Name: visualization of minisog tagged dna repair proteins in combination with electron spectroscopic imaging (esi)
Uploaded: 2015-09-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging ESI at JoVE.com

We thank Dr. Roger Tsien for providing us with the miniSOG constructs. Dr. Xuejun Sun for help with the TEM. Lisa Lem, and Peter Shipple from the Cross Cancer Institute for supplying oxygen. Hilmar Strickfaden holds a postdoctoral fellowship by the Alberta Cancer foundation and was supported by the Bayrische Forschungsallianz. This work was supported by grants from the Canadian Institutes of Health Research and Alberta Cancer Foundation.

MiniSOG Hücre hatları 1. Üretim <ol><li> % 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C &#39;de% 10 fetal bovin serumu (FBS) ile takviye edilmiş düşük glikoz Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM) içinde 2 ml ihtiva eden bir 35 mm çanak U2OS (insan osteosarkoma) hücreler büyümek atmosfer. </li><li> Bunlar miniSOG ve mCherry sekansları içeren plazmid transfeksiyon reaktifi yapılar 19 ve imalatçının protokolüne göre, onarım etiketli proteinlerin saflaştırılmış transfeksiyon kalitesi (A269 / 280 oranı 1.8-2.0) ile lipofeksiyon ile% 80 konfluent olduğunda, hücreleri transfekte. MiniSOG ifade plazmid Tsien-Lab sipariş edilebilir: <a href="http://www.tsienlab.ucsd.edu/Samples.htm">http://www.tsienlab.ucsd.edu/Samples.htm</a> </li><li> İki gün sonra transfeksiyon flüoresan aktifleşmiş hücre sıralaması ile miniSOG ve MCherry etiketiyle rekombinant proteini eksprese eden hücreler, kriteri. Hücreleri toplayın20 aşırı ifade eden hücreleri önlemek için bir ara madde floresan ile. </li><li> Kültür,% 10 FBS ve seleksiyon ajanın G418 (Geneticin) 0.6 ug / ml ile takviye edilmiş DMEM ortamı içinde 10 ml bir 10 cm&#39;lik bir tabak üzerinde pozitif hücreler. </li><li> Görünür koloniler plakalar üzerinde ortaya çıkmıştır sonra, MCherry pozitif kolonilerin ekranı ters bir floresan mikroskop kullanılarak ve kalıcı bir kalem ile (plaka alt üzerine) çevrelerindeki daireler çizin. Düşük büyütme hava objektif lens (örneğin, 10x) kullanın ve dikkatli steril 1000 ul pipet içine emme yavaş yavaş koloniler çizilmeye ve steril tekniği kullanarak klonları seçin. </li><li> Seçilen koloniler genişletin ve% 10 dimetil sülfoksit ile desteklenmiş aşama 1.1 açıklanan büyüme ortamı kullanarak onları kısımlarını aşağı dondurma. Steril 18 x 18 mm 2 kapak fişleri onları büyüyen ve bunları teşhir ederek DRF oluşumu için hücreleri testRadyasyon 2 Gy. Stabil bir miniSOG mCherry ifade ışınlanmış hücreler mCherry görüntülenmesinde filtre seti kullanan bir floresan mikroskop ile görüntülendi zaman tamir protein DSBs tipik odak desen özelliği göstermek zorundadır etiketledi. </li></ol> 2. Hücre Kültürü <ol><li> Kültür U2OS hücreleri stabil miniSOG ifade ve mCherry adımda 1.1 belirtilen şartlar altında onarım proteinleri etiketledi. DMEM 2 ml ihtiva eden bir 35 mm çapında bir cam alt tabak içinde% 80 konfluansa kadar hücreleri büyütün. Plastik ve kullanılan plastik kapak kayma verdiği tutkal kullanılan reçine sulu ve alkollü çözümlere karşı dayanıklı ve dirençli olduğundan emin olun! </li><li> Denemeyi gerçekleştirmeden önce, ilgilenilen bölgeyi tanımlamak için bir floresan mikroskop kullanılarak steril bir elmas kalemle çizilerek ektopik proteinleri ifade hücreleri içeren yaklaşık 1 mm 2 küçük bir alanda özetlemektedir. Alternatif bir cam alt çanak t kullanınşapka lamel yerleşik bir ön kazınmış ızgara sistemi ile lamel içeriyor. NOT: ESI ve floresan mikroskobik resimler 21 birleştirerek yüksek kalitede bağıntılı mikroskopi kullanılarak ise, lamel kalınlığı immersiyon yağı hedefleri ile uyumlu olduğundan emin olun. Bu kalınlık No. 1.5 (0,16-0,18 mm) olması gerekir. Bölge kenarlarına yakın oluşabilecek reçine polimerizasyonu ile sorunları önlemek amacıyla TEM incelenecek için çanak merkezine yakın bir alan seçin (nokta 4,10-4,13 bakınız). </li></ol> 3. DNA Hasarı İndüksiyon <ol><li> , Gama radyasyonu ile hücrelerin ışın tedavisi, bir radyomimetik ilaç kullanımı, ya da (18,22 veya 23 de tarif edildiği gibi, örneğin,) konfokal mikroskop lazer ışınlama, mikro hasarını teşvik eder. </li><li> Bu örnekte, 405 nm sol kullanarak bir sezyum-137 radyasyon kaynağı veya lazer microirradiate gama ışınlama 2 ve 6 Gy ile hücrelerin ışın tedavisi0,5 ug / ml Hoechst ile 20 dakika boyunca hücrelerin duyarlılaştırılması sonra konfokal mikroskop id hal lazer. </li></ol> 4. Numune Hazırlama <ol><li> 0.1 M sodyum kakodilat tampon maddesi içinde ya da karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 0.1 M fosfat tamponu pH 7.4 içinde% 4 paraformaldehit DİKKAT 1 ml hücreleri saptamak. DİKKAT: Paraformaldehit ve sodyum kakodilat zehirlidir! Eldiven giyin ve yeterince zehirli maddeler atmayın. </li><li> 0.1 M sodyum kakodilat tamponu, pH 7.4 ya da fosfat tampon maddesi, pH 7.4, 4 ml hücreler iki kez yıkayın. </li><li> 2 ml 50 mM glisin ile sabitleştirilmiş hücreler tedavi, 5 mM aminotriazol ve 30 dakika boyunca 0.1 M sodyum kakodilat tamponu ve 0,1 M fosfat tampon maddesi (pH 7.4) içinde 10 mM potasyum siyanür DİKKAT (pH kontrol!), Reaksiyona girmemiş bloke etmek için aldehit grupları ve arka plan artırabilir hem grupları tarafından üretilen reaktif oksijen türleri bastırmak için. DİKKAT: Potasyum siyanür son derece zehirlidir! WKulak eldiven, bir başlık altında çalışmak ve yeterince zehirli maddeler atmayın. PH belirlenmiş ve doğru olması önemlidir, böylece, reaksiyon pH karşı çok hassastır. </li><li> Bağıntılı mikroskopi isteniyorsa, ters bir floresan mikroskop 2D veya 3D adımda 2.2 seçildi alan kaydedin. </li><li> 2 ml&#39;lik bir mikrosantrifüj tüpü içine, bir 10 mg tablet diaminobenzidin hidroklorür koyarak 1 mg / ml diaminobenzidin hidroklorür DİKKAT çözeltisi hazırlayın. Distile H, konsantre edilmiş hidroklorik asit (11.65 M) 2 O ve 20 ul 980 ul ekleyin ve çözelti, açık kahverengi ve berrak hale gelene kadar karıştırın. 7.0 ile 7.6 arasında bir pH değerine kadar sodyum hidroksit ile pH ayarlanması sırasında, 1 mg / ml&#39;lik bir son konsantrasyona kadar, 0.1 M fosfat veya 0,1 M sodyum kakodilat tampon maddesi içinde bu çözüm seyreltilir (pH 7,4 önerilir). UYARI: diaminobenzidin zehirlidir! Eldiven giyin ve yeterince zehirli maddeler atmayın. </li><li> Fotooksidasyon, replace 0.1 M sodyum kakodilat tamponu ya da fosfat tampon maddesi içinde 1 mg / ml diaminobenzidin hidroklorür çözeltisinin 2 ml&#39;si ile tamponu. Işıktan bu çözüm korumak ve oksijenin çözünürlüğünü artırmak için 4 ° C&#39;nin buz üzerinde soğumasını. (Çözelti içine yerleştirilir ve bir oksijen şişeye bağlı bir hortum kullanarak) bir solüsyonu ile oksijen kabarcıkları geçirmek suretiyle oksijen ile çözelti Doymuş. Tekrar pH&#39;ı kontrol edin ve gerekirse ayarlayın. Not: Bu, pH pH 7.0 ve pH 7.6 arasında olduğunu fotooksidasyon reaksiyon için çok önemlidir. </li><li> Dikkatli bir 40x immersiyon yağı objektif lens ile donatılmış bir ters floresan mikroskop üzerine sabit hücrelerle çanak monte edin ve ilgi alanına taşımak. GFP veya CFP filtre küpleri kullanarak mavi ışıkla miniSOG etiketi Excite. MiniSOG 473 nm 10&#39;da bir omuz ile 448 nm bir uyarım maksimum vardır. </li><li> Hatta yeşil miniSOG floresan ha sonra aydınlatma ile devamtamamen kayboldu ve polimerize diaminobenzidin kahverengi fotoğraf oksidasyon ürünü iletilen ışık kanalda çıkana kadar s. Oksidasyon ürünü hücrelerin çoğunda görünür olduğunda, foto-oksidasyon durdurmak için floresan aydınlatma kapatın. NOT: Fotoğraf-oksidasyon objektif lens, filtre iletim dalga boylarında ve verimlilik ve aydınlatma kaynağına göre birkaç dakika sürebilir. </li><li> Postfix&#39;i 0.1 M sodyum kakodilat, pH% 2 gluteraldehit, 1 ml 7,4 tamponu veya 30 dakika boyunca fosfat tamponu pH 7.4 ile hücreleri. </li><li> 0.1 M sodyum kakodilat tamponu, pH 7.4 veya 0.1 M fosfat tamponu pH 7.4 içinde 20 dakika boyunca% 0.1% -0.5 ozmiyum tetroksit hücrelerin zarları sabitleyin. NOT: Bu zarlarını stabilize gerekli ozmiyum tetroksit mümkün olan en düşük konsantrasyonu kullanılması tavsiye edilir. Polimerleştirilmiş DAB çökeltiler ESI güçlü doğrudan tespit edilebilir bir azot yüksek yoğunluğa da sahip yanaozmiyum boyama miniSOG etiketli proteini tespit etmek için ve ESI zarar verebilecek gerekli değildir. Osmiyum tetroksit çok zehirlidir! Davlumbaz çalışın ve yeterince zehirli atık imha edin. </li><li> 30,% 50,% 70,% 90,% 98,% 100,% adım etanol (her biri 5 dakika) ile bir etanol dizi hücreler kurutmak. Daha sonra, bir 1 hücreleri inkübe:% 100 etanol ve akrilik reçinesi (LR White) 1 karışımı ve 100 en azından bir 4 saat hücreleri inkübe edilmeden önce, hücre içine girmesini kolaylaştırmak için 4 saat süre ile bir çalkalama düzenine üzerine tabak koyun % akrilik reçine (LR Beyaz). </li><li> Reçinenin polimerize etmek için, bir jilet kat akrilik reçine hızlandırıcılı kenarı ile etiketlenmiş bir 2 ml mikrosantrifüj tüpü kapağı kesti. Hızlandırıcı sadece jant kapakları ve tüp içine akmaz emin olun. Daha sonra, dikkatlice yaklaşık LR Beyaz reçine Pasteur pipeti kullanarak üçte iki tüp doldurun. Reçine iletişim zekâ içine almaz özenh jant üzerinde hızlandırıcı! </li><li> Çanak hücreleri sızan reçine çıkarmak ve tüpün genişliği neredeyse tamamen çanak cam kaplı gözlem penceresi doldurur ve böylece dik ayakta mikrosantrifüj tüp üzerine baş aşağı çanak yerleştirin. </li><li> Daha sonra, tüp ve lamel mühür tüp reçine artık hücrelerin kapsar şekilde tüp ters çevirmek için hızlandırıcı için 1 dakika 2 bekleyin. </li><li> 60 ° C&#39;da bir fırın içine tüp ile çanak yerleştirin ve 12 saat için tedavi. </li><li> Blok kürünü zaman fırından ekli reçine dolgulu mikrosantrifüj tüp ile çanak kaldırmak ve çanak ependorf tüp ayırın. Sıvı azot ve sıcak su içinde donmuş halde öğütme süreçleri ile ayrılmasını kolaylaştırmak. </li><li> Cam alt çanak atın ve dikkatle bloğu kaldırmak için bir jilet ile ependorf tüp açmak kesti. </li><li> Kalıcı bir kalem ile blok etiketleyin. </li><li> Tri Bir jilet kullanınDaha önce bir elmas veya tungsten kalem ile işaretlenmiştir alanı içerir (veya ilgi hücreleri alanı içeren) 1 ila 2 mm bölgesinde bir şey kalmayacak şekilde blok m. </li><li> Bir ultramicrotome içinde blok monte bir düzeltme bıçakla blok Döşeme ve elmas bıçak kullanarak yaklaşık 50 nm ultra-ince kesitler halinde kesilmiştir. </li><li> Yüksek aktarım 300 meş ızgaraları bölümleri Pick up. Bu ızgaralar çok küçük ızgara çubukları ve böylece ilgi alanında daha az hücre kapsamaktadır. </li><li> Coat karbon yaklaşık 0.2-0.4 nm TEM elektron ışını altında istikrara kavuşturmak için bir karbon kaplayıcı kullanarak ızgaraları bölümleri. </li></ol> 5. Elektron Mikroskobu <ol><li> Bir enerji filtresi ile donatılmış bir TEM içine ızgaraları yükleyin. Mikroskop ve üreticinin talimatlarına göre enerji filtresi ayarlama sonra, düşük büyütme modunda bölümlerde hücreleri kontrol (normal iletim) ve karşılaştırmak(adım 4.4 &#39;de elde edilen) uygun olduğunda bunları veri floresan. </li><li> Ilginç özellikleri (DNA hasarı parça veya DNA onarım odakları) ile bir çekirdeğe kez enerji filtreleme moduna geçin bulundu ve kalınlık haritası kayıt edilir. NOT: Bu prosedür sıfır kayıp ve filtresiz görüntü kaydını içerir. 0.3 kadar kalınlıklar ücretsiz yol (olay demetinin elektron% 30 örnek tarafından dağınık alır) iyi element haritaları oluşturmak için yeterince ince anlamına gelir. </li><li> Kullanılan mikroskop enerji filtresi kontrol yazılımı kullanarak elemanları fosfor ve azot Tutanak oranı haritalar. 20 eV bir yarık genişliği ile de, 120 eV enerji kaybı 20 eV ve ön kenar görüntüleri bir yarık genişliğine sahip 175 eV enerji kaybı fosfor haritası sonrası kenar görüntüleri kaydetmek. Ayrıca 35 eV bir yarık genişliğine sahip 358 eV 35 eV ve ön kenar görüntüleri bir yarık genişliği ile 447 eV azot haritalar, kayıt sonrası kenar görüntüler için. NOT: görüntülü elemanların içeriğinde bu yana (phosphOrus ve nitrojen) (yakl.% 1), gürültü oranı daha iyi bir sinyal ile görüntüler oluşturmak için &quot;3 pencere yöntemi&quot; üzerinde &quot;Oran Görüntü&quot; (kalitatif element harita) (elementer haritayı quantitate) tercih nispeten düşüktür. </li></ol> 6. Görüntü İşleme <ol><li> (Örneğin, Dijital Mikrografik) edinilen resim dosya biçimini işleyebilir bir görüntü işleme yazılımı element oranı haritalar açın. Kırmızı kanal ve bir RGB görüntüsünün yeşil kanal içine fosfor haritası içine azot haritası kopyalayın, daha sonra üst üste ve haritalar hizalayın. </li><li> Etiketli görüntü dosyası biçimi (TIFF) dosyası olarak kompozit görüntü aktarın. Katmanları kullanabileceğiniz bir görüntü işleme yazılımı (örneğin, Photoshop) görüntü açın. </li><li> 8 bitlik veri setine (255 0) ile görüntüdeki minimum ve maksimum değerleri rescaling her kanalın dinamik aralığını ayarlayın. </li><li> Kullanarak azot haritadan fosfor içeriği (ÇıkartProtein dağılımını gösteren bir harita nitel üretmek amacıyla &quot;Katmanlar&quot; pencere). </li><li> &quot;Dizinlenmiş renkli&quot; içine önceki adımda oluşturduğunuz nükleik asit (fosfor) ve protein (azot) haritaları dönüştürme ve nükleik asit dağılımı ve bir mavi arama tablosu gösteren harita için CMYK renk uzayında sarı arama tablosu oluşturmak olmayan nükleoprotein haritayı göstermek için. Renkler, iki element haritalar arasında maksimum kontrast üretmek için seçilir. </li><li> Farklı katmanlar olarak fosfor ve protein dağılımını gösteren haritalar yeni bir görüntü oluşturun ve içe aktarın. Birbirine bindirilmiş iki katmanı görmek için &quot;ekranı&quot; şeffaflık modunu kullanın. </li><li> Adım 5.2 elde sıfır kayıp görüntüyü açın. Bu görüntü, geleneksel TEM görüntü benziyor kaydedilen alanın görüntüsünü temsil ancak numune ile çarpışan olmadan numune geçtik elektronları içeriyor. IhracatTIFF görüntüsü olarak bu görüntü. </li><li> Bir fotoğraf editörü ihraç sıfır kayıp görüntü açın ve element haritayı gösteren görüntünün üst tabakası içine kopyalayın. &quot;Ekran&quot; şeffaflık modunu kullanarak görüntüyü hizalayın. </li><li> İsteğe bağlı eşik segment sıfır kayıp görüntü miniSOG kaynaklanır sinyali. Yukarıda tarif edildiği gibi ayrı bir katman olarak elde edilen görüntü ekleyin. </li></ol>

<ol>
	<li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy.">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> The Journal of Cell Biology. 190, 165-175 (2010).</li><li>Bazett-Jones, D. P., Hendzel, M. J., Kruhlak, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometric+analysis+of+protein-+and+nucleic+acid-based+structures+in+the+cell+nucleus.">Stoichiometric analysis of protein- and nucleic acid-based structures in the cell nucleus.</a> Micron (Oxford, England: 1993). 30, 151-157 (1999).</li><li>Michael J Hendzel, F. M. B., Bazett-Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Visualization+of+a+Protein+Nuclear+Architecture.">Direct Visualization of a Protein Nuclear Architecture.</a> Molecular biology of the cell. 10, 2051 (1999).</li><li>Ottensmeyer, F. P., Andrew, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+microanalysis+of+biological+specimens+by+electron+energy+loss+spectroscopy+and+by+electron+spectroscopic+imaging.">High-resolution microanalysis of biological specimens by electron energy loss spectroscopy and by electron spectroscopic imaging.</a> Journal of ultrastructure research. 72, 336-348 (1980).</li><li>Leapman, R. D., Ornberg, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+electron+energy+loss+spectroscopy+in+biology.">Quantitative electron energy loss spectroscopy in biology.</a> Ultramicroscopy. 24, 251-268 (1988).</li><li>Simon, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+spectroscopic+imaging.">Electron spectroscopic imaging.</a> Ultrastructural pathology. 11, 705-710 (1987).</li><li>Egerton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Electron Energy-Loss Spectroscopy in the Electron Microscope. , (2011).</li><li>Aronova, M. A., Kim, Y. C., Zhang, G., Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+and+thickness+correction+of+EFTEM+phosphorus+maps.">Quantification and thickness correction of EFTEM phosphorus maps.</a> Ultramicroscopy. 107, 232-244 (2007).</li><li>Hopkins, C., Gibson, A., Stinchcombe, J., Futter, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+molecules+employing+horseradish+peroxidase+as+reporter+enzyme+for+protein+localization+in+the+electron+microscope.">Chimeric molecules employing horseradish peroxidase as reporter enzyme for protein localization in the electron microscope.</a> Methods in enzymology. 327, 35-45 (2000).</li><li>Shu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genetically+Encoded+Tag+for+Correlated+Light+and+Electron+Microscopy+of+Intact+Cells,+Tissues,+and+Organisms.">A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms.</a> PLoS biology. 9, e1001041 (2011).</li><li>Gaietta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+and+electron+microscopic+imaging+of+connexin+trafficking.">Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking.</a> Science (New York, NY). 296, 503-507 (2002).</li><li>Fernandez-Capetillo, O., Celeste, A., Nussenzweig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focusing+on+foci:+H2AX+and+the+recruitment+of+DNA-damage+response+factors.">Focusing on foci: H2AX and the recruitment of DNA-damage response factors.</a> Cell cycle (Georgetown, Tex). 2, 426-427 (2003).</li><li>Haaf, T., Golub, E. I., Reddy, G., Radding, C. M., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+foci+of+mammalian+Rad51+recombination+protein+in+somatic+cells+after+DNA+damage+and+its+localization+in+synaptonemal+complexes.">Nuclear foci of mammalian Rad51 recombination protein in somatic cells after DNA damage and its localization in synaptonemal complexes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 2298-2302 (1995).</li><li>Maser, R. S., Monsen, K. J., Nelms, B. E., Petrini, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hMre11+and+hRad50+nuclear+foci+are+induced+during+the+normal+cellular+response+to+DNA+double-strand+breaks.">hMre11 and hRad50 nuclear foci are induced during the normal cellular response to DNA double-strand breaks.</a> Molecular and Cellular Biology. 17, 6087-6096 (1997).</li><li>Bekker-Jensen, S., Mailand, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+function+of+DNA+double-strand+break+repair+foci+in+mammalian+cells.">Assembly and function of DNA double-strand break repair foci in mammalian cells.</a> DNA repair. 9, 1219-1228 (2010).</li><li>Chapman, J. R., Sossick, A. J., Boulton, S. J., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRCA1-associated+exclusion+of+53BP1+from+DNA+damage+sites+underlies+temporal+control+of+DNA+repair.">BRCA1-associated exclusion of 53BP1 from DNA damage sites underlies temporal control of DNA repair.</a> Journal of cell science. 125, 3529-3534 (2012).</li><li>Dellaire, G., Kepkay, R., Bazett-Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+imaging+of+changes+in+the+structure+and+spatial+organization+of+chromatin,+gamma-H2A.X+and+the+MRN+complex+within+etoposide-induced+DNA+repair+foci.">High resolution imaging of changes in the structure and spatial organization of chromatin, gamma-H2A.X and the MRN complex within etoposide-induced DNA repair foci.</a> Cell cycle (Georgetown, Tex). 8, 3750-3769 (2009).</li><li>Kruhlak, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+chromatin+structure+and+mobility+in+living+cells+at+sites+of+DNA+double-strand+breaks.">Changes in chromatin structure and mobility in living cells at sites of DNA double-strand breaks.</a> The Journal of Cell Biology. 172, 823-834 (2006).</li><li>Goodson, H. V., Dzurisin, J. S., Wadsworth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+stable+cell+lines+expressing+GFP-tubulin+and+photoactivatable-GFP-tubulin+and+characterization+of+clones.">Generation of stable cell lines expressing GFP-tubulin and photoactivatable-GFP-tubulin and characterization of clones.</a> Cold Spring Harbor protocols. 2010, (2010).</li><li>Zeyda, M., Borth, N., Kunert, R., Katinger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+sorting+conditions+for+the+selection+of+stable,+high-producing+mammalian+cell+lines.">Optimization of sorting conditions for the selection of stable, high-producing mammalian cell lines.</a> Biotechnology progress. 15, 953-957 (1999).</li><li>Dellaire, G., Nisman, R., Bazett-Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+spectroscopic+imaging+of+chromatin+in+situ.">Correlative light and electron spectroscopic imaging of chromatin in situ.</a> Methods in enzymology. , 375-456 (2004).</li><li>Campbell, S., Ismail, I. H., Young, L. C., Poirier, G. G., Hendzel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb+repressive+complex+2+contributes+to+DNA+double-strand+break+repair.">Polycomb repressive complex 2 contributes to DNA double-strand break repair.</a> Cell cycle. 12, 2675-2683 (2013).</li><li>Mortusewicz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+RNA+polymerase+II+cofactor+PC4+to+DNA+damage+sites.">Recruitment of RNA polymerase II cofactor PC4 to DNA damage sites.</a> J Cell Biol. 183, 769-776 (2008).</li><li>Bekker-Jensen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+the+mammalian+genome+surveillance+machinery+in+response+to+DNA+strand+breaks.">Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks.</a> The Journal of Cell Biology. 173, 195-206 (2006).</li><li>Ferrando-May, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highlighting+the+DNA+damage+response+with+ultrashort+laser+pulses+in+the+near+infrared+and+kinetic+modeling.">Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling.</a> Frontiers in genetics. 4, 135 (2013).</li><li>Lukas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+nuclear+bodies+form+around+DNA+lesions+generated+by+mitotic+transmission+of+chromosomes+under+replication+stress.">53BP1 nuclear bodies form around DNA lesions generated by mitotic transmission of chromosomes under replication stress.</a> Nature. 13, 243-253 (2011).</li><li>Harrigan, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+stress+induces+53BP1-containing+OPT+domains+in+G1+cells.">Replication stress induces 53BP1-containing OPT domains in G1 cells.</a> The Journal of Cell Biology. 193, 97-108 (2011).</li><li>Aronova, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprint+of+'Three-dimensional+elemental+mapping+of+phosphorus+by+quantitative+electron+spectroscopic+tomography+(QuEST).">Reprint of 'Three-dimensional elemental mapping of phosphorus by quantitative electron spectroscopic tomography (QuEST).</a> J. Struct. Biol. 161, 322-335 (2007).</li><li>Fussner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+heterochromatin+reorganization+during+somatic+cell+reprogramming.">Constitutive heterochromatin reorganization during somatic cell reprogramming.</a> The EMBO journal. 30, 1778-1789 (2011).</li><li>Kepkay, R., Attwood, K. M., Ziv, Y., Shiloh, Y., Dellaire, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KAP1+depletion+increases+PML+nuclear+body+number+in+concert+with+ultrastructural+changes+in+chromatin.">KAP1 depletion increases PML nuclear body number in concert with ultrastructural changes in chromatin.</a> Cell cycle. 10, 308-322 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ESI özellikle fosfor bakımından zengin olan alanlar harita yapabiliyor çünkü çekirdeğinde kromatin ve ribonükleoproteinlerin farklı durumları incelemek için mükemmel bir araç olarak hizmet verebilir. Bu derinden bir elektron mikroskobu ile elde edilen ve spesifik olmayan zıt yöntemleri bağımlı değildir olabilir ayrıntı miktarını artırır. ESI bir dezavantajı aynı hızlanan gerilimde geleneksel TEM daha ince kesitler gerektirir. Bu seri bölümleri ile çalışan veya tomografik yöntemlerle <s...

Son yıllarda üzerinde 1 ışık mikroskobu önemli gelişmelere rağmen, hücre biyologlar hala çözünürlükte bir boşluk muzdarip. Bu makromoleküler kompleksleri arasında koordineli etkileşimi içeren temel hücresel süreçleri yapı-fonksiyon ilişkilerinin anlaşılmasını sınırlar (örneğin, kromatin yeniden, DNA onarımı, RNA transkripsiyonu ve DNA replikasyonu olarak). Transmisyon elektron mikroskopları (TEM) gerekli çözünürlüğü sağlamak s olsa da, görsel yapıların biyokimyasal kompozisyonu belirlemek mümkün olurken spesifik proteinlerin etiket yapısal yetersizlik nedeniyle bu süreçleri tanımlamak için zorlu olmuştur. Nükleer yapıları ayırt etmeye yardımcı iç membran yokluğunda, çekirdek özellikle zor olmuştur. Elektron spektroskopik görüntüleme (ESI), DNA, RNA ve prot eş zamanlı algılama ve farklılaşmasını izin vererek bu sınırlamaların bazılarını çözerNükleer yapılar 2-5 ein tabanlı. Elektron spektroskopik görüntüleme: Elektron mikroskobu yüksek hassasiyet ve çözünürlükte element dağılımları haritası için bir esnek olmayan numune 6 bir elemanın iç kabuk elektronları ile etkileşimleri dağılmış olan elektronların seçer bir görüntüleme spektrometresi kullanabilirsiniz. Enerji elemanı spesifik miktarlarda numune atom iyonizasyonu bir sonucu olarak kaybolur, çünkü bu elektron ayrıldı ve elektron mikroskobu bağlı bir spektrometre kullanılarak görüntülenebilir. Böylece numune ile etkileşimde elektronların spektrumunun analizi örneği 7 element kompozisyonu hakkında nitel ve nicel bilgiler ortaya koymaktadır. Numune geçerken enerji kaybetmek yok elektronlar elektron enerji kaybı &quot;sıfır kayıp zirve&quot; bulunurtayfı. Bu elektronların bolluğu numune kütlesi, yoğunluğu ve kalınlığı ile ilgilidir ve numune ile çarpışan veya numunenin geçişi sırasında enerji kaybı olmadan numune geçmesine elektron oluşur. Bu bilgiler, örnek 8, belirli bir eleman mevcut atomların sayıları mutlak ölçümü için yararlı olabilir. Biyolojik örnekler heavy metal kullanarak çoğunlukla kötü TEM olay ışın elektronları saptırmak hafif elementlerin, boyama metotları oluşur beri tuzları numunedeki kontrast üretmek için uygulanmak zorundadır. Bu farklı maddeler ve yetersizlik en özgüllüğü mümkündür birden fazla leke görselleştirmek için özgüllüğü olmaması çekirdeğinin çalışmada bilinen elektron mikroskobu değeri sınırlıdır. ESI özellikle hücre çekirdeğinin yapıların çalışma, geleneksel TEM göre önemli avantajlara sahiptir.Bu protein komplekslerinden nükleoprotein kompleksleri ayırmak için ve nükleik asitlerin yoğunluklarına dayalı olarak farklı nükleoprotein kompleksleri çözmek için nitelikteki DNA- ve RNA-içeren makromoleküler kompleksler fosfor açısından zengin doğasını yararlanmak mümkündür. Kalan biyolojik madde azot bolluğu dayalı görüntülü olabilir. Farklı anatomik yapıların içindeki dağılımı ve göreceli bolluk Haritalama sadece bu iki element ve analiz çekirdeğinin hakkında bilgi bir sürü bize sağlar. Örneğin, kromatine ve fosfor bolluğu temsil harita ribozomlar tespit etmek kolaydır. Interkromatin alanı, çekirdek gözenek kompleks ve nükleer organları, diğer yandan kolayca azot harita görüntü tespit edilebilir. Mini singlet oksijen jeneratörü sistemi (miniSOG) ESI güçlü bir teknik temsil ederken o alır çünkü yerinde kromatin yapısı okumak içinfosfor ve azot ile elementel kompozisyon karakteristik oranların s avantajı, element bir bileşim, normal protein kompleksleri farklı popülasyonlar arasında ayrım yapmak için kullanılamaz. Nanometre aralığındaki küçük altın parçacıkları ile etiketlenmiş antikorlar yaygın tek tek moleküller yerini haritalandırmak için kullanılmıştır. Altın partikül genellikle İkincil antikora bağlı olduğu için, bu primer antikor ile tespit epitopa çapında yaklaşık 20 nm&#39;lik bir çevresi içinde görünür. Sonrası gömme örneklerde, antikorlar tek bölümlerin yüzeyinde ortaya epitopu algılar. Bu, elde edilen bilgileri bir antijenin varlığı ispat ve hücrenin belirli bir anatomik yapıya ilişkilendirilmesi mümkün olsa da epitop en reçine ile örtülü olduğundan, tam değildir. Boyunca antijenlere erişime izin, floresan mikroskop için kullanılanlara benzer protokollerini kullanan teknikleri, Ön-gömmenumunenin tamamı derinliği ancak genellikle lipid membranların çıkarılmasını gerektirebilir ve aldehitler ile sabit olamaz bileşenleri kaldırmak antikor hücresine nüfuz sağlamak için gerekli olan permeabilizasyon adımlar. Ayrıca, ultrastrüktür korunması, glutaraldehit için tercih edilen aldehit sabitleştirici, yaygın dolayısıyla paraformaldehit tipik gereklidir epitopları tahrip ve. Bu protein-protein çapraz bağlama az etkilidir. Altın bir nanopartikül ile etiketlenmiş antikorların başka bir dezavantajı, altın zayıf kontrast örnek, ilginç yapısal detayları belirsiz olabilir güçlü bir kontrast oluşturan bir çok elektron-yoğun malzeme olmasıdır. Bir ifade edilen protein etiketi gibi yeşil flüoresan protein (GFP) ortaya çıkması hücre biyolojisinde soruları cevaplamak için floresan mikroskopi kullanımını dönüştürdü. Küçük bir flüoresan alana sahip bir protein etiketleme in vivo dağılım eşleme sağlar </em&gt; yapısını değiştirebilir permeabilizasyon prosedürlere gerek kalmadan. Mikroskopi elektron bir hücrede protein dağılımlarını eşleştirmek için protein etiketleri kullanarak zarif prensibini çevirmek için, bir sistem ilgi yapısına sinyal yakın üretmek ve TEM kontrast oluşturmak mümkün olduğunu gerekiyordu. Polimerize diaminobenzidinin genellikle bağlayıcı antikor tespit etmek histoloji kullanılan bir leke olduğunu. Bu leke genellikle ikinci antikoruna konjüge edilmiş yaban turpu peroksidazı (HRP) ile bırakılır. Reaksiyon, güvenilir bir sonuç üretir, ancak HRP hücrelerinin 9 sitozolünde katalitik olarak aktif değildir. Kendi çözünürlük NanoGold yöntemi 10 daha kötü olduğunu, HRP, reaksiyon ürünleri de kuşak mevkiden uzağa yayılabilir. Bu sorunları aşmak için, flash / ReAsH sistemi 11 geliştirilmiştir. Bir Tetracysteine ​​motifine sahip olan yeniden birleştirici füzyon proteinlerinin oluşur. Bu motif bağlanmasını sağlarBir biarsenic fluorofor. Heyecan, ilişkili veya FLASH ya da ReAsH etiketli proteinlerin yerinde hemen çökeltilerin a polimere singlet oksijeni ve böylece photoconvert diaminobenzidin (DAB) üretebilir. DAB polimeri, elektron yoğun ve dolayısıyla TEM rekombinant füzyon proteininin dağılımının haritasının için kullanılabilir osmium tetroksit ile boyanmış olabilir. 2011 yılında, Shu ve ark. 10 floresan ve 448 nm mavi ışık ile uyarıldığı zaman birçok singlet oksijen radikallerini oluşturmak mümkün Arabidopsis bir flavoprotein türetilen küçük 106 amino asit füzyon etiketinin oluşan miniSOG sistemini sundu. Bu tekli oksijen radikalleri ve immünolojik etiketlenmiş antikorlar 11 önemli ölçüde daha yakın olan etiketli protein, yüzeyine yakın polimerleri oluşturmak için foto-oksidaz diaminobenzidin için kullanılabilir. Flaş / ReAsH sistem floro getiren gerektirirkenkrom ve Fotoçevrim yapmadan önce hücre içine diaminobenzidinin, miniSOG sistem sadece diaminobenzidin ve ışık gerektiren ve buna ek olarak diaminobenzidin polimerize yaklaşık iki kat etkilidir. Burada, miniSOG DNA tamir odaklarının ultra yapısını eşlemek amacıyla ESI ile bir arada kullanılmaktadır. DNA tamir odakları (DRF) Onlar translokasyonlarda ve genetik bilginin kaybına yol açabilir çünkü unrepaired DNA çift iplikli sonları hücreye ciddi bir tehdit oluşturmaktadır. Buna karşılık, bu yaşlanma, kanser ve hücre ölümüne yol açabilir. DNA çift iplikli sonu onarım katılan pek çok protein 12-14 kırmak DNA çift sarmalı etrafında bir araya odaklar birikir. Bunların işlevi kesin olarak bilinmemekle birlikte, bu DNA çift iplik sonu içeren ve DNA çift iplik kırılım onarımı edilir çekirdeğinde sitesini göstermektedir. DNA tamir foci (DRF) floresan mikroskobu ile karakterize edilmiştir ve DNA hasarı 12,15 için biyomarkerların olarak hizmet vermektedir. Onlar çift iplikli mola büyüklüğüne masif göreli ve son süper çözünürlük mikroskop çalışmaları her 16 odak içinde moleküllerin alt bölümlendirme bazı kanıtlar ortaya dek görece homojen olarak kabul edildi. Bu siteler organize anlamak için, birbirine yatan biyolojik yapıların tüm göreceli görselleştirmek için gereklidir. Bu floresan mikroskobu ile elde ancak elektron mikroskobu 17,18 ile mümkün olamaz. Burada bir yöntem DNA çift sarmallı mola onarım ultrastrüktür keşfetmek için bu kombine yaklaşımın potansiyelini göstermek için miniSOG yöntemi ile elektron spektroskopik görüntüleme birleştiren açıklanmıştır.

<table><tbody><tr><td>35 mm glass bottom dishes</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Gridded 35 mm glass bottom dishes</td><td>MatTek</td><td>P35G-2-14-CGRD&amp;nbsp;</td><td>not made for immersion objectives</td></tr><tr><td>LR White: acryl resin</td><td>emsdiasum</td><td>14381</td><td></td></tr><tr><td>LR White accelerator</td><td>emsdiasum</td><td>14385</td><td></td></tr><tr><td>3,3&amp;prime;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets</td><td>Sigma</td><td>D5905</td><td></td></tr><tr><td>Slim Bar Grids 300 Mesh</td><td>SPI</td><td>1161123</td><td></td></tr><tr><td>Tungsten-Point Lab Pen</td><td>emsdiasum</td><td>41148</td><td></td></tr><tr><td>Osmium Tetroxide</td><td>emsdiasum</td><td>19100</td><td></td></tr><tr><td>Carbon Coater 208 carbon</td><td>Cressington</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultra microtome Leica EM UC6</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photoshop CS5</td><td>Adobe</td><td></td><td>might even work with older versions</td></tr><tr><td>Digital Micrograph V.2.30</td><td>Gatan</td><td></td><td>might even work with older versions</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma</td><td>H-1399</td><td></td></tr><tr><td>Effectene</td><td>Quiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MiniSOG-Constructs</td><td>Tsien-Lab</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;mailto:tsienlab@yahoo.com&quot;&gt;tsienlab@yahoo.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>MDC1 miniSOG mCherry</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>53BP1 miniSOG mCherry</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rad52 miniSOG mCherry</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cesium 137 radiation source &quot;MARK 1&quot;</td><td>&amp;nbsp;(J.L. Shepherd &amp;amp; Associated)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ/FiJi</td><td>open source</td><td></td><td>http://fiji.sc/Fiji</td></tr><tr><td>2 ml Eppendorf tubes</td><td>Fisherbrand</td><td>05-408-146</td><td></td></tr><tr><td>Diamond Knife ultra 35&amp;deg;</td><td>Diatome</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trimming Knife ultratrim</td><td>Diatome</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium cacodylate trihydrate</td><td>emsdiasum</td><td>12300</td><td>Caution Toxic!</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde EM Grade 8%</td><td>emsdiasum</td><td>16020</td><td>Caution Toxic!</td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic</td><td>emsdiasum</td><td>21180</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic</td><td>emsdiasum</td><td>21190</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>emsdiasum</td><td>19202</td><td></td></tr><tr><td>Osmium tetroxide 4% solution</td><td>emsdiasum</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>Inverted Fluorescence Micoscope Axiovert 200M</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid</td><td>Fisherbrand</td><td>A142-212</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide Solution 10M</td><td>Fluka</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>Oxygen</td><td>Medigas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-Amino-1,2,4-triazole</td><td>Sigma</td><td>A8056</td><td></td></tr><tr><td>Potassium cyanide</td><td>Sigma</td><td>207810</td><td>Caution Toxic!</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>emsdiasum</td><td>15058</td><td>Caution Toxic!</td></tr><tr><td>Razor blade Single Edge Carbon Steel</td><td>emsdiasum</td><td>71960</td><td>Caution Sharp!</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D 5546</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Life Technologies</td><td>11811-023</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Transmission Electron Microscope 200 kV</td><td>JEOL</td><td>2100</td><td></td></tr><tr><td>GIF Tridiem 863 Energy filter</td><td>Gatan</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualization of minisog tagged dna repair proteins in combination with electron spectroscopic imaging (esi)

Optik çözünürlük ve transmisyon elektron mikroskobu spesifik protein popülasyonlarını tanımlama meydan sınırları hücre biyolojisinde engeller olmuştur. Birçok fenomen basit sistemler, in vitro analizi ile açıklanabilir ve tam anlaşılması için, bilhassa 1 nm ve 0,1 um aralığında, yerinde ek yapısal bilgi mi edilemez. Burada, elektron spektroskopi görüntüleme, protein ve nükleik asitlerin dağılımının eşzamanlı eşleme sağlayan bir transmisyon elektron mikroskobu tekniği ve bir ekspresyon etiketi miniSOG DNA çift iplik kırılım onarımı odaklarının yapısını ve organizasyonunu incelemek için bir araya getirilmektedir.

ESI Konvansiyonel TEM görüntüleri ile çekirdeğe (Şekil 1) ESI görüntülerini karşılaştırarak (örneğin, Şekil 7-1) kolayca ayırt edilebilir anatomik yapıların dramatik bir artış ortaya koymaktadır. Kromatin sırtlar sarı görünür ve fare hücrelerinde chromocenters belirlemek oldukça kolaydır. Prefabrik ribozomlar önce fosfor yönünden zengin olan RNA, ek olarak nitrojen açısından zengin bir protein, y?...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging ESI at JoVE.com

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging ESI

Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

Elektron Spektroskopik Görüntüleme Kombinasyonunun miniSOG Etiketli DNA Onarım Proteinler Görselleştirme (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in ...

visualization-minisog-tagged-dna-repair-proteins-combination-with

Research

JoVE Journal

Biology

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging (ESI)

10.0K Görüntüleme.  University of Alberta. Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

Video: Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging ESI

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of programmed DNA breaks in lymphocytes. The Ataxia-Telangiectasia Mutated kinase (ATM), ATM- and Rad3-Related kinase (ATR) and the catalytic subunit of DNA-dependent Protein Kinase (DNA-PKcs) are among the first that are activated upon induction of DNA damage, and are central regulators of a network that controls DNA repair, apoptosis and cell survival. As part of a tumor-suppressive pathway, ATM and ATR activate p53 through phosphorylation, thereby regulating the transcriptional activity of p53. DNA damage also results in the formation of so-called ionizing radiation-induced foci (IRIF) that represent complexes of DNA damage sensor and repair proteins that accumulate at the sites of DNA damage, which are visualized by fluorescence microscopy. Co-localization of proteins in IRIFs, however, does not necessarily imply direct protein-protein interactions, as the resolution of fluorescence microscopy is limited. 
In situ Proximity Ligation Assay (PLA) is a novel technique that allows the direct visualization of protein-protein interactions in cells and tissues with unprecedented specificity and sensitivity. This technique is based on the spatial proximity of specific antibodies binding to the proteins of interest. When the interrogated proteins are within ~40 nm an amplification reaction is triggered by oligonucleotides that are conjugated to the antibodies, and the amplification product is visualized by fluorescent labeling, yielding a signal that corresponds to the subcellular location of the interacting proteins. Using the established functional interaction between ATM and p53 as an example, it is demonstrated here how PLA can be used in suspension cell cultures to study the direct interactions between proteins that are integral parts of the DNA damage response.

Here, it is demonstrated how the in situ Proximity Ligation Assay (PLA) can be used to detect and visualize the direct protein-protein interactions between ATM and p53 in suspension cell cultures exposed to genotoxic stress.

Proximity Ligation Testi ile Süspansiyon Hücre Kültürlerinde DNA Hasarına Bağlı Protein Komplekslerinin Saptanması ve Görselleştirilmesi

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Biyokimya

Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand genome maintenance mechanisms. Since recruitment and exchange of proteins at lesions are highly dynamic, their study requires the ability to generate DNA damage in a rapid and spatially-delimited manner. Here, we describe procedures to locally induce DNA damage in human cells using a commonly available laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser line. Accumulation of genome maintenance factors at laser stripes can be assessed by immunofluorescence (IF) or in real-time using proteins tagged with fluorescent reporters. Using phosphorylated histone H2A.X (&#947;-H2A.X) and Replication Protein A (RPA) as markers, the method provides sufficient resolution to discriminate locally-recruited factors from those that spread on adjacent chromatin. We further provide ImageJ-based scripts to efficiently monitor the kinetics of protein relocalization at DNA damage sites. These refinements greatly simplify the study of the DDR dynamics.

Studying DNA damage repair kinetics requires a system to induce lesions at defined sub-nuclear regions. We describe a method to create localized double-stranded breaks using a laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser and provide automated procedures to quantify the dynamics of repair factors at these lesions.

Soruşturma 405 Nm lazer mikro-ile kullanarak DNA lezyonlar için Protein alımı

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand ...

Genetik

Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair complexes. This process is regulated by a myriad of proteins that promote the association and disassociation of proteins to these lesions. Thanks in large part to the ability to perform functional screens of a vast library of proteins, there is a greater appreciation of the genes necessary for the double-strand DNA break repair. Often knockout or chemical inhibitor screens identify proteins involved in repair processes by using increased toxicity as a marker for a protein that is required for DSB repair. Although useful for identifying novel cellular proteins involved in maintaining genome fidelity, functional analysis requires the determination of whether the protein of interest promotes localization, formation, or resolution of repair complexes. 
The accumulation of repair proteins can be readily detected as distinct nuclear foci by immunofluorescence microscopy. Thus, association and disassociation of these proteins at sites of DNA damage can be accessed by observing these nuclear foci at representative intervals after the induction of double-strand DNA breaks. This approach can also identify mis-localized repair factor proteins, if repair defects do not simultaneously occur with incomplete delays in repair. In this scenario, long-lasting double-strand DNA breaks can be engineered by expressing a rare cutting endonuclease (e.g., I-SceI) in cells where the recognition site for the said enzyme has been integrated into the cellular genome. The resulting lesion is particularly hard to resolve as faithful repair will reintroduce the enzyme's recognition site, prompting another round of cleavage. As a result, differences in the kinetics of repair are eliminated. If repair complexes are not formed, localization has been impeded. This protocol describes the methodology necessary to identify changes in repair kinetics as well as repair protein localization.

Repair of double-strand DNA breaks is a dynamic process, requiring not only formation of repair complexes at the breaks, but also their resolution after the lesion is addressed. Here, we use immunofluorescence microscopy for transient and long-lasting double-stranded breaks as a tool to dissect this genome maintenance mechanism.

DNA onarım işlemleri, Darbe Gerilimlerinden ve uzun süreli iki iplikçikli DNA sonları ayirt mikroskobu ile karakterize

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

Kanser Araştırmaları

Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome organization are governed by DNA-binding proteins that recognize specific DNA structures or sequences. In vitro experiments have helped to generate detailed models for the function of many types of DNA-binding proteins, yet, the exact mechanisms of these processes and their organization in the complex environment of the living cell remain far less understood. We recently introduced a method for quantifying DNA-repair activities in live Escherichia coli cells using Photoactivated Localization Microscopy (PALM) combined with single-molecule tracking. Our general approach identifies individual DNA-binding events by the change in the mobility of a single protein upon association with the chromosome. The fraction of bound molecules provides a direct quantitative measure for the protein activity and abundance of substrates or binding sites at the single-cell level. Here, we describe the concept of the method and demonstrate sample preparation, data acquisition, and data analysis procedures.

Photoactivated localization microscopy (PALM) combined with single-molecule tracking allows direct observation and quantification of protein-DNA interactions in live Escherichia coli cells.

Fotoaktive Tek molekül Takip Kullanma Canlı Bakteriyel Hücrelerde Protein-DNA Etkileşimleri görselleştirme

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Immunofluorescence is one of the most widely used techniques to visualize target antigens with high sensitivity and specificity, allowing for the accurate identification and localization of proteins, glycans, and small molecules. While this technique is well-established in two-dimensional (2D) cell culture, less is known about its use in three-dimensional (3D) cell models. Ovarian cancer organoids are 3D tumor models that recapitulate tumor cell clonal heterogeneity, the tumor microenvironment, and cell-cell and cell-matrix interactions. Thus, they are superior to cell lines for the evaluation of drug sensitivity and functional biomarkers. Therefore, the ability to utilize immunofluorescence on primary ovarian cancer organoids is extremely beneficial in understanding the biology of this cancer. The current study describes the technique of immunofluorescence to detect DNA damage repair proteins in high-grade serous patient-derived ovarian cancer organoids (PDOs). After exposing the PDOs to ionizing radiation, immunofluorescence is performed on intact organoids to evaluate nuclear proteins as foci. Images are collected using z-stack imaging on confocal microscopy and analyzed using automated foci counting software. The described methods allow for the analysis of temporal and special recruitment of DNA damage repair proteins and colocalization of these proteins with cell-cycle markers.

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

The present protocol describes methods for evaluating DNA damage repair proteins in patient-derived ovarian cancer organoids. Included here are comprehensive plating and staining methods, as well as detailed, objective quantification procedures.

İmmünofloresan Tahlilleri ile Hasta Kaynaklı Yumurtalık Kanseri Organoidlerinde DNA Hasar Onarım Proteinlerinin Görselleştirilmesi

Immunofluorescence is one of the most widely used techniques to visualize target antigens with high sensitivity and specificity, allowing for the accurate ...

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

Inaccurate replication in the presence of DNA damage is responsible for the majority of cellular rearrangements and mutagenesis observed in all cell types and is widely believed to be directly associated with the development of cancer in humans. DNA damage, such as that induced by UV irradiation, severely impairs the ability of replication to duplicate the genomic template accurately. A number of gene products have been identified that are required when replication encounters DNA lesions in the template. However, a remaining challenge has been to determine how these proteins process lesions during replication in vivo. Using Escherichia coli as a model system, we describe a procedure in which two-dimensional agarose-gel analysis can be used to identify the structural intermediates that arise on replicating plasmids in vivo following UV-induced DNA damage. This procedure has been used to demonstrate that replication forks blocked by UV-induced damage undergo a transient reversal that is stabilized by RecA and several gene products associated with the RecF pathway. The technique demonstrates that these replication intermediates are maintained until a time that correlates with the removal of the lesions by nucleotide excision repair and replication resumes.

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

We present a procedure by which two-dimensional agarose-gel analysis can be used to identify the structure of replication intermediates that occur following UV irradiation.

UV ile indüklenen Çoğaltma Ara Görselleştirme E. coli İki boyutlu agaroz-jel Analizi

Inaccurate replication in the presence of DNA damage is responsible for the majority of cellular rearrangements and mutagenesis observed in all cell types ...

Biyoloji

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological approach to analyzing protein kinetics at DNA lesions over time or protein-protein interactions on locally microirradiated chromatin. We also show how to recognize individual phases of the cell cycle using the Fucci cellular system to study cell-cycle-dependent protein kinetics at DNA lesions. A methodological description of the use of two UV lasers (355 nm and 405 nm) to induce different types of DNA damage is also presented. Only the cells microirradiated by the 405-nm diode laser proceeded through mitosis normally and were devoid of cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs). We also show how microirradiated cells can be fixed at a given time point to perform immunodetection of the endogenous proteins of interest. For the DNA repair studies, we additionally describe the use of biophysical methods including FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) and FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) in cells with spontaneously occurring DNA damage foci. We also show an application of FLIM-FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) in experimental studies of protein-protein interactions.

Laser microirradiation is a useful tool for studies of DNA repair in living cells. A methodological approach for the use of UVA lasers to induce various DNA lesions is shown. We have optimized a method for local microirradiation that maintains the normal cell cycle; thus, irradiated cells proceed through mitosis.

Gelişmiş protein-protein etkileşimleri ve Kinetik DNA lezyonlar, çalışmaya Confocal mikroskobu teknikleri

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...

Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA insults. Genotoxic agents can damage the DNA backbone, break it, or modify the chemical nature of individual bases. Following DNA insult, DNA damage response (DDR) pathways are activated and proteins involved in the repair are recruited. A plethora of factors are involved in sensing the type of damage and activating the appropriate repair response. Failure to correctly activate and recruit DDR factors can lead to genomic instability, which underlies many human pathologies including cancer. Studies of DDR proteins can provide insights into genotoxic drug response and cellular mechanisms of drug resistance.
There are two major ways of visualizing&#160;proteins in vivo: direct observation, by tagging the protein of interest with a fluorescent protein and following it by live imaging, or indirect immunofluorescence on fixed samples. While visualization of fluorescently tagged proteins allows precise monitoring over time, direct tagging in N- or C-terminus can interfere with the protein localization or function. Observation of proteins in their unmodified, endogenous version is preferred. When DNA repair proteins are recruited to the DNA insult, their concentration increases locally and they form groups, or &#8220;foci&#8221;, that can be visualized by indirect immunofluorescence using specific antibodies.
Although detection of protein foci does not provide a definitive proof of direct interaction, co-localization of proteins in cells indicates that they regroup to the site of damage and can inform of the sequence of events required for complex formation. Careful analysis of foci spatial overlap in cells expressing wild type or mutant versions of a protein can provide precious clues on functional domains important for DNA repair function. Last, co-localization of proteins indicates possible direct interactions that can be verified by co-immunoprecipitation in cells, or direct pulldown using purified proteins.

Following DNA damage, human cells activate essential repair pathways to restore the integrity of their genome. Here, we describe the method of indirect immunofluorescence as a means to detect DNA repair proteins, analyze their spatial and temporal recruitment, and help interrogate protein-protein interaction at the sites of DNA damage.

DNA Onarım Proteinlerinin İmmünfluoresan Etkileşiminin Görselleştirilmesi

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA ...

Visualizing and Quantifying Endonuclease-Based Site-Specific DNA Damage

Cells are continuously exposed to various DNA damaging agents, inducing different cellular responses. Applying biochemical and genetic approaches is essential in revealing cellular events associated with the recruitment and assembly of DNA repair complexes at the site of DNA damage. In the last few years, several powerful tools have been developed to induce site-specific DNA damage. Moreover, novel seminal techniques allow us to study these processes at the single-cell resolution level using both fixed and living cells. Although these techniques have been used to study various biological processes, herein we present the most widely used protocols in the field of DNA repair, Fluorescence Immunostaining (IF) and Chromatin Immunoprecipitation (ChIP), which in combination with endonuclease-based site-specific DNA damage make it possible to visualize and quantify the genomic occupancy of DNA repair factors in a directed and regulated fashion, respectively. These techniques provide powerful tools for the researchers to identify novel proteins bound to the damaged genomic locus as well as their post-translational modifications necessary for their fine-tune regulation during DNA repair.

This article introduces essential steps of immunostaining and chromatin immunoprecipitation. These protocols are commonly used to study DNA damage-related cellular processes and to visualize and quantify the recruitment of proteins implicated in DNA repair.

Endononülaz Bazlı Meydana Özgü DNA Hasarlarını Görselleştirme ve Ölçme

Cells are continuously exposed to various DNA damaging agents, inducing different cellular responses. Applying biochemical and genetic approaches is ...

RPA2 İmmünofloresan Boyama ile G1 Fazlı Tek Sarmallı DNA Odaklarının Tespiti

Visualizing Single-Stranded DNA Foci in the G1 Phase of the Cell Cycle

DNA has dedicated cellular repair pathways capable of coping with lesions that could arise from both endogenous and/or exogenous sources. DNA repair necessitates collaboration between numerous proteins, responsible for covering a broad range of tasks from recognizing and signaling the presence of a DNA lesion to physically repairing it. During this process, tracks of single-stranded DNA (ssDNA) are often created, which are eventually filled by DNA polymerases. The nature of these ssDNA tracks (in terms of both length and number), along with the polymerase recruited to fill these gaps, are repair pathway-specific. The visualization of these ssDNA tracks can help us understand the complicated dynamics of DNA repair mechanisms.
This protocol provides a detailed method for the preparation of G1 synchronized cells to measure ssDNA foci formation upon genotoxic stress. Using an easy-to-utilize immunofluorescence approach, we visualize ssDNA by staining for RPA2, a component of the heterotrimeric replication protein A complex (RPA). RPA2 binds to and stabilizes ssDNA intermediates that arise upon genotoxic stress or replication to control DNA repair and DNA damage checkpoint activation. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) staining is used to visualize DNA replication to exclude any S phase cells. This protocol provides an alternative approach to the conventional, non-denaturing 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU)-based assays and is better suited for the detection of ssDNA foci outside the S phase.

Yazar Spotlight: Terapötik İçgörüler için DNA Onarımı Sırasında Tek Sarmallı DNA'yı Görselleştirme 

The following protocol presents the detection of single-stranded DNA foci in the G1 phase of the cell cycle utilizing cell cycle synchronization followed by RPA2 immunofluorescent staining.

Hücre Döngüsünün G1 Fazında Tek Sarmallı DNA Odaklarının Görselleştirilmesi

DNA has dedicated cellular repair pathways capable of coping with lesions that could arise from both endogenous and/or exogenous sources. DNA repair ...