Esta publicación fue apoyada por la Clínica y Traslacional de Investigación (SCTR) Instituto de Carolina del Sur, con un hogar académico de la Universidad Médica de Carolina del Sur, NIH / NCATS subvención Número de UL1 TR000062. Más apoyo fue proporcionado por premio al mérito VA BX002327-01 de DRM. DJH fue apoyado por el NIH / NCATS subvención Número de TL1 TR000061 y por el NIH subvención Número de T32 GM008716. MAR fue apoyado por el NIH subvención Número de T32 HL07260.

Todos los procedimientos que figuran a continuación han sido aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Medicina de Carolina del Sur. Los experimentos descritos aquí son experimentos agudos, no de supervivencia. Como tal, no hay uso de la pomada para los ojos y no se requiere un quirófano estéril. La eutanasia se logra por desangrado durante la recolección del corazón. 1. Preparación Experimental <ol><li> Configure sea una presión constante o flujo constante de perfusión Langendorff Aparato 4. </li><li> Preparar 4 L de Krebs Henseleit modificado Buffer (en mM: 112 NaCl, 5 KCl, 1,2 MgSO 4, 1 K 2 HPO 4, 1,25 CaCl 2, 25 NaHCO 3, 11 D-glucosa, 0.2 ácido octanoico, pH = 7,4). <ol><li> Hacer 10x buffers de valores. <ol><li> Disolver NaCl, KCl, MgSO 4, y K 2 HPO 4 en 3 L de agua ultrapura. </li><li> Disolver CaCl 2 en 500 ml de agua ultrapura wiTH 40 ml de HCl 1 N. </li><li> Agregue lentamente solución de CaCl2 al búfer hecho en 1.2.1.1. Agregar suficiente agua ultrapura a un total de 4 L. Permitir agitar durante 1 hora antes de filtrar a través de un filtro de 0,8 micras. Almacenar a 4 ° C. </li><li> Disolver NaHCO3 en 4 L de agua ultrapura. Dejar en agitación durante 1 hr antes de filtrar a través de al 0.8 micras filtro. Almacenar a 4 ° C </li></ol></li><li> Combinar 400 ml de 10x tampón de Krebs Henseleit con NaHCO tampón 400 ml de 10x 3. Agregar suficiente agua ultrapura a un total de 4 L. Disolver la glucosa y ácido octanoico mientras se agita. Filtrar a través de 0,8 micras filtro. </li></ol></li><li> Sistema de Preparación para el corazón. <ol><li> Añadir 2 L de tampón se filtró a una botella de 4 L colocados por encima de 38 en la llave de paso unido a la cánula aórtica. Esto entregar una presión de perfusión de 70-80 mm de Hg para el corazón, que es la presión de perfusión recomendado 4. </li><li> Inserte gas dispersión de burbujeo en el búfer en la botella. </li><li> Ejecutar el tampón a través del sistema, asegurándose de eliminar cualquier burbuja desde el interior de la tubería. </li><li> Encienda gas (95% O 2/5% de CO 2) al menos 30 min antes de corazón se va a colocar en el sistema. Use una sonda de flujo de gas y el analizador de gases en sangre para verificar la saturación de oxígeno. </li></ol></li><li> Preparar material quirúrgico y globo. <ol><li> Para la recolección de corazón, preparar un par de 6.75 &quot;tijeras quirúrgicas, un par de 4.5&quot; tijeras, dos pares de pinzas, dos juegos de pinzas caramalt, dos jeringas con agujas de 27 G, 2 piezas de sutura de seda 0 de calibre (alrededor de 15 cm de longitud), una cánula de púas 1/16 pulgadas, y una cánula traqueal. </li><li> Para el montaje de cánula traqueal, pegar un pequeño trozo de tubo de plástico de diámetro 1/16 pulgada a un conector. </li><li> Para montar un aparato de balón: adjuntar una aguja de sonda a un trozo de tubo de 1/16 pulgadas, a continuación, conecte la tubería a la vivienda transductor de presión. Una pequeña jeringa unida al otro lado de la presión transducer vivienda permitirá la inflación y la deflación del balón. <ol><li> Corte un cuadrado de abrigo y lugar punta de plástico de una aguja sonda en el centro. Envuelva la envoltura de plástico alrededor de la aguja sonda. </li><li> Rellene el globo con solución salina y atar con dos suturas. Inflar el globo para asegurar que no haya fugas. El volumen de solución salina dentro del balón inflado debe ser aproximadamente 200 l, pero puede variar dependiendo del tamaño de la rata. </li><li> También puede utilizar un dedil de látex en lugar de la envoltura de plástico. Coloque la aguja sonda dentro dedil, rellenar con solución salina y atar. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Cosecha el corazón <ol><li> Restringir una rata Sprague Dawley utilizando un decapicone u otro dispositivo de sujeción manual. Pesar rata. </li><li> Administrar ketamina / xilazina mezcla (0,85 mg / kg de ketamina y 0,15 mg / kg de xilazina) mediante inyección intraperitoneal para anestesiar la rata. Esta dosis de anestésico proporcionará suficientes para anestesia20-40 min, pero el procedimiento debe completarse lo antes posible después de que se confirmó la anestesia. </li><li> Confirme grado adecuado de anestesia mediante pruebas toe pizca reflejo. </li><li> Traqueotomía <ol><li> Retire piel desde mediados de pata a la base de la mandíbula, usando pinzas para elevar piel y tijeras para hacer la incisión. Mantenga la piel elevado a separarlo del músculo subyacente, que permite una para cortar a lo largo de la piel y retírela. </li><li> Usando pinzas hemostáticas, levantar el tejido glandular y hacer una incisión horizontal en la fascia inferior al tejido glandular. Utilice pinzas para difundir incisión abierta, teniendo cuidado de no cortar las venas yugulares. </li><li> Usando pinzas hemostáticas, músculo pizca superpuestos tráquea, y el uso de las tijeras hacen una incisión transversal en el músculo justo debajo de la punta de las pinzas hemostáticas. Usando pinzas hemostáticas, se extendió el tejido aparte de revelar tráquea. </li><li> Inserte cuidadosamente hemostatos bajo tráquea, despejando fascia mientras progresa avanzando suavemente y retraer hemostáticos. </li><li>Una vez hemostáticos se colocan con éxito detrás de la tráquea, pellizcar 0-0 sutura de seda con pinzas hemostáticas y hemisect la tráquea con un pequeño par de tijeras afiladas,. </li><li> Insertar cánula traqueal en la tráquea hemiseccionaron, tire de la sutura detrás de la tráquea, y atar la sutura alrededor de la tráquea canulado, el anclaje de la sutura a la Y-ingle de la cánula con un nudo cirujanos. </li><li> Usando una aguja 27 G, inyectar 1.000 U / kg de heparina en la vena yugular y permitir a circular para 30 seg. </li></ol></li><li> La toracotomía <ol><li> Retire piel desde mediados de abdomen a la región a mediados de pata pellizcando con pinzas hemostáticas y cortar con tijeras. </li><li> Hacer una incisión transversal pulgadas ¾ en la pared muscular del abdomen, justo por debajo del diafragma. </li><li> Hacer una incisión vertical hasta la pared y en el pecho de la pared abdominal, el corte a lo largo del esternón. </li><li> Cortar el diafragma hacia atrás de forma bilateral, luego se extendió la caja torácica para revelar el corazón, costillas de sujeción con pinzas hemostáticas para asegurar que sigue siendo propagación. </li&gt; <li> Utilizando pinzas, retire con cuidado el timo, la exposición de la aorta ascendente. </li><li> Tease hemostatos a través del bucle de la aorta, de avance y retroceso hemostáticos y suavemente difusión fascia para permitir punta de pinzas a través. </li><li> Utilice pinzas para tirar de 0-0 sutura de seda detrás de la aorta ascendente, la corbata de sutura en un medio cuadrado nudo flojo. </li><li> Gire la llave de paso para iniciar el flujo de tampón de perfusión, la aorta hemisect e inmediatamente inserte cánula en luz aórtica. Rápidamente cincha un nudo de media plaza y completar el nudo, apretar a fondo. </li><li> Use las tijeras para diseccionar corazón lejos de los grandes vasos, quite el corazón del pecho y adjuntar a la columna de la perfusión. </li><li> Recorte el exceso de tejido pulmonar y permitir que el corazón se equilibre en la columna durante aproximadamente 15 min antes de la inserción del globo. Utilice un caudal normal de búfer a través del corazón de 10 a 20 ml / min. </li></ol></li></ol> 3. Langendorff de perfusión e isquemia reperfusión <ol><li> La colocación de LV preglobo fisura <ol><li> Desinflar globo mientras rueda en forma de cono y gire la llave de paso para asegurar globo permanece desinflado. </li><li> Impuestos Especiales dejó atrio con un pequeño par de tijeras para exponer el acceso a la válvula mitral. </li><li> Inserte globo a través de la aurícula izquierda y la válvula mitral hacia el ventrículo izquierdo. </li><li> Inicie el software de control de presión (LabChart Pro). </li><li> Inflar el globo con la apertura de la llave de paso y suavemente creciente cantidad de solución salina en el globo hasta que la presión diastólica lectura de micromanómetro supera cero. </li><li> Para comprobar la respuesta longitud-tensión, inflar el globo lentamente a una presión diastólica de 75 mmHg, desinflarse lentamente, repetir una vez. </li><li> Establecer la presión diastólica a 10 mmHg mediante la modulación de la cantidad de solución salina en el globo. Gire la llave de paso para sellar el globo en este nivel de la inflación y mantener el sistema de presión cerrado entre el globo LV y transductor de presión. </li><li> Baja corazón en la cámara de cámara y cubierta climatizada con plástico. </li></ol></li><li> Una dministerio de isquemia reperfusión <ol><li> Enchufe el fondo de la cámara climatizada y permitir que la cámara se llene con tampón derramada. </li><li> Cuando tampón ha sumergido corazón, gire la llave de paso para detener el flujo de tampón en el corazón, la inducción de la isquemia global. El tiempo de isquemia puede variar dependiendo de los objetivos del experimento. </li><li> Después de 30 min de isquemia, gire la llave de paso para restaurar el flujo de tampón en el corazón, iniciando la reperfusión. </li><li> Permitir la reperfusión del corazón durante 1 hora antes de terminar el experimento. Utilice tiempos de reperfusión variables, dependiendo de los objetivos del experimento. </li></ol></li><li> La terminación del experimento y la recolección de Tejidos <ol><li> Uso de puerto lateral de la llave de paso, administrar 10 ml de salina tamponada con fosfato a 4 ° C en el corazón a una velocidad de 10 ml / min para parar el corazón. </li><li> Quite el corazón de la columna de la perfusión, recortar restante tejido auricular. </li><li> Coloque corazón en una matriz de corte de tejido de acero inoxidable, cubrir con Parafilm y lugar a -80 ° C durante 8 minutos, o hasta que el corazón tiene una consistencia como la melcocha. </li><li> Retire el bloque del congelador e insertar hojas de afeitar en la matriz de cortar para cortar corazón en rodajas 2 mm. Bloques de tejidos también pueden ser comprados con tamaños rebanada distintos de 2 mm. </li><li> Retire las rebanadas una a la vez y soltar en nitrógeno líquido para congelar parpadear para estudios bioquímicos. Conserve la tercera rebanada ventricular desde el vértice para la tinción del infarto. </li><li> Retire el tejido de nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C hasta su uso en experimentos bioquímicos. </li></ol></li><li> Infarto de tinción <ol><li> Incubar la tercera rebanada ventricular en 10 ml de 1% w / v de cloruro de trifeniltetrazolio (TTC) a 37 ° C durante 15 min. Nota: La incubación en TTC se puede realizar para 15 o 30 min sin cambio en la eficacia 15. </li><li> Transferencia rebanada de tejido de TTC a 10% de formalina tamponada y se deja incubar a temperatura ambiente durante la noche. Para obtener resultados óptimos, escucharts deben ser sacados de formol y la imagen dentro de 24 horas 4. </li><li> Fotografía manchado software rebanada y el uso como ImageJ para estimar el tamaño del infarto según el protocolo del fabricante. Tome fotografías tan pronto como sea posible después de la fijación, ya que el tinte se desvanecerá con el tiempo. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Bainey, K. R., Armstrong, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+perspectives+on+reperfusion+injury+in+acute+myocardial+infarction.">Clinical perspectives on reperfusion injury in acute myocardial infarction.</a> American Heart Journal. 167 (5), 637-645 (2014).</li><li>Beyersdorf, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+controlled+reperfusion+strategies+in+cardiac+surgery+to+minimize+ischaemia/reperfusion+damage.">The use of controlled reperfusion strategies in cardiac surgery to minimize ischaemia/reperfusion damage.</a> Cardiovascular Research. 83 (2), 262-268 (2009).</li><li>Langendorff, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untersuchugen+am+&#252;berlebenden+S&#228;ugethierherzen.">Untersuchugen am &#252;berlebenden S&#228;ugethierherzen.</a> Pfl&#252;gers Archives. 61, 291-307 (1895).</li><li>Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+heart+perfusion:+The+langendorff+technique+of+isolated+heart+perfusion.">Retrograde heart perfusion: The langendorff technique of isolated heart perfusion.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).</li><li>Tyers, G. F., Todd, G. J., Neely, J. R., Waldhausen, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+myocardial+protection+from+ischemic+arrest+by+intracoronary+tetrodotoxin+administration.">The mechanism of myocardial protection from ischemic arrest by intracoronary tetrodotoxin administration.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 69 (2), 190-195 (1975).</li><li>Murry, C. E., Jennings, R. B., Reimer, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preconditioning+with+ischemia:+A+delay+of+lethal+cell+injury+in+ischemic+myocardium.">Preconditioning with ischemia: A delay of lethal cell injury in ischemic myocardium.</a> Circulation. 74 (5), 1124-1136 (1986).</li><li>Kolwicz, S. C., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+cardiac+function+and+energetics+in+isolated+mouse+hearts+using+31P+NMR+spectroscopy.">Assessment of cardiac function and energetics in isolated mouse hearts using 31P NMR spectroscopy.</a> The Journal of Visualized Experiments. (42), (2010).</li><li>Fishbein, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+phase+acute+myocardial+infarct+size+quantification:+Validation+of+the+triphenyl+tetrazolium+chloride+tissue+enzyme+staining+technique.">Early phase acute myocardial infarct size quantification: Validation of the triphenyl tetrazolium chloride tissue enzyme staining technique.</a> American Heart Journal. 101 (5), 593-600 (1981).</li><li>Aune, S. E., Herr, D. J., Mani, S. K., Menick, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+inhibition+of+class+I+but+not+class+IIb+histone+deacetylases+exerts+cardiac+protection+from+ischemia+reperfusion.">Selective inhibition of class I but not class IIb histone deacetylases exerts cardiac protection from ischemia reperfusion.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 138-145 (2014).</li><li>Yellon, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protective+role+of+heat+stress+in+the+ischaemic+and+reperfused+rabbit+myocardium.">The protective role of heat stress in the ischaemic and reperfused rabbit myocardium.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 24 (8), 895-907 (1992).</li><li>Khaliulin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+preconditioning+of+isolated+rat+hearts--a+potent+cardioprotective+mechanism+involving+a+reduction+in+oxidative+stress+and+inhibition+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore.">Temperature preconditioning of isolated rat hearts--a potent cardioprotective mechanism involving a reduction in oxidative stress and inhibition of the mitochondrial permeability transition pore.</a> The Journal of Physiology. 581 (Pt 3), 1147-1161 (2007).</li><li>Molojavyi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+ketamine+and+its+isomers+on+ischemic+preconditioning+in+the+isolated+rat+heart).">Effects of ketamine and its isomers on ischemic preconditioning in the isolated rat heart).</a> Anesthesiology. 94 (4), 623-629 (2001).</li><li>Asfour, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADH+fluorescence+imaging+of+isolated+biventricular+working+rabbit+hearts.">NADH fluorescence imaging of isolated biventricular working rabbit hearts.</a> The Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li><li>Sill, B., Hammer, P. E., Cowan, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+mapping+of+langendorff-perfused+rat+hearts.">Optical mapping of langendorff-perfused rat hearts.</a> The Journal of Visualized Experiments. (30), (2009).</li><li>Ferrera, R., Benhabbouche, S., Bopassa, J. C., Li, B., Ovize, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+hour+reperfusion+is+enough+to+assess+function+and+infarct+size+with+TTC+staining+in+langendorff+rat+model.">One hour reperfusion is enough to assess function and infarct size with TTC staining in langendorff rat model.</a> Cardiovascular Drugs and Therapy. 23 (4), 327-331 (2009).</li><li>Sutherland, F. J., Shattock, M. J., Baker, K. E., Hearse, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+isolated+perfused+heart:+Characteristics+and+cautions.">Mouse isolated perfused heart: Characteristics and cautions.</a> Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 30 (11), 867-878 (2003).</li><li>Reichelt, M. E., Willems, L., Hack BA, ., Peart, J. N., Headrick, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+and+coronary+function+in+the+langendorff-perfused+mouse+heart+model.">Cardiac and coronary function in the langendorff-perfused mouse heart model.</a> Experimental Physiology. 94 (1), 54-70 (2009).</li><li>Xie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+inhibition+blunts+ischemia/reperfusion+injury+by+inducing+cardiomyocyte+autophagy.">Histone deacetylase inhibition blunts ischemia/reperfusion injury by inducing cardiomyocyte autophagy.</a> Circulation. 129 (10), 1139-1151 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

El corazón aislado y perfundido de rata puede ser utilizado con éxito para estudiar el efecto de la intervención farmacológica en el precondicionamiento cardíaco en la isquemia reperfusión 9. Sin embargo, hay algunos pasos esenciales para el procedimiento que debe ser estandarizada con el fin de asegurar resultados reproducibles. El mantenimiento de una temperatura de 37,4 ° C dentro del sistema es crítica, ya que incluso la hipotermia leve y la hipertermia pueden causar preacondicionamiento cardíaco...

La elucidación de los hechos que subyacen a la respuesta cardiaca tanto la isquemia y la reperfusión es esencial para mejorar el tratamiento del infarto de 1 y cardíacas procedimientos quirúrgicos miocardio que requieren pinzamiento aórtico 2. Mientras que los modelos in vivo de la lesión de reperfusión de isquemia permiten el análisis de punto final muy útiles, no son tan eficaces para el estudio de los efectos funcionales de la lesión de reperfusión de isquemia aguda en tiempo real. Además, en modelos de isquemia reperfusión in vivo generalmente producen variabilidad significativa en el tamaño del infarto, y la entrega directa de medicamento para el corazón en el momento de la reperfusión es un reto. La utilización de un sistema de corazón Langendorff aislados para el estudio de la lesión de reperfusión de isquemia permite una evaluación funcional en tiempo real de los tratamientos farmacológicos, área uniforme de tejido infartado, y la entrega instantánea del fármaco directamente al miocardio. En primer lugar se describe by Oscar Langendorff en 1895 3, el corazón Langendorff aislado es un modelo robusto para el estudio de la lesión por isquemia-reperfusión, después de haber sido utilizado en la investigación de isquemia reperfusión durante los últimos 40 años 4,5. Aquí, se hacen algunas modificaciones para optimizar el corazón aislado para el análisis funcional. En la canulación situ de la aorta mientras el corazón está latiendo asegura que el corazón no experimenta precondicionamiento isquémico que pudieran alterar los resultados de los ensayos de reperfusión isquemia 6. Para facilitar esto, se realiza una traqueotomía, lo que permite la ventilación y garantizar la estabilidad fisiológica de la rata durante la cirugía. El corazón luego se une a una columna con camisa de agua espiral de vidrio a través del cual tampón de Krebs Henseleit se entrega a través de perfusión retrógrada directamente en la aorta. Un globo lleno de solución salina se inserta en el ventrículo izquierdo y unido a un transductor de presión, que permite la medición en tiempo real de las presiones desde dentro de la una ventrículod cálculo de varios parámetros funcionales. A la conclusión del experimento, el corazón se lava con solución salina fría para detener la contracción y flash congelado en nitrógeno líquido para permitir el análisis aguas abajo de los niveles de ADN, ARN y proteínas. Por lo tanto modificado, el corazón Langendorff perfundidos sirve como un sistema eficaz para la supervisión directa del efecto fisiológico de las intervenciones farmacológicas en cualquier momento de forma aguda durante la lesión por isquemia y reperfusión.

<table><tbody><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>203726</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate Dibasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>RES20765-A7</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride Dihydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Octanoic Acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2875</td><td></td></tr><tr><td>2,3,5-triphenyltetrazolium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8877</td><td></td></tr><tr><td>Medical Pressure Transducer</td><td>MEMSCAP</td><td>SP844</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex Peristaltic Pump</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-07521-40</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex Easy Load Pump Head</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-07518-10</td><td></td></tr><tr><td>Heated circulating water bath</td><td>Lauda</td><td>M3</td><td></td></tr><tr><td>Tubing Flow Module</td><td>Transonic</td><td>TS410</td><td></td></tr><tr><td>Modular Research Console</td><td>Transonic</td><td>T402</td><td></td></tr><tr><td>Inline flow sensor</td><td>Transonic</td><td>ME2PXN</td><td></td></tr><tr><td>PowerLab Data Acquisition Device</td><td>AD Instruments</td><td>PL3508</td><td></td></tr><tr><td>LabChart data acquisition software</td><td>AD Instruments</td><td>MLU60/8</td><td></td></tr></tbody></table>

induction and assessment of ischemia-reperfusion injury in langendorff-perfused rat hearts

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for myocardial infarction and cardiac complications of thoracic surgery. The ability of certain drugs to precondition the myocardium against ischemia reperfusion injury has led to multiple clinical trials, with little success. The isolated heart model allows acute observation of the functional effects of ischemia reperfusion injury in real time, including the effects of various pharmacological interventions administered at any time-point before or within the ischemia-reperfusion injury window. Since brief periods of ischemia can precondition the heart against ischemic injury, in situ aortic cannulation is performed to allow for functional assessment of non-preconditioned myocardium. A saline filled balloon is placed into the left ventricle to allow for real-time measurement of pressure generation. Ischemic injury is simulated by the cessation of perfusion buffer flow, followed by reperfusion. The duration of both ischemia and reperfusion can be modulated to examine biochemical events at any given time-point. Although the Langendorff isolated heart model does not allow for the consideration of systemic events affecting ischemia and reperfusion, it is an excellent model for the examination of acute functional and biochemical events within the window of ischemia reperfusion injury as well as the effect of pharmacological intervention on cardiac pre- and postconditioning. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform in situ aortic cannulation and heart excision followed by ischemia/reperfusion injury in the Langendorff model.

El aparato de balón del ventrículo izquierdo permite la monitorización en tiempo real de la presión desarrollada por la contratación del ventrículo izquierdo (Figura 1). Como se ha descrito previamente 7, esta traza de presión puede ser usada para calcular muchos de los parámetros de la función ventricular. Estos cálculos pueden realizarse en la fase de línea de base, así como la fase de reperfusión, promediados sobre múltiples trazas dentro de cada grupo, y se compararon con el...

Watch this Scientific Journal Video about Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts at JoVE.com

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

The isolated rat heart is an enduring model for ischemia reperfusion injury. Here, we describe the process of harvesting the beating heart from a rat via in situ aortic cannulation, Langendorff perfusion of the heart, simulated ischemia-reperfusion injury, and infarct staining to confirm the extent of ischemic insult.

Inducción y Evaluación de la isquemia-reperfusión en perfundidos Langendorff corazones de ratas

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

induction-assessment-ischemia-reperfusion-injury-langendorff-perfused

Research

JoVE Journal

Medicine

22.8K vistas.  Medical University of South Carolina. The isolated rat heart is an enduring model for ischemia reperfusion injury. Here, we describe the process of harvesting the beating heart from a rat via in situ aortic cannulation, Langendorff perfusion of the heart, simulated ischemia-reperfusion injury, and infarct staining to confirm the extent of ischemic insult.

Video: Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

Acute Myocardial Infarction in Rats

With heart failure leading the cause of death in the USA (Hunt), biomedical research is fundamental to advance medical treatments for cardiovascular diseases. Animal models that mimic human cardiac disease, such as myocardial infarction (MI) and ischemia-reperfusion (IR) that induces heart failure as well as pressure-overload (transverse aortic constriction) that induces cardiac hypertrophy and heart failure (Goldman and Tarnavski), are useful models to study cardiovascular disease. In particular, myocardial ischemia (MI) is a leading cause for cardiovascular morbidity and mortality despite controlling certain risk factors such as arteriosclerosis and treatments via surgical intervention (Thygesen). Furthermore, an acute loss of the myocardium following myocardial ischemia (MI) results in increased loading conditions that induces ventricular remodeling of the infarcted border zone and the remote non-infarcted myocardium. Myocyte apoptosis, necrosis and the resultant increased hemodynamic load activate multiple biochemical intracellular signaling that initiates LV dilatation, hypertrophy, ventricular shape distortion, and collagen scar formation. This pathological remodeling and failure to normalize the increased wall stresses results in progressive dilatation, recruitment of the border zone myocardium into the scar, and eventually deterioration in myocardial contractile function (i.e. heart failure). The progression of LV dysfunction and heart failure in rats is similar to that observed in patients who sustain a large myocardial infarction, survive and subsequently develops heart failure (Goldman). The acute myocardial infarction (AMI) model in rats has been used to mimic human cardiovascular disease; specifically used to study cardiac signaling mechanisms associated with heart failure as well as to assess the contribution of therapeutic strategies for the treatment of heart failure. The method described in this report is the rat model of acute myocardial infarction (AMI). This model is also referred to as an acute ischemic cardiomyopathy or ischemia followed by reperfusion (IR); which is induced by an acute 30-minute period of ischemia by ligation of the left anterior descending artery (LAD) followed by reperfusion of the tissue by releasing the LAD ligation (Vasilyev and McConnell). This protocol will focus on assessment of the infarct size and the area-at-risk (AAR) by Evan's blue dye and triphenyl tetrazolium chloride (TTC) following 4-hours of reperfusion; additional comments toward the evaluation of cardiac function and remodeling by modifying the duration of reperfusion, is also presented. Overall, this AMI rat animal model is useful for studying the consequence of a myocardial infarction on cardiac pathophysiological and physiological function.

The rat model of acute myocardial infarction (AMI) is useful to study the consequence of a MI on cardiac pathophysiological and physiological function.

Infarto agudo de miocardio en ratas

With heart failure leading the cause of death in the USA (Hunt), biomedical research is fundamental to advance medical treatments for cardiovascular ...

Investigación

Medicina

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in experimental models that range in scale from cell cultures to whole-organs[1, 2]. Using state-of-the-art optical imaging systems, generation and propagation of action potentials during normal cardiac rhythm or throughout initiation and maintenance of arrhythmias can be visualized almost instantly[1]. The latest commercially-available systems can provide information at exceedingly high spatiotemporal resolutions and were based on custom-built equipment initially developed to overcome the obstacles imposed by more conventional electrophysiological methods[1]. Advancements in high-resolution and high-speed complementary metal-oxide-semiconductor (CMOS) cameras and intensely-bright, light-emitting diodes (LEDs) as well as voltage-sensitive dyes, optics, and filters have begun to make electrical signal acquisition practical for cardiovascular cell biologists who are more accustomed to working with microscopes. Although the newest generation of CMOS cameras can acquire 10,000 frames per second on a 16,384 pixel array, depending on the type of sample preparation, long-established fluorescence acquisition technologies such as photodiode arrays, laser scanning systems, and cooled charged-coupled device (CCD) cameras still have some distinct advantages with respect to dynamic range, signal-to-noise ratio, and quantum efficiency[1, 3]. In the present study, Lewis rat hearts were perfused ex vivo with a crystalloid perfusate (Krebs-Henseleit solution) at 37&deg;C on a modified Langendorff apparatus. After a 20 minute stabilization period, the hearts were intermittently perfused with 11 mMol/L 2,3-butanedione monoxime to eliminate contraction-associated motion during image acquisition. For optical mapping, we loaded hearts with the fast-response potentiometric probe di-8-ANEPPS[4] (5 &mu;Mol/L) and briefly illuminated the preparation with 475&plusmn;15 nm excitation light. During a typical 2 second period of illumination, &gt;605 nm light emitted from the cardiac preparation was imaged with a high-speed CMOS camera connected to a horizontal macroscope. For this demonstration, hearts were paced at 300 beats per minute with a coaxial electrode connected to an isolated electrical stimulation unit. Simultaneous bipolar electrographic recordings were acquired and analyzed along with the voltage signals using readily-available software. In this manner, action potentials on the surface of Langendorff-perfused rat hearts can be visualized and registered with electrographic signals.

This article describes a high temporal and spatial resolution technique to optically image action potential movement on the surface of Langendorff-perfused rat hearts using a potentiometric dye (di-8-ANEPPS).

Mapeo óptico de corazones de ratas Langendorff perfundidos

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

Biología

Evaluation of Coronary Flow Reserve After Myocardial Ischemia Reperfusion in Rats

Coronary artery disease is the leading cause of death worldwide. After an acute myocardial infarction, early and successful myocardial intervention via recanalization of the coronary artery is the most effective strategy for reducing the size of ischemic myocardium. The coronary microvasculature cannot be visualized and imaged&#160;in vivo, but there are several invasive and noninvasive techniques that can be used to assess parameters which depend directly on coronary microvascular function. The endothelial function after ischemia reperfusion can be assessed also at the level of the coronary circulation via the coronary flow reserve (CFR).&#160;In this study, peak velocity of left anterior descending (LAD) coronary arteries was measured in rats in vivo via Transthoracic Doppler Echocardiography during resting and stress challenge (induced by Dobutamine). A normal heart can increase its coronary blood flow up to four times above the resting values during stress induction. Following ischemia reperfusion, we found a significantly diminished CFR, which can be used as a marker of coronary microvascular dysfunction. CFR has opened a window on the importance of microvascular dysfunction and has been shown to predict cardiovascular risk independent of whether the severe obstructive disease is present.

Coronary flow reserve (CFR), is defined as the ratio of maximal coronary blood flow to the resting coronary blood flow. We present a protocol for evaluating CFR in rats via ultrasound, which offers the opportunity to predict cardiovascular risk factors in the absence of obstructive coronary disease.

Evaluación de la Reserva de Flujo Coronario Después de la Reperfusión de Isquemia Miocárdica en Ratas

Coronary artery disease is the leading cause of death worldwide. After an acute myocardial infarction, early and successful myocardial intervention via ...

Mejora de la investigación de ECV con perfusión de Langendorff modificada

Modified Langendorff Perfusion for Extended Perfusion Times of Rodent Cardiac Grafts

Despite important advancements in the diagnosis and treatment of cardiovascular diseases (CVDs), the field is in urgent need of increased research and scientific advancement. As a result, innovation, improvement and/or repurposing of the available research toolset can provide improved testbeds for research advancement. Langendorff perfusion is an extremely valuable research technique for the field of CVD research that can be modified to accommodate a wide array of experimental needs. This tailoring can be achieved by personalizing a large number of perfusion parameters, including perfusion pressure, flow, perfusate, temperature, etc. This protocol demonstrates the versatility of Langendorff perfusion and the feasibility of achieving longer perfusion times (4 h) without graft function loss by utilizing lower perfusion pressures (30-35 mmHg). Achieving extended perfusion times without graft damage and/or function loss caused by the technique itself has the potential to eliminate confounding elements from experimental results. In effect, in scientific circumstances where longer perfusion times are relevant to the experimental needs (i.e., drug treatments, immunological response analysis, gene editing, graft preservation, etc.), lower perfusion pressures can be key for scientific success.

Autor destacado: Avance de la investigación cardiovascular - Técnicas de perfusión de Langendorff personalizadas para mejorar los resultados experimentales

This article demonstrates the feasibility of achieving longer perfusion times (4 h) of murine cardiac grafts without function loss by employing lower (30-35 mmHg) than physiological (60-80 mmHg) perfusion pressures during Langendorff.

Perfusión de Langendorff modificada para prolongar los tiempos de perfusión de injertos cardíacos de roedores

Despite important advancements in the diagnosis and treatment of cardiovascular diseases (CVDs), the field is in urgent need of increased research and ...

Bioingeniería

Organ Ischemia-Reperfusion Injury by Simulating Hemodynamic Changes in Rat Liver Transplant Model

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats is a tried and proven animal model used for preoperative, intraoperative, and postoperative studies, including ischemia-reperfusion injury (IRI) of extrahepatic organs. This model requires numerous experiments and devices. The duration of anhepatic phase is closely related to the time to develop IRI after transplantation. In this experiment, we used hemodynamic changes to induce extrahepatic organ damage in rats and determined the maximum tolerance time. The time until the most severe organ injury varied for different organs. This method can easily be replicated and can also be used to study IRI of the extrahepatic organs after liver transplantation.

This paper provides a detailed description of how to build an animal model of the anhepatic phase (liver ischemia) in rats to facilitate basic research into ischemia-reperfusion injury after liver transplantation.

Lesión de isquemia-reperfusión de órganos mediante la simulación de cambios hemodinámicos en el modelo de trasplante de hígado de rata

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats is a tried and proven animal model used for preoperative, intraoperative, and postoperative studies, ...

A Fluorescence Assay for Evaluating the Permeability of a Cardiac Microvascular Endothelial Barrier in a Rat Model of Ischemia/reperfusion

Revascularization therapies for culprit arteries, regardless of percutaneous coronary intervention and coronary artery bypass grafting, are considered the best strategy for improving the clinical prognosis of patients with acute coronary syndrome (ACS). Nonetheless, myocardial reperfusion following effective revascularization can trigger significant cardiomyocyte death and coronary endothelial collapse, known as myocardial ischemia/reperfusion injury (MIRI). Usually, endothelial cells and their intercellular tight junctions cooperatively maintain the microvascular endothelial barrier and its relatively low permeability but fail in reperfusion areas. 
Microvascular endothelial hyperpermeability induced by ischemia/reperfusion (IR) contributes to myocardial edema, increased infiltration of pro-inflammatory cells, and aggravated intramyocardial hemorrhage, which may worsen the prognosis of ACS. The tracer used in this study-70,000 Da FITC-dextran, a branched glucose molecule labeled by fluorescein isothiocyanate (FITC)-appears too large to infiltrate the cardiac microvascular endothelium in normal conditions. However, it is capable of infiltrating a broken barrier after MIRI. Thus, the higher the endothelial permeability is, the more FITC-dextran accumulates in the extravascular intercellular space. Thus, the intensity of fluorescence from FITC can indicate the permeability of the microvascular endothelial barrier. This protocol takes advantage of FITC-dextran to evaluate the cardiac microvascular endothelial barrier functionally, which is detected by an automated quantitative pathology imaging system.

Here, we describe a method to functionally assess the endothelial barrier of cardiac microvessels after ischemia/reperfusion injury via the measurement of the mean fluorescence intensity of extravasated 70,000 Da FITC-dextran in comparison with Evans Blue.

Revascularization therapies for culprit arteries, regardless of percutaneous coronary intervention and coronary artery bypass grafting, are considered the ...

Induction of Myocardial Infarction and Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury in Mice

Acute myocardial infarction is a common cardiovascular disease with high mortality. Myocardial reperfusion injury can counteract the beneficial effects of heart reflow and induce secondary myocardial injury. A simple and reproducible model of myocardial infarction and myocardial ischemia-reperfusion injury is a good tool for researchers. Here, a customizable method to create a myocardial infarction (MI) model and MIRI by precision ligation of the left anterior descending coronary artery (LAD) through micromanipulation is described. Accurate and reproducible ligature positioning of the LAD helps obtain consistent results for heart injury. ST-segment changes can help to identify model accuracy. The serum level of cardiac troponin T (cTnT) is used to assess the myocardial injury, cardiac ultrasound is employed to evaluate the myocardial systolic function, and Evans-Blue/triphenyl tetrazolium chloride staining is used to measure infarct size. In general, this protocol reduces procedure duration, ensures controllable infarct size, and improves mouse survival.

Here we describe a simple and reproducible method that can induce myocardial infarction or myocardial ischemia-reperfusion injury in mice by precision ligation of the left anterior descending coronary artery through micromanipulation.

Inducción de infarto de miocardio y lesión por isquemia-reperfusión miocárdica en ratones

Acute myocardial infarction is a common cardiovascular disease with high mortality. Myocardial reperfusion injury can counteract the beneficial effects of ...

Improved Rodent Model of Myocardial Ischemia and Reperfusion Injury

Myocardial ischemia and reperfusion injury (MIRI), induced by coronary heart disease (CHD), causes damage to the cardiomyocytes. Furthermore, evidence suggests that thrombolytic therapy or primary percutaneous coronary intervention (PPCI) does not prevent reperfusion injury. There is still no ideal animal model for MIRI. This study aims to improve the MIRI model in rats to make surgery easier and more feasible. A unique method for establishing MIRI is developed by using a soft tube during a key step of the ischemic period. To explore this method, thirty rats were randomly divided into three groups: sham group (n = 10); experimental model group (n = 10); and existing model group (n = 10). Findings of triphenyltetrazolium chloride staining, electrocardiography, and percent survival are compared to determine the accuracies and survival rates of the operations. Based on the study results, it has been concluded that the improved surgery method is associated with a higher survival rate, elevated ST-T segment, and larger infarct size, which is expected to mimic the pathology of MIRI better.

Myocardial ischemia-reperfusion model of rat heart is improved by using a self-made retractor, polyvinyl chloride tube, and a unique knotting method. Electrocardiogram, triphenyltetrazolium chloride and histological staining, and percent survival analysis results showed that the improved model group has higher success and survival rates than the already existing model group.

Modelo mejorado de roedores de isquemia miocárdica y lesión por reperfusión

Myocardial ischemia and reperfusion injury (MIRI), induced by coronary heart disease (CHD), causes damage to the cardiomyocytes. Furthermore, evidence ...

Inducción y Evaluación de la isquemia-reperfusión en perfundidos Langendorff corazones de ratas

Resumen

Explorar más videos

Capítulos en este video

Infarto agudo de miocardio en ratas

Mapeo óptico de corazones de ratas Langendorff perfundidos

Evaluación de la Reserva de Flujo Coronario Después de la Reperfusión de Isquemia Miocárdica en Ratas

Perfusión de Langendorff modificada para prolongar los tiempos de perfusión de injertos cardíacos de roedores

Perfusión de Langendorff modificada para prolongar los tiempos de perfusión de injertos cardíacos de roedores

Perfusión de Langendorff modificada para prolongar los tiempos de perfusión de injertos cardíacos de roedores

Lesión de isquemia-reperfusión de órganos mediante la simulación de cambios hemodinámicos en el modelo de trasplante de hígado de rata

A Fluorescence Assay for Evaluating the Permeability of a Cardiac Microvascular Endothelial Barrier in a Rat Model of Ischemia/reperfusion

Inducción de infarto de miocardio y lesión por isquemia-reperfusión miocárdica en ratones

Modelo mejorado de roedores de isquemia miocárdica y lesión por reperfusión