This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) through the Collaborative Research Initiative 796 (SFB796) to A.L. and C.B., and through the ERA-NET PathoGenoMics 3rd call to A.L.

1. Generación de líneas celulares estables que expresan la proteína de interés <ol><li> Preparar los medios de comunicación mediante la adición de FCS inactivado por calor y 1% de penicilina / estreptomicina al comercialmente disponible Dulbecco medio Eagle modificado (DMEM) suplementado con GlutaMAX-I, el piruvato, y 4,5 g / L de D-glucosa. </li><li> Cultivar las células HEK293 en medios a 37 ° C en 5% de CO 2. Sub-cultivar células cada tercer día. Retire los medios de comunicación y resuspender las células en 15 ml de medio fresco. Pipeta 1 ml en un nuevo 75 cm 2 frasco de cultivo celular y añadir 14 ml de medio. </li><li> Analizar el número de células utilizando un hemocitómetro. </li><li> Semilla células HEK293 en una placa de 6 pocillos a una densidad de 2 x 10 5 células por pocillo y se incuban durante 24 horas. </li><li> Para la transfección utilizar el protocolo proporcionado por el fabricante del reactivo de transfección. Transfectar células con pEGFP-C2 o pEGFP-C2-CAEB utilizando el reactivo de transfección. Antes de su uso, calentar el reag transfecciónent y los medios necesarios para RT. Utilice una proporción de 3: 1 de reactivo de transfección con el ADN. <ol><li> En detalle, pipeta 1,5 l de reactivo de transfección directamente en 50 l de medio DMEM libre de suero. Para la formación del complejo, una pipeta 0,5 g de ADN que codifica GFP o GFP-CAEB a la mezcla que contiene el reactivo de la transfección y se incuba durante 15 min a TA. </li><li> Transfectar células mediante la adición de la mezcla de reacción de una manera gota a gota y se incuba a 37 ° C en 5% de CO 2 durante 24 horas. </li></ol></li><li> Añadir 1 mg / ml de geneticina para la selección de clones GFP-positivas a 37 ° C en 5% de CO 2. </li><li> Después de 6 días, aislar células individuales mediante citometría de flujo de clasificación en una placa de 96 pocillos que alberga medio y HEK293 sobrenadante en una relación 1: 1. Generar HEK293 sobrenadante de las células HEK293 confluentes cultivadas que se centrifugaron durante 15 min a 4966 x g. </li><li> Al día siguiente, reemplazar medio de cultivo con medio que contiene 1,50; mg / ml de geneticina. Cambie los medios una vez por semana. Si las células forman una monocapa confluente, transferirlos a una placa de 24 pocillos. Sub-cultivar las células dos veces a la semana en una proporción de 1: 5 en medio que contenía 1,5 mg / ml de geneticina. Por último, analizar el porcentaje de células positivas para GFP mediante análisis de inmunotransferencia y citometría de flujo. </li></ol> 2. Análisis de líneas celulares estables mediante análisis de inmunotransferencia <ol><li> Eliminar el sobrenadante y lavar las células adheridas una vez con PBS caliente. Resuspender las células en 100 l de tampón de muestra 2x Laemmli, el calor durante 5 minutos a 95 ° C y se almacena a -20 ° C. </li><li> Cargar aproximadamente 4 x 10 4 células por muestra en un gel de SDS-PAGE 12%. Además, la carga de 6 l de una escalera proteína comercial como un marcador de peso molecular. Ejecutar geles en un sistema de electroforesis en gel en un voltaje constante de 180 V durante 45-60 min con tampón de Laemmli 1x. </li><li> Proteínas Blot a membranas de PVDF (tamaño de poro de 0.45 m) a un voltaje constante de 16 V durante 60 min utilizando una célula de transferencia Semi-Dry Trans-Blot SD. </li><li> Membranas bloque en 10 ml de leche en polvo desnatada al 5% en PBS / 0,05% de Tween 20 (MPT) para 1 hr a RT. </li><li> Diluir 4 l de anticuerpo anti-GFP en 4 ml de MPT e incubar las membranas O / N a 4 ° C. </li><li> Realizar tres etapas de lavado 10 min con 10 ml de PBS / 0,05% de Tween 20. </li><li> Incubar membranas con 0,8 l de conjugados con peroxidasa de rábano picante anticuerpos secundarios en 4 ml de MPT. </li><li> Después de 1 h de incubación a TA, lavar las membranas tres veces con PBS / 0,05% de Tween 20 (como se describe en 2.6) y detectar la actividad de peroxidasa de rábano picante con un kit comercial de acuerdo con el protocolo del fabricante. Aplicar equipo estándar para el desarrollo de la película para visualizar las bandas de proteínas. </li></ol> 3. Analizar las células utilizando un citómetro de flujo. <ol><li> Resuspender las células en PBS. Utilice células HEK293 como control negativo para ajustar hacia adelante scatter (FSC) y dispersión lateral (SSC), de modo que las células están en escala. Dibuja una puerta en las células vivas mediante la exclusión de dobletes de células, agregados y restos celulares. </li><li> Ajuste el tubo fotomultiplicador (PMT) de ganancia para que las células no teñidas están en el extremo izquierdo del histograma para el canal FL1 (láser de argón de 488 nm). </li><li> Para analizar la intensidad de fluorescencia de las células HEK293-GFP y HEK293-GFP-CAEB abrir el histograma del canal FL1 y adquirir 10.000 eventos en la población cerrada. </li><li> Analizar los datos mediante FACS comerciales de software de análisis. </li></ol> 4. La transfección de la línea celular estable con el sistema de vector de expresión inducible <ol><li> Células de semillas HEK293 que expresan establemente GFP o GFP-CAEB en una placa de 12 pocillos a una densidad de 1 x 10 5 células / pocillo. </li><li> 19 horas después de la siembra, co-transfectar las células con plásmido regulador y plásmido respuesta sea que codifica Bax o caspasa 3 activada. <ol><li> Co-transfectar las células HEK293 establescon 100 ng de plásmido regulador pWHE125-P (Figura 2) y 100 ng de los plásmidos de respuesta pWHE655-hBax o pWHE655-revCasp3 (Figura 3) y 0,4 l de polietilenimina. </li><li> Preparar el ADN y reactivo de transfección polietilenimina cada uno en 75 l de medio Opti-MEM e incubar durante exactamente 5 min a TA. Para la formación del complejo, incubar ambas mezclas juntos durante 15 min a TA. </li></ol></li><li> Añadir la solución de polietilenimina / DNA gota a gota a las células y se incuba a 37 ° C en 5% de CO 2. </li></ol> 5. inducción de la apoptosis <ol><li> 5 horas después de la transfección, inducir la expresión de las proteínas pro-apoptóticas mediante la adición de 1 mg / ml de doxiciclina al medio de cultivo. Se incuban las células durante 18 horas a 37 ° C en 5% de CO 2. </li></ol> 6. Análisis de Host Cell Apoptosis por análisis de inmunotransferencia <ol><li> Inspeccione las células antes de harvesting bajo el microscopio óptico para comprobar la inducción de muerte celular. Las células apoptóticas son detectable por la presencia de cuerpos apoptóticos que rodea la célula moribunda. </li><li> Eliminar el sobrenadante y lavar las células adheridas una vez con PBS caliente. Resuspender las células en 100 l de tampón de muestra 2x Laemmli, el calor durante 5 minutos a 95 ° C y se almacena a -20 ° C. </li><li> Cargar aproximadamente 4 x 10 4 células por muestra en un gel de SDS-PAGE 12%. Además, la carga de 6 l de una escalera proteína comercial como un marcador de peso molecular. Ejecutar geles en un sistema de electroforesis en gel en un voltaje constante de 180 V durante 45-60 min con tampón de Laemmli 1x. </li><li> Proteínas Blot a membranas de PVDF (tamaño de poro de 0,45 micras) en una tensión constante de 16 V durante 60 minutos usando una célula de transferencia semi-seco Trans-Blot SD. </li><li> Membranas bloque en 10 ml de leche en polvo desnatada al 5% en PBS / 0,05% de Tween 20 (MPT) para 1 hr a RT. </li><li> Diluir 4 μl de poli anticuerpo anti-escindido ADP-ribosa polimerasa (PARP) en 4 ml de MPT e incubar O / N a 4 ° C. </li><li> Realizar tres etapas de lavado 10 min con 10 ml de PBS / 0,05% de Tween 20. </li><li> Incubar membranas con 0,8 rábano anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa mu l diluido en 4 ml MPT. </li><li> Después de 1 h de incubación a TA, lavar las membranas tres veces con PBS / 0,05% de Tween 20 (como se describe en 6.7) y detectar la actividad de peroxidasa de rábano picante con un kit comercial según el protocolo del fabricante. Aplicar equipo estándar para el desarrollo de la película para visualizar las bandas de proteínas. </li><li> Retire anticuerpos unidos por 30 minutos de incubación a temperatura ambiente con 7 ml Western Blot Stripping Buffer. </li><li> Después de tres lavados con PBS / 0,05% de Tween 20 (como se describe en 6.7), sondear las membranas con 4 l de anticuerpo anti-actina en 4 ml de MPT O / N a 4 ° C. </li><li> Después de tres etapas de lavado con MPT (como se describe en 6.7), se incuban las membranas con 0,8 l de hoanticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa rseradish diluidas en 4 ml de MPT. </li><li> Después de 1 h de incubación a TA, lavar las membranas tres veces con PBS / 0,05% de Tween 20 (como se describe en 6.7 y detectar la actividad de peroxidasa de rábano picante con un kit comercial de acuerdo con el protocolo del fabricante. Aplicar equipo estándar para desarrollo de la película para visualizar las bandas de proteínas. Nota: Todas las etapas de incubación se realizaron en un agitador de placas durante el tiempo indicado y la temperatura. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Muchas bacterias patógenas albergan sistemas de secreción para secretar o translocar proteínas efectoras bacterianas en la célula huésped. Estas proteínas efectoras tienen la capacidad de modular los procesos y vías en la célula huésped, permitiendo que las bacterias para sobrevivir y replicarse dentro de su respectivo nicho intracelular. La comprensión de las actividades bioquímicas y los mecanismos moleculares de las proteínas efectoras ayudará a una mejor comprensión de la patogenicidad y puede ayudar a...

La virulencia de muchos patógenos Gram-negativas bacterias depende de sistemas de secreción especializados para secuestrar células huésped eucariotas. Las bacterias utilizan estos sistemas de secreción para inyectar proteínas de virulencia bacteriana (efectores) en la célula huésped para modular una variedad de actividades celulares y bioquímicos. El estudio de las proteínas efectoras no sólo ha proporcionado notable penetración en los aspectos fundamentales de huésped / patógeno, sino también en la biología básica de las células eucariotas 1. La modulación de la apoptosis de las células huésped ha sido demostrado ser un mecanismo de virulencia importante para muchos patógenos intracelulares, y una serie de proteínas efectoras que modulan la apoptosis se han identificado 2-9. Sin embargo, sus mecanismos moleculares precisos de actividad sigue siendo difícil en muchos casos. Apoptosis, una forma de muerte celular programada, juega un papel importante en la respuesta inmune a la infección 10. Dos vías principales que conducen a la apoptosis tienenhan identificado: la orientación de la mitocondria (apoptosis intrínseca) o transducción directa de la señal a través de receptores de muerte celular en la membrana plasmática (apoptosis extrínseca). La vía de la muerte celular intrínseca o mediada por mitocondrias se activa por señales intracelulares e implica la activación de Bax y Bak, dos miembros pro-apoptóticos de la familia Bcl-2. Esta familia se compone de proteínas reguladoras pro-y anti-apoptóticos que controlan la muerte celular 11-14. La activación de la apoptosis conduce a la oligomerización de Bax y Bak seguidos por subsiguiente permeabilización de la membrana externa mitocondrial, lo que resulta en la liberación del citocromo C en el citoplasma. La liberación del citocromo C inicia la activación de las caspasas efectoras 3 y 7 a través de la activación de la caspasa 9 en el apoptosome 15. Esto conduce a la proteolisis de sustratos seleccionados que, entre otros, los resultados en la exposición de fosfatidilserina en la superficie celular 16 y libera una DNasa dedicado que fragmenta chromatin 17,18. Con el fin de determinar dónde dentro de la cascada apoptótica una proteína efectora individuo interfiere, un sistema de expresión inducible se empleó 19. Los sistemas de regulación para la expresión condicional de transgenes han sido una herramienta muy valiosa en el análisis de la función de una proteína dentro de la célula o su importancia para el tejido, órgano y desarrollo del organismo, así como durante la iniciación, progresión y mantenimiento de la enfermedad 20-23. Típicamente, los sistemas de control inducibles, tales como el sistema Tet 24 empleado aquí, forman una unidad de transcripción artificial (véase la Figura 1). Uno de los componentes es un factor de transcripción diseñados artificialmente llamada tTA (activador de la transcripción dependiente de tetraciclina), formado por la fusión del represor de la transcripción bacteriana TetR 25 a un dominio de proteína de mamífero que media la activación transcripcional o silenciar 24,26. El segundo componente es un híbridopromotor, denominado TRE (elemento sensible a la tetraciclina), que consiste en un promotor mínimo eucariota, que contiene al menos una caja TATA y un sitio de iniciación de la transcripción, unido a múltiples repeticiones del sitio de unión al ADN cognado para TetR, tetO 24,25. El tercer componente es el ligando natural de TetR, tetraciclina o uno de sus derivados, tales como anhidrotetraciclina o doxiciclina 25. Después de la adición de ligando al medio de cultivo, TetR pierde su afinidad por tetO y se disocia de la TRE. Como resultado, la transcripción del gen diana es abolida. La expresión del transgen puede, por lo tanto, ser estrechamente controlada de una manera tiempo y dependiente de la dosis, tanto en cultivos celulares y en animales 20,23,24. Con tTA, la expresión del transgen se produce constitutivamente, excepto en la presencia de una tetraciclina. Esto puede ser una desventaja en el estudio de proteínas citotóxicas o oncogénicos porque tetraciclina tiene primero que ser eliminado del sistema, antes de expressio transgénn se produce y los efectos de la proteína diana en la célula puede ser monitoreado. Esto puede llevar mucho tiempo y no siempre es completa, especialmente en animales transgénicos 27. Para abordar esta limitación, se usó un mutante TetR con una respuesta inversa a la presencia de doxiciclina para generar un nuevo factor de transcripción, rtTA (inversa tTA) 28. Sólo se une a la TRE y, concomitantemente, activa la transcripción en presencia de doxiciclina. Leakiness residual del sistema, es decir., La expresión del transgen en ausencia de factor de transcripción unido a la TRE, originando ya sea (i) a partir de los efectos de posición en un sitio de integración genómica, (ii) de la propia TRE 29, o (iii) de la no específico de unión de tTA / rtTA 28, fue abordado mediante la introducción de un silenciador transcripcional adicional, denominado TTS (silenciador transcripcional dependiente de tetraciclina) 30 al sistema. Se forma una red regulador dual junto con rtTA (véase la Figura 1).En ausencia de doxiciclina, TTS se une a TRE y activamente apaga cualquier transcripción restante. En presencia de doxiciclina, TTS se disocia de TRE y ata el rtTA inducir simultáneamente la expresión del gen diana. Esta capa adicional de rigor es a menudo necesario para expresar proteínas citotóxicas altamente activos 31-34. Usando este sistema de doble regulador estrechamente controlada, la cascada apoptótica puede iniciarse en una etapa definida que permite el análisis de si la proteína efectora dado puede interferir con la inducción de apoptosis. Este método no sólo se puede utilizar para estudiar la actividad anti-apoptótica de proteínas efectoras bacterianas sino también para la expresión inducible de proteínas pro-apoptóticas o tóxicos, o para la disección de la interferencia con otras vías de señalización.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>31966-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>S0115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>51985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGENE 9</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6365752001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geneticin</td>
			<td>Roth</td>
			<td>CP11.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine</td>
			<td>Polyscienes</td>
			<td>23966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-8000EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-3940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP&#160;</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>A6455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-cleaved PARP</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>611038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-actin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG (H+L)-HRPO</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>111-035-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG (H+L)-HRPO</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>111-035-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Western Blotting Substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>32106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restore Plus Western Blot Stripping Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>46428</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applying an inducible expression system to study interference of bacterial virulence factors with intracellular signaling

La técnica presentada aquí permite analizar en qué etapa una proteína diana, o, alternativamente, una molécula pequeña, interactúa con los componentes de una vía de señalización. El método se basa, por un lado, en la expresión inducible de una proteína específica para iniciar un evento de señalización en un paso definido y predeterminado en la cascada de señalización seleccionado. Expresión concomitante, por otro lado, del gen de interés, luego permite al investigador evaluar si la actividad de la proteína diana expresada se encuentra aguas arriba o aguas abajo del evento de señalización iniciada, dependiendo de la lectura de la vía de señalización que se obtiene. Aquí, la cascada apoptótica fue seleccionado como una vía de señalización definido para demostrar la funcionalidad de protocolo. Las bacterias patógenas, tales como Coxiella burnetii, translocación de proteínas efectoras que interfieren con la inducción de la muerte de la célula huésped en la célula huésped para asegurar la supervivencia bacteriana en la célula y para promover sudifusión en el organismo. El C. proteína efectora burnetii CAEB inhibe eficazmente la muerte de la célula huésped después de la inducción de la apoptosis con luz UV o con estaurosporina. Para reducir a la que paso CAEB interfiere con la propagación de la señal apoptótica, proteínas seleccionadas con actividad pro-apoptótica bien caracterizado se expresaron transitoriamente de una manera doxiciclina inducible. Si CAEB actúa aguas arriba de estas proteínas, la apoptosis se procederá sin obstáculos. Si CAEB actúa aguas abajo, se inhibirá la muerte celular. Las proteínas de prueba seleccionadas fueron Bax, que actúa a nivel de la mitocondria, y la caspasa 3, que es la principal proteasa ejecutor. CAEB interfiere con la muerte celular inducida por la expresión de Bax, pero no por la caspasa 3 expresión. CAEB, por lo tanto, interactúa con la cascada apoptótica entre estas dos proteínas.

En primer lugar, se establecieron líneas de células HEK293 que expresan establemente la proteína de interés (CAEB) como una proteína GFP-fusión. Como control, también se generaron líneas de células HEK293 que expresan establemente GFP. La expresión de GFP y GFP-CAEB se verificó mediante análisis de inmunotransferencia. El representante de inmunotransferencia (Figura 4A) demuestra la expresión estable y claramente detectable de GFP y GFP-CAEB. Sin embargo, este ensayo no puede determinar si ...

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Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

La aplicación de un sistema de expresión inducible para el Estudio de la interferencia de los factores de virulencia bacteriana con Señalización Intracelular

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.1K vistas.  Friedrich-Alexander-Universität. The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

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Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions 1. The major cell types of the innate immune system, macrophages and neutrophils, develop during the first days of embryogenesis prior to the maturation of lymphocytes that are required for adaptive immune responses. The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, the optical transparency of embryonic and larval stages, a wide range of genetic tools, extensive mutant resources and collections of transgenic reporter lines, all add to the versatility of the zebrafish model. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium) and Mycobacterium marinum can reside intracellularly in macrophages and are frequently used to study host-pathogen interactions in zebrafish embryos. The infection processes of these two bacterial pathogens are interesting to compare because S. typhimurium infection is acute and lethal within one day, whereas M. marinum infection is chronic and can be imaged up to the larval stage 2, 3. The site of micro-injection of bacteria into the embryo (Figure 1) determines whether the infection will rapidly become systemic or will initially remain localized. A rapid systemic infection can be established by micro-injecting bacteria directly into the blood circulation via the caudal vein at the posterior blood island or via the Duct of Cuvier, a wide circulation channel on the yolk sac connecting the heart to the trunk vasculature. At 1 dpf, when embryos at this stage have phagocytically active macrophages but neutrophils have not yet matured, injecting into the blood island is preferred. For injections at 2-3 dpf, when embryos also have developed functional (myeloperoxidase-producing) neutrophils, the Duct of Cuvier is preferred as the injection site. To study directed migration of myeloid cells towards local infections, bacteria can be injected into the tail muscle, otic vesicle, or hindbrain ventricle 4-6. In addition, the notochord, a structure that appears to be normally inaccessible to myeloid cells, is highly susceptible to local infection 7. A useful alternative for high-throughput applications is the injection of bacteria into the yolk of embryos within the first hours after fertilization 8. Combining fluorescent bacteria and transgenic zebrafish lines with fluorescent macrophages or neutrophils creates ideal circumstances for multi-color imaging of host-pathogen interactions. This video article will describe detailed protocols for intravenous and local infection of zebrafish embryos with S. typhimurium or M. marinum bacteria and for subsequent fluorescence imaging of the interaction with cells of the innate immune system.

Transparent zebrafish embryos have proved useful model hosts to visualize and functionally study interactions between innate immune cells and intracellular bacterial pathogens, such as Salmonella typhimurium and Mycobacterium marinum. Micro-injection of bacteria and multi-color fluorescence imaging are essential techniques involved in the application of zebrafish embryo infection models.

La infección de embriones de pez cebra con patógenos bacterianos intracelulares

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Investigación

Inmunología e Infección

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

Manduca sexta, commonly known as the tobacco hornworm, is considered a significant agricultural pest, feeding on solanaceous plants including tobacco and tomato. The susceptibility of M. sexta larvae to a variety of entomopathogenic bacterial species1-5, as well as the wealth of information available regarding the insect's immune system6-8, and the pending genome sequence9 make it a good model organism for use in studying host-microbe interactions during pathogenesis. In addition, M. sexta larvae are relatively large and easy to manipulate and maintain in the laboratory relative to other susceptible insect species. Their large size also facilitates efficient tissue/hemolymph extraction for analysis of the host response to infection.
The method presented here describes the direct injection of bacteria into the hemocoel (blood cavity) of M. sexta larvae. This approach can be used to analyze and compare the virulence characteristics of various bacterial species, strains, or mutants by simply monitoring the time to insect death after injection. This method was developed to study the pathogenicity of Xenorhabdus and Photorhabdus species, which typically associate with nematode vectors as a means to gain entry into the insect. Entomopathogenic nematodes typically infect larvae via natural digestive or respiratory openings, and release their symbiotic bacterial contents into the insect hemolymph (blood) shortly thereafter10. The injection method described here bypasses the need for a nematode vector, thus uncoupling the effects of bacteria and nematode on the insect. This method allows for accurate enumeration of infectious material (cells or protein) within the inoculum, which is not possible using other existing methods for analyzing entomopathogenesis, including nicking11 and oral toxicity assays12. Also, oral toxicity assays address the virulence of secreted toxins introduced into the digestive system of larvae, whereas the direct injection method addresses the virulence of whole-cell inocula.
The utility of the direct injection method as described here is to analyze bacterial pathogenesis by monitoring insect mortality. However, this method can easily be expanded for use in studying the effects of infection on the M. sexta immune system. The insect responds to infection via both humoral and cellular responses. The humoral response includes recognition of bacterial-associated patterns and subsequent production of various antimicrobial peptides7; the expression of genes encoding these peptides can be monitored subsequent to direct infection via RNA extraction and quantitative PCR13. The cellular response to infection involves nodulation, encapsulation, and phagocytosis of infectious agents by hemocytes6. To analyze these responses, injected insects can be dissected and visualized by microscopy13, 14.

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

The method described here utilizes direct injection of entomopathogenic bacteria into the hemocoel of Manduca sexta insect larvae. M. sexta is a commercially available and well-studied insect. Thus, this method represents a simple approach to analyzing host-bacterial interactions from the perspective of one or both partners.

Crianza y la inyección de<em&gt; Manduca sexta</em&gt; Las larvas para evaluar la virulencia bacteriana

Manduca sexta, commonly known as the tobacco hornworm, is considered a significant agricultural pest, feeding on solanaceous plants including tobacco and ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable alternative to animal model systems for the study of a specific step of microbial pathogen infection. A human monocytic cell line THP-1 which, upon phorbol ester treatment, is differentiated into macrophages, has previously been used to study virulence strategies of many intracellular pathogens including Mycobacterium tuberculosis. Here, we discuss a protocol to enact an in vitro cell culture model system using THP-1 macrophages to delineate the interaction of an opportunistic human yeast pathogen Candida glabrata with host phagocytic cells. This model system is simple, fast, amenable to high-throughput mutant screens, and requires no sophisticated equipment. A typical THP-1 macrophage infection experiment takes approximately 24 hr with an additional 24-48 hr to allow recovered intracellular yeast to grow on rich medium for colony forming unit-based viability analysis. Like other in vitro model systems, a possible limitation of this approach is difficulty in extrapolating the results obtained to a highly complex immune cell circuitry existing in the human host. However, despite this, the current protocol is very useful to elucidate the strategies that a fungal pathogen may employ to evade/counteract antimicrobial response and survive, adapt, and proliferate in the nutrient-poor environment of host immune cells.

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

The current article outlines a protocol to establish an in vitro cell culture model system to study the interaction of a facultative intracellular human fungal pathogen Candida glabrata with human macrophages which will be a useful tool to advance our knowledge of fungal virulence mechanisms.

Establecimiento de un<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema para estudiar el comportamiento intracelular de<em&gt; Candida glabrata</em&gt; En humanos THP-1 macrófagos

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. Despite advances in knowledge of this illness, the availability of intensive care units (ICU), and the use of potent antimicrobial agents and effective vaccines, the mortality rates remain high1. Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen of community-acquired pneumonia (CAP) and one of the most common causes of bacteremia in humans. This pathogen is equipped with an armamentarium of surface-exposed adhesins and virulence factors contributing to pneumonia and invasive pneumococcal disease (IPD). The assessment of the in vivo role of bacterial fitness or virulence factors is of utmost importance to unravel S. pneumoniae pathogenicity mechanisms. Murine models of pneumonia, bacteremia, and meningitis are being used to determine the impact of pneumococcal factors at different stages of the infection. Here we describe a protocol to monitor in real-time pneumococcal dissemination in mice after intranasal or intraperitoneal infections with bioluminescent bacteria. The results show the multiplication and dissemination of pneumococci in the lower respiratory tract and blood, which can be visualized and evaluated using an imaging system and the accompanying analysis software.

Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen causing severe community-acquired pneumonia and responsible for over 2&#160;million deaths worldwide. The impact of bacterial factors implicated in fitness or virulence can be monitored in real-time in an acute mouse pneumonia or bacteremia model using bioluminescent bacteria.

Siguiendo en tiempo real el impacto de factores de virulencia neumocócica en un ratón de neumonía aguda modelo utilizando bacterias bioluminiscentes

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on the amber suppression technology that was originally developed by Peter Schultz and colleagues1. An amber mutation is first introduced at a specific codon of the gene encoding the protein of interest. The amber mutant is then expressed in E. coli together with genes encoding an amber suppressor tRNA and an amino acyl-tRNA synthetase derived from Methanococcus jannaschii. Using this system, the photo activatable amino acid analog p-benzoylphenylalanine (Bpa) is incorporated at the amber codon. Cells are then irradiated with ultraviolet light to covalently link the Bpa residue to proteins that are located within 3-8 &#197;. Photocrosslinking is performed in combination with pulse-chase labeling and immunoprecipitation of the protein of interest in order to monitor changes in protein-protein interactions that occur over a time scale of seconds to minutes. We optimized the procedure to study the assembly of a bacterial virulence factor that consists of two independent domains, a domain that is integrated into the outer membrane and a domain that is translocated into the extracellular space, but the method can be used to study many different assembly processes and biological pathways in both prokaryotic and eukaryotic cells. In principle interacting factors and even specific residues of interacting factors that bind to a protein of interest can be identified by mass spectrometry.

This article illustrates the use of pulse-chase radio labeling in combination with site-specific photocrosslinking to monitor interactions between a protein of interest and other factors in E. coli. Unlike traditional chemical cross-linking methods, this approach generates high resolution &#8220;snapshots&#8221; of an ordered assembly pathway in a living cell.

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we introduce a method using gold-BSA-rhodamine NPs to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells and monitor manipulations of host cellular pathways by the intracellular pathogen Salmonella enterica. The NPs were readily internalized by HeLa cells and localized in late endosomes/lysosomes. Salmonella infection induced rearrangement of the vesicles and accumulation of NPs in Salmonella-induced membrane structures. We deployed the Imaris software package for quantitative analyses of confocal microscopy images. The number of objects and their size distribution in non-infected cells were distinct from the ones in Salmonella-infected cells, indicating extremely remodeling of the endo-lysosomal system by WT Salmonella.

This article describes methods for the synthesis and fluorescent labeling of nanoparticles (NPs). The NPs were applied in pulse-chase experiments to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells. Manipulation of the endo-lysosomal system by activities of the intracellular pathogen Salmonella enterica were followed by live cell imaging and quantified.

Aplicación de nanopartículas fluorescentes para estudiar Remodelación del Sistema Endo-lisosomal por bacterias intracelulares

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

Establecimiento de un programa de instalación de alto rendimiento para la detección de pequeñas moléculas que modulan la c-di-GMP Señalización en el<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Análisis de linfocitos extravasación El uso de una<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de la barrera sangre-cerebro humano

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability to multiply inside such cells. These virulence traits render M. abscessus pathogenic, especially in vulnerable hosts with underlying structural lung disease, such as cystic fibrosis, bronchiectasis or tuberculosis. How patients become infected with M. abscessus remains unclear. Unlike many mycobacteria, M. abscessus is not found in the environment but might reside inside amoebae, environmental phagocytes that represent a potential reservoir for M. abscessus. Indeed, M. abscessus is resistant to amoebal phagocytosis and the intra-amoeba life seems to increase M. abscessus virulence in an experimental model of infection. However, little is known about M. abscessus virulence in itself. To decipher the genes conferring an advantage to M. abscessus intracellular life, a screening of a M. abscessus transposon mutant library was developed. In parallel, a method of RNA extraction from intracellular Mycobacteria after co-culture with amoebae was developed. This method was validated and allowed the sequencing of whole M. abscessus transcriptomes inside the cells; providing, for the first time, a global view on M. abscessus adaptation to intracellular life. Both approaches give us an insight into M. abscessus virulence factors that enable M. abscessus to colonize the airways in humans.

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Here, we present two protocols to study Phagocyte-Mycobacterium abscessus interactions: the screening of a transposon mutant library for bacterial intracellular deficiency and the determination of bacterial intracellular transcriptome from RNA sequencing. Both approaches provide insight into the genomic advantages and transcriptomic adaptations enhancing intracellular bacteria fitness.

Identificación de marcadores de virulencia de Mycobacterium abscessus para la replicación intracelular de fagocitos

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...

In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice

Leishmania spp. are protozoan parasites that cause leishmaniases, diseases that present a wide spectrum of clinical manifestations from cutaneous to visceral lesions. Currently, 12 million people are estimated to be infected with Leishmania worldwide and over 1 billion people live at the risk of infection. Leishmania amazonensis is endemic in Central and South America and usually leads to the cutaneous form of the disease, which can be directly visualized in an animal model. Therefore, L. amazonensis strains are good models for cutaneous leishmaniasis studies because they are also easily cultivated in vitro. C57BL/6 mice mimic the L. amazonensis-driven disease progression observed in humans and are considered one of the best mice strains model for cutaneous leishmaniasis. In the vertebrate host, these parasites inhabit macrophages despite the defense mechanisms of these cells. Several studies use in vitro macrophage infection assays to evaluate the parasite infectivity under different conditions. However, the in vitro approach is limited to an isolated cell system that disregards the organism&#39;s response. Here, we compile an in vivo murine infection method that provides a systemic physiological overview of the host-parasite interaction. The detailed protocol for the in vivo infection of C57BL/6 mice with L. amazonensis comprises parasite differentiation into infective amastigotes, mice footpad cutaneous inoculation, lesion development, and parasite load determination. We propose this well-established method as the most adequate method for physiological studies of the host immune and metabolic responses to cutaneous leishmaniasis.

In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice

Here, we present a compiled protocol to evaluate the cutaneous infection of mice with Leishmania amazonensis. This is a reliable method for studying parasite virulence, allowing a systemic view of the vertebrate host response to the infection.

In Vivo infección con Leishmania amazonensis para evaluar la virulencia del parásito en ratones

Leishmania spp. are protozoan parasites that cause leishmaniases, diseases that present a wide spectrum of clinical manifestations from cutaneous to ...