We thank Sergio G&#243;mez-Medina for excellent technical support with mouse experiments. This work was supported by funds from the Leibniz Association and the Leibniz Center of Infection. A.L. is a recipient of a pre-doctoral fellowship from the Leibniz Graduate School.

Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo a los protocolos aprobados y siguiendo las directrices de la ley alemana de protección de los animales. Todo el personal que llevan a cabo experimentos con animales pasaron los programas de capacitación de acuerdo a la categoría B o C de la Federación de Asociaciones Europeas de animales de laboratorio de ciencias. 1. Generación de recombinante viva atenuada Vacunas contra la Influenza por genética inversa NOTA: El protocolo detallado para la generación de virus de la gripe recombinantes mediante genética inversa ha sido descrito por estudios anteriores 5 y está fuera del alcance de este informe. En pocas palabras, el rescate de las vacunas antigripales adaptadas al frío (CAV) se lleva a cabo en un gabinete de seguridad biológica de clase II bajo nivel de bioseguridad 2 (BSL2) contención, e implica los pasos que se detallan a continuación. El protocolo de transfección y la infección se deduce que de Martínez-Sobrido et al. 5. <ol><li> Generar una gripe adaptada al frío reassortantvacuna utilizando como fondo la cepa adaptada al frío A / Ann Arbor / 6/60 (H2N2), así como la hemaglutinina (HA) y neuraminidasa un modificado (NA) de la / PR / 8/34 (H1N1) cepa A ( Figura 1A). La modificación en el gen de NA consiste en una sustitución basada en PCR de una secuencia conservada en el tallo de la proteína (residuos 65 a 72) por una secuencia de ADNc corto que codifica la ovoalbúmina de pollo (OVA) péptido SIINFEKL -derivado (Figura 1B). El péptido SIINFEKL es un péptido altamente inmunodominante en el contexto de la H-2b MHC de clase de respuesta de ratones C57BL / 6 12 I-restringido. </li><li> Placa 10 6 293T células por pocillo en placas de 6 pocillos utilizando DMEM 10% de suero bovino fetal (FBS) suplementado con 1% de penicilina / estreptomicina (P / E). </li><li> Preparar la mezcla de transfección del plásmido: Añadir 1 g de cada uno de los plásmidos que codifican los ADNc de PB2, PB1, PA, NP, M, NS de la gripe A / Ann Arbor / 6/60 cepa y 1 g de los plásmidos que codifican para la NA -SIINFEKL yHA de la gripe A / PR / 8/34. Agregar pre-calentado OptiMEM (15 l para un volumen final de 100 l / pocillo). </li><li> Incubar la mezcla de transfección durante 30 min a TA. </li><li> Añadir 100 l de mezcla de transfección / pocillo y se incuba durante 16 horas a 37 ° C y 5% de CO 2. </li><li> Cambie medio celular por DMEM 0,3% de BSA 1% P / E a 33 ° C y 5% de CO 2 durante 5 horas. </li><li> Añadir 10 6 influenza células MDCK permisivas en DMSO que contiene 1 mg / ml de tripsina de páncreas bovino tratado con L-1-tosilamida-2-feniletil clorometil cetona (TPCK-tripsina). Mantener los co-cultivos 293T-MDCK de 2 - 3 días a 33 ° C y 5% de CO 2. </li><li> Recoger los sobrenadantes de células MDCK-293T co-cultivos y clara por centrifugación a 260 xg durante 5 min. </li><li> Inocular 9-10 días de edad huevos embrionados de pollo en condiciones estériles. Para ello, hacer un agujero en la parte superior de la cáscara del huevo, como se indica por Martínez-Sobrido et al. 5. </li><li> Cubra el ingenio de la cáscara de huevoh derritió la cera utilizando un hisopo de algodón e incubar los huevos de gallina inoculados durante 3 días a 33 ° C. </li><li> Recoger el líquido alantoideo de los huevos embrionados infectados: Lávese las cáscaras de huevo con 70% de etanol. Abra el huevo con una grieta muy suavemente en la parte superior y retirar la membrana alantoideo usando pinzas estériles. Utilice una pipeta de 10 ml para recoger la mayor cantidad de líquido posible (normalmente 6-10 ml). Centrifugar a 260 xg durante 10 min a 4 ° C y transferir el fluido alantoideo aclarado a tubos nuevos. </li></ol> Inmunidad 2. Seguimiento de Vacunas específicas <ol><li> Seguimiento de las células dendríticas péptido-cojinete (PED) <ol><li> Para la vacunación de ratón, anestesiar los ratones con 5% de isoflurano en oxígeno utilizando un vaporizador de precisión. Usar una pipeta de 200 l para administrar 50 l de PBS que contienen 10 3 unidades formadoras de placa (pfu) de la vacuna que expresa el péptido SIINFEKL a través de gotitas directamente a las fosas nasales del ratón. </li><li> Tres días después de la vacunación, euthanizratones E a través de la anestesia con isoflurano seguido por dislocación cervical. </li><li> Levante la piel del ratón en la línea media justo debajo de la caja torácica con pinzas y cortar una pequeña incisión a través de la piel con unas tijeras. Desde el punto de incisión, hacen unos 3-5 cm de largo cortar a través de la piel hacia la cabeza y la cola, a continuación, dos incisiones 2 cm de la línea media lateralmente desde cada extremo. Pele la piel para revelar las cavidades peritoneal y torácica. Corte cuidadosamente a través de las membranas que rodean el peritoneo para exponer el tórax. </li><li> Para acceder a la mediastino cortó el diafragma y la parte inferior de la caja torácica. Encontrar y eliminar 2 ganglios linfáticos mediastínicos (MLN), ligeramente dorsal y lateralmente adyacente a la timo, medialmente adyacente a la arteria braquiocefálica, cerca del lado ventral de la tráquea. </li><li> Para cosechar los MLNs utilizan pinzas curvas. Coloque fórceps debajo de los ganglios linfáticos y tirar de ellos suavemente. Coloca los ganglios linfáticos en una placa de 6 pocillos que contienen 1 ml de DMEM y quitar cualquier connecticinco o tejido graso que rodea el nodo. <ol><li> Se burlan de cada muestra a fondo con dos agujas 26 G unidas a 1 ml jeringas. Para burlarse de los ganglios linfáticos, mantenga hacia abajo con una aguja mientras que romper abierto el ganglio linfático con la otra aguja. Cuando esto se hace correctamente, las células concentradas de ruptura del ganglio linfático se observan fácilmente en los medios. Pasar todo el material de tejido a través de un filtro de nylon de 70 micras para obtener suspensiones de células individuales. </li></ol></li><li> Suspensiones de células individuales Centrifugar durante 10 min a 260 xg en una centrífuga refrigerada. Resuspender el pellet de células en 2 ml de glóbulos rojos lisis (RbCl) Buffer para lisar las células rojas de la sangre. Permitir la lisis de proceder durante 3 min a RT. </li><li> Neutralizar tampón rbcL a través de centrifugación y resuspensión de células en 2 ml de PBS enfriado en hielo. </li><li> Células de la placa en placas de 96 pocillos en forma de U a una concentración de 10 7 células / ml en un volumen final de 100 microlitros. </li><li> Para el análisis de citometría de flujo, teléfonos bloque de receptores Fc usando1 g de anticuerpos anti-ratón CD16 / CD32 por 10 6 células para 15 min en hielo. </li><li> Placas de centrífuga y descartan los sobrenadantes por placa parpadeo. Incubar los pocillos individuales con la combinación anticuerpo de superficie de la elección. Típicamente, para la detección de células dendríticas en los ganglios linfáticos, el cóctel de anticuerpos debe incluir: 0,25 g de anti-CD11c, 0,25 g de CD11b, 0,5 g de MHC de clase II, 0,25 g de CD103 y 0,15 g de CD8a en un volumen final de 100 l. </li><li> Para gating negativo, añadir 0,25 g de anti-CD3, CD19, NK1.1 o un cóctel linaje (Figura 2A). Estrategias de compuerta alternativos, así como los protocolos de indemnización adecuada de múltiples tintes fluorescentes se pueden encontrar en la página web del Proyecto Genoma inmunológica. Además de los marcadores de superficie de elección, añadir 1 g de un anticuerpo contra H-2K b unido a SIINFEKL al cóctel. Este anticuerpo disponible comercialmente permitirá la visualización de países en desarrollo in el que el péptido SIINFEKL se une a la superficie de MHC de clase I. </li><li> Se incuban las células con anticuerpos de superficie durante 30 min en hielo. Proteja la placa de la luz. Placas centrifugar a 260 xg durante 5 minutos y lavar con 2 ml de PBS dos veces. Transferir las células a tubos de citometría de flujo para el análisis. </li></ol></li><li> Evaluación de la vacuna específica de la proliferación de células T <ol><li> Obtener células T del donante disponible comercialmente a partir de ratones transgénicos TCR (ratones OT-I) (C57BL / 6-Tg (TCR aTcrb) 1100Mjb / J) en la que todas las células T CD8 generados son específicos para el péptido SIINFEKL. La eutanasia a los ratones por la anestesia con isoflurano seguido por dislocación cervical. Cosecha bazo mediante la realización de una incisión en la cavidad abdominal. Coloque bazo / s en 2 ml de DMEM / bazo y eliminar el tejido conectivo y grasa. </li><li> Generar suspensiones de células individuales de bazo tras el procedimiento descrito en 2.1.2 y 2.1.3. </li><li> Para enriquecer aún más la suspensión de células individuales en las células T, aplicar protocolos de separación de cuentas magnéticautilizando cualquiera de los procedimientos de selección positivos o negativos 12. Para diferenciar donante de células receptoras, utilice congenic ratones modo que por ejemplo los ratones receptores expresan el marcador leucocitario CD45.1 mientras que las células T del donante expresan CD45.2 12. </li><li> Para etiquetar las células T, se incuban en 1 ml de PBS que contenía 5 mM de carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE) en una densidad óptima de la célula de 5 x 10 6 células / ml. Se incuban las células durante 20 min a 37 ° C protegido de la exposición a la luz. Después de la incubación, centrifugar las células a 260 xg durante 5 min, el sobrenadante de descarte, y Resuspender las células en 3 ml de suero fetal bovino (FBS) para neutralizar CFSE. </li><li> Centrifugar las células a 260 xg durante 10 min y resuspender en el volumen adecuado de PBS de manera que 100 l de solución contiene 2 x 10 6 células. Infundir congenic ratones receptores con 2 x 10 6 células / ratón a través de la inyección seno retro-orbital 13. </li><li> La eutanasia a los ratones receptores en los días 3, 4 y 5 post-vacunación usando anestesia con isoflurano, seguido por dislocación cervical. Cosecha de los ganglios linfáticos del mediastino y preparar suspensiones de células individuales para citometría de flujo como se indica en 2.1.2-2.1.5. </li><li> Identificar las células del donante por tinción de las suspensiones de células individuales en 100 l de un cóctel de anticuerpos que contiene: 0,25 g de anti-CD3 de ratón, anticuerpos CD4 y CD8; 0,5 g de anti-ratón CD45.1 o anticuerpo CD45.2 (dependiendo del fenotipo de las células del donante). Deje el canal FL-1 del citómetro de flujo abierto (FITC) para determinar el perfil de dilución de CFSE 12 (Figura 2B). </li></ol></li></ol> 3. Los ratones quiméricos para diseccionar Respuestas vacuna-Gene específica NOTA: La generación de quimeras de médula ósea competitivos utilizando modelos de ratón con sede en DTR permite la discriminación de las funciones de las células específicas durante la respuesta inmune a las vacunas. Aquí mostramos una estrategia adicional por el cual combinación de DTR-expresión de los donantes cells con células de ratones knockout permisos para estudiar las funciones específicas de genes durante la inmunidad en compartimentos celulares específicos. En el ejemplo que generamos ratones con deleción específica de Toll-like receptor 3 (TLR3) en Langerin + CD103 + DC. <ol><li> Preparación de células de donante de médula ósea <ol><li> Trabajar bajo un gabinete de bioseguridad de nivel II. Evite la contaminación mediante el uso de instrumentos autoclave exclusivamente. </li><li> Para generar ratones quiméricos de la médula ósea, utilizar CD45.1 + congenic C57BL / 6 ratones hembra como receptores, y el uso de TLR3 - / -, Langerin-DTR / EGFP, o peso de los ratones que expresan CD45.2 + como donantes. El uso de donantes y receptores ratones congenic permite la diferenciación de las células donantes y receptores a través de citometría de flujo y esto permite que el injerto a ser evaluado. </li><li> Para obtener células de médula ósea de donantes, la eutanasia a los ratones donantes con anestesia con isoflurano seguido por dislocación cervical. Con unas tijeras afiladas realizan incisiones alrededor de los tobillos para que el mmusculatura ouse está expuesto. </li><li> Uso de fórceps romos tirar la piel del ratón y de la piel con suavidad desde el tobillo hacia las caderas de manera que los músculos de las piernas son visibles. </li><li> Con unas tijeras afiladas cortar las piernas del ratón a la altura de las caderas y por encima de la cabeza del fémur. </li><li> Coloque las piernas en una placa de Petri y en hielo. Trabaja rápido y eliminar todos los músculos para exponer los huesos. </li><li> Fémures y tibias independientes. Coloque los huesos en una solución de etanol al 70% durante 5 min para eliminar posibles bacterias y colocarlos inmediatamente en otra placa de Petri que contiene 5 ml de DMEM libre de suero. Termina el hueso Cortar con unas tijeras afiladas y lave la médula ósea en el DMEM. Para ello, a ras 1 ml de DMEM en el hueso mediante la inserción de una aguja de 26 G unida a una jeringa de 5 ml. Asegúrese de que los huesos se ven de color blanco (vacío) después de lavado. </li><li> Recoger todas las células de médula ósea de ratones donantes en 10 ml de DMEM. Generar suspensiones de células individuales de células de médula ósea pasando la cosecha a través de un filtro de células de 70 micras. </li><li> Cloído suspensiones de células individuales de células de médula ósea por centrifugación a 260 xg durante 10 min a 4 ° C en una centrífuga refrigerada. Resuspender el sedimento celular en 10 ml de PBS. Agotar las células rojas de la sangre utilizando solución RbCl como se describe en 2.1.3 y 2.1.4. </li><li> Recuento de células de médula ósea utilizando un hemocitómetro o un contador de células automatizado. Evaluar la viabilidad celular mediante la determinación de las células muertas mediante tinción con azul de tripano 13. De manera óptima, los rendimientos de uno de los animales individuales alrededor de 3 x 10 7 células blancas de la sangre / ratón con una viabilidad de por lo menos 80%. </li><li> En el caso de quimeras de médula ósea totales, preparar TLR-3 - células o en peso de donantes - /. La concentración celular óptima es de 2 x 10 7 células / ml desde 2 x 10 6 células en 100 l de PBS serán utilizados para el trasplante. Si no se utiliza inmediatamente, conservar las células del donante a -80 ° C, utilizando técnicas de congelación lenta y FBS con DMSO al 10%. Para el modelo quimérico mixta, mezclar células Langerin-DTR-donantes y TLR3 - / - </sup&gt; Células del donante en una relación de 75:25. Preparar una mezcla de 75: 25 Langerin-DTR: wt células de médula ósea para generar ratones de control. </li></ol></li><li> Irradiación del ratón y el trasplante <ol><li> Irradiar ratones hembras entre 6-8 semanas de edad en un irradiador fuente de Cesio-137. Dé ratones dos dosis de 550 rad 4 horas de diferencia. Irradiación de Split minimiza la toxicidad hepática aguda y por lo tanto reduce la letalidad del ratón debido al protocolo de irradiación. </li><li> Después de la irradiación, mantener los ratones bajo tratamiento con antibióticos durante dos semanas. Dar antibióticos con el agua de bebida a 2,5-5 mg de Baytril / kg. </li><li> 2-4 horas después de la segunda irradiación, los ratones trasplantados con células de la médula ósea del donante por vía intravenosa. Realizar la inyección de células del donante a través de inyección seno retro-orbital 13 y bajo anestesia con isoflurano usando volumen máximo de 100 l de PBS que contenía 2 x 10 6 células. </li><li> Cuatro semanas después del trasplante, injerto evaluar en una muestra de 100l de sangre periférica mediante citometría de flujo utilizando una máquina capaz de leer al menos dos colores. Para distinguir entre el donante y las células receptoras de radio-resistentes, utilizar comercialmente disponible CD45.1 marcado con fluorescencia y CD45.2 anticuerpos anti-ratón utilizando diluciones entre 1/100 y 1/200. Injerto óptimo de las células del donante debe ser de al menos el 80% de las células hematopoyéticas totales en sangre periférica. </li></ol></li><li> Agotamiento de Vacunación y específica <ol><li> Vacunar a los ratones con la vacuna de la influenza viva atenuada recombinante vía intranasal. Para la vacunación de ratón, anestesiar los ratones con 5% de isoflurano en oxígeno utilizando un vaporizador de precisión. Usar una pipeta de 200 l para administrar 50 l de PBS que contienen 10 3 unidades formadoras de placa (pfu) de la vacuna. </li><li> Para generar el modelo final ratón, el tratamiento de ratones con 50 ng de DT diluido en 50 l de PBS por vía intranasal. Administrar gota a gota DT directamente a las fosas nasales de los ratones anestesiados como se describe en 3.3.1. Mi Tratarce con dosis diarias que comienzan el tratamiento en días -2 antes de la vacunación hasta el día 2 después de la vacunación (Figura 3B). </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understand+memory,+design+better+vaccines.">Understand memory, design better vaccines.</a> Nat. Immunol. 12, 463-465 (2011).</li><li>Gaucher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yellow+fever+vaccine+induces+integrated+multilineage+and+polyfunctional+immune+responses.">Yellow fever vaccine induces integrated multilineage and polyfunctional immune responses.</a> J. Exp. Med. 205, 3119-3131 (2008).</li><li>Querec, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+biology+approach+predicts+immunogenicity+of+the+yellow+fever+vaccine+in+humans.">Systems biology approach predicts immunogenicity of the yellow fever vaccine in humans.</a> Nat. Immunol. 10, 116-125 (2009).</li><li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity.">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392, 245-252 (1998).</li><li>Mart&#237;nez-Sobrido, L., Garc&#237;a-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+recombinant+influenza+virus+from+plasmid+DNA.">Generation of recombinant influenza virus from plasmid DNA.</a> J Vis Exp. 3, (2010).</li><li>Haniffa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Tissues+Contain+CD141hi+Cross-Presenting+Dendritic+Cells+with+Functional+Homology+to+Mouse+CD103++Nonlymphoid+Dendritic+Cells.">Human Tissues Contain CD141hi Cross-Presenting Dendritic Cells with Functional Homology to Mouse CD103+ Nonlymphoid Dendritic Cells.</a> Immunity. 37, 60-73 (2012).</li><li>Haniffa, M., Collin, M., Ginhoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+and+functional+specialization+of+dendritic+cells+in+human+and+mouse.">Ontogeny and functional specialization of dendritic cells in human and mouse.</a> Adv. Immunol. 120, 1-49 (2013).</li><li>Jung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+depletion+of+CD11c++dendritic+cells+abrogates+priming+of+CD8++T+cells+by+exogenous+cell-associated+antigens.">In vivo depletion of CD11c+ dendritic cells abrogates priming of CD8+ T cells by exogenous cell-associated antigens.</a> Immunity. 17, 211-220 (2011).</li><li>Lahl, K., Sparwasser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+depletion+of+FoxP3++Tregs+using+the+DEREG+mouse+model.">In vivo depletion of FoxP3+ Tregs using the DEREG mouse model.</a> Methods Mol. Biol. 17, 211-220 (2011).</li><li>Duffield, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+depletion+of+macrophages+reveals+distinct,+opposing+roles+during+liver+injury+and+repair.">Selective depletion of macrophages reveals distinct, opposing roles during liver injury and repair.</a> J. Clin. Invest. 115, 56-65 (2005).</li><li>Meredith, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+zinc+finger+transcription+factor+zDC.">Expression of the zinc finger transcription factor zDC.</a> J. Exp. Med. 209, 1153-1165 (2012).</li><li>Gir&#243;n, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+Polyinosinic-Polycytidylic+Acid+Improves+Protection+Elicited+by+Replicating+Influenza+Vaccines+via+Enhanced+Dendritic+Cell+Function+and+T+Cell+Immunity.">Mucosal Polyinosinic-Polycytidylic Acid Improves Protection Elicited by Replicating Influenza Vaccines via Enhanced Dendritic Cell Function and T Cell Immunity.</a> J. Immunol. 193, 1324-1332 (2014).</li><li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+animal+cells:+a+manual+of+basic+technique.">Culture of animal cells: a manual of basic technique.</a> bib.usb.ve. , (1983).</li><li>Cox, R. J., Brokstad, K. A., Ogra, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus:+immunity+and+vaccination+strategies.+Comparison+of+the+immune+response+to+inactivated+and+live,+attenuated+influenza+vaccines.">Influenza virus: immunity and vaccination strategies. Comparison of the immune response to inactivated and live, attenuated influenza vaccines.</a> Scand. J. Immunol. 59, 1-15 (2004).</li><li>Gowdy, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+CD8(+)+T+cell+immunity+after+allogeneic+bone+marrow+transplantation+leads+to+persistent+and+severe+respiratory+viral+infection.">Impaired CD8(+) T cell immunity after allogeneic bone marrow transplantation leads to persistent and severe respiratory viral infection.</a> Transpl. Immunol. 32, 51-60 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

En este estudio se describe cómo la genética y modelos de ratones quiméricos inversa puede ser utilizado para dilucidar los mecanismos fisiológicos y moleculares de la inmunidad inducida por la vacuna. Genética inversa influenza se establece en muchos laboratorios y ha jugado un papel principal en la comprensión de la patogénesis de la gripe, la replicación y la transmisión 17. Un punto clave en nuestro protocolo es el rescate de las vacunas antigripales adaptadas al frío que expresan epítopos extr...

La generación de memoria inmunológica en ausencia de enfermedad es la base fisiológica de la vacunación eficiente 1. Recientemente, los sistemas de enfoques basados ​​en la biología han revelado que las vacunas exitosas, como la vacuna contra la fiebre amarilla, inducen una fuerte inducción de la respuesta inmune innata y la activación de varios subconjuntos de células dendríticas (DC), que a su vez, conducen a la activación del antígeno multilinaje células T específicas 2,3. Desde los DC son la única población de células inmunes con la capacidad de activar las células T vírgenes de antígenos específicos de 4, el estudio de su función durante la vacunación es fundamental para entender la respuesta inmune a las vacunas y diseñar estrategias de futuro frente a patógenos desafiantes. Un sistema que permita el seguimiento de diferentes subconjuntos DCs durante las respuestas inmunes a las vacunas sería deseable con el fin de establecer una cinética precisos de la migración DC a los tejidos linfoides, y por lo tanto para proporcionarinformación sobre los mecanismos fisiológicos responsables de la iniciación de la inmunidad adaptativa-vacuna específica. Genética basada inversas enfoques ofrecen la posibilidad de generar modificado, las vacunas vivas atenuadas que se pueden utilizar experimentalmente con este propósito. Desde su puesta en práctica en la investigación de la gripe, la genética inversa basada en plásmidos se ha empleado ampliamente para generar cepas de la gripe recombinantes incluyendo LAIVs. Los protocolos estándar para rescatar virus de la gripe recombinantes requieren multi-transfección de líneas celulares altamente transfectables con plásmidos ambisense (produciendo tanto ARN de sentido positivo y negativo) que contienen los segmentos virales de la influenza ocho, así como la amplificación en un sistema permisivo tal como Madin-Darby de riñón canino ( células MDCK) y / o de pollo huevos embrionados 5. Sin embargo, la aplicación de genética inversa para generar herramientas moleculares con el fin de estudiar los mecanismos inmunes de la vacunación permanece sin explorar. La generaciónde nuevos modelos de ratón que permite el agotamiento específico de subconjuntos de células inmunes, incluyendo las DC, ha abierto nuevas posibilidades para comprender los mecanismos inmunológicos básicos subyacentes protección de la vacuna-suscitó. La comparación entre las funciones de subconjuntos de DC en ratones y seres humanos ha revelado que, en gran medida, ratón y humanos DCs son funcionalmente homóloga 6,7, estos hallazgos, fuertemente sugieren que el desarrollo de modelos de ratón que permite el agotamiento específico de DCs en el estado estacionario y durante condiciones inflamatorias, puede servir para entender la fisiología de las respuestas de CC en los seres humanos. En los últimos años una serie de modelos de ratones se han generado que llevan transgenes que expresan el receptor de la toxina de la difteria de simio (DT) (DTR) bajo el control de la región promotora de un gen de interés 8,9. Desde tejidos de ratón no expresan naturalmente DTR, estos modelos permiten el agotamiento condicional de subconjuntos de células que portan el gen diana de interés sobre la inoculación al ratón con DT. Por lo tanto, nuestra ability para agotar DCs específicos y otros leucocitos en vivo durante los procesos fisiológicos, se ha mejorado en gran medida por el desarrollo de ro a base de DTR. Sin embargo, mientras que estos modelos de ratones transgénicos se han utilizado ampliamente para entender la ontogenia del sistema inmune, su aplicación para el desarrollo de vacunas ha sido apenas probado. Aquí, mediante la combinación de genética inversa de la gripe y quimeras de médula ósea competitivos basados-DTR, proponemos un método para estudiar la cinética de la inmunidad de la vacuna, así como la función del gen individual durante la respuesta inmune a las vacunas en vivo. La aplicación de esta tecnología para la evaluación preclínica de nuevas vacunas contra enfermedades infecciosas desafiantes podría ayudar a racionalizar el diseño de vacunas y probar vacunas candidatas en vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s Modified Eagle Medium (DMEM 1X)</td>
			<td>Gibco RL-Life Technologies</td>
			<td>41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti MEM</td>
			<td>Gibco RL-Life Technologies</td>
			<td>31985-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen-Life Technologies</td>
			<td>11668-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)</td>
			<td>PAA</td>
			<td>p11-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryonated eggs</td>
			<td>Valo biomedia Gmbh</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (1X)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;M Nylon Filters</td>
			<td>Greiner-Biorad</td>
			<td>542-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysing buffer (RBCL) 10X</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16/CD32 Mouse BD Fc Block (2.4G2)</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-Anti-mouse SIINFEKL-H2kb (25 D1.16)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>141605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Anti-mouse CD11c (HLA3)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eFluor 450-Anti-mouse MHCII (Md/114.15.2)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-5321-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pe-Cy7-Anti-mouse CD11b (M1/70)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCp/Cy5.5-Anti-mouse CD103 (2E7)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>121416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Anti-mouse CD45.1 (A20)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0453-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V500-Anti-mouse CD45.2 (1O4)</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>562130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCp-eFluor710 -Anti-mouse CD8a (53-6.7)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>46-0081-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-Cy7-Anti-mouse CD3&#949; (145-2611)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eFluor450-Anti-mouse CD4 (GK 1.5)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-0041-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFSE Proliferation dye</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>65-0850-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baytril 2.5%</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>65-0850-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dymethil-Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin&#160;</td>
			<td>Molecular probes&#160;</td>
			<td>O23020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diphteria Toxin (DT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-TPCK</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACsCanto II Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo cell analysis software 9.5</td>
			<td>Flowjo inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain (0.4%)&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Automatic Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen-Life Technologies</td>
			<td>C10227</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intranasal administration of recombinant influenza vaccines in chimeric mouse models to study mucosal immunity

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies. 
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

Generación de vacunas de la gripe vivos atenuados recombinantes puede conseguirse mediante la transfección de plásmidos que codifican los ocho segmentos del virus de la gripe bajo el control de promotores bidireccionales 5. Una vacuna de la gripe adaptada al frío por lo general contiene seis segmentos de una cepa adaptada al frío, así como el HA y NA de la cepa de la gripe de elección (por ejemplo, H1N1) (Figura 1A). El principio de adaptación al frío se basa en la replicaci...

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Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

Administración intranasal de vacunas contra la influenza recombinante en modelos de ratón quimérico para el Estudio de la mucosa Inmunidad

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.4K vistas.  Heinrich Pette Institute, Leibniz Institute for Experimental Virology. There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

Video: Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

Generación de recombinantes del virus de influenza a partir del ADN plásmido

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Investigación

Inmunología e Infección

Protocol for Recombinant RBD-based SARS Vaccines: Protein Preparation, Animal Vaccination and Neutralization Detection

Based on their safety profile and ability to induce potent immune responses against infections, subunit vaccines have been used as candidates for a wide variety of pathogens 1-3. Since the mammalian cell system is capable of post-translational modification, thus forming properly folded and glycosylated proteins, recombinant proteins expressed in mammalian cells have shown the greatest potential to maintain high antigenicity and immunogenicity 4-6.
Although no new cases of SARS have been reported since 2004, future outbreaks are a constant threat; therefore, the development of vaccines against SARS-CoV is a prudent preventive step and should be carried out. The RBD of SARS-CoV S protein plays important roles in receptor binding and induction of specific neutralizing antibodies against virus infection 7-9. Therefore, in this protocol, we describe novel methods for developing a RBD-based subunit vaccine against SARS. Briefly, the recombinant RBD protein (rRBD) was expressed in culture supernatant of mammalian 293T cells to obtain a correctly folded protein with proper conformation and high immunogenicity 6. The transfection of the recombinant plasmid encoding RBD to the cells was then performed using a calcium phosphate transfection method 6,10 with some modifications. Compared with the lipid transfection method 11,12, this modified calcium phosphate transfection method is cheaper, easier to handle, and has the potential to reach high efficacy once a transfection complex with suitable size and shape is formed 13,14. Finally, a SARS pseudovirus neutralization assay was introduced in the protocol and used to detect the neutralizing activity of sera of mice vaccinated with rRBD protein. This assay is relatively safe, does not involve an infectious SARS-CoV, and can be performed without the requirement of a biosafety-3 laboratory 15.
The protocol described here can also be used to design and study recombinant subunit vaccines against other viruses with class I fusion proteins, for example, HIV, respiratory syncytial virus (RSV), Ebola virus, influenza virus, as well as Nipah and Handra viruses. In addition, the methods for generating a pseudovirus and subsequently establishing a pseudovirus neutralization assay can be applied to all these viruses.

This protocol describes a general procedure for studying recombinant receptor-binding domain (RBD)-based subunit vaccines against SARS. It includes methods for transfection and expression of RBD protein in 293T cells, immunization of mice with RBD and detection of neutralization activity of mouse sera using an established SARS pseudovirus neutralization assay.

Protocolo para las vacunas recombinantes para RBD basada en el SRAS: Preparación de la proteína, la vacunación de animales y la detección de neutralización

Based on their safety profile and ability to induce potent immune responses against infections, subunit vaccines have been used as candidates for a wide ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

El análisis cuantitativo de todos Influenza Tipo A Hemaglutininas viral y neuraminidasas el uso de anticuerpos Universal en simples ensayos Slot Blot

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue (NALT) in Mouse Responses to Vaccines

The nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissues (NALT) found in humans, rodents, and other mammals, contribute to immunity in the nasal sinuses1-3. The NALT are two parallel bell-shaped structures located in the nasal passages above the hard palate, and are usually considered to be secondary components of the mucosal-associated lymphoid system4-6. Located within the NALT are discrete compartments of B and T lymphocytes interspersed with antigen-presenting dendritic cells4,7,8. These cells are surrounded by an epithelial cell layer intercalated with M-cells that are responsible for antigen retrieval from the mucosal surfaces of the air passages9,10. Naive lymphocytes circulating through the NALT are poised to respond to first encounters with respiratory pathogens7. While NALT disappear in humans by the age of two years, the Waldeyer's Ring and similarly structured lymphatic organs continue to persist throughout life6. In contrast to humans, mice retain NALT throughout life, thus providing a convenient animal model for the study of immune responses originating within the nasal sinuses11.
Cultures of single-cell suspensions of NALT are not practical due to low yields of mononuclear cells. However, NALT biology can be examined by ex vivo culturing of the intact organ, and this method has the additional advantage of maintaining the natural tissue structure. For in vivo studies, genetic knockout models presenting defects limited to NALT are not currently available due to a poor understanding of the developmental pathway. For example, while lymphotoxin-&alpha; knockout mice have atrophied NALT, the Peyer's patches, peripheral lymph nodes, follicular dendritic cells and other lymphoid tissues are also altered in these genetically manipulated mice12,13. As an alternative to gene knockout mice, surgical ablation permanently eliminates NALT from the nasal passage without affecting other tissues. The resulting mouse model has been used to establish relationships between NALT and immune responses to vaccines1,3. Serial collection of serum, saliva, nasal washes and vaginal secretions is necessary for establishing the basis of host responses to vaccination, while immune responses originating directly from NALT can be confirmed by tissue culture. The following procedures outline the surgeries, tissue culture and sample collection necessary to examine local and systemic humoral immune responses to intranasal (IN) vaccination.

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue NALT in Mouse Responses to Vaccines

Methods to examine contributions of the nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissues (NALT) to nasal and systemic immune responses of mice to intranasal vaccines are described. We demonstrate a surgical procedure to establish a NALT-dependent mouse model and ex vivo cultures of extracted NALT.

Análisis de la importancia del tejido linforreticular nasofaríngeo asociado (NALT) en las respuestas de ratón a las vacunas

The nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissues (NALT) found in humans, rodents, and other mammals, contribute to immunity in the nasal sinuses1-3. ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

Un ensayo de adhesión de flujo para estudiar Leucocyte Reclutamiento para hepático humano sinusoidales endotelio en condiciones de estrés de cizalla

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Aislamiento de neutrófilos y análisis para determinar su papel en el linfoma de células sensibles a los agentes terapéuticos

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We demonstrate the procedure for preparing H. influenzae inoculum, intra-tracheal instillation of H. influenzae into the lung, collection of broncho-alveolar lavage fluid (BALF), analysis of immune cells in the BALF, and RNA isolation for differential gene expression analysis. This procedure can be used to study the lung inflammatory response to any bacteria, virus or fungi. Direct tracheal instillation is mostly preferred over intranasal or aerosol inhalation procedures because it more efficiently delivers the bacterial inoculum into the lower respiratory tract with less ambiguity.

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

We demonstrate the procedure for intra-tracheal inoculation of Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. This is a very useful tool to study signaling pathways that regulate airway inflammation in mouse models.

Administración intra-traqueal de<em&gt; Haemophilus influenzae</em&gt; En modelos de ratón para estudiar las vías respiratorias inflamación

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

Protective Efficacy and Pulmonary Immune Response Following Subcutaneous and Intranasal BCG Administration in Mice

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data have encouraged pulmonary tuberculosis vaccines as a promising strategy to prevent pulmonary disease, which is responsible for transmission. In this work, we describe the methodology used to demonstrate in the mouse model the benefits of intranasal BCG vaccination when compared to subcutaneous. Our data revealed greater protective efficacy following intranasal BCG administration. In addition, our results indicate that pulmonary vaccination triggers a higher immune response in lungs, including Th1 and Th17 responses, as well as an increase of immunoglobulin A (IgA) concentration in respiratory airways. Our data show correlation between protective efficacy and the presence of IL17-producing cells in lungs post-Mycobacterium tuberculosis challenge, suggesting a role for this cytokine in the protective response conferred by pulmonary vaccination. Finally, we detail the global workflow we have developed to study respiratory vaccination in the mouse model, which could be extrapolated to other tuberculosis vaccines, apart from BCG, targeting the mucosal response or other pulmonary routes of administration such as the intratracheal or aerosol.

We herein detail the methodology followed to compare protective efficacy and lung immune response induced by intranasal and subcutaneous immunization with BCG in mouse model. Our results show the benefits of pulmonary vaccination and suggest a role for IL17-mediated response in vaccine-induced protection.

La eficacia protectora y la respuesta inmune pulmonar tras la administración subcutánea e intranasal BCG en ratones

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

La medición de la influenza neuraminidasa inhibición títulos de anticuerpos mediante un ensayo de lectina ligado a enzimas

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare burden. The principle strategy to curtail infections is yearly vaccination. In individuals who have contracted influenza, antiviral drugs can mitigate symptoms. There is a clear and unmet need to develop alternative strategies to combat influenza. Several animal models have been created to model host-influenza interactions. Here, protocols for generating zebrafish models for systemic and localized human influenza A virus (IAV) infection are described. Using a systemic IAV infection model, small molecules with potential antiviral activity can be screened. As a proof-of-principle, a protocol that demonstrates the efficacy of the antiviral drug Zanamivir in IAV-infected zebrafish is described. It shows how disease phenotypes can be quantified to score the relative efficacy of potential antivirals in IAV-infected zebrafish. In recent years, there has been increased appreciation for the critical role neutrophils play in the human host response to influenza infection. The zebrafish has proven to be an indispensable model for the study of neutrophil biology, with direct impacts on human medicine. A protocol to generate a localized IAV infection in the Tg(mpx:mCherry) zebrafish line to study neutrophil biology in the context of a localized viral infection is described. Neutrophil recruitment to localized infection sites provides an additional quantifiable phenotype for assessing experimental manipulations that may have therapeutic applications. Both zebrafish protocols described faithfully recapitulate aspects of human IAV infection. The zebrafish model possesses numerous inherent advantages, including high fecundity, optical clarity, amenability to drug screening, and availability of transgenic lines, including those in which immune cells such as neutrophils are labeled with fluorescent proteins. The protocols detailed here exploit these advantages and have the potential to reveal critical insights into host-IAV interactions that may ultimately translate into the clinic.

Systemic and localized zebrafish infection models for human influenza A virus are demonstrated. Using a systemic infection model, zebrafish can be used to screen antiviral drugs. Using a localized infection model, zebrafish can be used to characterize host immune cell responses.

El uso de modelos de pez cebra de Infecciones por Virus de la Influenza Humana A a la pantalla medicamentos antivirales y caracterizar inmune del huésped respuestas de las células

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...