La biología de sistemas ofrece información sobre las redes biológicas y los mecanismos de los modelos de infección, mientras que la biología sintética permite una terapia de precisión. Estamos explorando el inmunometabolismo en la infección mayor por Leishmania y el potencial de los circuitos biosintéticos para la resolución de enfermedades, revolucionando la inmunoterapia. En los últimos años, la biología sintética ha demostrado ser muy prometedora para el desarrollo de estrategias nuevas y efectivas para combatir la leishmaniasis.
Algunos de los desarrollos recientes se encuentran en el campo de la ingeniería de citocinas sintéticas, el circuito sintético biestable CRISPR-Cas9, y los péptidos sintéticos se están investigando como terapéuticos. Nuestro protocolo se dirige a la proteína del huésped, que es modulada por el parásito para su supervivencia. Por lo tanto, estudiamos el efecto en el circuito no solo sobre el parásito, sino también sobre el huésped.
Además, estudiamos el efecto del circuito sintético en el abordaje de la ortogonalidad y la función de modularidad en la entrega en el huésped. Para comenzar, en una computadora, abra el software TinkerCell y haga clic en la pestaña de piezas. Seleccione el componente promotor de CMV de la biblioteca y colóquelo en el lienzo para simbolizar el promotor del citomegalovirus dentro del circuito sintético.
A continuación, recupere el sitio de unión del represor análogo al operador de tetraciclina y colóquelo junto al promotor en el lienzo, integrándose con el promotor de CMV. Arrastre y suelte los sitios de entrada de ribosomas internos y la región codificante en el lienzo, integrándolos con los componentes genéticos existentes. Cambie el nombre de la región codificante como represor sensible a la tetraciclina.
Fusionar estos elementos genéticos para facilitar la construcción de las piezas sintéticas. Incorpore una región espaciadora cortable por el teschovirus porcino 12A en el lienzo. Introducir una región codificante adicional, la succinato deshidrogenasa o SDHA, que representa el gen de interés en la construcción sintética e integrándolo con los demás elementos.
Adyacente a la región codificante de SDHA, se integra otra región espaciadora escindible por la proteasa celular porcina teschovirus 12A. Introduzca una región codificante que represente el gen reportero y etiquétela como GFP en el constructo. Junto a GFP, anexe un terminador.
Para verificar la formación de un circuito genético funcional, haga clic en cualquier parte del circuito. El circuito aparece en rojo al hacer clic. Desde la pestaña de reacción, asigne tasas regulatorias al represor sensible a la tetraciclina, SDHA y GFP para delinear la reacción de traducción dentro del circuito sintético.
Añade una pequeña molécula de la pestaña de partes y nómbrala doxiciclina. Para asignar una función de onda a la doxiciclina, en la pestaña de partes y conexión, seleccione entrada y haga clic en entrada de onda. Desde la pestaña de reacción, haga clic en reacción de represión.
Arrastre y suelte la velocidad de reacción en el lienzo entre el dox y el represor sensible a la tetraciclina. Para establecer la cinética de reacción entre el represor sensible a dox y tetraciclina, haga doble clic en el icono de función de onda en dox y ajuste doxycycline.sin. amplitud a 10.
Para implementar la reacción reguladora transcripcional entre la proteína represora que responde a la tetraciclina y el sitio de unión del represor, seleccione la reacción de la pestaña de reacción y colóquela en el lienzo entre el represor que responde a la tetraciclina y el operador de tetraciclina. Haga doble clic en cada componente y reacción para establecer una concentración inicial y un parámetro para la simulación. Haga clic en simulación, elija determinista y simule el circuito para 100 unidades de tiempo.
Ajuste el gráfico de simulación desde el panel de control y observe el patrón del gráfico para SDHA y proteínas represivas que responden a la tetraciclina. Abra el registro de partes biológicas estándar, luego haga clic en buscar e ingrese el nombre del componente genético. Para obtener la secuencia de nucleótidos del promotor CMV, haga clic en obtener secuencia de partes y guarde el archivo como un archivo de texto.
Para obtener la secuencia codificante de proteínas de SDHA, abra NCBI y elija nucleótido en el menú desplegable junto a la ventana de búsqueda. Escriba la succinato deshidrogenasa y Mus musculus y busque la secuencia de nucleótidos. Haga clic en la opción CDS para obtener la secuencia de codificación de SDHA y guardar la secuencia en un archivo de texto.
Fusionar secuencialmente la secuencia de nucleótidos de todas las partes reguladoras genéticas en un solo archivo. Agregue un codón de inicio ATG justo después de la secuencia de Kozak y elimine los codones de parada internos para evitar la formación de polipéptidos nacientes. Abra el sitio web de Expasy y pegue la secuencia de nucleótidos.
Haga clic en traducir la opción de secuencia, luego seleccione cinco primos, tres fotogramas primos, uno y elimine los codones de parada. Para empezar, se cultivan células RAW264.7 a 37 grados centígrados hasta alcanzar un 90% de confluencia. Prepare las siguientes muestras para determinar el efecto de eliminación de parásitos del circuito sintético inducido.
Raspe las celdas RAW264.7 de un matraz de 25 centímetros cuadrados. Centrifugar la suspensión celular a 300 G durante cinco minutos y volver a suspender el pellet en un mililitro de medio completo DMEM. Transfiera 10 microlitros de la suspensión de celda resuspendida a un tubo de 100 microlitros.
Agregue 10 microlitros de azul de tripano al 0,5% a las células y mezcle bien. Cargue 10 microlitros de mezcla de celda y azul de tripán en el portaobjetos de la cámara de recuento de celdas y tome el recuento de células de cuatro cámaras. Placa dos veces 10 a la potencia de cuatro celdas por pocillo en la placa de 96 pocillos con fondo deslizante e incubar a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante 24 horas.
Para preparar una muestra infectada de seis horas, centrifugar un mililitro de promastigotes de Leishmania major en fase estacionaria a 7,273G durante 10 minutos y volver a suspender el pellet en 500 microlitros de medio completo DMEM. Después de contar, agregue dos veces 10 a la potencia de cinco promastigotes L. major en la placa de 96 pocillos con fondo deslizante de cubierta. Incubar las células a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante seis horas.
Después de la incubación, lavar las células tres veces con PBS. Para preparar las muestras de IMT e IMTI, crezca dos veces 10 a la potencia de cinco promastigotes L. major durante 6, 12, 18 y 24 horas. En un tubo de 1,5 mililitros, agregue 24 microlitros de medio sérico reducido y un microgramo de plásmido de circuito sintético.
En otro tubo de 1,5 mililitros, agregue 24 microlitros de medio sérico reducido y un microlitro de polietilenina o PEI. Mezclo bien pipeteando al menos 10 veces e incubo a temperatura ambiente durante cinco minutos. Transfiera la mezcla de PEI al tubo de 1,5 mililitros que contiene el ADN y mezcle bien.
Incuba el tubo durante 10 minutos. Deseche los medios de los pocillos en la placa inferior deslizante de cubierta de 96 pocillos y lave las celdas tres veces con PBS. Con una pipeta, agregue gota a gota la mezcla de ADN-PEI a las células y agite suavemente la placa.
Incubar las células a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante tres horas. A continuación, agregue 200 microlitros de medio sérico fresco reducido a las células, agite suavemente la placa e incube durante 24 horas a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, deseche el medio.
Después de lavar las células dos veces con PBS, agregue medios completos DMEM que contengan geneticina y doxiciclina a las células e incube durante 24 horas. La simulación del circuito sintético reveló una dinámica oscilatoria tanto en SDHA como en el represor de tetraciclina. La introducción del circuito sintético en Escherichia coli DH5-alfa dio lugar a colonias transformadas que exhibían resistencia a la kanamicina, lo que indica una transformación eficiente.
La transfección con el circuito sintético y la inducción con doxiciclina aumentaron significativamente la expresión de GFP en las células IMT con el tiempo. Después de la transfección y la inducción de doxiciclina, se observó una reducción significativa de la carga parasitaria intracelular en los macrófagos infectados. Los niveles de citocinas de interleucina 10 e interleucina 12 fueron más altos a las seis horas después de la infección, sin que se observaran diferencias significativas en la transfección e inducción de circuitos sintéticos.
Se observó un aumento significativo en el factor de necrosis tumoral alfa, el interferón gamma y el factor de crecimiento transformante beta en la muestra de IMTI de 24 horas, lo que indica la regulación positiva de las citocinas proinflamatorias.
