </li><li> Enjuague con agua destilada. </li><li> Compruebe rodajas de cerebro con un microscopio de campo claro. Tenga en cuenta que la materia gris y blanca debería empezar a ser gránulos distinguibles y ARN todavía visibles como / puntos lagrimales negro azul oscuro. Verifique que los axones comienzan a aparecer como fibras de color azul claro. </li><li> Repita los pasos del 02/02/28 a 02/02/32. Perform incubaciones con solución de azul luxol rápido en 10 a 20 pasos min, controlando cuidadosamente la contratinción y la presencia de gránulos de ARN. Nota: Por lo general, de contraste óptimo se adquiere en 60 a 90 minutos (tiempo total de incubación), pero el tiempo se puede acortar si se sospecha que los gránulos de ARN pueden ser enmascarados por la luxol mancha azul rápido (ver Figura 2 para ver ejemplos). </li><li> Incubar los portaobjetos en una solución de violeta de cresilo durante 10 min a RT. </li><li> Enjuague los portaobjetos en agua destilada. </li><li> Dip desliza 5 a 10 veces en etanol al 70%. </li><li> Deshidratar rodajas de cerebro a través de 3 cambios rápidos de etanol al 100%. </li><li> En una campana de humos, rodajas de cerebro claras por incubando dos veces en cámara de compensación alternativa xileno durante 2 minutos y una tercera vez durante 5 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Rebanadas Monte cerebrales en medio de montaje permanente a base de xileno. </li><li> Analizar las muestras en un microscopio de campo claro. </li></ol></li></ol>

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	<li>Jung, H., Yoon, B. C., Holt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+mRNA+localization+and+local+protein+synthesis+in+nervous+system+assembly,+maintenance+and+repair.">Axonal mRNA localization and local protein synthesis in nervous system assembly, maintenance and repair.</a> Nat. Rev. Neurosci. 13, 308-324 (2012).</li><li>Campbell, D. S., Holt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotropic+responses+of+retinal+growth+cones+mediated+by+rapid+local+protein+synthesis+and+degradation.">Chemotropic responses of retinal growth cones mediated by rapid local protein synthesis and degradation.</a> Neuron. 32, 1013-1026 (2001).</li><li>Wu, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+translation+of+RhoA+regulates+growth+cone+collapse.">Local translation of RhoA regulates growth cone collapse.</a> Nature. 436, 1020-1024 (2005).</li><li>Piper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+mechanisms+underlying+Slit2-induced+collapse+of+Xenopus+retinal+growth+cones.">Signaling mechanisms underlying Slit2-induced collapse of Xenopus retinal growth cones.</a> Neuron. 49, 215-228 (2006).</li><li>Yao, J., Sasaki, Y., Wen, Z., Bassell, G. J., Zheng, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+role+for+&#946;-actin+mRNA+localization+and+translation+in+Ca2+-dependent+growth+cone+guidance.">An essential role for &#946;-actin mRNA localization and translation in Ca2+-dependent growth cone guidance.</a> Nat. Neurosci. 9, 1265-1273 (2006).</li><li>Hengst, U., Deglincerti, A., Kim, H. J., Jeon, N. L., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+elongation+triggered+by+stimulus-induced+local+translation+of+a+polarity+complex+protein.">Axonal elongation triggered by stimulus-induced local translation of a polarity complex protein.</a> Nat. Cell Biol. 11, 1024-1030 (2009).</li><li>Gracias, N. G., Shirkey-Son, N. J., Hengst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+translation+of+TC10+is+required+for+membrane+expansion+during+axon+outgrowth.">Local translation of TC10 is required for membrane expansion during axon outgrowth.</a> Nat. Commun. 5, 3506 (2014).</li><li>Preitner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APC+Is+an+RNA-Binding+Protein,+and+Its+Interactome+Provides+a+Link+to+Neural+Development+and+Microtubule+Assembly.">APC Is an RNA-Binding Protein, and Its Interactome Provides a Link to Neural Development and Microtubule Assembly.</a> Cell. 158, 368-382 (2014).</li><li>Brittis, P. A., Lu, Q., Flanagan, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+protein+synthesis+provides+a+mechanism+for+localized+regulation+at+an+intermediate+target.">Axonal protein synthesis provides a mechanism for localized regulation at an intermediate target.</a> Cell. 110, 223-235 (2002).</li><li>Tcherkezian, J., Brittis, P. A., Thomas, F., Roux, P. P., Flanagan, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+receptor+DCC+associates+with+protein+synthesis+machinery+and+regulates+translation.">Transmembrane receptor DCC associates with protein synthesis machinery and regulates translation.</a> Cell. 141, 632-644 (2010).</li><li>Colak, D., Ji, S. J., Porse, B. T., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+axon+guidance+by+compartmentalized+nonsense-mediated+mRNA+decay.">Regulation of axon guidance by compartmentalized nonsense-mediated mRNA decay.</a> Cell. 153, 1252-1265 (2013).</li><li>Cox, L. J., Hengst, U., Gurskaya, N. G., Lukyanov, K. A., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-axonal+translation+and+retrograde+trafficking+of+CREB+promotes+neuronal+survival.">Intra-axonal translation and retrograde trafficking of CREB promotes neuronal survival.</a> Nat. Cell Biol. 10, 149-159 (2008).</li><li>Ji, S. J., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-axonal+translation+of+SMAD1/5/8+mediates+retrograde+regulation+of+trigeminal+ganglia+subtype+specification.">Intra-axonal translation of SMAD1/5/8 mediates retrograde regulation of trigeminal ganglia subtype specification.</a> Neuron. 74, 95-107 (2012).</li><li>Bassell, G. J., Singer, R. H., Kosik, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+poly(A)+mRNA+with+microtubules+in+cultured+neurons.">Association of poly(A) mRNA with microtubules in cultured neurons.</a> Neuron. 12, 571-582 (1994).</li><li>Kleiman, R., Banker, G., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+subcellular+mRNA+compartmentation+in+hippocampal+neurons+in+culture.">Development of subcellular mRNA compartmentation in hippocampal neurons in culture.</a> J. Neurosci. 14, 1130-1140 (1994).</li><li>Hengst, U., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+and+translational+regulation+of+mRNA+in+developing+axons.">Function and translational regulation of mRNA in developing axons.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 18, 209-215 (2007).</li><li>Deglincerti, A., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+roles+of+local+translation+from+the+axonal+transcriptome.">Insights into the roles of local translation from the axonal transcriptome.</a> Open Biology. 2, 120079 (2012).</li><li>Baleriola, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonally+synthesized+ATF4+transmits+a+neurodegenerative+signal+across+brain+regions.">Axonally synthesized ATF4 transmits a neurodegenerative signal across brain regions.</a> Cell. 158, 1159-1172 (2014).</li><li>Gumy, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+of+embryonic+and+adult+sensory+axons+reveals+changes+in+mRNA+repertoire+localization.">Transcriptome analysis of embryonic and adult sensory axons reveals changes in mRNA repertoire localization.</a> RNA. 17, 85-98 (2011).</li><li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+mRNA+in+uninjured+and+regenerating+cortical+mammalian+axons.">Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons.</a> J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).</li><li>Yoon, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+translation+of+extranuclear+lamin+B+promotes+axon+maintenance.">Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance.</a> Cell. 148, 752-764 (2012).</li><li>Dubacq, C., Jamet, S., Trembleau, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+developmentally+regulated+local+translation+of+odorant+receptor+mRNAs+in+the+axons+of+olfactory+sensory+neurons.">Evidence for developmentally regulated local translation of odorant receptor mRNAs in the axons of olfactory sensory neurons.</a> J. Neurosci. 29, 10184-10190 (2009).</li><li>Willis, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+Localization+of+transgene+mRNA+in+mature+PNS+and+CNS+neurons.">Axonal Localization of transgene mRNA in mature PNS and CNS neurons.</a> J. Neurosci. 31, 14481-14487 (2011).</li><li>Kar, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+the+axonal+trafficking+of+nuclear-encoded+mitochondrial+mRNA+alters+neuronal+mitochondrial+activity+and+mouse.">Dysregulation of the axonal trafficking of nuclear-encoded mitochondrial mRNA alters neuronal mitochondrial activity and mouse.</a> Dev. Neurobiol. 74, 333-350 (2014).</li><li>Levsky, J. M., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization:+past,+present+and+future.">Fluorescence in situ hybridization: past, present and future.</a> J. Cell Sci. 116, 2833-2838 (2003).</li><li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-mRNA+counting+using+fluorescent+in+situ+hybridization+in+budding+yeast.">Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast.</a> Nat. Protoc. 7, 408-419 (2012).</li><li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat. Methods. 5, 877-879 (2008).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> J. Mol. Diagn. 14, 22-29 (2012).</li><li>Ge, S., Crooks, G. M., McNamara, G., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+immunohistochemistry+and+in+situ+hybridization+analysis+of+mouse+pancreas+using+low-power+antigen-retrieval+technique.">Fluorescent immunohistochemistry and in situ hybridization analysis of mouse pancreas using low-power antigen-retrieval technique.</a> J. Histochem. Cytochem. 54, 843-847 (2006).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-Color+Ultrasensitive+Bright-Field+RNA+In+Situ+Hybridization+with+RNAscope.">Dual-Color Ultrasensitive Bright-Field RNA In Situ Hybridization with RNAscope.</a> Methods Mol. Biol. 1211, 139-149 (2014).</li><li>Kluver, H., Barrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+combined+staining+of+cells+and+fibers+in+the+nervous+system.">A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 12, 400-403 (1953).</li><li>Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory and Practice of Histotechnology. , (1987).</li><li>Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+high-resolution+detection+of+multiple+transcripts+combined+with+localization+of+proteins+in+whole-mount+embryos.">Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos.</a> BMC Biol. 12, 55 (2014).</li><li>Farris, S., Lewandowski, G., Cox, C. D., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+localization+of+arc+mRNA+in+dendrites+involves+activity-+and+translation-dependent+mRNA+degradation.">Selective localization of arc mRNA in dendrites involves activity- and translation-dependent mRNA degradation.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 4481-4493 (2014).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> The Journal of molecular diagnostics : JMD. 14, 22-29 (2012).</li><li>Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory and practice of histotechnology. , (1980).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

En este informe se describe el uso de una tecnología de ISH de alta resolución en la detección de mRNA ATF4 axón localizada. Estos y los anteriores estudios publicados muestran que esta tecnología es compatible con base de anticuerpos de detección de proteínas en los tejidos o incluso embriones enteros 33. Es importante destacar que se ha utilizado recientemente para la detección de Arco mRNA dentro de las dendritas de las neuronas del hipocampo 34. También se puede combi...

Contratación ARNm axonal y la traducción local de los axones permiten responder a estímulos extracelulares de manera temporal y espacialmente aguda 1. La síntesis de proteínas intra-axonal se entiende mejor en el contexto del desarrollo neurológico en el que desempeña un papel crucial en el crecimiento de la conducta cono 2-8, axón pathfinding 9-11 y señalización retrógrada 12,13. Pero mucho menos se sabe acerca de la importancia funcional de la síntesis de proteínas axonal en las neuronas post-desarrollo cuando los niveles de ARNm y ribosomas axonal se reducen considerablemente 14,15. Axones vertebrados maduros durante mucho tiempo han sido considerados como translationally inactivos 16. Sin embargo, estudios recientes indican que la traducción locales se reactiva en los axones maduros en condiciones patológicas. Por ejemplo, un subconjunto de mRNAs es reclutado para regeneración de los axones se requiere lesión del nervio y la síntesis de proteínas intra-axonal para la regeneración correcta de estos axones 17 siguiente. Además, nuestro grupo has demostró que mRNAs específicos son reclutados a los axones después de que se requiere la exposición local a peptídico de la enfermedad de Alzheimer 1-42, y la traducción local de la ATF4 factor de transcripción para propagar los efectos neurodegenerativos de Aß 1-42 de axones a la soma neuronal 18. Finalmente, los análisis de alto rendimiento han revelado que los axones maduros tienen un transcriptoma más complejo y dinámico de lo esperado 18-21, especialmente bajo condiciones patológicas. A la luz de estos estudios, un método altamente sensible y específica para detectar que se necesita ARNm axón localizados en el sistema nervioso adulto. Gran parte del trabajo en el reclutamiento de ARNm y la traducción local en axones maduros se ha realizado en las neuronas cultivadas. Esto es especialmente cierto para los análisis de transcriptoma ya que existen métodos de cultivo especializados que permiten el aislamiento de los axones de el compartimiento somato-dendrítica 18-20. Aunque estos estudios han dado valiosos complementosvuelo en el papel de la traducción local en axones maduros, la cuestión de si las neuronas cultivadas representan fielmente la situación in vivo o si ARNm reclutamiento es una respuesta adaptativa de los axones a condiciones de cultivo sigue abierta. Pocos estudios han proporcionado pruebas de la contratación ARNm para madurar axones in vivo. Por ejemplo, la que codifica para la proteína marcadora olfativo transcripción se ha detectado en los axones en las neuronas sensoriales adultas 22. Un transgén que contiene el 3 &#39;UTR del mRNA β-actina se transporta a los axones en las neuronas del sistema nervioso periférico y central en los ratones y se traduce localmente después de períodos de desarrollo 23. ARNm Lamin b2 se localiza en los axones de la retina en Xenopues laevis renacuajos y su agotamiento afecta mantenimiento axón después del desarrollo axonal 21. Interferencia con el transporte axonal de la codificación de ARNm para citocromo C oxidasa IV altera el comportamiento del ratón 24. Por último, ATF4 ARNm se encuentra en un adultoXON de ratones y cerebros humanos en el contexto de Aß 1-42 inducida por la neurodegeneración 18. Análisis del transcriptoma alto rendimiento han demostrado ser útiles para identificar perfiles de mRNA en los axones aislados in vitro, pero tienen limitaciones para los estudios in vivo, ya que en los tejidos enteros axones no se encuentran en forma aislada, sino entremezclados con cuerpos celulares neuronales, células gliales y otros tipos de células. Por lo tanto, este tipo de análisis tienen que ser combinado con técnicas de imagen que confirman la localización subcelular de mRNAs. ARN hibridación in situ (ISH ARN) permite la detección y visualización de las secuencias de ARN específicos en células y tejidos. Sin embargo, los ensayos originales ARN ISH eran adecuadas sólo para la identificación de los muy abundantes ARN 25, que rara vez es el caso de los ARNm axón localizadas. Desde hace décadas el aumento de los esfuerzos se han puesto en el desarrollo de nuevas tecnologías que permitan la detección de ARNm en el nivel de una sola molécula <sup&gt; 25,26. Por ejemplo, Singer y sus colegas han desarrollado sondas ISH para detectar ARNm en las células individuales, que consiste en 5 no se solapan etiqueta fluorescente 50-meros (para más detalles, consulte 27). La principal diferencia entre las técnicas antes mencionadas y el que aquí se describe es que el más tarde utiliza 20-Z estructura doble (no lineal) sondas que normalmente se dirigen a ~ 1 kb de la región de ARN de interés asegurar la especificidad y bajos niveles de fondo. Las sondas se hibridan con secuencias de preamplificador y amplificador que finalmente están marcados con fluorescencia o conjugarse con las enzimas que permiten reacciones cromogénicos. Estos pasos de amplificación mejorar la relación señal-ruido en comparación con otras tecnologías de ISH 28. Aquí se describen dos protocolos que utilizan RNAscope combinado ya sea con inmunocitoquímica fluorescencia o con colorantes histológicos que permiten counterstaining axonal. Ambos protocolos son apropiados para visualizar la localización axonal de ATF4 mRNA en mo adultosusar y cerebros humanos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>custom probe targeting residues 20-1381 of the mouse Atf4 mRNA (NM_009716)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>-</td>
			<td>probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>custom probe targeting residues 15-1256 of the human ATF4 mRNA (NM_001675.2)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>-</td>
			<td>probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>negative control probe-DapB</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td align="right">310043</td>
			<td>probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>positive control probe-mouse Polr2A (optional)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td align="right">312471</td>
			<td>probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>positive control probe-human PPIB (optional)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td align="right">313901</td>
			<td>probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit (for fluorescence detection)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td align="right">320850</td>
			<td>In situ hybridization kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope 2.0 HD Reagent Kit - BROWN (for chromogenic detection)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td align="right">310035</td>
			<td>In situ hybridization kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat polyclonal anti-ChAT antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB144P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luxol Fast Blue-Cresyl Echt Violet Stain Kit</td>
			<td>American MasterTech</td>
			<td>KTLFB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clearify clearing agent (xylene substitute)</td>
			<td>American MasterTech</td>
			<td>CACLEGAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold mounting&#160; medium with DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX mounting medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right">6522</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of axonally localized mrnas in brain sections using high-resolution in situ hybridization

ARNm se localizan con frecuencia a los axones de vertebrados y de su traducción locales se requiere para pathfinding axón o ramificación durante el desarrollo y para el mantenimiento, la reparación o la neurodegeneración en períodos postdevelopmental. Análisis de alto rendimiento han revelado recientemente que los axones tienen un transcriptoma más dinámico y complejo de lo esperado. Estos análisis, sin embargo se han realizado principalmente en neuronas cultivadas, donde los axones pueden ser aislados de los compartimentos somato-dendrítica. Es prácticamente imposible de conseguir tal aislamiento en tejidos enteros en vivo. Por lo tanto, con el fin de verificar el reclutamiento de mRNAs y su relevancia funcional en un animal entero, los análisis del transcriptoma idealmente deben ser combinados con técnicas que permiten la visualización de mRNAs in situ. Recientemente, las tecnologías ISH novedosos que detectan ARN a nivel de una sola molécula se han desarrollado. Esto es especialmente importante cuando se analiza la localización subcelular de mRNA, ARN ya localizados se encuentran típicamente en niveles bajos. Aquí se describen dos protocolos para la detección de mRNAs axón localizadas utilizando un nuevo ultrasensible tecnología de ARN ISH. Hemos combinado RNAscope ISH con contratinción axonal mediante inmunohistoquímica de fluorescencia o colorantes histológicos para verificar el reclutamiento de ATF4 mRNA a los axones in vivo en el ratón madura y los cerebros humanos.

Un breve resumen de los procedimientos descritos anteriormente se muestra en la Figura 1. Detección óptima de ATF4 ARNm gránulos en los axones colinérgicos usando desenmascaramiento inducida por calor Al evaluar la localización axonal de los ARNm, es fundamental para poder identificar a los axones y ser capaz de visualizar los ARN abundantes bajas. La tecnología de ARN ISH descrito aquí permite la detección de ARN a una resoluci?...

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Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

La detección de ARNm axón localizado en las secciones cerebrales Uso de alta resolución<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

detection-axonally-localized-mrnas-brain-sections-using-high

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

11.7K vistas.  Columbia University. RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

Video: Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh frozen brain sections. Our group has successfully used this approach to study gene co-regulation. More specifically, we have used this dFISH method to explore the anatomical organization, neurochemical properties, and the impact of sensory experience in central sensory circuits, at single cell resolution. This protocol has been validated in brain tissue from mice, rats and songbirds but is expected to be easily adaptable to other vertebrate species, as well as to an array of non-neural tissues. In this film we provide a detailed demonstration of the main steps of this procedure.

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

This protocol involves a non-radioactive in-situ hybridization procedure that enables the simultaneous identification of two transcript species, at a single cell resolution, in thin sections of the vertebrate brain.

Doble fluorescencia In situ La hibridación en las secciones del cerebro fresco

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Investigación

Neurociencias

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal. Such analysis of two or more genes needs to be complemented with in situ hybridization of other genes, or immunohistochemistry of their proteins, both in whole mounted developing organs or sections for detailed resolution of the cellular and tissue expression alterations. Combining multiple gene alterations requires the use of cre or flipase to conditionally delete genes and avoid embryonic lethality. Required breeding schemes dramatically enhance effort and cost proportional to the number of genes mutated, with an outcome of very few animals with the full repertoire of genetic modifications desired. Amortizing the vast amount of effort and time to obtain these few precious specimens that are carrying multiple mutations necessitates tissue optimization. Moreover, investigating a single animal with multiple techniques makes it easier to correlate gene deletion defects with expression profiles. We have developed a technique to obtain a more thorough analysis of a given animal; with the ability to analyze several different histologically recognizable structures as well as gene and protein expression all from the same specimen in both whole mounted organs and sections. Although mice have been utilized to demonstrate the effectiveness of this technique it can be applied to a wide array of animals. To do this we combine lipophilic dye tracing, whole mount in situ hybridization, immunohistochemistry, and histology to extract the maximal possible amount of data.

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

A combination of different techniques to maximize data collection from mouse tissue is presented.

La combinación de colorantes lipofílicos, In situ</emHibridación>, inmunohistoquímica y la histología

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are characteristic to neurons in both normal and diseased brain. Towards this, a great deal of effort has been placed on building high-resolution neuroanatomical maps1-3. With the expansion of molecular genetics and advances in light microscopy has come the ability to query not only neuronal morphologies, but also the molecular and cellular makeup of individual neurons and their associated networks4. Major advances in the ability to mark and manipulate neurons through transgenic and gene targeting technologies in the rodent now allow investigators to 'program' neuronal subsets at will5-6. Arguably, one of the most influential contributions to contemporary neuroscience has been the discovery and cloning of genes encoding fluorescent proteins (FPs) in marine invertebrates7-8, alongside their subsequent engineering to yield an ever-expanding toolbox of vital reporters9. Exploiting cell type-specific promoter activity to drive targeted FP expression in discrete neuronal populations now affords neuroanatomical investigation with genetic precision.
Engineering FP expression in neurons has vastly improved our understanding of brain structure and function. However, imaging individual neurons and their associated networks in deep brain tissues, or in three dimensions, has remained a challenge. Due to high lipid content, nervous tissue is rather opaque and exhibits auto fluorescence. These inherent biophysical properties make it difficult to visualize and image fluorescently labelled neurons at high resolution using standard epifluorescent or confocal microscopy beyond depths of tens of microns. To circumvent this challenge investigators often employ serial thin-section imaging and reconstruction methods10, or 2-photon laser scanning microscopy11. Current drawbacks to these approaches are the associated labor-intensive tissue preparation, or cost-prohibitive instrumentation respectively.
Here, we present a relatively rapid and simple method to visualize fluorescently labelled cells in fixed semi-thick mouse brain slices by optical clearing and imaging. In the attached protocol we describe the methods of: 1) fixing brain tissue in situ via intracardial perfusion, 2) dissection and removal of whole brain, 3) stationary brain embedding in agarose, 4) precision semi-thick slice preparation using new vibratome instrumentation, 5) clearing brain tissue through a glycerol gradient, and 6) mounting on glass slides for light microscopy and z-stack reconstruction (Figure 1).
For preparing brain slices we implemented a relatively new piece of instrumentation called the 'Compresstome' VF-200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html). This instrument is a semi-automated microtome equipped with a motorized advance and blade vibration system with features similar in function to other vibratomes. Unlike other vibratomes, the tissue to be sliced is mounted in an agarose plug within a stainless steel cylinder. The tissue is extruded at desired thicknesses from the cylinder, and cut by the forward advancing vibrating blade. The agarose plug/cylinder system allows for reproducible tissue mounting, alignment, and precision cutting. In our hands, the 'Compresstome' yields high quality tissue slices for electrophysiology, immunohistochemistry, and direct fixed-tissue mounting and imaging. Combined with optical clearing, here we demonstrate the preparation of semi-thick fixed brain slices for high-resolution fluorescent imaging.

Here we describe a rapid and simple method to image fluorescently labeled cells in semi-thick brain slices. By fixing, slicing, and optically clearing brain tissue we describe how standard epifluorescent or confocal imaging can be used to visualize individual cells and neuronal networks within intact nervous tissue.

Un enfoque rápido para imágenes de fluorescencia de alta resolución en rodajas de cerebro semi-gruesa

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge in the field of virology; in particular for nuclear-replicating persistent DNA viruses that involve animal models for their study. Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. Latent virus serves as reservoir, from which it reactivates and induces a new herpetic episode. The cell biology of HSV-1 latency remains poorly understood, in part due to the lack of methods to detect HSV-1 genomes in situ in animal models. We describe a DNA-fluorescent in situ hybridization (FISH) approach efficiently detecting low-copy viral genomes within sections of neuronal tissues from infected animal models. The method relies on heat-based antigen unmasking, and directly labeled home-made DNA probes, or commercially available probes. We developed a triple staining approach, combining DNA-FISH with RNA-FISH&#160;and immunofluorescence, using peroxidase based signal amplification to accommodate each staining requirement. A major improvement is the ability to obtain, within 10 &#181;m tissue sections, low-background signals that can be imaged at high resolution by confocal microscopy and wide-field conventional epifluorescence. Additionally, the triple staining worked with a wide range of antibodies directed against cellular and viral proteins. The complete protocol takes 2.5 days to accommodate antibody and probe penetration within the tissue.

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

We established a fluorescent in situ hybridization protocol for the detection of a persistent DNA virus genome within tissue sections of animal models. This protocol enables studying infection process by codetection of the viral genome, its RNA products, and viral or cellular proteins within single cells.

Detección del genoma y transcripciones de un virus ADN persistente en los tejidos neuronales por Fluorescente In situ La hibridación Combinado con inmunotinción

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several weeks, and this is accompanied by short distance regeneration (a few mm) of propriospinal axons and spinal-projecting axons from the brainstem. Among the 36 large identifiable spinal-projecting neurons, some are good regenerators and others are bad regenerators. These neurons can most easily be identified in wholemount CNS preparations. In order to understand the neuron-intrinsic mechanisms that favor or inhibit axon regeneration after injury in the vertebrates CNS, we determine differences in gene expression between the good and bad regenerators, and how expression is influenced by spinal cord transection. This paper illustrates the techniques for housing larval and recently transformed adult sea lampreys in fresh water tanks, producing complete spinal cord transections under microscopic vision, and preparing brain and spinal cord wholemounts for in situ hybridization. Briefly, animals are kept at 16&#160;&#176;C and anesthetized in 1% Benzocaine in lamprey Ringer. The spinal cord is transected with iridectomy scissors via a dorsal approach and the animal is allowed to recover in fresh water tanks at 23 &#176;C. For in situ hybridization, animals are reanesthetized and the brain and cord removed via a dorsal approach.

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Lampreys recover locomotion after a complete spinal cord injury. However, some spinal-projecting neurons are good regenerators and others are not. This paper illustrates the techniques for housing sea lamprey larvae (and recently transformed adults), producing complete spinal cord transections and preparing wholemount brains and spinal cords for in situ hybridization.

Lesiones de la Médula Espinal completo y Protocolo Disección del cerebro por Wholemount posterior<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación en larvas lamprea de mar

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has been heavily studied. While many imaging studies treat the hippocampus as a single unitary neuroanatomical structure, it is, in fact, composed of several subfields that have a complex three-dimensional geometry. As such, it is known that these subfields perform specialized functions and are differentially affected through the course of different disease states. Magnetic resonance (MR) imaging can be used as a powerful tool to interrogate the morphology of the hippocampus and its subfields. Many groups use advanced imaging software and hardware (&#62;3T) to image the subfields; however this type of technology may not be readily available in most research and clinical imaging centers. To address this need, this manuscript provides a detailed step-by-step protocol for segmenting the full anterior-posterior length of the hippocampus and its subfields: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus (DG), strata radiatum/lacunosum/moleculare (SR/SL/SM), and subiculum. This protocol has been applied to five subjects (3F, 2M; age 29-57, avg. 37). Protocol reliability is assessed by resegmenting either the right or left hippocampus of each subject and computing the overlap using the Dice&#39;s kappa metric. Mean Dice&#39;s kappa (range) across the five subjects are: whole hippocampus, 0.91 (0.90-0.92); CA1, 0.78 (0.77-0.79); CA2/CA3, 0.64 (0.56-0.73); CA4/dentate gyrus, 0.83 (0.81-0.85); strata radiatum/lacunosum/moleculare, 0.71 (0.68-0.73); and subiculum 0.75 (0.72-0.78). The segmentation protocol presented here provides other laboratories with a reliable method to study the hippocampus and hippocampal subfields in vivo using commonly available MR tools.

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The goal of this manuscript is to study the hippocampus and hippocampal subfields using MRI. The manuscript describes a protocol for segmenting the hippocampus and five hippocampal substructures: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus, strata radiatum/lacunosum/moleculare, and subiculum.

Alta resolución<em&gt; En Vivo</em&gt; Protocolo Segmentación Manual for Human hipocampo subcampos Usando 3T Imágenes por Resonancia Magnética

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin (5-hydroxytryptamine; 5-HT) syndrome. This hypothesis can be tested using in situ hybridization to detect the serotonin 5-HT2A receptor gene htr2a. In the past, such procedures, utilizing radioactive riboprobe, were difficult because of the complicated workflow that needs several days to perform and the added difficulty that the technique required the use of fresh frozen tissues maintained in an RNase-free environment. Recently, the development of short oligonucleotide probes has simplified in situ hybridization procedures and allowed the use of paraformaldehyde-prefixed brain sections, which are more widely available in laboratories. Here, we describe a detailed protocol using non-radioactive oligonucleotide probes on the prefixed brain tissues. Hybridization probes used for this study include dapB (a bacterial gene coding for dihydrodipicolinate reductase), ppiB (a housekeeping gene coding for peptidylprolyl isomerase B), and htr2a (a serotonin gene coding for 5-HT2A receptors). This method is relatively simply, cheap, reproducible and requires less than two days to complete.

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

This protocol describes a rapid and simplified in situ hybridization method ideal forparaformaldehyde-prefixed brain, thus reducing the need for prolonged complex steps while using fresh frozen tissues. The method is validated using the identification of the serotonin 5-HT2A receptor gene htr2a in rats.

Rápido<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación usando sondas de oligonucleótidos en Cerebro paraformaldehído-prefijo de ratas con síndrome de serotonina

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin ...

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can be hampered by the lack of specific primary or secondary antibodies for immunostaining. Here we describe a protocol to detect the expression of three different genes in the same brain section using double fluorescence in situ hybridization with two gene-specific probes followed by immunostaining with an antibody of high specificity directed against the protein encoded by a third gene. The Aspartoacyclase (ASPA) gene, mutations of which can lead to a rare human white matter disease - Canavan disease - is thought to be expressed in oligodendrocytes and microglia but not in astrocytes and neurons. However, the precise expression pattern of ASPA in the brain has yet to be established. This protocol has allowed us to determine that ASPA is expressed in a subset of mature oligodendrocytes and it can be generally applied to a wide range of gene expression pattern studies.

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.

La combinación de doble fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación con Immunolabelling para la detección de la expresión de tres genes en las secciones de cerebro de ratón

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in regulating neuronal growth and development. However, the mechanisms underlying Drd1&#945; receptor abnormalities mediating behavioral responses and modulating working memory function are still unclear. Using a novel RNA in situ hybridization assay, the current study identified dopamine Drd1&#945; receptor and tyrosine hydroxylase (TH) RNA expression from DA-related circuitry in the nucleus accumbens (NAc) area and substantia nigra region (SNR), respectively. Drd1&#945; expression in the NAc shows a &#34;discrete dot&#34; staining pattern. Clear sex differences in Drd1&#945; expression were observed. In contrast, TH shows a &#34;clustered&#34; staining pattern. Regarding TH expression, female rats displayed a higher signal expression per cell relative to male animals. The methods presented here provide a novel in situ hybridization technique for investigating changes in dopamine system dysfunction during the progression of central nervous system diseases.

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

Identification of dopamine D1-alpha receptor in the nucleus accumbens is critical for clarifying D1 receptor dysfunction during a central nervous system disease. We performed a novel RNA in situ hybridization assay to visualize single RNA molecules in a specific brain area.

Identificación del Receptor de dopamina D1-alfa en roedores núcleo Accumbens por una innovador ARN In Situ la tecnología de detección

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in ...

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and study the distribution, tropism, and abundance of pathogens inside of organ tissues provides pivotal data on disease development and progression. Using conventional microscopy methods, immunolabeling is mostly restricted to thin sections obtained from paraffin-embedded or frozen samples. However, the limited 2D image plane of these thin sections may lead to the loss of crucial information on the complex structure of an infected organ and the cellular context of the infection. Modern multicolor, immunostaining-compatible tissue clearing techniques now provide a relatively fast and inexpensive way to study high-volume 3D image stacks of virus-infected organ tissue. By exposing the tissue to organic solvents, it becomes optically transparent. This matches the sample&#8217;s refractive indices and eventually leads to a significant reduction of light scattering. Thus, in combination with long free working distance objectives, large tissue sections up to 1 mm in size can be imaged by conventional confocal laser scanning microscopy (CLSM) at high resolution. Here, we describe a protocol to apply deep-tissue imaging after tissue clearing to visualize rabies virus distribution in infected brains in order to study topics like virus pathogenesis, spread, tropism, and neuroinvasion.

Novel, immunostaining-compatible tissue clearing techniques like the ultimate 3D imaging of solvent-cleared organs allow the 3D visualization of rabies virus brain infection and its complex cellular environment. Thick, antibody-labeled brain tissue slices are made optically transparent to increase imaging depth and to enable 3D analysis by confocal laser scanning microscopy.

Imágenes 3D de alta resolución de la infección por el virus de la rabia en el tejido cerebral con disolventes

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...