Este trabajo fue apoyado por el Ministerio de Ciencia y Tecnología de Taiwán bajo número de concesión 101-2221-E-002-064-MY3.

1. La fabricación de dispositivos de microfluidos <ol><li> Utilice un software gráfico de diseño (por ejemplo, AutoCAD) para dibujar el contorno de una camiseta de microcanales. Para el T-microcanal, los dos canales de alimentación son 90 micras de ancho y 2,500 m de largo, y el canal de confluencia es de 180 micras de ancho y 3,000 m de largo. Conectar el extremo de cada canal a un individuo círculo con un diámetro de 1,100 m. </li><li> Marcos &#39;clara&#39; y &#39;oscuro&#39; de la exposición y las áreas cubiertas, respectivamente. Para un fotoprotector negativo (por ejemplo, SU-8), la forma de la T-microcanal es &#39;clara&#39; y el entorno es &quot;oscuro&quot;. </li><li> Utilice un generador de patrones de láser con una longitud de onda de 442 nm y un tamaño mínimo de característica de 2 micras para transferir el patrón de la T-microcanal sobre una fotomáscara de cromo sobre vidrio. </li><li> Utilice la fotomáscara, un sustrato (por ejemplo, de un solo lado pulido de obleas de silicio) y una resina fotosensible epoxi permanente (por ejemplo,., SU-8) para hacer un molde a través de un proceso de litografía estándar. La capa fotorresistente es 55,2 m de espesor. En general, el espesor fotorresistente debe ser más delgada que la profundidad de la correlación de la lente objetivo 17-19. </li><li> Utilice el molde y un material transparente, tal como polidimetilsiloxano (PDMS) para fabricar el T-20 microcanal. </li><li> Para la conexión fluídica, utilizar un tubo de acero inoxidable de 2 mm de diámetro exterior para perforar agujeros pasantes alineados con los patrones circulares en los PDMS. </li><li> Tratar las superficies de los PDMS y un portaobjetos de vidrio con plasma de oxígeno a 60 W durante 30 s. Conecte el PDMS a la lámina de vidrio. Las superficies oxidadas de los dos materiales crean una unión fuerte. Coloque la estructura PDMS unido en un plato caliente durante 5 minutos a 120 ° C. </li><li> Inserte los tubos de teflón en los agujeros perforados para la conexión de fluido. </li></ol> 2. Configuración Experimental <ol><li> Construir el sistema schlieren microescala de un Hoffman modulación contraste microscopio mediante la eliminación de la placa de ranura en el plano focal frontal del condensador y la sustitución de la modulador con un filo de cuchillo en el plano focal posterior del objetivo 5X 3. La profundidad de correlación, que depende de la apertura numérica del objetivo 17-19, debe ser suficiente para cubrir toda la profundidad del dispositivo de microfluidos. La superficie de la cuchilla es ennegrecido por óxido de aluminio anódica para reducir su reflectividad. </li><li> Monte la cámara de alta velocidad para el tubo trinocular del microscopio a través de un adaptador de montaje C. Tienes la cámara frente a la trayectoria óptica del microscopio a través de un divisor de haz. Conecte la cámara a una computadora de escritorio a través de un cable Ethernet. Establecer la corrección gamma a 1 para la cámara de manera que su lectura en escala de grises es proporcional a la luminancia de entrada. </li><li> Encienda la fuente de luz. Con el fin de evitar el exceso de calor, utilice LED (diodo emisor de luz) de iluminación. </li><li> Utilice un software de procesamiento de imágenes (por ejemplo, &lt;/ Em&gt; Función imread en MATLAB) para obtener los valores de escala de grises de una imagen adquirida. Retire el filo de cuchillo, ajustar la iluminación, la abertura y el tiempo de exposición, de modo que la lectura de la escala de grises promedio de la imagen es de aproximadamente 10% menor que el valor máximo. Esto denota la intensidad de fondo para un punto de corte 0% y usamos un valor de 230 para una imagen de 8 bits. </li><li> Inserte el filo de la navaja para bloquear la luz incidente por completo. Registre la lectura promedio de la escala de grises de la imagen. Esto indica la intensidad de fondo para un punto de corte 100% y el valor es aproximadamente 15 para una imagen de 8 bits. </li><li> Ajustar la posición del filo de cuchillo de tal manera que la lectura de la escala de grises promedio de la imagen adquirida se encuentra en el medio de los valores de 0% y 100% de corte. Ahora el grado de el punto de corte se establece en 50%. </li><li> Preparar dos fluidos transparentes con índices de refracción conocidos 21 que son completamente miscibles entre sí como los constituyentes. Para evaluar la dependencia de refracción index de la concentración de la mezcla, compruebe la literatura 21 o utilice la ecuación Gladstone-Dale 22. Si la curva no es lineal en toda la gama, recoger otros componentes del fluido. Entonces, elegir una composición designada por debajo del cual el índice de refracción de la solución varía linealmente con la concentración. Por ejemplo, utilice diluir etanol acuoso con una fracción másica de 0,05 y el agua como los fluidos de trabajo. </li><li> Ponga la camiseta de microcanales en el escenario de la muestra. Organizar el T-microcanales por lo que con el canal confluentes paralelo al filo de la navaja (Figura 1). </li><li> Preparar dos jeringas idénticas: Una jeringa se llena con el fluido de trabajo que sirve como el fluido de referencia (agua), y la jeringa B se llena con el otro fluido de trabajo (diluir etanol acuoso). El tamaño de la jeringa depende de la Q caudal deseado y la especificación de la bomba de jeringa: Q = πd 2 V / 4, donde d es el diámetro interior de la syrInge y V es la velocidad del émbolo. Pulsación de flujo por lo general se puede prevenir mediante la elección de una pequeña jeringa para aumentar V 23. </li><li> Recoger el fluido de salida de la T-microcanal en un vaso de precipitados. Asegúrese de que el tubo de salida de teflón se fija a la pared del vaso de precipitados y su final está por debajo del nivel de líquido en el vaso de precipitados con el fin de evitar la vibración que sería causado por breakoff gotita. </li></ol> 3. Calibración <ol><li> Adquirir las imágenes de los dos fluidos de mezcla y las imágenes de referencia. <ol><li> En un número de Reynolds Re dado, ajustar la velocidad de flujo de las bombas de jeringa, Q. Q se calcula a partir Q = μ (W + D) Re / 4ρ, donde μ y ρ son la viscosidad y la densidad del fluido de trabajo, y W y D son la anchura y la profundidad del canal de confluencia de la T-microcanal, respectivamente. </li><li> Cargar una bomba con jeringa A y la otra bomba con syringe B. Conecte las dos entradas de la T-microcanal para jeringa A y B de la jeringa a través de tubos de teflón. Iniciar las bombas de jeringa para entregar los fluidos de trabajo en el T-microcanal con caudales volumen idénticas. </li><li> Espere hasta que el flujo constante establece. La condición de flujo constante se define por la aparición de un patrón schlieren estacionaria. </li><li> Utilice el software de la cámara controlada para grabar veinte marcos de mezcla de fluidos a una velocidad de 30 fps. </li><li> Parar la bomba que se carga con la jeringuilla B. Sólo bombear el fluido de referencia (agua) a través de una entrada en el canal de confluencia de la T-microcanal a una tasa constante. </li><li> Espere hasta que se alcance la condición de flujo constante y no se observa ningún patrón schlieren. </li><li> Utilice el software de la cámara controlada para tomar la imagen de referencia, cuando hay falta de homogeneidad óptica está presente en el T-microcanal. Registre veinte fotogramas a una velocidad de 30 fps. </li><li> Repita 3.1.1 a 3.1.7 en diferente número de Reynolds: Re = 1, 5, 10, 20 y 50 de manera que ninguna estructura de flujo complejo emerge en la región de confluencia de la T-24 microcanal. </li></ol></li><li> Utilice un software de procesamiento de imágenes para dividir la imagen adquirida I (i, j) por la imagen de referencia I 0 (i, j) 25, donde i y j son los índices de píxeles. </li><li> Emplear un paquete de CFD (Computational Fluid Dynamics) para simular la mezcla de los fluidos designados en el T-microcanal. <ol><li> Construir el modelo tridimensional de la geometría de la T-microcanal. Discretizar el dominio de flujo en las redes estructuradas. Para aumentar la precisión, emplear malla más fina en la confluencia y la región central de la T-microcanal. </li><li> Asignar las propiedades físicas de los fluidos y establecer las condiciones de contorno para el dominio de flujo. Durante el proceso de resolución de problemas, determinar el coeficiente de difusión dependiente de la concentración de la concentración obtenida en la últimaiteración 26 a fin de actualizar la concentración local. </li><li> Examine la sensibilidad de los resultados calculados mediante la realización del estudio de rejilla 27. </li></ol></li><li> Para cada nodo (x i, y i) en el plano xy xy, utilizo la herramienta de post-procesamiento de CFD para tomar los valores medios del campo de concentración a través de la profundidad del canal por la regla trapezoidal: w (x i, y j) = {Σ k [w (x i, y j, k z) + w (x i, y j, z k 1)] ∙ (z k 1 - z k) / 2} / D 28, donde D es la profundidad del canal. Utilice el esquema de diferenciación fundamental para calcular la derivativa de la concentración con respecto a la dirección transversal de la corriente: (∂ w / ∂ y) i, j = [w (x i, y j 1) - w (x i, y j-1)] / (y j 1 - y j-1). </li><li> Para ambos gradientes positivos y negativos, extraer la relación de los valores de escala de grises I / I 0 (obtenido en 3.2) y el gradiente de fracción de masa ∂ w / ∂ y (obtenido en 3.4) en los lugares especificados, tales como y = 0 (línea central, sentido de la corriente dirección) o x dado varios (dirección transversal a la corriente). </li><li> Trazar los resultados y determinar la relación entre la I / I 0 y ∂ w / ∂ y, I / I 0 </sub&gt; C = 1 ∂ w / ∂ C y + 2 (C 1 y C 2 son constantes), con regresión lineal. </li></ol> 4. Cuantificación <ol><li> Repita los pasos 3.1 a 3.2 para la mezcla en el dispositivo de microfluidos objetivo. La profundidad del dispositivo de microfluidos objetivo debe ser idéntico o similar a la de la T-microcanal. Si se espera fenómeno inestable, adquirir un videoclip (secuencia de imágenes) en el paso 3.1.4 en su lugar. La velocidad de fotogramas debería ser suficiente para resolver la dinámica del flujo transitorio claramente alto, mientras que el tiempo de exposición debe ser idéntico al valor utilizado en 2.4, 2.5, 3.1.4 y 3.1.7. </li><li> Utilice la relación obtenida en la etapa 3.6 para convertir la relación de los valores de escala de grises para el gradiente de la fracción de masa en el dispositivo de microfluidos objetivo. </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

Para la mezcla de fluido en un dispositivo de microfluidos, la técnica schlieren microescala es capaz de medir la magnitud del gradiente de concentración a través de la cuantificación de cambio en la intensidad de la luz. Debido a que el principio de esta técnica se basa en la detección de la alternancia de propagación de la luz, los fluidos de trabajo y el dispositivo de microfluidos tienen que ser transparente para la luz incidente. Además, el protocolo requiere una relación lineal entre el índice de refracc...

Mezcla de líquidos es un problema importante que se encuentra en muchos procesos industriales y sistemas biológicos. Con la aparición de la microfluídica, mezclando en microescala ha traído mucha atención debido a su desafío en la dominación de difusión entre los mecanismos de transporte de masas. Desde el diseño de una validación cuantitativa micromezclador efectiva requerida, varios métodos de medición se desarrollaron 5-7. Sin embargo, la estructura tridimensional, se encuentran comúnmente en micromezcladores eficientes 5, exige una representación más precisa del campo de concentración que las técnicas de medición comunes no pueden entregar. Debido al límite de ángulo de visión 8 o cinética de reacción 6, los métodos mencionados anteriormente pueden producir resultados engañosos que no representan correctamente para la homogeneidad de la mezcla. Para fluidos ópticamente transparentes de mezcla en microestructuras ópticamente transparentes, técnica schlieren microescala 3,9-14 </sup&gt; proporciona una alternativa atractiva para analizar la mezcla de falta de homogeneidad. En el pasado, la técnica schlieren microescala ha sido utilizado principalmente para visualizar el flujo compresible 9-13, 15 o fase gradiente de 16. Microescala beneficios técnica Schlieren tanto de un diseño óptico simple y alta sensibilidad y permite no sólo la investigación no invasiva de la función de flujo específico que causa perturbación óptica pero es muy adecuado para su uso en la evaluación de la mezcla. En este trabajo, se construye el sistema schlieren microescala mediante la inserción de un filo de la navaja en el plano focal del objetivo de un microscopio, describir un procedimiento de calibración para realizar el análisis cuantitativo y reportar una medición de validación en un oscilador de microfluidos 4. Para implementar mediciones, los fluidos de trabajo se seleccionan adecuadamente de modo que el índice de refracción de los fluidos mezclados varía linealmente con la composición, y el espesor del dispositivo de microfluidos objetivo es idéntica a la dee utilizado en la calibración. Además de la concentración de las especies, la técnica schlieren microescala se puede extender para medir el gradiente de otra cantidad escalar que se correlaciona linealmente con el índice de refracción, tales como la temperatura o la salinidad.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Permanent Epoxy Negative Photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>SU-8 2150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>single side polished silicon wafer</td>
			<td>Light Technology</td>
			<td>S4W1PP5SABUP1</td>
			<td>p-type, diameter: 100&#177;0.5 mm, thickness: 525 &#177;25 mm, orientation: (1 0 0)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe pump</td>
			<td>kdScientific</td>
			<td>kds210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe, i.e. 10 ml</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS-10L2138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoffman modulation contrast microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DM IL LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X objective lens</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>N PLAN</td>
			<td>NA = 0.12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>knife-edge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>custom made part</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera, i.e. high speed</td>
			<td>Integrated Design Tools</td>
			<td>NX7-S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-mount adapter HC 0.63x</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>541537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera operating software</td>
			<td>Integrated Design Tools</td>
			<td>MotionPro X Studio 2.02.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard-184 silicone elastomer kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon tubing, i.e. O.D. x I.D. 1/16 in. x 0.031 in.</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>58700-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro glass slide</td>
			<td>Matsunami Glass</td>
			<td>S2215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hot plate</td>
			<td>Yeong-Shin</td>
			<td>HP-303DN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>distilled water, i.e. HPLC grade</td>
			<td>Alps Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethyl alcohol, i.e. reagent grade</td>
			<td>Nihon Shiyaku Reagent</td>
			<td>EA448652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>image processing software</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>MATLAB R2009a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>computational fluid dynamics package</td>
			<td>ESI group</td>
			<td>CFD-ACE+ 2008</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing mixing inhomogeneity in a microfluidic device by microscale schlieren technique

En este trabajo, presentamos el uso de la técnica schlieren microescala para medir la falta de homogeneidad de mezcla en un dispositivo de microfluidos. El sistema schlieren microescala se construye a partir de un microscopio de contraste de modulación Hoffman, que proporciona un fácil acceso al plano focal posterior de la lente del objetivo, mediante la eliminación de la placa de hendidura y la sustitución del modulador con un filo de la navaja. El principio de funcionamiento de la técnica schlieren microescala se basa en la detección de desviación de la luz causada por la variación del índice de refracción 1-3. La luz desviada sea escapa o es obstruido por el filo de la navaja para producir un brillante o una banda oscura, respectivamente. Si el índice de refracción de la mezcla varía linealmente con su composición, el cambio local en la intensidad de luz en el plano de la imagen es proporcional al gradiente de concentración normal al eje óptico. La imagen micro-schlieren da una proyección bidimensional de la luz producida por la falta de homogeneidad perturbado tridimensional. Para llevar a cabo el análisis cuantitativo, se describe un procedimiento de calibración que mezcla dos fluidos en un T-microcanal. Llevamos a cabo una simulación numérica para obtener el gradiente de concentración en el T-microcanales que se correlaciona estrechamente con la imagen-micro schlieren correspondiente. Por comparación, se establece una relación entre las lecturas de escala de grises de la imagen micro-schlieren y los gradientes de concentración presentados en un dispositivo de microfluidos. Usando esta relación, somos capaces de analizar la falta de homogeneidad de mezcla de imagen micro schlieren asociado y demostrar la capacidad de la técnica schlieren microescala con las mediciones en un oscilador de microfluidos 4. Para fluidos ópticamente transparentes, la técnica schlieren microescala es una herramienta de diagnóstico atractivo para proporcionar información de campo completo instantánea que conserva las características tridimensionales del proceso de mezcla.

La relación de escala de grises I / I 0 bajo diferente número de Reynolds para ambos gradientes positivos y negativos de la fracción de masa se ​​muestra (Figura 2) con una banda simétrica que aparece en el medio de la T-microcanal. En bajo número de Reynolds, la cola de la banda schlieren se expande y borrosa debido a la dispersión a través de la interfaz de mezcla. A medida que el número de Reynolds aumenta, la longitud de difusión acorta dando lugar a una ban...

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Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

Herein, we describe a procedure that employs microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. Through calibration, distribution of concentration gradient can be derived from the micro-schlieren image.

Analizando Mezcla falta de homogeneidad en un dispositivo de microfluidos por Microscale Schlieren Técnica

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.9K vistas.  National Taiwan University. Herein, we describe a procedure that employs microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. Through calibration, distribution of concentration gradient can be derived from the micro-schlieren image. 

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Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in vitro. Nutrients delivered by vasculature fail to reach all parts of tumors, giving rise to heterogeneous microenvironments consisting of viable, quiescent and necrotic cell types. Many cancer drugs fail to effectively penetrate and treat all types of cells because of this heterogeneity. Monolayers of cancer cells do not mimic this heterogeneity, making it difficult to test cancer drugs with a suitable in vitro model. Our microfluidic devices were fabricated out of PDMS using soft lithography. Multicellular tumor spheroids, formed by the hanging drop method, were inserted and constrained into rectangular chambers on the device and maintained with continuous medium perfusion on one side. The rectangular shape of chambers on the device created linear gradients within tissue. Fluorescent stains were used to quantify the variability in apoptosis within tissue. Tumors on the device were treated with the fluorescent chemotherapeutic drug doxorubicin, time-lapse microscopy was used to monitor its diffusion into tissue, and the effective diffusion coefficient was estimated. The hanging drop method allowed quick formation of uniform spheroids from several cancer cell lines. The device enabled growth of spheroids for up to 3 days. Cells in proximity of flowing medium were minimally apoptotic and those far from the channel were more apoptotic, thereby accurately mimicking regions in tumors adjacent to blood vessels. The estimated value of the doxorubicin diffusion coefficient agreed with a previously reported value in human breast cancer. Because the penetration and retention of drugs in solid tumors affects their efficacy, we believe that this device is an important tool in understanding the behavior of drugs, and developing new cancer therapeutics.

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We present the procedure for fabrication and operation of a microfluidic device that recreates heterogeneous tumor microenvironments in vitro. The variability in apoptosis within tumor tissue was quantified using fluorescent stains and the effective diffusion coefficient of the chemotherapeutic drug doxorubicin into tumor tissue was evaluated.

Dispositivo de microfluidos para volver a crear un microambiente tumoral<em&gt; In Vitro</em

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

Investigación

Bioingeniería

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a comparative manner. Multiwell plates are routinely used to compare many different strains or cell lines, but allow limited control over the environment dynamics. Microfluidic devices, on the other hand, allow exquisite dynamic control over the surrounding conditions, but it is challenging to image and distinguish more than a few strains in them. Here we describe a method to easily and rapidly manufacture a microfluidic device capable of applying dynamically changing conditions to multiple distinct yeast strains in one channel. The device is designed and manufactured by simple means without the need for soft lithography. It is composed of a Y-shaped flow channel attached to a second layer harboring microwells. The strains are placed in separate microwells, and imaged under the exact same dynamic conditions. We demonstrate the use of the device for measuring protein localization responses to pulses of nutrient changes in different yeast strains.

We present a simple method to produce microfluidic devices capable of applying similar dynamic conditions to multiple distinct strains, without the need for a clean room or soft lithography.

Un dispositivo de microfluidos para el estudio de varias cepas distintas

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an efficient manner. Typically, data for ~102 cells can be acquired within a 1 hr experiment. An automated image analysis program enables efficient post-experiment analysis of image data, enabling processing to be complete within a few hours. Our device geometry is unique in that cells must deform through a series of micron-scale constrictions, thereby enabling the initial deformation and time-dependent relaxation of individual cells to be assayed. The applicability of this method to human promyelocytic leukemia (HL-60) cells is demonstrated. Driving cells to deform through micron-scale constrictions using pressure-driven flow, we observe that human promyelocytic (HL-60) cells momentarily occlude the first constriction for a median time of 9.3 msec before passaging more quickly through the subsequent constrictions with a median transit time of 4.0 msec per constriction. By contrast, all-trans retinoic acid-treated (neutrophil-type) HL-60 cells occlude the first constriction for only 4.3 msec before passaging through the subsequent constrictions with a median transit time of 3.3 msec. This method can provide insight into the viscoelastic nature of cells, and ultimately reveal the molecular origins of this behavior.

We demonstrate a microfluidics-based assay to measure the timescale for cells to transit through a sequence of micron-scale constrictions.

Una técnica de microfluidos investigará Deformabilidad Cell

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in porous media are relevant to several industrial and environmental processes such as wastewater treatment and CO2 sequestration. We used Pseudomonas fluorescens, a Gram-negative aerobic bacterium, to investigate biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media. The microfluidic device consists of an array of micro-posts, which were fabricated using soft-lithography. Subsequently, biofilm formation in these devices with flow was investigated and we demonstrate the formation of filamentous biofilms known as streamers in our device. The detailed protocols for fabrication and assembly of microfluidic device are provided here along with the bacterial culture protocols. Detailed procedures for experimentation with the microfluidic device are also presented along with representative results.

Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.

Protocolo para Biofilm Streamer Formación en un dispositivo de microfluidos con Micro-pilares

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D culture of cells in collagen type I gels helps to stabilize cell morphology and function, which is necessary for creating microfluidic tissue models in microdevices. Translating traditional 3D culture techniques for tissue culture plates to microfluidic devices is often difficult because of the limited channel dimensions. In this method, we describe a technique for modifying native type I collagen to generate polycationic and polyanionic collagen solutions that can be used with layer-by-layer deposition to create ultrathin collagen assemblies on top of cells cultured in microfluidic devices. These thin collagen layers stabilize cell morphology and function, as shown using primary hepatocytes as an example cell, allowing for the long term culture of microtissues in microfluidic devices.

The creation of functional microtissues within microfluidic devices requires the stabilization of cell phenotypes by adapting traditional cell culture techniques to the limited spatial dimensions in microdevices. Modification of collagen allows the layer-by-layer deposition of ultrathin collagen assemblies that can stabilize primary cells, such as hepatocytes, as microfluidic tissue models.

Capa por capa deposición de colágeno en dispositivos de microfluidos para microtejidos Estabilización

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the spheroid cultures, a perfusable vascular network in the spheroids remains a critical challenge for long-term culture required to maintain and develop their functions, such as protein expressions and morphogenesis. The protocol presents a novel method to integrate a perfusable vascular network within the spheroid in a microfluidic device. To induce a perfusable vascular network in the spheroid, angiogenic sprouts connected to microchannels were guided to the spheroid by utilizing angiogenic factors from human lung fibroblasts cultured in the spheroid. The angiogenic sprouts reached the spheroid, merged with the endothelial cells co-cultured in the spheroid, and formed a continuous vascular network. The vascular network could perfuse the interior of the spheroid without any leakage. The constructed vascular network may be further used as a route for supply of nutrients and removal of waste products, mimicking blood circulation in vivo. The method provides a new platform in spheroid culture toward better recapitulation of living tissues.

The protocol describes how to engineer a perfusable vascular network in a spheroid. The spheroid's surrounding microenvironment is devised to induce angiogenesis and connect the spheroid to the microchannels in a microfluidic device. The method allows the perfusion of the spheroid, which is a long-awaited technique in three-dimensional cultures.

Perfusable Red Vascular con un modelo de tejido en un dispositivo de microfluidos

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

Detección de endotoxinas en las formulaciones Nano mediante ensayos de Limulus Amoebocyte Lysate (LAL)

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

Generación de condiciones ambientales dinámicas utilizando un dispositivo microfluídico de alto rendimiento

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high encapsulation efficiency. Use of lipid nanoparticles (LNPs) to encapsulate nucleic acids is advantageous to protect the RNA or DNA from degradation, while also promoting cellular uptake. LNPs often contain multiple lipid components including an ionizable lipid, helper lipid, cholesterol, and polyethylene glycol (PEG) conjugated lipid. LNPs can readily encapsulate nucleic acids due to the ionizable lipid presence, which at low pH is cationic and allows for complexation with negatively charged RNA or DNA. Here LNPs are formed by encapsulating messenger RNA (mRNA) or plasmid DNA (pDNA) using rapid mixing of the lipid components in an organic phase and the nucleic acid component in an aqueous phase. This mixing is performed using a precise microfluidic mixing platform, allowing for nanoparticle self-assembly while maintaining laminar flow. The hydrodynamic size and polydispersity are measured using dynamic light scattering (DLS). The effective surface charge on the LNP is determined by measuring the zeta potential. The encapsulation efficiency is characterized using a fluorescent dye to quantify entrapped nucleic acid. Representative results demonstrate the reproducibility of this method and the influence that different formulation and process parameters have on the developed LNPs.

Lipid nanoparticles are developed using a microfluidic mixing platform approach for mRNA and DNA encapsulation.

Formulación y caracterización de nanopartículas lipídicas para la administración de genes utilizando una plataforma de mezcla microfluídica

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high ...

Preparation and Structural Evaluation of Epithelial Cell Monolayers in a Physiologically Sized Microfluidic Culture Device

In vitro microfluidic experimentation holds great potential to reveal many insights into the microphysiological phenomena occurring in conditions such as acute respiratory distress syndrome (ARDS) and ventilator-induced lung injury (VILI). However, studies in microfluidic channels with dimensions physiologically relevant to the terminal bronchioles of the human lung currently face several challenges, especially due to difficulties in establishing appropriate cell culture conditions, including media flow rates, within a given culture environment. The presented protocol describes an image-based approach to evaluate the structure of NCI-H441 human lung epithelial cells cultured in an oxygen-impermeable microfluidic channel with dimensions physiologically relevant to the terminal bronchioles of the human lung. Using phalloidin-based filamentous-actin staining, the cytoskeletal structures of the cells are revealed by confocal laser scanning microscopy, allowing for the visualization of individual as well as layered cells. Subsequent quantification determines whether the cell culture conditions being employed are producing uniform monolayers suitable for further experimentation. The protocol describes cell culture and layer evaluation methods in microfluidic channels and traditional fixed-well environments. This includes channel construction, cell culture and requisite conditions, fixation, permeabilization and staining, confocal microscopic imaging, image processing, and data analysis.

The presented protocol describes the development and use of a phalloidin-based filamentous-actin staining technique with confocal laser scanning microscopy (CLSM) to visualize adherent cell layer structure in microfluidic dynamic-culture channels and traditional fixed-well static-culture chambers. This approach aids in evaluating cell layer confluency, monolayer formation, and layer-thickness uniformity.

Preparación y evaluación estructural de monocapas de células epiteliales en un dispositivo de cultivo microfluídico de tamaño fisiológico

In vitro microfluidic experimentation holds great potential to reveal many insights into the microphysiological phenomena occurring in conditions such as ...