We thank Dr. Roger Tsien for providing us with the miniSOG constructs. Dr. Xuejun Sun for help with the TEM. Lisa Lem, and Peter Shipple from the Cross Cancer Institute for supplying oxygen. Hilmar Strickfaden holds a postdoctoral fellowship by the Alberta Cancer foundation and was supported by the Bayrische Forschungsallianz. This work was supported by grants from the Canadian Institutes of Health Research and Alberta Cancer Foundation.

1. Generación de miniSOG líneas celulares <ol><li> Crecer células U2OS (osteosarcoma humano) en una placa de 35 mm que contiene 2 ml de glucosa baja en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que se suplementó con 10% de suero bovino fetal (FBS) a 37 ° C en un incubador humidificado con 5% de CO 2 atmósfera. </li><li> Transfectar las células cuando son 80% de confluencia mediante lipofección con la calidad de la transfección purificada (A269 / ratio de 280 1.8-2.0) construcciones de plásmidos que contienen las secuencias para miniSOG y mCherry etiquetados proteínas de reparación de acuerdo con el protocolo del fabricante del reactivo de transfección 19. Los plásmidos de expresión miniSOG pueden ser solicitados a la Tsien-Lab: <a href="http://www.tsienlab.ucsd.edu/Samples.htm">http://www.tsienlab.ucsd.edu/Samples.htm</a> </li><li> Ordenar las células que expresan la proteína recombinante con la etiqueta miniSOG y mCherry por fluorescencia de células activadas por la clasificación dos días después de la transfección. Recoger las célulascon la intensidad de fluorescencia intermedia con el fin de evitar las células que se sobreexpresan 20. </li><li> Cultivar las células positivas en un plato de 10 cm en 10 ml de medio DMEM que se complementa con 10% de FBS y 0,6 g / ml del agente de selección G418 (geneticina). </li><li> Después de colonias visibles han surgido en las placas, de pantalla para colonias mCherry positivas usando un microscopio de fluorescencia invertido y dibujar círculos alrededor de ellos (en la parte inferior de la placa) con un marcador permanente. Use un lente objetivo de aire bajo aumento (por ejemplo, 10 veces) y recoger clones usando una técnica estéril por rascarse cuidadosamente las colonias fuera y lentamente chupar ellos en una punta de pipeta de 1.000 l estéril. </li><li> Expandir las colonias seleccionadas y congelar partes de ellos hacia abajo usando el medio de crecimiento descrito en el paso 1.1 suplementado con 10% de sulfóxido de dimetilo. Pon a prueba las células para la formación DRF cultivándolas en 18 x 18 mm 2 cubreobjetos estériles y exponiéndolos a2 Gy de radiación. Las células irradiadas que expresan establemente un miniSOG mCherry etiquetados proteína de reparación debe mostrar el patrón típico característico focal de DSBs cuando visualizó con un microscopio de fluorescencia utilizando un filtro de set-para obtener imágenes de mCherry. </li></ol> 2. Cultivo Celular <ol><li> Cultura U2OS células que expresan establemente el miniSOG y mCherry etiquetados proteínas de reparación en las condiciones descritas en el paso 1.1. Cultivan las células a 80% de confluencia en una placa de fondo de vidrio de diámetro 35 mm que contiene 2 ml de DMEM. Asegúrese de que el pegamento que une la hoja de la cubierta para el plástico y el plástico utilizado es resistente a las soluciones acuosas y alcohólicas y resistente a la resina utilizada! </li><li> Antes de realizar el experimento, esbozar una pequeña zona de aproximadamente 1 mm 2 que contiene células que expresan las proteínas ectópicos por el rascado con una pluma de diamante estéril usando un microscopio de fluorescencia para identificar la región de interés. Alternativamente, puede utilizar un plato con fondo de cristal tsombrero contiene un cubreobjetos con un sistema de red pre-grabado al agua fuerte incorporado en el cubreobjetos. NOTA: Si utiliza la microscopía correlativa de alta calidad que combina ESI y fluorescencia imágenes microscópicas 21, asegúrese de que el grosor del cubreobjetos es compatible con los objetivos de inmersión en aceite. Debe tener el espesor No. 1,5 (desde 0,16 hasta 0,18 mm). Elija un área cerca del centro del plato para la región a ser examinada en el TEM con el fin de evitar problemas con la polimerización de la resina que puede ocurrir cerca de los bordes (véase el punto 4.10 a 4.13). </li></ol> 3. ADN Inducción Daños <ol><li> Irradiar las células con radiación gamma, utilice un fármaco radio, o inducir el daño por irradiación láser micro en un microscopio confocal (por ejemplo, como se describe en 18,22 o 23). </li><li> En este ejemplo, irradiar las células con 2 y 6 Gy de irradiación gamma en un microirradiate de cesio-137 fuente de radiación o láser usando el sol 405 nmIdentificación del láser de estado de un microscopio confocal después de la sensibilización de las células durante 20 min con 0,5 g / ml Hoechst. </li></ol> Preparación 4. Muestra <ol><li> Fijar las células con 1 ml de paraformaldehído al 4% en tampón cacodilato PRECAUCIÓN 0,1 M de sodio o en tampón fosfato 0,1 M pH 7,4 durante 30 min a RT en la oscuridad. PRECAUCIÓN: El paraformaldehído y cacodilato de sodio son tóxicos! Use guantes y disponer adecuadamente las sustancias tóxicas. </li><li> Lavar las células dos veces con 4 ml de tampón de cacodilato de sodio 0,1 M pH 7,4 o tampón fosfato pH 7,4. </li><li> Tratar las células fijadas con glicina 2 ml de 50 mM, 5 mM aminotriazol y 10 mM cianuro de potasio PRECAUCIÓN en tampón cacodilato 0,1 M de sodio o un tampón de fosfato 0,1 M (pH 7,4) (comprobar el pH!) Por 30 min con el fin de bloquear sin reaccionar grupos aldehído y para suprimir la especies reactivas de oxígeno generadas por grupos hemo, que puede aumentar el fondo. PRECAUCIÓN: cianuro de potasio es extremadamente tóxico! Wguantes de oído, trabajan bajo una capucha y disponer adecuadamente las sustancias tóxicas. La reacción es muy sensible a pH por lo que es importante que el pH verificados y precisa. </li><li> Registre el área que se seleccionó en el paso 2.2 en 2D o 3D en un microscopio de fluorescencia invertida, si se desea microscopía correlativa. </li><li> Preparar una solución de diaminobencidina 1 mg / ml de clorhidrato PRECAUCIÓN mediante la colocación de un comprimido de 10 mg de clorhidrato de diaminobencidina en un tubo de microcentrífuga de 2 ml. Añadir 980 l de H2O destilada y 20 l de ácido clorhídrico concentrado (11,65 M) y mezclar hasta que la solución es de color marrón claro y translúcido. Diluir esta solución en 0,1 M de fosfato o tampón de cacodilato de sodio 0,1 M a una concentración final de 1 mg / ml mientras se ajusta el pH con hidróxido de sodio a un pH entre 7,0 y 7,6 (pH 7,4 se recomienda). PRECAUCIÓN: Diaminobencidina es tóxico! Use guantes y disponer adecuadamente las sustancias tóxicas. </li><li> Para fotooxidación, replace el tampón con 2 ml de una solución de 1 mg / ml de diaminobencidina hidrocloruro en tampón cacodilato 0,1 M de sodio o tampón fosfato. Proteger esta solución de la luz y enfriarlo en hielo para 4 o C con el fin de aumentar la solubilidad del oxígeno. Saturar la solución con oxígeno burbujeando oxígeno a través de la solución (utilizar una manguera que se inserta en la solución y conectado a una botella de oxígeno). Comprobar el pH de nuevo y ajustar si es necesario. NOTA: Es fundamental para la reacción de foto-oxidación que el pH está entre pH 7,0 y pH 7,6. </li><li> Montar el plato con las células fijadas con cuidado sobre un microscopio de fluorescencia invertido equipado con una lente de objetivo de 40x de inmersión en aceite y moverlo a la zona de interés. Excite la etiqueta miniSOG con luz azul utilizando cubos de filtro para las buenas prácticas agrarias o PPC. MiniSOG tiene un máximo de excitación a 448 nm con un hombro a 473 nm 10. </li><li> Continuar con la iluminación, incluso después de que el verde miniSOG fluorescencia jas desaparecido por completo y hasta que el producto fotooxidación marrón del Diaminobencidina polimerizado emerge en el canal de la luz transmitida. Cuando el producto de oxidación es visible en la mayoría de las células, apagar la iluminación de fluorescencia para detener la foto-oxidación. NOTA: La foto-oxidación puede tardar varios minutos, dependiendo de la lente del objetivo, las longitudes de onda de transmisión del filtro y la eficiencia, y la fuente de iluminación. </li><li> Postfix las células con 1 ml de glutaraldehído al 2% en cacodilato de sodio 0,1 M pH 7,4 tampón de pH o tampón de fosfato 7,4 durante 30 min. </li><li> Fijar las membranas de las células con 0,1% -0,5% de tetróxido de osmio durante 20 min en tampón cacodilato de sodio 0,1 M pH 7,4 o en 0,1 M tampón fosfato pH 7,4. NOTA: Se recomienda el uso de la concentración más baja posible de tetróxido de osmio requerido para estabilizar las membranas. Puesto que los precipitados DAB polimerizados tienen una alta densidad de nitrógeno, que puede ser detectada directamente por ESI, un fuertetinción de osmio no es necesario identificar la proteína marcada con miniSOG y podría ser perjudicial para la ESI. El tetróxido de osmio es muy tóxico! Trabajar en una campana extractora y disponer adecuadamente los residuos tóxicos. </li><li> Deshidratar, las células a través de una serie de etanol usando 30%, 50%, 70%, 90%, 98% 100 pasos de etanol (% cada 5 min). Posteriormente, se incuban las células en una mezcla 1: 1 de etanol al 100% y resina acrílica (LR White) y poner el plato en un agitador durante 4 horas para facilitar la infiltración en las células antes de la incubación de las células durante al menos otros 4 h en 100 resina acrílica% (LR White). </li><li> Con el fin de polimerizar la resina, cortar la tapa de un tubo de microcentrífuga de 2 ml marcado con un hoja de afeitar y recubrir el borde con acelerador de resina acrílica. Asegúrese de que el acelerador sólo cubre la llanta y no fluye en el tubo. Posteriormente, llenar cuidadosamente el tubo aproximadamente dos tercios con resina LR White usando una pipeta Pasteur. Tenga cuidado de que la resina no entra en contacto ingenioh el acelerador en la llanta! </li><li> Retire la resina que se infiltró en las células en el plato y colocar el plato boca abajo sobre el tubo de microcentrífuga de pie en posición vertical para que el ancho del tubo se llena casi por completo la ventana de observación de vidrio cubierto del plato. </li><li> Espere 1 a 2 min para el acelerador para sellar el tubo y el cubreobjetos, a continuación, invertir el tubo de manera que la resina en el tubo cubre ahora las células. </li><li> Coloque el plato con el tubo en un horno a 60 ° C y curar durante 12 horas. </li><li> Cuando se cura el bloque, retire el plato con el tubo de microcentrífuga de llenado de resina adjunta del horno y separar el tubo de microcentrífuga de la antena. Facilitar la separación por ciclos de congelación-descongelación en nitrógeno líquido y agua caliente. </li><li> Deseche el plato con fondo de cristal y cortar cuidadosamente abrir el tubo de microcentrífuga con una hoja de afeitar con el fin de quitar el bloqueo. </li><li> Marque el bloque con un marcador permanente. </li><li> Utilice una hoja de afeitar a trim el bloque de manera que nada más que la región de 1 mm 2 que contiene el área marcada previamente con el lápiz de diamante o de tungsteno (o contiene el área con las células de interés) se mantiene. </li><li> Monte el bloque en un ultramicrotomo, recorte el bloque con un cuchillo de cortar y cortar secciones ultrafinas de aproximadamente 50 nm usando un cuchillo de diamante. </li><li> Recoge las secciones de alta transmisión de 300 redes de malla. Estas rejillas tienen muy pequeñas barras de la rejilla y por lo tanto cubren menos células en el área de interés. </li><li> Cubra las secciones sobre las rejillas con aproximadamente 0,2 a 0,4 nm de carbono utilizando un dispositivo de recubrimiento de carbono para ayudar a estabilizar bajo el haz de electrones del TEM. </li></ol> 5. Microscopía Electrónica <ol><li> Cargar las rejillas en un TEM que está equipado con un filtro de energía. Después de sintonizar el microscopio y el filtro de energía de acuerdo con las instrucciones del fabricante, inspeccionar las células en las secciones en el modo de bajo aumento (transmisión normal) y compararellos a la fluorescencia de datos cuando sea apropiado (obtenido en el paso 4.4). </li><li> Una vez que un núcleo con características interesantes (pista daño en el ADN o ADN focos de reparación) se encuentra, cambie al modo de filtrado de energía y registrar un mapa de espesor. NOTA: Este procedimiento incluye la grabación de una pérdida de cero y una imagen sin filtrar. Espesores de hasta 0,3 recorrido libre medio (30% de los electrones del haz incidente se dispersa por la muestra) son lo suficientemente delgada como para generar buenos mapas elementales. </li><li> Mapas de relación de registro de los elementos fósforo y nitrógeno utilizando el software que controla el filtro de la energía del microscopio usado. Registre el mapa de fósforo imágenes de borde posterior en 175 eV pérdida de energía con una anchura de rendija de 20 eV y pre-borde imágenes a 120 eV pérdida de energía, también con una anchura de rendija de 20 eV. Para los mapas de nitrógeno, grabar imágenes de borde posterior de 447 eV con un ancho de ranura de 35 eV y pre-borde imágenes a 358 eV, también con un ancho de ranura de 35 eV. NOTA: Debido a que el contenido de los elementos fotografiados (fosfOrus y nitrógeno) es relativamente baja (aprox. 1%), elija &quot;Relación de Imagen&quot; (mapa elemental cualitativo) sobre el &quot;Método 3 ventana&quot; (cuantificar mapa elemental) con el fin de generar imágenes con una mejor relación señal-ruido. </li></ol> Procesamiento 6. Imagen <ol><li> Abra los mapas elementales de relación en un software de procesamiento de imágenes que puede manejar el formato de archivo de las imágenes adquiridas (por ejemplo, Micrografía Digital). Copie el mapa de nitrógeno en el canal rojo y el mapa de fósforo en el canal verde de una imagen RGB, a continuación, superponer y alinear los mapas. </li><li> Exportar la imagen compuesta como un archivo de formato de archivo de imagen etiquetada (TIFF). Abre la imagen en un software de procesamiento de imágenes que se pueden usar capas (por ejemplo, Photoshop). </li><li> Ajuste el rango dinámico de cada canal por reescalar los valores máximo y mínimo en la imagen a un conjunto de datos de 8 bits (0 a 255). </li><li> Restar el contenido de fósforo desde el mapa de nitrógeno (usando el&quot;Capas&quot; ventana) con el fin de generar un mapa cualitativo que muestra la distribución de la proteína. </li><li> Convertir los mapas del ácido nucleico (fósforo) y la proteína (nitrógeno), creado en el paso anterior en &quot;color indexado&quot; y crear una tabla de búsqueda de color amarillo en el espacio de color CMYK para el mapa que muestra la distribución de ácido nucleico y una tabla de búsqueda cian para mostrar el mapa no nucleoproteína. Los colores se eligen para generar el máximo contraste entre los dos mapas elementales. </li><li> Crear una nueva imagen e importar los mapas que muestran la distribución de fósforo y proteínas como las diferentes capas. Utilice el modo de transparencia &quot;pantalla&quot; con el fin de ver las dos capas superpuestas unas sobre otras. </li><li> Abra la imagen-cero pérdida adquirida en el paso 5.2. Esta imagen representa una imagen de la zona grabada que se ve una imagen TEM convencional como pero sólo contiene los electrones que han pasado a través de la muestra sin chocar con la muestra. Exportaciónesta imagen como una imagen TIFF. </li><li> Abra la imagen cero pérdida exportado en un editor de fotos y copiarlo en la capa superior de la imagen que muestra el mapa elemental. Alinear la imagen usando el modo de transparencia &quot;pantalla&quot;. </li><li> Umbral Opcionalmente la imagen para bajar de cero a segmento de la señal que se origina en el miniSOG. Añadir la imagen resultante como una capa separada como se describe anteriormente. </li></ol>

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Biol. 161, 322-335 (2007).</li><li>Fussner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+heterochromatin+reorganization+during+somatic+cell+reprogramming.">Constitutive heterochromatin reorganization during somatic cell reprogramming.</a> The EMBO journal. 30, 1778-1789 (2011).</li><li>Kepkay, R., Attwood, K. M., Ziv, Y., Shiloh, Y., Dellaire, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KAP1+depletion+increases+PML+nuclear+body+number+in+concert+with+ultrastructural+changes+in+chromatin.">KAP1 depletion increases PML nuclear body number in concert with ultrastructural changes in chromatin.</a> Cell cycle. 10, 308-322 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ESI puede servir como una herramienta excelente para examinar diferentes estados de la cromatina y ribonucleoproteínas en el núcleo debido a que es capaz de asignar específicamente a las zonas que son ricos en fósforo. Es profundamente aumenta la cantidad de detalle que se puede obtener por un microscopio electrónico y no depende de los métodos de contraste no específicos. Una desventaja de ESI es que requiere secciones más delgadas que TEM convencional al mismo voltaje de aceleración. Esto se puede superar med...

A pesar de los importantes avances en microscopía de luz en los últimos años 1, celulares biólogos todavía sufren de una brecha en la resolución. Esto limita la comprensión de las relaciones estructura-función en los procesos celulares fundamentales que implican la interacción coordinada entre los complejos macromoleculares (por ejemplo, en remodelación de la cromatina, la reparación del ADN, el ARN transcripción y replicación de ADN). Aunque los microscopios electrónicos de transmisión (TEM) es proporcionar la resolución necesaria, ha sido un reto para definir estos procesos estructuralmente debido a la incapacidad para etiquetar proteínas específicas al mismo tiempo ser capaz de determinar la composición bioquímica de las estructuras visualizadas. En ausencia de membranas internas para ayudar a diferenciar las estructuras nucleares, el núcleo ha sido particularmente difícil. Electron espectroscópica de imágenes (ESI) resuelve algunas de estas limitaciones, permitiendo la detección simultánea y diferenciación de ADN, ARN y protein-basada estructuras nucleares 2-5. Electron imágenes espectroscópicas: Con el fin de mapear las distribuciones elementales a alta sensibilidad y resolución en el microscopio electrónico, se puede usar un espectrómetro de imágenes que selecciona los electrones que han sido dispersos inelásticamente través de interacciones con electrones de la capa interior de un elemento en la muestra 6. Puesto que las cantidades de elementos específicos de la energía se pierden como consecuencia de la ionización de los átomos en la muestra, estos electrones se pueden separar y se visualizaron usando un espectrómetro que está unido al microscopio electrónico. Por lo tanto, el análisis del espectro de los electrones que han interactuado con el espécimen revela información cualitativa y cuantitativa acerca de la composición elemental de la muestra 7. Los electrones que no pierden energía cuando pasa a través de la muestra se encuentran en el &quot;pico de pérdida cero&quot; de la pérdida de energía de electronesespectro. La abundancia de estos electrones se relaciona con la masa, densidad y espesor de la muestra y se compone de electrones que pasan a través de la muestra sin chocar con la muestra o la pérdida de energía durante el paso a través de la muestra. Esta información puede ser útil para la cuantificación absoluta de los números de átomos de un elemento específico presente en la muestra 8. Dado que las muestras biológicas consisten principalmente de elementos ligeros que mal desvían los electrones en el haz incidente de la TEM, métodos de tinción usando sales de metal pesado tienen que ser aplicados con el fin de generar contraste en la muestra. La falta de especificidad de la mayoría de estos agentes de contraste y la incapacidad para visualizar más de una mancha donde es posible especificidad ha limitado el valor de la microscopía electrónica convencional en el estudio del núcleo. ESI tiene ventajas significativas sobre TEM convencional, en particular para el estudio de las estructuras del núcleo de la célula.Es posible explotar la naturaleza rica en fósforo de ADN y complejos macromoleculares que contienen ARN para distinguir los complejos de nucleoproteína de complejos de proteínas y para resolver diferentes complejos de nucleoproteína en función de su densidad de ácidos nucleicos. El material biológico restante se pueden obtener imágenes en base a su abundancia de nitrógeno. Asignación de sólo estos dos elementos y el análisis de su distribución y abundancia relativa dentro de las diferentes estructuras anatómicas nos proporciona una gran cantidad de información sobre el núcleo. Por ejemplo, es fácil identificar la cromatina y los ribosomas en el mapa que representan la abundancia de fósforo. El espacio interchromatin, complejos de poro nucleares, y los cuerpos nucleares, por otro lado, pueden detectarse fácilmente en la imagen del mapa de nitrógeno. Mini sistema generador de oxígeno singlete (miniSOG) Mientras ESI representa una poderosa técnica para el estudio de la estructura de la cromatina in situ, ya que tomas ventaja de las relaciones característicos en la composición elemental entre el fósforo y el nitrógeno, la composición elemental no puede normalmente ser usada para discriminar entre diferentes poblaciones de complejos de proteínas. Anticuerpos marcados con pequeñas partículas de oro en el rango nanométrico se han utilizado ampliamente para mapear la localización de moléculas individuales. Dado que la partícula de oro generalmente se une a un anticuerpo secundario, aparecerá dentro de una circunferencia de aproximadamente 20 nm alrededor del epítopo detectado por el anticuerpo primario. En las muestras post incrustación, los anticuerpos sólo pueden detectar los epítopos que están expuestos en la superficie de las secciones. Si bien es posible demostrar la presencia de un antígeno y relacionarlo con una cierta estructura anatómica de la célula, la información que se obtiene es incompleta, ya que la mayoría de los epítopos están oscurecidos por la resina. Técnicas, que utilizan protocolos similares a los utilizados para la microscopía de fluorescencia Pre-incrustación, permitir el acceso a los antígenos a lo largotoda la profundidad de la muestra pero los pasos de permeabilización que se requieren para permitir que el anticuerpo para penetrar en la célula típicamente requieren la eliminación de las membranas lipídicas y eliminar componentes que no pueden ser corregidos por aldehídos. Por otra parte, el fijador aldehído preferido para la preservación ultraestructura, glutaraldehído, comúnmente destruye epítopos y, en consecuencia, paraformaldehído se requiere típicamente. Esto es menos efectivo en la reticulación proteína-proteína. Otra desventaja de los anticuerpos que se etiqueta con una nanopartícula de oro es que el oro es un material muy denso en electrones que crea un fuerte contraste que puede oscurecer los detalles estructurales interesantes de la muestra, que tiene más débil contraste. La aparición de la proteína verde fluorescente (GFP) como una etiqueta proteína expresada ha transformado el uso de microscopía de fluorescencia para responder a preguntas de la biología celular. Etiquetado de una proteína con un pequeño dominio fluorescente permite el mapeo de su distribución in vivo </em&gt; sin la necesidad de procedimientos de permeabilización que pueden alterar la estructura. Con el fin de traducir el principio elegante de la utilización de etiquetas de proteínas para mapear las distribuciones de proteínas en una célula de Microscopía Electrónica, se necesitaba un sistema que es capaz de producir una señal de cerca de la estructura de interés y generar contraste en el TEM. Diaminobencidina polimerizado es una mancha que se utiliza a menudo en la histología para detectar la unión del anticuerpo. Esta mancha se deposita normalmente utilizando peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugada con un anticuerpo secundario. Aunque la reacción produce un resultado fiable, HRP no es catalíticamente activo en el citosol de las células 9. Los productos de reacción de HRP pueden también difunden lejos del lugar de generación de modo que su resolución es peor que el método Nanogold 10. Con el fin de evitar estos problemas, el sistema / ReAsH FLASH fue desarrollado 11. Se compone de proteínas de fusión recombinantes que poseen un motivo tetracisteína. Este motivo permite la unión deun fluoróforo biarsenic. Cuando excitado, el flash consolidado o ReAsH es capaz de generar el oxígeno atómico altamente reactivo y diaminobencidina tanto photoconvert (DAB) en un polímero que precipita inmediatamente en el lugar de las proteínas etiquetadas. El polímero DAB se puede teñir con tetróxido de osmio, que es denso en electrones y por lo tanto se puede utilizar para mapear la distribución de la proteína de fusión recombinante en el TEM. En 2011, Shu et al. 10 presentó el sistema miniSOG, que consiste en una pequeña 106 amino ácidos etiqueta de fusión derivada de una flavoproteína de Arabidopsis que es fluorescente y capaz de crear muchos radicales de oxígeno singlete cuando se excita con luz azul 448 nm. Estos radicales de oxígeno singlete se pueden utilizar para diaminobencidina foto-oxidar para formar polímeros en y cerca de la superficie de la proteína etiquetada, que es considerablemente más estrecha que los anticuerpos marcados inmunoelectrónica 11. Mientras que el sistema de flash / ReAsH requiere llevar el flúorcromo y la diaminobenzidina en las células antes de hacer la fotoconversión, el sistema miniSOG sólo requiere diaminobencidina y la luz y, además, es dos veces más eficaz en la polimerización de diaminobencidina. Aquí, miniSOG se emplea en combinación con ESI con el fin de mapear la ultraestructura de focos de reparación del ADN. Focos de reparación del ADN (DRF) ADN no reparado doble filamento se rompe representan una seria amenaza para la célula, ya que pueden dar lugar a translocaciones y pérdida de información genética. A su vez, esto puede conducir a la senescencia, el cáncer y la muerte celular. Muchas proteínas que están implicadas en la reparación de ADN de doble filamento romper acumulan en los focos que reunir en torno a una doble cadena de ADN romper 12-14. Aunque su función no se conoce, que representan el sitio en el núcleo que contiene el ADN de doble capítulo romper y es el sitio de ADN de doble hebra de romper la reparación. Foc reparación del ADNi (DRF) se han caracterizado por microscopía de fluorescencia y servir como biomarcadores de daño en el ADN 12,15. Ellos son enormes en relación con el tamaño de la rotura de doble cadena y se consideraron relativamente homogénea hasta que los estudios de microscopía de super-resolución recientes revelaron algunas pruebas de sub-compartimentación de moléculas en cada enfoque 16. Con el fin de entender cómo se organizan estos sitios, es necesario para visualizar todas las estructuras biológicos subyacentes respecto a la otra. Esto no se puede lograr mediante microscopía de fluorescencia, pero es posible a través de microscopía electrónica 17,18. Aquí, se describe un método que combina imágenes espectroscópicas de electrones con el método miniSOG para ilustrar el potencial de este enfoque combinado para explorar la ultraestructura de reparación del ADN de doble filamento romper.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gridded 35 mm glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-2-14-CGRD&#160;</td>
			<td>not made for immersion objectives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR White: acryl resin</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>14381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR White accelerator</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>14385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#8242;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slim Bar Grids 300 Mesh</td>
			<td>SPI</td>
			<td>1161123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten-Point Lab Pen</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>41148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>19100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Coater 208carbon</td>
			<td>Cressington</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra microtome Leica EM UC6</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop CS5</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>might even work with older versions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Micrograph V.2.30</td>
			<td>Gatan</td>
			<td></td>
			<td>might even work with older versions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H-1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Effectene</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniSOG-Constructs</td>
			<td>Tsien-Lab</td>
			<td></td>
			<td><a href="mailto:tsienlab@yahoo.com">tsienlab@yahoo.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDC1 miniSOG mCherry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>53BP1 miniSOG mCherry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rad52 miniSOG mCherry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cesium 137 radiation source &#34;MARK 1&#34;</td>
			<td>&#160;(J.L. Shepherd &#38; Associated)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ/FiJi</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>http://fiji.sc/Fiji</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml Eppendorf tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-408-146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond Knife ultra 35&#176;</td>
			<td>Diatome</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimming Knife ultratrim</td>
			<td>Diatome</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>12300</td>
			<td>Caution Toxic!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde EM Grade 8%</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>16020</td>
			<td>Caution Toxic!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>21180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>21190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>19202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide 4% solution</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>19150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescence Micoscope Axiovert 200M</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>A142-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide Solution 10M</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>72068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen</td>
			<td>Medigas</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Amino-1,2,4-triazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium cyanide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>207810</td>
			<td>Caution Toxic!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>15058</td>
			<td>Caution Toxic!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade Single Edge Carbon Steel</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>71960</td>
			<td>Caution Sharp!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D 5546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>lifetechnologies</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>lifetechnologies</td>
			<td>11811-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope 200 kV</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GIF Tridiem 863 Energy filter</td>
			<td>Gatan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of minisog tagged dna repair proteins in combination with electron spectroscopic imaging (esi)

Los límites a la resolución óptica y el reto de identificar poblaciones específicas de proteína en microscopía electrónica de transmisión han sido obstáculos en la biología celular. Muchos fenómenos no se pueden explicar mediante análisis in vitro en los sistemas simplificados y necesitan información estructural adicional in situ, en particular en el rango entre 1 nm y 0,1 m, con el fin de ser plenamente comprendido. Aquí, imágenes espectroscópicas de electrones, una técnica de microscopía electrónica de transmisión que permite el mapeo simultáneo de la distribución de las proteínas y ácidos nucleicos, y una etiqueta de expresión, miniSOG, se combinan para estudiar la estructura y organización de ADN de doble hebra focos romper la reparación.

ESI Comparando las imágenes ESI del núcleo (Figura 1) con las imágenes de TEM convencionales (por ejemplo, la Figura 7-1) revela un aumento dramático en las estructuras anatómicas que pueden ser fácilmente distinguido. Las crestas de la cromatina aparecen en amarillo y es muy fácil de identificar las chromocenters en células de ratón. Nucleolos se puede distinguir fácilmente de la cromatina por su estructura redon...

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Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging ESI

Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

Visualización de miniSOG Tagged proteínas de reparación de ADN en combinación con Electron espectroscópico Imaging (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in ...

visualization-minisog-tagged-dna-repair-proteins-combination-with

Research

JoVE Journal

Biology

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging (ESI)

10.0K vistas.  University of Alberta. Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

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Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers. Genetic studies in mammalian systems have been limited due to the lack of readily available tools including defined mutant genetic cell lines, regulatory expression systems, and appropriate selectable markers. To circumvent these difficulties, model genetic systems in lower eukaryotes have become an attractive choice for the study of functionally conserved DNA repair proteins and pathways. We have developed a model yeast system to study the poorly defined genetic functions of the Werner syndrome helicase-nuclease (WRN) in nucleic acid metabolism. Cellular phenotypes associated with defined genetic mutant backgrounds can be investigated to clarify the cellular and molecular functions of WRN through its catalytic activities and protein interactions. The human WRN gene and associated variants, cloned into DNA plasmids for expression in yeast, can be placed under the control of a regulatory plasmid element. The expression construct can then be transformed into the appropriate yeast mutant background, and genetic function assayed by a variety of methodologies. Using this approach, we determined that WRN, like its related RecQ family members BLM and Sgs1, operates in a Top3-dependent pathway that is likely to be important for genomic stability. This is described in our recent publication [1] at <a href="http://www.impactaging.com">www.impactaging.com</a>. Detailed methods of specific assays for genetic complementation studies in yeast are provided in this paper.

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System

Genetic studies in yeast can be employed to investigate the molecular and cellular functions of human genes in cellular DNA metabolism. Methods are described for the genetic characterization of the human WRN gene product defective in the premature aging disorder Werner syndrome in functionally conserved pathways using yeast as a tractable model system.

Los estudios genéticos de proteínas humanas de reparación del ADN utilizando la levadura como un sistema modelo

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Investigación

Biología

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution of existing proteins, and the assembly of new protein complexes can be stimulated by a variety of DNA lesions and mismatched DNA base pairs. Fluorescence microscopy has been used as a powerful experimental tool for visualizing and quantifying these and other responses to DNA lesions and to monitor DNA replication status within the complex subcellular architecture of a living cell. Translational fusions between fluorescent reporter proteins and components of the DNA replication and repair machinery have been used to determine the cues that target DNA repair proteins to their cognate lesions in vivo and to understand how these proteins are organized within bacterial cells. In addition, transcriptional and translational fusions linked to DNA damage inducible promoters have revealed which cells within a population have activated genotoxic stress responses. In this review, we provide a detailed protocol for using fluorescence microscopy to image the assembly of DNA repair and DNA replication complexes in single bacterial cells. In particular, this work focuses on imaging mismatch repair proteins, homologous recombination, DNA replication and an SOS-inducible protein in Bacillus subtilis. All of the procedures described here are easily amenable for imaging protein complexes in a variety of bacterial species.

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

A detailed protocol is described for imaging the real time formation of DNA repair complexes in Bacillus subtilis cells.

Imágenes de reparación del ADN y la respuesta celular al daño del ADN en Bacillus subtilis</em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many degenerative human diseases. The recent discovery of MG53 as a key component of the membrane resealing machinery allows for a better molecular understanding of the basic biology of tissue repair, as well as for potential translational applications in regenerative medicine. Here we detail the experimental protocols for exploring the in vivo function of MG53 in repair of muscle injury using treadmill exercise protocols on mouse models, for testing the ex vivo membrane repair capacity by measuring dye entry into isolated muscle fibers, and for monitoring the dynamic process of MG53-mediated vesicle trafficking and cell membrane repair in cultured cells using live cell confocal microscopy.

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Described here are protocols used to visualize the dynamic process of MG53-mediated cell membrane repair in whole animals and at the cellular level. These methods can be applied to investigate the cell biology of plasma membrane resealing and regenerative medicine.

Visualización de MG53 mediada por reparación de la membrana celular mediante In vivo Y In vitro Sistemas de

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

De alto rendimiento de purificación de afinidad de proteínas marcadas con recombinantes

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as cells, organelles, membrane vesicles, or viruses at molecular detail. To achieve this, the aqueous sample is rapidly vitrified in liquid ethane, which preserves it in a close-to-native, frozen-hydrated state. In the electron microscope, tilt series are recorded at liquid nitrogen temperature, from which 3D tomograms are reconstructed. The signal-to-noise ratio of the tomographic volume is inherently low. Recognizable, recurring features are enhanced by subtomogram averaging, by which individual subvolumes are cut out, aligned and averaged to reduce noise. In this way, 3D maps with a resolution of 2 nm or better can be obtained. A fit of available high-resolution structures to the 3D volume then produces atomic models of protein complexes in their native environment. Here we show how we use electron cryo-tomography to study the in situ organization of large membrane protein complexes in mitochondria. We find that ATP synthases are organized in rows of dimers along highly curved apices of the inner membrane cristae, whereas complex I is randomly distributed in the membrane regions on either side of the rows. By subtomogram averaging we obtained a structure of the mitochondrial ATP synthase dimer within the cristae membrane.

We present a protocol of how to collect and process electron cryo-tomograms of whole mitochondria. The technique provides detailed insights into the structure, function, and organization of large membrane protein complexes in native biological membranes.

La visualización de la ATP sintasa dímeros en mitocondrias por Electron Cryo-tomografía

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

Imágenes en tiempo real de Soltero Engineered ARN transcritos en células vivas utilizando Ratiometric bimoleculares Balizas

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3' hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).

We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.

La visualización de atado-gran superficie moléculas de ADN con un ADN Fluorescent Protein unión del péptido

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to occur in some cyanobacteria before cell division. However, due to the large cell size and the transient character, it is difficult to investigate the structure in detail. To overcome the difficulties, first, DNA compaction is reproducibly produced in the cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 by synchronous culture using 12 h each light/dark cycle. Second, DNA compaction is monitored by fluorescence microscopy and captured by rapid freezing. Third, the detailed structure of DNA compacted cells is visualized in three dimensions (3D) by high voltage cryo-electron tomography. This set of methods is widely applicable to investigate transient structures in bacteria, e.g. cell division, chromosome segregation, phage infection etc., which are monitored by fluorescence microscopy and directly visualized by cryo-electron tomography at appropriate time points.

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. Synchronous cultivation, monitoring by fluorescence microscopy, rapid freezing, and high voltage cryo-electron tomography are used. A protocol for these methodologies is presented, and future applications and developments are discussed.

Visualización de compactación del ADN en cianobacterias por Tomography del Cryo-electrón de alta tensión

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA insults. Genotoxic agents can damage the DNA backbone, break it, or modify the chemical nature of individual bases. Following DNA insult, DNA damage response (DDR) pathways are activated and proteins involved in the repair are recruited. A plethora of factors are involved in sensing the type of damage and activating the appropriate repair response. Failure to correctly activate and recruit DDR factors can lead to genomic instability, which underlies many human pathologies including cancer. Studies of DDR proteins can provide insights into genotoxic drug response and cellular mechanisms of drug resistance.
There are two major ways of visualizing&#160;proteins in vivo: direct observation, by tagging the protein of interest with a fluorescent protein and following it by live imaging, or indirect immunofluorescence on fixed samples. While visualization of fluorescently tagged proteins allows precise monitoring over time, direct tagging in N- or C-terminus can interfere with the protein localization or function. Observation of proteins in their unmodified, endogenous version is preferred. When DNA repair proteins are recruited to the DNA insult, their concentration increases locally and they form groups, or &#8220;foci&#8221;, that can be visualized by indirect immunofluorescence using specific antibodies.
Although detection of protein foci does not provide a definitive proof of direct interaction, co-localization of proteins in cells indicates that they regroup to the site of damage and can inform of the sequence of events required for complex formation. Careful analysis of foci spatial overlap in cells expressing wild type or mutant versions of a protein can provide precious clues on functional domains important for DNA repair function. Last, co-localization of proteins indicates possible direct interactions that can be verified by co-immunoprecipitation in cells, or direct pulldown using purified proteins.

Following DNA damage, human cells activate essential repair pathways to restore the integrity of their genome. Here, we describe the method of indirect immunofluorescence as a means to detect DNA repair proteins, analyze their spatial and temporal recruitment, and help interrogate protein-protein interaction at the sites of DNA damage.

Visualización de la interacción de proteínas de reparación del ADN por inmunofluorescencia

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA ...

Photodiode-Based Optical Imaging for Recording Network Dynamics with Single-Neuron Resolution in Non-Transgenic Invertebrates

The development of transgenic invertebrate preparations in which the activity of specifiable sets of neurons can be recorded and manipulated with light represents a revolutionary advance for studies of the neural basis of behavior. However, a downside of this development is its tendency to focus investigators on a very small number of &#8220;designer&#8221; organisms (e.g., C. elegans and Drosophila), potentially negatively impacting the pursuit of comparative studies across many species, which is needed for identifying general principles of network function. The present article illustrates how optical recording with voltage-sensitive dyes in the brains of non-transgenic gastropod species can be used to rapidly (i.e., within the time course of single experiments) reveal features of the functional organization of their neural networks with single-cell resolution. We outline in detail the dissection, staining, and recording methods used by our laboratory to obtain action potential traces from dozens to ~150 neurons during behaviorally relevant motor programs in the CNS of multiple gastropod species, including one new to neuroscience &#8211; the nudibranch Berghia stephanieae. Imaging is performed with absorbance voltage-sensitive dyes and a 464-element photodiode array that samples at 1,600 frames/second, fast enough to capture all action potentials generated by the recorded neurons. Multiple several-minute recordings can be obtained per preparation with little to no signal bleaching or phototoxicity. The raw optical data collected through the methods described can subsequently be analyzed through a variety of illustrated methods. Our optical recording approach can be readily used to probe network activity in a variety of non-transgenic species, making it well suited for comparative studies of how brains generate behavior.

This protocol presents a method for imaging neuronal population activity with single-cell resolution in non-transgenic invertebrate species using absorbance voltage-sensitive dyes and a photodiode array. This approach enables a rapid workflow, wherein imaging and analysis can be pursued over the course of a single day.

Imágenes ópticas basadas en fotodiodos para registrar dinámicas de red con resolución de una sola neurona en invertebrados no transgénicos

The development of transgenic invertebrate preparations in which the activity of specifiable sets of neurons can be recorded and manipulated with light ...