Este método describe un nuevo modelo de ratón para estudiar la transición del neumococo de un colonizador asintomático a un patógeno causante de enfermedades durante la infección viral. Imita más de cerca lo que sucede en los humanos. Este modelo puede ser una herramienta importante para identificar posibles objetivos terapéuticos contra la neumonía neumocócica secundaria en huéspedes susceptibles.
Este modelo reproduce la susceptibilidad del envejecimiento. Por lo tanto, se puede utilizar para comprender qué aspectos del huésped se vuelven defectuosos con la edad y nos permite adaptar las opciones de tratamiento para los huéspedes ancianos vulnerables. El cultivo de biopelícula neumocócica es un desafío ya que las diferentes cepas toman diferentes cantidades de tiempo.
Mi consejo es intentar cultivar la biopelícula antes de ejecutar el estudio en animales. Una vez que las células H292 sean 100% confluentes, lave las células tres veces con PBS. Luego agregue 250 microlitros de paraformaldehído al 4% por pocillo para fijar las células e incubar durante una hora en hielo o durante la noche a cuatro grados centígrados.
Strake streptococcus pneumoniae cepa de interés en la placa de agar sangre e incubar durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, inocular las bacterias de la placa en medios frescos químicamente definidos o CDM más oxirasa lavando las bacterias de la placa agregando un mililitro de CDM más oxirasa y levantando suavemente las colonias bacterianas usando el lado de una punta de pipeta de un mililitro, teniendo cuidado de no raspar el agar. Diluir el cultivo bacteriano en CDM más oxirasa a un OD inicial 600 de 0.05.
Luego cultive las bacterias en un tubo cónico de 50 mililitros con tapa suelta a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono hasta que se alcance un OD de 0.2. A continuación, vortex el tubo de cultivo bacteriano. Siembre 0,5 mililitros del cultivo en las células H292 fijas y agregue otros 0,5 mililitros de CDM más medio de oxirasa por pocillo.
Agregue CDM más oxirasa a los pocillos de control sin bacterias. Incubar la placa durante 48 horas a 34 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Cada 12 horas, después de la siembra inicial, reemplace suavemente los 0,5 mililitros del medio con CDM fresco más oxirasa.
Tenga cuidado de no interrumpir la formación de biopelículas. Revise la parte inferior de la placa en busca de biopelícula y busque un aumento de la nubosidad a medida que pasa el tiempo debido al crecimiento de la biopelícula. Después de 48 horas, retire el sobrenadante y lave la biopelícula dos veces con un mililitro de PBS.
A continuación, vuelva a suspender el biofilm en un mililitro de CDM fresco y pipetear hacia arriba y hacia abajo vigorosamente para levantar el biofilm. Para cada cepa bacteriana, agrupe el cultivo de todos los pocillos en un tubo de 50 mililitros. Mezcle bien inclinando suavemente el tubo bien tapado hacia arriba y hacia abajo varias veces.
A continuación, agregue 40% de glicerol y CDM en volúmenes iguales para lograr una suspensión bacteriana con una concentración final de 20% de glicerol. Alícuota un mililitro en un tubo de microcentrífuga, congele rápidamente en hielo seco y ahorre a menos 80 grados centígrados. Descongele las alícuotas cultivadas en biofilm en hielo y gire a 1.700 G durante cinco minutos.
Retire y deseche con cuidado el sobrenadante sin interrumpir el pellet. Luego lave el pellet resuspendiéndolo en un mililitro de PBS y gírelo nuevamente. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en el volumen necesario para alcanzar la concentración deseada.
Inocular el C57 negro seis machos de ratón por vía intranasal con cinco veces 10 a la sexta colonia formando unidades o UFC pipeteando cinco microlitros del inóculo diluido en cada naris. Después de la inoculación, sostenga al ratón firmemente, estabilizando la cabeza hasta que se inhale el volumen. Una vez que el virus se haya descongelado, diluya el virus en PBS a la concentración deseada.
Coloque lubricante oftálmico en los ojos del ratón antes de la anestesia. Infecte inmediatamente al ratón anestesiado con 50 microlitros de 20 unidades formadoras de placa, o PFU, del virus de la influenza A o IAV por vía intratraqueal mediante el uso de pinzas romas para sacar la lengua de la boca y pipetear el volumen de líquido por la tráquea. Después de la recuperación, inocular intranasales 10 microlitros de 200 PFU de IAV utilizando el método de inoculación descrito anteriormente.
Para la recolección de pulmón, usando tijeras de disección, corte los lados de la caja torácica expuesta y tire suavemente de las costillas hacia la cabeza del ratón para exponer el corazón. Inserte una aguja de calibre 25 conectada a una jeringa de 10 mililitros precargada con PBS en el ventrículo derecho y comience a perfundir lentamente. Busque el blanqueamiento de los pulmones como un indicador de perfusión exitosa.
Enjuague lentamente para evitar romper el tejido pulmonar. Levante el corazón con fórceps y haga un corte para separar los pulmones y el corazón. Una vez separados, recoger todos los lóbulos del pulmón con fórceps y enjuagar en un plato con PBS estéril para eliminar cualquier sangre residual.
En una placa de Petri, picar el pulmón en trozos pequeños y mezclar bien. Retire la mitad de la mezcla pulmonar para determinar la UFC bacteriana o la UFP viral y colóquela en un tubo redondo de fondo de 15 mililitros precargado con 0,5 mililitros de PBS para homogeneización. Retire la otra mitad del pulmón para citometría de flujo y colóquelo en una placa de 24 pocillos tratada con cultivo no tisular con cada pocillo precargado con 0,5 mililitros de RP10.
Dejar a temperatura ambiente hasta el procesamiento. Para homogeneizar el tejido recolectado, limpie la sonda homogeneizadora poniéndola en etanol al 70% y encendiendo el homogeneizador al 60% de potencia durante 30 segundos. Repita este paso en agua estéril durante 10 segundos.
Homogeneiza cada tejido durante un minuto. Para la enumeración de números bacterianos, diluciones en serie de placas en placas de agar sangre. Para calcular la UFC total, use 10 microlitros para platear y anotar el volumen final en mililitros para cada muestra.
Coloque las muestras de nasofaringe en placas de agar sangre suplementadas con tres microgramos por mililitro de gentamicina para seleccionar el crecimiento de S. pneumoniae mientras inhibe el crecimiento de otros microorganismos. Incubar durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Para la citometría de flujo, agregue 500 microlitros de tampón de digestión a cada pocillo de una placa de 24 pocillos que contenga una muestra de pulmón.
Incubar el plato durante 45 minutos a una hora. A continuación, utilizando una micropipeta P-1000, mueva los pulmones digeridos y colóquelos en el filtro. Luego use el émbolo de una jeringa de tres mililitros para triturar la muestra.
El inóculo de S.pneumoniae de crecimiento de biofilm da como resultado un transporte neumocócico consistente restringido a la nasofaringe al tiempo que evita la propagación sistemática. La presentación de la enfermedad en ratones coinfectados con S pneumoniae IAV dependió de la cepa bacteriana. Si bien no hubo diferencias significativas en el número bacteriano de la nasofaringe entre ninguna de las cepas, S pneumoniae, TIGR4 y D39, pero no EF3030 se diseminaron a los pulmones 48 horas después de la infección por IAV.
El 40% de los ratones infectados con S. pneumoniae TIGR4 mostraron diseminación bacteriana a los pulmones y de ellos, la mitad de ellos se volvieron bacterémicos. Los ratones infectados con S. pneumoniae D39 mostraron una diseminación del 100% a los pulmones y la mitad de eso experimentó bacteriemia. En el seguimiento de la supervivencia general, independientemente de la cepa bacteriana, la tasa de supervivencia de los ratones coinfectados fue significativamente menor que la de los ratones desafiados individualmente con S pneumoniae.
Este modelo también se utilizó para evaluar la presencia de varias células inmunes en los pulmones después de la infección por IAV. Las cepas bacterianas D39 y TIGR4 provocaron un aumento significativo por encima de la línea de base en la afluencia de células inmunes inflamatorias de la circulación, como neutrófilos y monocitos, mientras que EF3030 no lo hizo. La infección por IAV sola provocó un aumento significativo por encima de la línea de base en la afluencia de células inmunes como las células NK y las células T gamma delta.
Estas respuestas antivirales se atenuaron significativamente en ratones infectados intranasalmente con S. pneumoniae antes del desafío viral. En ratones infectados individualmente, los títulos virales no variaron entre las cohortes jóvenes y envejecidas. Los ratones viejos mostraron signos de enfermedad más tempranos y significativamente más graves y murieron más rápido, dentro de las 24 horas, mientras que los controles jóvenes sobrevivieron mejor a la infección.
Separar el transporte y la enfermedad en distintos pasos nos permite examinar tanto la respuesta inmune como los factores bacterianos y/o virales importantes en las diferentes fases de la progresión de la enfermedad. Esperamos que este modelo sea adaptado por otros laboratorios para estudiar otras interacciones polimicrobianas e interacciones del patógeno del huésped durante diferentes fases de la progresión de la enfermedad y en los diversos huéspedes.
