Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud de subvención # 1R01CA120825-01A1, la investigación en colaboración Biomédica (CBR) Programa de la Universidad de Massachusetts Amherst, y la Beca J. Isenberg para Bhushan Toley. Agradecemos la valiosa contribución de James Schafer, el camarógrafo, narrador y editor de este video.

1. Fabricación de los dispositivos La réplica de características de microfluidos en materiales elastoméricos se basó en el método descrito por Duffy et al. 1 <ol><li> Elastómero Mix (polidimetilsiloxano; PDMS) y agente de curado del Kit de elastómero de silicona (Dow Corning, Midland, MI) en una proporción en peso 9:1 y se vierte sobre el maestro para formar una capa de 4 mm de espesor. Degas para eliminar burbujas de aire y curar la mezcla a 60 ° C durante 5 horas. Pelar PDMS curado del molde para obtener un sello de características de flujo en el elastómero. </li><li> Haga agujeros para las entradas y salidas de 1,5 mm usando un punzón de biopsia (Miltex, York, PA) montado en una prensa de taladro. Sacar los residuos. </li><li> Se somete el lado de características del sello y de un portaobjetos de vidrio limpio para plasma de oxígeno durante 8 minutos en un grabador de plasma de oxígeno. Traiga las superficies tratadas en contacto inmediatamente para formar un enlace entre ellos. Mantener el conjunto a 60 º C en un portaobjetos caliente durante al menos 5 horass para fortalecer el vínculo. </li><li> Conectar 0,032 &quot;ID tubos de PTFE (Cole Parmer, Vernon Hills, IL) a las entradas y salidas mediante una interfaz de cierre luer macho conectores conectados al púas conectores luer hembra de bloqueo (Qosina, Edgewood, NY). </li><li> Instale el ensamblaje de flujo utilizando válvulas de cierre y un conector (Upchurch Scientific, Oak Harbor, WA; Figura 1). Montar el dispositivo en el microscopio. Coloque jeringas para mangueras mediante 20G 1,5 &quot;agujas (BD Bioscience, Rockville, MD). </li></ol> 2. Formación de esferoides uniformes Esferoides fueron formados por el método de la gota colgante 2,3. <ol><li> Tripsinizar las células bajo una campana de cultivo celular estéril. </li><li> Centrifugar las células tratadas con tripsina a 2000 rpm durante 5 minutos y se resuspenden en medio fresco ml 6. Diluir la solución madre a una concentración final deseada (Tabla 1). </li><li> Retire la tapa de una placa de 48 pocillos y colocarlo boca abajo en el sterilized capucha. Regiones circulares correspondientes a cada pocillo son evidentes en la cubierta. Llenar cada pocillo de la placa con 1 ml de agua esterilizada para mantener la humedad. Poner una gota de 20 ml de la solución diluida de células en cada región circular con una micropipeta. Invierta cuidadosamente la tapa y colóquela sobre la placa bien, asegurando que las gotas no toque los bordes de los pozos. </li><li> Incubar la placa de pocillos a 37 º C durante un número especificado de días (Tabla 1). Un esferoide se formará en cada gota colgante. </li></ol> 3. Introducción de esferoides en el dispositivo Consulte la Figura 1 y la Tabla 2 de esta sección. <ol><li> Esterilizar el dispositivo por el lavado con 70% de etanol introducido a través de la entrada de flujo. Posteriormente, lavar con PBS seguido de tampón HEPES medio de cultivo celular. Deja F la jeringa medio S conectado a la tubería. </li><li> Empate 2-3 esferoides en P S jeringa, presione la jeringa para eliminar las burbujas de aire, yadjuntar a la entrada de embalaje del dispositivo. </li><li> Abra la válvula de entrada V Pin y cerca Fin V. Abra la válvula de salida Pout V y cerca Fout V. Mantenga la jeringa envasado vertical con la aguja apuntando hacia abajo; ver como esferoides depositan en el fondo de la jeringa en el conector de cierre luer de la aguja. Empujar el émbolo de la jeringa de embalaje y esferoides reloj entrar en el tubo y el flujo en el dispositivo. Debido a que sólo la válvula de salida del embalaje es abierto, un esferoide entrará en la cámara del dispositivo y ser retenido por los puestos en la parte de atrás (Fig. 2). </li><li> Cerrar la válvula de entrada y de salida V Pin Pout válvula V. Montar la jeringa F S en una bomba de jeringa. Abra la válvula y la válvula de aleta V V Fout. Flujo del medio en el dispositivo en 3 l / min. </li></ol> 4. Introducción de Agente de Detección de Apoptosis (CaspGLOW) Después de la colocación de cámaras de esferoides, para permitir el equilibrio up a 24 horas para establecer gradientes de nutrientes y los microambientes, antes de la introducción de la apoptosis o la detección de agentes terapéuticos. Debido a que los tejidos en las cámaras están en contacto con las paredes impenetrables de arriba y abajo, no hay gradientes de nutrientes a lo largo del espesor (0,15 mm) del tejido. Después de 24 horas de incubación, todas las capas de células a lo largo del espesor del tejido son por lo tanto equivalentes y la heterogeneidad es sólo en una dirección lejos del canal de flujo. <ol><li> Apague V Fin, parar la bomba de jeringa, retire la jeringa F S de la bomba y reemplazarlo con una jeringa que tiene un medio que contenía 0,25 l / ml de CaspGLOW Red activa la caspasa-3 marcador (Red-DEVD-FMK; Biovision, Mountain View, CA). </li><li> Enjuagar manualmente 0,7 ml de esta solución a través del dispositivo para asegurar el desplazamiento de más medio. Montar la jeringa en la bomba, a restablecer el flujo, y Fin de V abierta. Durante un período de 5-8 horas, la apoptosis detectar difunde agente en tél tejido y emite fluorescencia más brillante en regiones apoptóticas. Agente apoptosis detectar en esta concentración se mantiene en todas las soluciones de flujo subsiguiente en el dispositivo. </li></ol> Nota: <ol class="lroman"><li> Heterogeneidad del tejido puede ser confirmado mediante la obtención de perfiles lineales de intensidad de fluorescencia como se describe en la Sección 6. Los perfiles deben mostrar gradientes espaciales de la apoptosis, lo que confirma que el tejido es heterogénea con respecto a la viabilidad celular. </li><li> CaspGLOW verde activa la caspasa-3 marcador (Fluoresceína-DEVD-FMK; Biovision) también se puede utilizar para detectar la apoptosis. Este marcador contiene el fluoróforo fluoresceína verde en lugar de la rodamina fluorocromo rojo. </li></ol> 5. Introducción de agente terapéutico <ol><li> Siga el procedimiento de los pasos 4.1-4.2 para introducir 10 mM clorhidrato de doxorrubicina (DOX, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), que contiene el reactivo apoptosis. </li><li> Continuar flujo de la therapesolución de agente UTIC por un período fijo de tiempo. Cierre la válvula de aleta V y apague la bomba de jeringa. Reemplazar la jeringa tratamiento con una jeringa medio fresco que contiene el reactivo apoptosis. Permitir el flujo de medio fresco durante 24 -36 horas, mientras que supervisar continuamente el tejido bajo un microscopio. </li></ol> 6. Time-lapse microscopía y estimación de los coeficientes de difusividad de drogas Para la obtención de los datos de fluorescencia más limpias, adquirir todas las imágenes del microscopio, centrándose en las capas inferiores de los tejidos. Debido a que no hay gradientes de nutrientes en la dirección vertical (véase la Sección 4), las capas inferiores de células son buenos representantes de todas las demás capas anteriores. <ol><li> El proceso de adquisición fue automatizado mediante un script personalizado en IPLab (BD Bioscience, Rockville, MD). Adquirir imágenes de transmisión de luz y la fluorescencia de la esferoide embalado con un aumento de 10 veces cada 30 minutos (Fig. 3A). Acquire una imagen de la fluorescencia de fondo antes de la introducción de Dox. Para acomodar el gran tamaño de la cámara (1000 micras x 300 micras), adquieren dos imágenes contiguas y azulejos y baldosas juntos 4. </li><li> Para la estimación matemática de coeficientes de difusividad de drogas, el primer paso es para generar perfiles de intensidad promediados lineales de Dox fluorescencia usando ImageJ. Seleccione una región rectangular de interés (ROI) que abarca el tejido en la cámara. Utilice el comando Perfil Parcela para generar un perfil de intensidades promedio como una función de la distancia desde el canal de flujo. Repita el procedimiento para hasta 3 puntos de tiempo diferentes. </li><li> Obtener una imagen de fondo de fluorescencia antes de la introducción de Dox para medir la autofluorescencia del tejido. Restar la intensidad media de fluorescencia de fondo de los perfiles de intensidad obtenidos y normalizar cada perfil por la intensidad máxima correspondiente para obtener <img src="/files/ftp_upload/2425/2425eq0.jpg" alt="c" /> (X, t) (Fig. 3B). </li><li> El siguiente paso es evaluar la eficacia coeficiente de difusión D de Dox dentro del tejido tumoral. Dox difusión puede ser representado por la siguiente ecuación 5 <img src="/files/ftp_upload/2425/2425eq1.jpg" alt="Ecuación 1"/> donde erfc es la función de error complementaria, x es la distancia en el tejido desde el canal, y t es el tiempo después de la introducción de Dox (véase la fig. 3). Utilice el siguiente esquema iterativo en cada punto de tiempo considerado: <ul><li> Adivina un valor para D </li><li> Calcular lado derecho de la ecuación en cada ubicación x </li><li> Calcular la suma de los errores cuadráticos (residual) entre las dos partes </li><li> Modificar D para minimizar el residual </li></ul></li><li> Promedio de los valores óptimos de D obtenidos en cada punto de tiempo para estimar el coeficiente medio de difusión efectivo de Dox en el tejido. </li></ol> 7. Los resultados representativos: &lt;clase p = &quot;jove_content&quot;&gt; Los dispositivos de microfluidos proporcionado 1mm x 0,3 mm x 0,15 mm ópticamente cámaras accesibles de cultivo para el crecimiento de tejido del tumor en tres dimensiones. Esferoides multicelulares tumorales fueron trasladados a estas cámaras y fueron retenidos por dos puestos de filtro en la parte posterior. El método de la gota colgante permite rápida formación de esferoides de tamaño uniforme y la forma de varias líneas celulares. Esferoides fueron cultivadas con éxito en el dispositivo durante un máximo de 3 días. El crecimiento en las cámaras se asoció con una modificación reproducible de microambientes dentro de esferoides. La apoptosis se produjo menos en las células en la proximidad del canal de flujo y mayor más profundamente en el tejido. El dispositivo se utilizó para estimar el coeficiente de difusión de la doxorrubicina en el tejido tumoral. El valor obtenido de 8,75 x 10 -7 cm -1 2 s de acuerdo con el valor de 9,1 x 10 -7 cm 2 s -1 informó anteriormente 6 en cáncer de mama humano. <table border="1"><tbody><tr><td> Línea celular </td><td> Requiere concentración celular </td><td> Tiempo de incubación </td></tr><tr><td> LS174T </td><td> 300 células / l </td><td> 2-3 días </td></tr><tr><td> T47D </td><td> 750 células / l </td><td> 3-4 días </td></tr><tr><td> MDA-MB-231 </td><td> 150 células / l </td><td> 5-6 días </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Parámetros para Spheroids gota colgante <table border="1"><tbody><tr><td> Parte </td><td> Descripción </td></tr><tr><td> S F </td><td> Flujo Jeringa </td></tr><tr><td> S P </td><td> Embalaje Jeringa </td></tr><tr><td> V Fin </td><td> Flujo de la válvula de entrada </td></tr><tr><td> V Pin </td><td> Embalaje válvula de entrada </td></tr><tr><td> V Fout </td><td> Flujo de salida de la válvula </td></tr><tr><td> V Pout </td><td> Embalaje válvula de salida </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Las jeringas y válvulas en configuración de flujo <img src="/files/ftp_upload/2425/2425fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1 Esquema de la configuración de flujo de aleta V y V Fout:. Entrada de flujo y válvulas de salida; V Pin y Pout V: Embalaje de entrada y válvulas de salida, S y F S P: Flujo y jeringas de embalaje. La jeringa de preparación y envasado de entrada y válvulas de salida se utilizan cuando un esferoide se vuela en la cámara. La jeringa y el flujo de entrada de flujo y válvulas de salida se utilizan para fluir medio posteriormente. <img src="/files/ftp_upload/2425/2425fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Esquema de un esferoide atrapado en una cámara en el dispositivo. Un esferoide se hace fluir en la cámara en el dispositivo y está bloqueado por dos pos filtrots en la parte posterior de la cámara. <img src="/files/ftp_upload/2425/2425fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Doxorrubicina difusión en el tejido tumoral en el dispositivo. A. Fusionada imagen transmitida luz fluorescente y rojo de tejido, que muestra la ubicación y concentración de doxorrubicina (en rojo). La barra de escala representa a 250 micras. B. Normalizado perfil de intensidad de fluorescencia lineal de doxorubicina.

<ol>
	<li>Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Prototyping+of+Microfluidic+Systems+in+Poly(dimethylsiloxane).">Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in Poly(dimethylsiloxane).</a> Anal. Chem. 70, 4974-4984 (1998).</li><li>Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+generation+of+homogeneous+multicellular+tumor+spheroids+applicable+to+a+wide+variety+of+cell+types.">Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types.</a> Biotechnol. Bioeng. 83, 173-180 (2003).</li><li>Timmins, N. E., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+multicellular+tumor+spheroids+by+the+hanging-drop+method.">Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method.</a> Methods. Mol. Med. 140, 141-151 (2007).</li><li>Kasinskas, R. W., Forbes, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+typhimurium+specifically+chemotax+and+proliferate+in+heterogeneous+tumor+tissue+in+vitro.">Salmonella typhimurium specifically chemotax and proliferate in heterogeneous tumor tissue in vitro.</a> Biotechnol. Bioeng. 94, 710-721 (2006).</li><li>Walsh, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multipurpose+microfluidic+device+designed+to+mimic+microenvironment+gradients+and+develop+targeted+cancer+therapeutics.">A multipurpose microfluidic device designed to mimic microenvironment gradients and develop targeted cancer therapeutics.</a> Lab. Chip. 9, 545-554 (2009).</li><li>Lankelma, J., Fernandez Luque, R., Dekker, H., Schinkel, W., Pinedo, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mathematical+model+of+drug+transport+in+human+breast+cancer.">A mathematical model of drug transport in human breast cancer.</a> Microvasc. Res. 59, 149-161 (2000).</li><li>Less, J. R., Skalak, T. C., Sevick, E. M., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+architecture+in+a+mammary+carcinoma:+branching+patterns+and+vessel+dimensions.">Microvascular architecture in a mammary carcinoma: branching patterns and vessel dimensions.</a> Cancer. Res. 51, 265-273 (1991).</li><li>Brown, J. M., Giaccia, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unique+physiology+of+solid+tumors:+opportunities+(and+problems)+for+cancer+therapy.">The unique physiology of solid tumors: opportunities (and problems) for cancer therapy.</a> Cancer. Res. 58, 1408-1416 (1998).</li><li>Thomlinson, R. H., Gray, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histological+structure+of+some+human+lung+cancers+and+the+possible+implications+for+radiotherapy.">The histological structure of some human lung cancers and the possible implications for radiotherapy.</a> Br. J. Cancer. 9, 539-549 (1955).</li><li>Minchinton, A. I., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+penetration+in+solid+tumours.">Drug penetration in solid tumours.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 583-592 (2006).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

La vascularización de los tumores son escasas y mal desarrollados 7,8. Hay regiones situadas lejos (&gt; 100 mm) de los vasos sanguíneos que son inaccesibles para los nutrientes y medicamentos suministrados aunque la vasculatura 9. El microambiente heterogénea resultante contribuye a la eficacia limitada de muchos agentes quimioterapéuticos 10. El dispositivo microfluídico desarrollado aquí recrea un microambiente tumoral heterogénea que se caracteriza por la proliferación, las c...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre de reactivo </th><th> Empresa </th><th> El número de catálogo </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> Kit de silicona elastómero </td><td> Ellsworth Adhesives </td><td> 184 Sil Elast Kit </td><td></td></tr><tr><td> Miltex biopsia en sacabocados </td><td> MedexSupply </td><td> MTX-33-31AA </td><td> 1,5 mm </td></tr><tr><td> PTFE tubería </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06.417-31 </td><td> 0,032 &quot;ID </td></tr><tr><td> Hombre luer lock </td><td> Qosina </td><td> 65111 </td><td></td></tr><tr><td> Púas conector hembra luer lock </td><td> Qosina </td><td> 11556 </td><td></td></tr><tr><td> Válvula de cierre </td><td> Idex Salud y Ciencia </td><td> P-721 </td><td></td></tr><tr><td> Y-conector </td><td> Idex Salud y Ciencia </td><td> P-513 </td><td></td></tr><tr><td> 20G 1,5 &quot;agujas </td><td> BD Bioscience </td><td> 305176 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H-4034 </td><td></td></tr><tr><td> CaspGLOW fluoresceína </td><td> Biovision </td><td> K183-25 </td><td></td></tr><tr><td> CaspGLOW Red </td><td> Biovision </td><td> K193-25 </td><td></td></tr><tr><td> Clorhidrato de doxorubicina </td><td> Sigma </td><td> 44583 </td><td></td></tr><tr><td> LS174T </td><td> ATCC </td><td> CCL-188 </td><td> Carcinoma de colon humano línea celular </td></tr><tr><td> T47D </td><td> ATCC </td><td> HTB-133 </td><td> Carcinoma ductal Humanos línea celular </td></tr><tr><td> MDA-MB-231 </td><td> ATCC </td><td> HTB-26 </td><td> Adenocarcinoma mamario humano línea celular </td></tr></tbody></table>

microfluidic device for recreating a tumor microenvironment in vitro

Hemos desarrollado un dispositivo de microfluidos que imita la entrega y el aclaramiento sistémico de fármacos para heterogéneos tejidos tridimensionales tumorales in vitro. Nutrientes suministrados por la vasculatura no llegan a todas las partes de los tumores, dando lugar a microambientes heterogéneo que consiste en tipos de células viables, quiescentes y necróticas. Muchos fármacos de cáncer no logran penetrar con eficacia y tratar todos los tipos de células, debido a esta heterogeneidad. Las monocapas de células de cáncer no imitan esta heterogeneidad, por lo que es difícil de probar fármacos contra el cáncer con un adecuado modelo in vitro. Nuestros dispositivos de microfluidos se fabricaron fuera de PDMS mediante litografía blanda. Esferoides multicelulares tumorales, formadas por el método de la gota colgante, se insertaron y constreñido en cámaras rectangulares en el dispositivo y se mantiene con perfusión del medio continuo en un lado. La forma rectangular de cámaras en el dispositivo creado gradientes lineales dentro del tejido. Manchas fluorescentes se utilizan para cuantificar ªe variabilidad en la apoptosis en el tejido. Los tumores en el dispositivo fueron tratados con el fármaco quimioterapéutico doxorrubicina fluorescente, el tiempo transcurrido microscopía se utilizó para controlar su difusión en el tejido, y el coeficiente de difusión efectiva se estimó. El método de la gota colgante permite rápida formación de esferoides uniformes a partir de varias líneas celulares de cáncer. El dispositivo de activar el crecimiento de esferoides de hasta 3 días. Las células en la proximidad del medio que fluye fueron mínimamente apoptótica y los alejados del canal eran más apoptótica, con lo que precisa que imitan las regiones de los tumores adyacentes a los vasos sanguíneos. El valor estimado del coeficiente de difusión doxorrubicina mostró de acuerdo con un valor previamente en el cáncer de mama humano. Debido a que la penetración y la retención de las drogas en los tumores sólidos afecta a su eficacia, creemos que este dispositivo es una herramienta importante en la comprensión del comportamiento de los medicamentos y el desarrollo de nuevas terapias contra el cáncer.

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Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

Se presenta el procedimiento para la fabricación y el funcionamiento de un dispositivo de microfluidos que recrea heterogéneos microambientes tumorales<em&gt; In vitro</em&gt;. La variabilidad en la apoptosis en el tejido tumoral se cuantificó utilizando tinciones fluorescentes y el coeficiente de difusión eficaz del fármaco quimioterapéutico doxorrubicina en el tejido tumoral se evaluó.

Dispositivo de microfluidos para volver a crear un microambiente tumoral<em&gt; In Vitro</em

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

microfluidic-device-for-recreating-a-tumor-microenvironment-in-vitro

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

11.5K vistas.  University Of Massachusetts Amherst. Se presenta el procedimiento para la fabricación y el funcionamiento de un dispositivo de microfluidos que recrea heterogéneos microambientes tumorales In vitro. La variabilidad en la apoptosis en el tejido tumoral se cuantificó utilizando tinciones fluorescentes y el coeficiente de difusión eficaz del fármaco quimioterapéutico doxorrubicina en el tejido tumoral se evaluó.

Video: Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a comparative manner. Multiwell plates are routinely used to compare many different strains or cell lines, but allow limited control over the environment dynamics. Microfluidic devices, on the other hand, allow exquisite dynamic control over the surrounding conditions, but it is challenging to image and distinguish more than a few strains in them. Here we describe a method to easily and rapidly manufacture a microfluidic device capable of applying dynamically changing conditions to multiple distinct yeast strains in one channel. The device is designed and manufactured by simple means without the need for soft lithography. It is composed of a Y-shaped flow channel attached to a second layer harboring microwells. The strains are placed in separate microwells, and imaged under the exact same dynamic conditions. We demonstrate the use of the device for measuring protein localization responses to pulses of nutrient changes in different yeast strains.

We present a simple method to produce microfluidic devices capable of applying similar dynamic conditions to multiple distinct strains, without the need for a clean room or soft lithography.

Un dispositivo de microfluidos para el estudio de varias cepas distintas

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

Investigación

Bioingeniería

Tissue Engineering of Tumor Stromal Microenvironment with Application to Cancer Cell Invasion

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and invasion. Rat tail type I collagen and/or matrix derived from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells have been traditionally employed as the substrates to model the matrix or stromal microenvironment into which mesenchymal cells (usually fibroblasts) are populated. Although experiments using such matrices are very informative, it can be argued that due to an overriding presence of a single protein (such as in type I Collagen) or a high content of basement membrane components and growth factors (such as in matrix derived from mouse sarcoma cells), these substrates do not best reflect the contribution to matrix composition made by the stromal cells themselves. To study native matrices produced by primary dermal fibroblasts isolated from patients with a tumor prone, genetic blistering disorder (recessive dystrophic epidermolysis bullosa), we have adapted an existing native matrix protocol to study tumor cell invasion. Fibroblasts are induced to produce their own matrix over a prolonged period in culture. This native matrix is then detached from the culture dish and epithelial cells are seeded onto it before the entire coculture is raised to the air-liquid interface. Cellular differentiation and/or invasion can then be assessed over time. This technique provides the ability to assess epithelial-mesenchymal cell interactions in a 3D setting without the need for a synthetic or foreign matrix with the only disadvantage being the prolonged period of time required to produce the native matrix. Here we describe the application of this technique to assess the ability of a single molecule expressed by fibroblasts, type VII collagen, to inhibit tumor cell invasion.

Tissue engineered fibroblast-derived native matrix is an emerging tool to generate a stromal substrate which supports epithelial cell proliferation and differentiation. Here a protocol applying this methodology to assess the impact of different stromal cell types on tumor cell biology is presented.

Ingeniería de tejidos de tumor del estroma Microambiente con Aplicación a la invasión de células cancerosas

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and ...

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in porous media are relevant to several industrial and environmental processes such as wastewater treatment and CO2 sequestration. We used Pseudomonas fluorescens, a Gram-negative aerobic bacterium, to investigate biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media. The microfluidic device consists of an array of micro-posts, which were fabricated using soft-lithography. Subsequently, biofilm formation in these devices with flow was investigated and we demonstrate the formation of filamentous biofilms known as streamers in our device. The detailed protocols for fabrication and assembly of microfluidic device are provided here along with the bacterial culture protocols. Detailed procedures for experimentation with the microfluidic device are also presented along with representative results.

Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.

Protocolo para Biofilm Streamer Formación en un dispositivo de microfluidos con Micro-pilares

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren system is constructed from a Hoffman modulation contrast microscope, which provides easy access to the rear focal plane of the objective lens, by removing the slit plate and replacing the modulator with a knife-edge. The working principle of microscale schlieren technique relies on detecting light deflection caused by variation of refractive index1-3. The deflected light either escapes or is obstructed by the knife-edge to produce a bright or a dark band, respectively. If the refractive index of the mixture varies linearly with its composition, the local change in light intensity in the image plane is proportional to the concentration gradient normal to the optical axis. The micro-schlieren image gives a two-dimensional projection of the disturbed light produced by three-dimensional inhomogeneity.
To accomplish quantitative analysis, we describe a calibration procedure that mixes two fluids in a T-microchannel. We carry out a numerical simulation to obtain the concentration gradient in the T-microchannel that correlates closely with the corresponding micro-schlieren image. By comparison, a relationship between the grayscale readouts of the micro-schlieren image and the concentration gradients presented in a microfluidic device is established. Using this relationship, we are able to analyze the mixing inhomogeneity from associate micro-schlieren image and demonstrate the capability of microscale schlieren technique with measurements in a microfluidic oscillator4. For optically transparent fluids, microscale schlieren technique is an attractive diagnostic tool to provide instantaneous full-field information that retains the three-dimensional features of the mixing process.

Herein, we describe a procedure that employs microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. Through calibration, distribution of concentration gradient can be derived from the micro-schlieren image.

Analizando Mezcla falta de homogeneidad en un dispositivo de microfluidos por Microscale Schlieren Técnica

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Irritación de los ojos de prueba (IET) para la identificación del peligro de los ojos: Irrita los productos químicos que utilizan Reconstruido humana Córnea-como epitelial (RHCE) Modelo de Tejidos

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human gut-on-a-chip microphysiological device. We recapitulate the intestinal lumen-capillary tissue interface in a microfluidic device, where physiological mechanical deformations and fluid shear flow are constantly applied to mimic peristalsis. In the lumen microchannel, human intestinal epithelial Caco-2 cells are cultured to form a &#39;germ-free&#39; villus epithelium and regenerate small intestinal villi. Pre-cultured microbial cells are inoculated into the lumen side to establish a host-microbe ecosystem. After microbial cells adhere to the apical surface of the villi, fluid flow and mechanical deformations are resumed to produce a steady-state microenvironment in which fresh culture medium is constantly supplied and unbound bacteria (as well as bacterial wastes) are continuously removed. After extended co-culture from days to weeks, multiple microcolonies are found to be randomly located between the villi, and both microbial and epithelial cells remain viable and functional for at least one week in culture. Our co-culture protocol can be adapted to provide a versatile platform for other host-microbiome ecosystems that can be found in various human organs, which may facilitate in vitro study of the role of human microbiome in orchestrating health and disease.

We describe an in vitro protocol to co-culture gut microbiome and intestinal villi for an extended period using a human gut-on-a-chip microphysiological system.

Co-cultivo de estar con microbioma intestinal humana microconstruidos Villi en una Gut-on-a-Chip dispositivo de microfluidos

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the spheroid cultures, a perfusable vascular network in the spheroids remains a critical challenge for long-term culture required to maintain and develop their functions, such as protein expressions and morphogenesis. The protocol presents a novel method to integrate a perfusable vascular network within the spheroid in a microfluidic device. To induce a perfusable vascular network in the spheroid, angiogenic sprouts connected to microchannels were guided to the spheroid by utilizing angiogenic factors from human lung fibroblasts cultured in the spheroid. The angiogenic sprouts reached the spheroid, merged with the endothelial cells co-cultured in the spheroid, and formed a continuous vascular network. The vascular network could perfuse the interior of the spheroid without any leakage. The constructed vascular network may be further used as a route for supply of nutrients and removal of waste products, mimicking blood circulation in vivo. The method provides a new platform in spheroid culture toward better recapitulation of living tissues.

The protocol describes how to engineer a perfusable vascular network in a spheroid. The spheroid's surrounding microenvironment is devised to induce angiogenesis and connect the spheroid to the microchannels in a microfluidic device. The method allows the perfusion of the spheroid, which is a long-awaited technique in three-dimensional cultures.

Perfusable Red Vascular con un modelo de tejido en un dispositivo de microfluidos

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of robust, predictive in vitro test systems is essential. Hepatic toxicology is key when considering ENM exposure, as the liver serves a vital role in metabolic homeostasis and detoxification as well as being a major site of ENM accumulation post exposure. Based upon this and the accepted understanding that 2D hepatocyte models do not accurately mimic the complexities of intricate multi-cellular interactions and metabolic activity observed in vivo, there is a greater focus on the development of physiologically relevant 3D liver models tailored for ENM hazard assessment purposes in vitro. In line with the principles of the 3Rs to replace, reduce and refine animal experimentation, a 3D HepG2 cell-line based liver model has been developed, which is a user friendly, cost effective system that can support both extended and repeated ENM exposure regimes (&#8804;14 days). These spheroid models (&#8805;500 &#181;m in diameter) retain their proliferative capacity (i.e., dividing cell models) allowing them to be coupled with the &#8216;gold standard&#8217; micronucleus assay to effectively assess genotoxicity in vitro. Their ability to report on a range of toxicological endpoints (e.g., liver function, (pro-)inflammatory response, cytotoxicity and genotoxicity) has been characterized using several ENMs across both acute (24 h) and long-term (120 h) exposure regimes. This 3D in vitro hepatic model has the capacity to be utilized for evaluating more realistic ENM exposures, thereby providing a future in vitro approach to better support ENM hazard assessment in a routine and easily accessible manner.

This procedure was established to be used for developing advanced 3D hepatic cultures in vitro, which can provide a more physiologically relevant assessment of the genotoxic hazards associated with nanomaterial exposures over both an acute or long-term, repeated dose regimes.

Modelos avanzados de hígado 3D para pruebas de genotoxicidad in vitro tras la exposición a nanomateriales a largo plazo

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

Generación de condiciones ambientales dinámicas utilizando un dispositivo microfluídico de alto rendimiento

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Configuración de un dispositivo microfluídico para la producción de tapones combinatorios

Bilayer Microfluidic Device for Combinatorial Plug Production

Droplet microfluidics is a versatile tool that allows the execution of a large number of reactions in chemically distinct nanoliter compartments. Such systems have been used to encapsulate a variety of biochemical reactions - from incubation of single cells to implementation of PCR reactions, from genomics to chemical synthesis. Coupling the microfluidic channels with regulatory valves allows control over their opening and closing, thereby enabling the rapid production of large-scale combinatorial libraries consisting of a population of droplets with unique compositions. In this paper, protocols for the fabrication and operation of a pressure-driven, PDMS-based bilayer microfluidic device that can be utilized to generate combinatorial libraries of water-in-oil emulsions called plugs are presented. By incorporating software programs and microfluidic hardware, the flow of desired fluids in the device can be controlled and manipulated to generate combinatorial plug libraries and to control the composition and quantity of constituent plug populations. These protocols will expedite the process of generating combinatorial screens, particularly to study drug response in cells from cancer patient biopsies.

Autor destacado: Integración de enfoques computacionales y experimentales en oncología de precisión

The fabrication of a polydimethylsiloxane (PDMS)-based bilayer device for the production of combinatorial libraries in water-in-oil emulsions (plugs) is presented here. The necessary hardware and software required to automate plug production are detailed in the protocol, and the production of a quantitative library of fluorescent plugs is also demonstrated.

Dispositivo microfluídico bicapa para la producción de tapones combinatorios

Droplet microfluidics is a versatile tool that allows the execution of a large number of reactions in chemically distinct nanoliter compartments. Such ...