Este protocolo combina la hibridación in situ de ARNscope de fluorescencia y la inmunohistoquímica utilizando preparaciones cerebrales frescas congeladas o fijas. Esta técnica permite flexibilidad al demostrar una combinación de métodos de hibridación in situ e inmunohistoquímica altamente sensibles para la visualización espacial de dianas de ARN y proteínas en la misma muestra de tejido. Este método es aplicable para el marcaje múltiple en la sección de tejido cerebral, lo que ayuda a la investigación de la organización espacial y la importancia funcional del ARNm y las proteínas dentro de poblaciones neuronales heterogéneas en neurociencia.
Este protocolo se centra principalmente en los pasos de procesamiento para el tejido fresco congelado y el tejido fijado con paraformaldehído. Para comenzar a seccionar el tejido cerebral recién congelado, fíjelo al mandril de criostato preenfriado y corte secciones coronales de 14 micrómetros de grosor. Monte la sección en un portaobjetos de microscopía de vidrio cargado.
Transfiera la diapositiva montada a una caja de diapositivas. A continuación, transporta la caja al congelador a menos 80 grados centígrados sobre hielo seco. Para la fijación de tejidos, filtre la solución de paraformaldehído preparada.
Enfríelo a 4 grados centígrados. Lleve el portaobjetos montado del congelador a menos 80 grados Celsius sobre hielo seco e sumérjalo inmediatamente en la solución de paraformaldehído preenfriada durante 15 minutos, realice la deshidratación del tejido fresco congelado para asegurarse de que el portaobjetos de vidrio esté completamente seco. Después de extraer el cerebro de un soporte fijo de profusión transcárdica, utilizando un micrótomo vibratorio, corte secciones de tejido de 30 micrómetros de grosor.
Guarde las secciones cortadas en una solución crioprotectora. El día del ensayo FISH, transfiera la sección flotante libre a una placa de cultivo celular de 12 pocillos que contenga 0,1 PBS molar y agítela a 90 a 100 RPM en un agitador de plataforma giratoria para eliminar el crioprotector. Luego, con un pincel, monte la sección plana en un portaobjetos de microscopía de vidrio para evitar que se desprenda durante los lavados y seque al aire durante al menos dos horas.
Con un bolígrafo de barrera hidrofóbica, dibuje una barrera hidrofóbica alrededor de la sección para contener los reactivos FISH. Después del preprocesamiento, el tejido se incuba en una solución de proteasa y se hibrida con sondas de ARNscope durante dos horas según las pautas del fabricante. A continuación, se realizan pasos secuenciales de amplificación e inmunohistoquímica de fluorescencia.
Comience preparando una cámara protegida de la luz humidificada para incubar los portaobjetos. En un baño de agua, caliente el tampón de lavado 50X y las sondas a 40 grados centígrados durante 10 minutos. Una vez que se enfríe a temperatura ambiente, prepare un litro de tampón de lavado 1X a partir de la concentración de caldo 50X.
Prepare la mezcla de la sonda como se describe en el manuscrito del texto. Para el tratamiento con proteinasa, agregue proteinasa 3 a la sección de tejido e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos. Para eliminar la proteinasa, sumerja suavemente el portaobjetos en PBS 0,1 molar a temperatura ambiente, evitando que la sección se desprenda.
Para la hibridación, agregue la mezcla de la sonda a la sección de tejido. Colóquelo en la cámara precalentada humidificada. Luego incubarlo durante dos horas a 40 grados centígrados.
Enjuague la sección de pañuelos con tampón de lavado dos veces durante dos minutos. Para la amplificación de la señal, con un frasco gotero, agregue una solución de amplificación para cubrir la sección de tejido e incubar como se describe en el texto. Agregue la solución de bloqueo a la sección de tejido e incube durante una hora a temperatura ambiente para evitar la unión inespecífica.
Mueva el portaobjetos para eliminar el exceso de tampón de bloqueo después de la incubación. Ahora, incuba la sección con anticuerpos primarios durante la noche a 4 grados centígrados. Al día siguiente, lave el portaobjetos tres veces con 1X TBS.
Añadir el anticuerpo secundario e incubar las secciones durante dos horas a temperatura ambiente. Examine el portaobjetos bajo un microscopio de epifluorescencia equipado con una cámara. Adquiera imágenes representativas con un aumento de 20 veces y guárdelas como archivos TIF.
En el presente estudio, la calidad del tejido, la integridad y la ausencia de contaminación bacteriana fueron confirmadas por la ausencia de marcaje DAPI. El marcaje de las sondas de control positivo dirigidas a la ubiquitina C, la peptidilprolil isomerasa B y el ARNm de la ARN polimerasa IIA confirmó la integridad del ARN. En preparaciones frescas congeladas para distinguir las neuronas positivas al ARNm de GalR1 dentro del NTS, se utilizaron marcadores neuroquímicos adicionales.
El transportador vesicular unido a la membrana estaba claramente marcado. Por el contrario, las proteínas citoplasmáticas como la tirosina hidroxilasa y la GFP expresadas bajo el control del promotor PHOX2B se observaron débilmente y se describieron como floculantes, ya que carecen de un contorno claro. El marcaje de la sonda GalR1 FISH del ARNm citoplasmático de GalR1 fue puntuado y se observó claramente.
Para confirmar que la calidad inmunohistoquímica depende de la localización subcelular de las proteínas, se marcaron diferentes proteínas nucleares y citoplasmáticas en paralelo con FISH en las mismas secciones de tejido. La GFP citoplasmática PHOX2B tenía un aspecto floculante. Mientras que la señal nuclear de la proteína PHOX2B era clara, lo que confirmaba un inmunomarcaje de mayor calidad cuando se combinaba con FISH.
Cuando se realizó en secciones fijas congeladas en combinación con FISH, la inmunohistoquímica fue confiable independientemente de la localización subcelular. Las neuronas positivas para el ARNm de GlyT2 se localizaron ventralmente al SNT y no dentro del SNT. Las neuronas positivas para el ARNm de GlyT2 y las positivas para el ARNm de PHOX2B no se colocalizaron.
Una subpoblación de neuronas NTS positivas para ARNm de PHOX2B era tirosina hidroxilasa inmunorreactiva, y ninguna contenía ARNm de GlyT2. El ARNoscopio permite la visualización y el análisis de la distribución del ARN con una resolución de una sola molécula en células y tejidos. Potencia la investigación de nuevas especies de ARN, mecanismos de enfermedades, patrones de expresión génica, diversidad de neuronas e interacciones celulares.
