Los autores desean agradecer Lloyd Ung de aportación constructiva en las primeras versiones de esta técnica, el Dr. Jeremy Agresti para tapa de presión consejos de diseño, y el Dr. Dongping Qi por su ayuda en la fabricación de la tapa de presión. Estamos muy agradecidos a los laboratorios de M. Teitell y P. Gunaratne para proporcionar una variedad de muestras de células para la prueba. Estamos muy agradecidos a la Fundación Nacional para la Ciencia (CARRERA Premio DBI-1254185), el Centro Integral del Cáncer Jonsson de la UCLA, y la UCLA Clínica y Translational Science Institute para apoyar este trabajo.

1. Diseño de dispositivos de microfluidos NOTA: El diseño del dispositivo tiene cuatro regiones funcionales básicos: puerto de entrada, filtro de células, matriz de constricción, y el puerto de salida (Figura 1). El diseño general se puede aplicar a una amplia gama de tipos de células, con ajustes menores en las dimensiones. Siempre he aquí algunas recomendaciones básicas de diseño, junto con los parámetros del dispositivo que son eficaces para una selección de ambas células primarias y inmortalizadas. <ol><li> Seleccionar la anchura de los canales de la matriz de constricción (Figura 1B) en aproximadamente 30-50% del diámetro medio de celda; estos resultados de proporción-constricción a célula de tamaño en la deformación celular significativa, pero la obstrucción mínima. Dado un tipo de célula que no ha sido previamente probado, es prudente para diseñar una gama de anchos de constricción de ~ 30-50% del diámetro de la celda para encontrar el ancho óptimo. Al igual que con muchos tipos de dispositivos de microfluidos, más de 120 maestros moldes de dispositivos pueden tomar como modelo en un pecadogle oblea de silicio de 4 pulgadas, lo que permite una gran variedad de diferentes diseños de dispositivos que se fabrica en un único proceso de fabricación. </li><li> Seleccione la altura del canal a ser al menos 50% del diámetro de la célula; Esto asegura que la célula está confinado en 2 dimensiones. Para evitar el colapso durante la unión de canal, asegúrese de que la relación de aspecto del canal no menos de 1:10 es (altura: anchura) en todo el dispositivo. Para los canales que deben superar esta relación de aspecto, añadir puestos de apoyo para evitar el colapso. Postes de soporte espacio a una distancia que es al menos dos veces el diámetro de la celda, para no impedir el flujo celular. </li><li> Incluir un filtro en los puertos de entrada para eliminar los residuos y desagregar grupos de células (Figura 1B). Ajuste el tamaño y el espaciamiento de los postes de filtro de modo que la distancia que separa los mensajes es aproximadamente igual a un diámetro celular. NOTA: El límite inferior del tamaño de la característica está establecida por la resolución con la que la máscara de la litografía se imprime. Asegúrese de que todas las funciones están dentro de los resolution límite especificado por el proveedor máscara. </li></ol> 2. Suministros y Preparación NOTA: Antes de realizar un experimento, los siguientes elementos deben estar preparados. Un diagrama esquemático de la configuración completa se da en la Figura 1. <ol><li> Fabricar el maestro dispositivo usando técnicas estándar para micromecanizado litográfica 14,15. Verificar la altura de las características modeladas utilizando un perfilómetro. NOTA: Mientras que los maestros pueden ser fácilmente fabricados en una instalación de salas blancas, algunos laboratorios han desarrollado métodos de litografía de bajo costo para su uso en un entorno semi-limpia 16,17. </li><li> Preparar la fuente de aire para el flujo accionado por presión, usando un tanque de aire comprimido y la secuencia de los reguladores de aire y accesorios (Figura 1A). <ol><li> Establecer un tanque de suministro de aire y regulador manual. NOTA: Una composición de 5% de CO2 en aire mantiene un ambiente similar a un incubato típica de cultivo de célulasr, pero otras mezclas de gases pueden también ser utilizados. </li><li> Establecer un regulador de presión controlado electrónicamente en línea con el regulador manual. Utilice un convertidor electroneumático para regular y mantener una caída de presión estable a través de los canales, con fluctuaciones de presión de menos de 2 kPa. Utilice el código simple escrito en LabVIEW (Información complementaria) a la entrada de la presión deseada. NOTA: El convertidor electro-neumática utiliza un bucle de retroalimentación interno para ajustar la presión de salida de la válvula para que coincida con la presión especificada a través del dispositivo de microfluidos. </li><li> Configurar una cámara presurizada para conducir el flujo de la suspensión celular. Montar una cámara de suspensión de células de un citómetro de flujo estándar de tubo y una tapa mecanizada que crea un sello hermético a presión en el tubo. NOTA: La tapa de la cámara de presión contiene dos orificios: una entrada que se conecta al tanque de aire comprimido, y una salida a través de la cual las células fluyen desde la cámara de presión en el dispositivo (Figure 2). </li></ol></li><li> Establecer un microscopio invertido equipado con una cámara que tiene una velocidad de adquisición de al menos 100 fotogramas por segundo para capturar imágenes de las células fluyen a través de la matriz de constricción. Interfaz de la cámara con una tarjeta de captura de vídeo y un ordenador. </li><li> Preparar una solución madre de tensioactivo de 10% w / w de Pluronic F-127 en tampón fosfato salino (PBS) como la adición de una pequeña cantidad de F127 a la solución de medio celular ayudará a minimizar la adhesión celular a las paredes de PDMS. Para preparar la solución F127, vórtice y calentar suavemente a 37 ° C para disolver el F127. Antes de usar, pasar la solución a través de un filtro de jeringa de 0,2 micras y almacenar a temperatura ambiente. Preparar la solución de tensioactivo antelación vórtex y filtrado generará burbujas que persistirán durante más de 24 horas. </li></ol> 3. la fabricación del dispositivo de microfluidos <ol><li> Fabrique bloque PDMS con canales de microfluidos. <ol><li> Mezclar bien con un PDMSta relación de 1:10 (w / w) agente de curado a la base. </li><li> Vierta la mezcla sobre el maestro del equipo (paso 2.1). Degas en una campana de vidrio con vacío aplicada hasta que las burbujas atrapadas desaparecen, o durante unos 10-20 min. NOTA: Después de este tiempo, todavía puede haber burbujas en la interfase aire-PDMS, que es normal; éstos normalmente se disiparán durante la cocción. Es más crítico para asegurar que no haya burbujas restantes adyacentes a los canales. </li><li> Hornee el dispositivo de desgasificado a 65 ° C durante 4 horas. Para evitar el colapso de los canales, hornear el dispositivo durante la noche para reticular aún más las PDMS para un dispositivo con un mayor módulo elástico que es más resistente al colapso canal. Sin embargo, nota que se extendía hornear también fragiliza los PDMS y puede conducir a la rotura al perforar agujeros (Paso 3.3). </li></ol></li><li> Retire los dispositivos de microfluidos del molde maestro. Cortar los dispositivos de microfluidos individuales fuera del bloque de PDMS con una hoja de afeitar y retire el dispositivo desde el mástiler. Comience levantando suavemente una esquina del dispositivo; pelado lento y suave, en lugar de levantar el bloque de PDMS hacia arriba, reduce la presión sobre los dos PDMS y el maestro. </li><li> Haga agujeros en el dispositivo de PDMS para crear puertos de conexión para el acceso entre la tubería y microcanales. Crear orificios utilizando un punzón de biopsia, y el punzón desde el lado del canal hasta el lado exterior del dispositivo. NOTA: Un punzón de biopsia con un diámetro interior de 0,75 mm crea agujeros de esa interfaz perfectamente con polieteretercetona (PEEK) tubo (diámetro exterior = 1/32 &quot;o 0,79 mm) o un tubo de polietileno (PE-20, de diámetro exterior = 0,043&quot; o 1,09 mm ). Use un anillo de luz para ayudar a visualizar agujeros en dispositivos con canales poco profundos 18. Asegúrese de que el punzón de biopsia es fuerte; después de un uso repetido la vanguardia embota y el punzón de biopsia debe ser desechado y sustituido. </li><li> Enjuague el dispositivo de PDMS con isopropanol (grado HPLC) para quitar trozos de polvo y presentadas de PDMS. Asegúrese de que elagujeros estén libres de desechos por la dirección de un flujo constante de isopropanol puro a partir de una botella de apretón a través de los agujeros. Secar con aire filtrado. Después de la limpieza, coloque PDMS bloques con canales boca arriba en una placa de Petri limpia para mantener la limpieza del dispositivo. Si es necesario, dispositivos de tiendas en esta forma hasta que la unión. </li><li> Limpie el sustrato de vidrio de lavado con metanol (grado HPLC), secar con aire filtrado y coloque sobre una placa caliente a 200 ° C durante 5-10 minutos para asegurar que el vaso está completamente limpia y seca antes del tratamiento de plasma. NOTA: El sustrato de vidrio se forma la parte inferior de cada canal. Normalmente basta un portaobjetos de vidrio, ya que un objetivo de 10X o 20X es ideal para la formación de imágenes de múltiples canales en paralelo. Para imágenes de mayor resolución, unir el dispositivo a un cubreobjetos (# 1.5 espesor). </li><li> Unir el dispositivo de PDMS al sustrato de vidrio. <ol><li> El plasma de oxígeno tratar el lateral de canal del bloque de PDMS y 1 lateral de un portaobjetos de vidrio. NOTA: WITH una unidad de descarga de mano, utilizar un tiempo de tratamiento de 1 min, pero optimizar el tiempo de tratamiento para cada aparato plasma de oxígeno. </li><li> Coloque el lado del canal de los PDMS en la parte superior del lado tratado del vidrio inmediatamente después del tratamiento. </li><li> Sostenga con una ligera presión para ~ 10 seg para promover la unión. Hornear todo el dispositivo a una temperatura elevada (60-80 ° C) durante al menos 15 min para mejorar la resistencia de la unión. </li></ol></li></ol> 4. Deformación células a través de canales constreñida <ol><li> Inspeccione el dispositivo de microfluidos con un microscopio. Asegúrese de que los canales no se contraen o rotas y que los dos orificios de entrada y salida se conectan directamente en los canales de dispositivos mediante el uso de un objetivo de baja potencia (10 veces). Designe dispositivos defectuosos al anotar la superficie del PDMS con una hoja de afeitar y no usarlos para experimentos. </li><li> Preparar las muestras de cultivo de células a ensayar. Células de cultivo utilizando condiciones estándar. <ol><li> Fo ejemplo, cultivo de células HL-60 en medio RPMI-1640 suplementado con solución de penicilina-estreptomicina al 1% y suero bovino fetal al 10% en 5% de CO 2 incubadora a 37 ° C. </li><li> Para las células adherentes, los cosechan por tripsinización y se resuspende en medio de crecimiento fresco. Utilice un protocolo tripsinización estándar; por ejemplo, añadir ~ 0,5 ml de tripsina a un matraz con 25 cm2 de área de cultivo, y volver a suspender en ~ 30 ml de medio fresco. Diferenciar células HL-60 en células de tipo neutrófilo por todo-trans retinoico (ATRA) a una concentración final de 5 mM por 1 x 10 5 células / ml como se ha descrito previamente 19,20. </li><li> Centrifugar las células a 300 xg durante 3 min, aspirar cuidadosamente las células sobrenadante y resuspender a la densidad final apropiado en medio de cultivo fresco con 0,1% v / v F-127. </li></ol></li><li> Contar las células utilizando un contador Coulter, hemocitómetro o citómetro de flujo. Ajustar la suspensión celular a una densidad de 1 × 10 6 5 x 10 <shasta&gt; 6 células / ml. Una vez que la densidad de la suspensión se ajusta, suplemento con aproximadamente 0,1% v / v F-127. NOTA: La densidad celular y la concentración de tensioactivo pueden necesitar ser modificada dependiendo de los sistemas de células particulares, Tabla 1 proporciona un registro de concentraciones utilizadas previamente de células y F-127 para diferentes tipos de células. </li><li> Coloque suspensión de células en un citómetro de flujo del tubo y conectarse a la tapa de presión. Antes de conectar el tubo al dispositivo de microfluidos, ajustar la presión a alrededor de 14-21 kPa y descarga hasta que la suspensión celular emerge desde la punta de la tubería. Esto ayudará a minimizar las burbujas de aire en el tubo y el dispositivo. </li><li> Inserte la punta del tubo que contiene la suspensión de células en la entrada de dispositivo. Si el equipo está unido a un cubreobjetos, coloque el dispositivo sobre una superficie plana y sólida, tal como la platina del microscopio antes de conectar el tubo; el cubreobjetos es frágil y lo contrario podría romperse. </li><li> Inserte un trozo de tubo into el puerto de salida y la ruta en un tubo de vacío para la recogida de residuos tal como un tubo Falcon vacío pegada a la cara de la platina del microscopio. Para mantener la coherencia en la resistencia fluídica global del dispositivo entre los experimentos, asegúrese de que el tubo de entrada y la salida es del mismo diámetro y aproximadamente la misma longitud para cada experimento. </li><li> Rampa suavemente la presión para cerca de 28 kPa o hasta que las células fluyen a través de los canales. Coloque el dispositivo de modo que múltiples canales están en el campo de visión y son perpendiculares a la parte inferior de la pantalla. Si la cámara está limitada por el tamaño de los datos, adquirir múltiples vídeos para generar un número suficiente de puntos de datos independientes. Ajustar la velocidad según sea necesario para la salida de datos deseado marco. Para captar los cambios en la forma celular, utilizar imágenes de alta velocidad a 300 fotogramas por segundo (fps); para medir los tiempos de tránsito de las células, utilizar velocidades de fotogramas de aproximadamente 100 fps. </li></ol> Análisis 5. Datos <ol><li> Abra el archivo de mástiler_script.m (Descargable Archivo Suplementario) y ejecutar el programa. </li><li> Seleccione el primer video para ser analizada desde la ventana del Explorador de Windows que aparece. Especifique la velocidad de fotogramas del vídeo seleccionado y presione intro. NOTA: Una figura aparecerá que pide al usuario que seleccione una ventana de recorte rectangular para el primer video. </li><li> Seleccionar una ventana que abarca todos los canales de izquierda a derecha y cruza los canales justo encima de la primera bombilla de la matriz de canales en la parte superior y la parte inferior (Figura 3). </li><li> Seleccione las regiones de constricción de la imagen recortada. Preste especial atención a mantener una distancia fija de píxeles entre la ventana de límite superior e inferior para cada vídeo seleccionado. NOTA: El borde superior ventana especifica la constricción superior y el borde inferior ventana especifica la constricción más inferior (Figura 4); constricciones intermedios se aproximan de esta entrada del usuario. A continuación, el algoritmo muestra las segmentation de las células en los primeros 50 cuadros de cada video (Figura 5). </li><li> Monitorear la imagen izquierda superior (Figura 5A) de cerca para determinar si el algoritmo está localizando con precisión las células; una imagen binarizada se superpone a la fuente de vídeo para demostrar la localización de las células identificadas. NOTA: Las diferentes ventanas, (Figuras 5B-5D) son para el diagnóstico de código y demuestran los fotogramas de vídeo después de las operaciones específicas de procesamiento de imágenes. </li><li> Seleccione el siguiente vídeo que se procesa a partir de la ventana del Explorador de Windows. NOTA: El algoritmo se repetirá los pasos 5.2-5.5 para cada vídeo seleccionado. </li><li> Seleccione Cancelar una vez todos los vídeos deseados, se han añadido a través de la ventana del Explorador de Windows para instruir a la función que la lista de vídeos se ha completado. NOTA: El algoritmo llevará a cabo las operaciones restantes sin intervención del usuario. Esto tomará aproximadamente 1-2 horas, dependiendo del número de vídeos procesados ​​y pe informáticosrformance. Al finalizar, el algoritmo producirá un histograma de los datos de tiempo de tránsito y guardar los datos en el directorio como un archivo .mat MATLAB y un archivo xls de Microsoft Excel. </li></ol>

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Los autores no tienen conflictos de intereses a revelar.

Aquí proporcionamos un procedimiento experimental global para el análisis de la deformación de las células que transitan a través de canales de microfluidos obstruida usando flujo de presión impulsada. Una secuencia de comandos de MATLAB permite el procesamiento automático de datos (material complementario); se mantiene una versión actualizada del código ( <a href="www.ibp.ucla.edu/research/rowat" target="_blank">www.ibp.ucla.edu/research/rowat</a> ). En términos más generales, las técnicas presentadas aquí...

Los cambios en la forma celular son fundamentales en numerosos contextos biológicos. Por ejemplo, los eritrocitos y los leucocitos se deforman través de los capilares que son menores que su propio diámetro 1. En la metástasis, las células cancerosas deben deformarse a través de huecos intersticiales estrechas, así como la vasculatura tortuosa y redes linfáticos para sembrar en sitios secundarios 2. Para investigar el comportamiento físico de las células individuales, dispositivos de microfluidos presentan una plataforma ideal que se puede personalizar para estudiar una serie de comportamientos celulares, incluyendo su capacidad de migrar a través de huecos estrecho 3 y deformar pasivamente a través de las constricciones de escala micrométrica 3- 9. Polidimetilsiloxano (PDMS) dispositivos de microfluidos son ópticamente transparentes, permitiendo deformaciones celulares para ser visualizadas mediante microscopía de luz y analizados utilizando herramientas básicas de procesamiento de imágenes. Además, las matrices de constricciones pueden ser definidos con precisión, que permite el análisis de múltiples células simultáneamente con unarendimiento que supera muchas técnicas existentes 10,11. Aquí se presenta un protocolo experimental detallado para sondear deformabilidad celular utilizando el dispositivo de microfluidos &#39;Cell Deformador&#39; PDMS. El dispositivo está diseñado de manera que las células de paso a través de constricciones secuenciales; esta geometría es común en contextos fisiológicos, tales como el lecho capilar pulmonar 12. Para medir la deformabilidad celular, el tiempo de tránsito proporciona una métrica conveniente que se mide fácilmente como el tiempo requerido para una célula individual a través de un único tránsito 4,6 constricción. Para mantener una caída de presión constante a través de los canales estrechos durante el tránsito de células, usamos flujo accionado por presión. Nuestro protocolo incluye instrucciones detalladas sobre el diseño del dispositivo y la fabricación, el funcionamiento del dispositivo de flujo impulsado por presión, la preparación y obtención de imágenes de células, así como el procesamiento de imágenes para medir el tiempo para que las células se deforman a través de una serie de constricciones. Incluimosambos diseños de dispositivos y el código de procesamiento de datos como archivos de visión suplementarios. Como una muestra representativa de los datos, se muestra el tiempo de tránsito celular a través de una serie de constricciones como una función del número de constricciones pases. Análisis de la escala de tiempo para que las células tránsito a través constricciones estrechos de un dispositivo de microfluidos puede revelar diferencias en la deformabilidad de una variedad de tipos de células 4,5,13. El dispositivo ha demostrado aquí examina únicamente el tránsito celular a través de una serie de constricciones a escala micrométrica; este diseño emula el tortuoso camino que las células experimentan en circulación y también permite sondear las características físicas adicionales de las células, tales como tiempo de relajación.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Pluronic F-127 Block Copolymer Surfactant&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">8409400</td>
			<td style="width:167px;">Produced by BASF, also available through Sigma</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">PDMS base and crosslinker</td>
			<td style="width:71px;">Essex Brownell</td>
			<td style="width:119px;">DC-184-1.1</td>
			<td style="width:167px;">Product commonly named Sylgard 184 Elastomer</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Oxygen plasma discharge unit</td>
			<td style="width:71px;">Enercon</td>
			<td style="width:119px;">Dyne-A-Mite 3D Treater</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Biopsy Punch, Harris Uni-Core (0.75 mm)</td>
			<td style="width:71px;">Ted Pella, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">15072</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Fingertight Ferrule, 1/32&#34;</td>
			<td style="width:71px;">Upchurch Scientific</td>
			<td style="width:119px;">UP-F-113</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Fingertight III Fitting, 10-32</td>
			<td style="width:71px;">Upchurch Scientific</td>
			<td style="width:119px;">UP-F-300X</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">polyetheretherketone (PEEK) tubing, outer diameter = 1/32&#34;or 0.79 mm</td>
			<td style="width:71px;">Valco</td>
			<td style="width:119px;">TPK.515-25M</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">polyethylene (PE-20) tubing, 0.043&#34; or 1.09 mm</td>
			<td style="width:71px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">427406</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Pressure regulator</td>
			<td style="width:71px;">Airgas or Praxair</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Polyurethane tubing, 5/32&#8221; OD</td>
			<td style="width:71px;">McMaster Carr</td>
			<td style="width:119px;">5648K284</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Push-to-connect fittings</td>
			<td style="width:71px;">McMaster Carr</td>
			<td style="width:119px;">5111K91</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Voltage to Pressure (E/P) Electropneumatic Converter</td>
			<td style="width:71px;">Omega</td>
			<td style="width:119px;">IP413-020</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:216px;">16-bit,250 kS/S, 80 Analog Inputs Multifunction DAQ</td>
			<td style="width:71px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;">NI PCI 6225-779295-01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:216px;">Analog Connector Block-Screw Terminal</td>
			<td style="width:71px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;">SCB-68-776844-01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:216px;">LabView System Design Software</td>
			<td style="width:71px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:216px;">Matlab Software</td>
			<td style="width:71px;">The MathWorks, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">Matlab R2012a</td>
			<td style="width:167px;">Code requires the Image Processing Toolbox</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:216px;">Shielded Cable</td>
			<td style="width:71px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;">SHC68-68</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a microfluidic technique to probe cell deformability

Aquí nos detalle el diseño, fabricación y uso de un dispositivo de microfluidos para evaluar la deformabilidad de un gran número de células individuales de una manera eficiente. Típicamente, los datos de ~ 10 2 células pueden ser adquiridos dentro de un experimento 1 hr. Un programa de análisis de imagen automatizado permite eficiente análisis post-experimento de datos de imagen, lo que permite el procesamiento de estar completo dentro de unas pocas horas. Nuestra geometría del dispositivo es único en que las células deben deformarse a través de una serie de constricciones a escala micrométrica, permitiendo de ese modo la deformación inicial y la relajación dependiente del tiempo de las células individuales a ensayar. La aplicabilidad de este método a las células de leucemia promielocítica humana (HL-60) se demuestra. Células de conducción para deformar través constricciones micras escala que utilizan flujo de presión impulsada, observamos que (HL-60) células promielocítica humana momentáneamente ocluyen la primera constricción de un tiempo medio de 9,3 ms antes de pases con mayor rapidez a través de la constricción posterioriones con un tiempo de tránsito promedio de 4,0 milisegundos por constricción. Por el contrario, todo-trans tratado con ácido (tipo de neutrófilos) retinoico células HL-60 ocluyen la primera constricción sólo 4,3 mseg antes de pases a través de las constricciones posteriores con un tiempo de tránsito mediana de 3,3 mseg. Este método puede dar una idea de la naturaleza viscoelástica de células, y finalmente revelar los orígenes moleculares de este comportamiento.

Para investigar la deformabilidad de diferentes tipos de células, células de leucemia mieloide humana (HL-60), células de neutrófilos, células diferenciadas de linfocitos de ratón, y líneas celulares de cáncer de ovario humano (OVCAR8, HEYA8) se evalúan utilizando la técnica de microfluidos la &quot;célula Deformador &#39;. Los resultados representativos para el tiempo de tránsito de la HL-60 células HL-60 y de tipo de neutrófilos muestran la escala de tiempo de una sola célula de tránsito a través de u...

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A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Se demuestra un ensayo basado en microfluídica para medir la escala de tiempo de tránsito para las células a través de una secuencia de constricciones a escala micrométrica.

Una técnica de microfluidos investigará Deformabilidad Cell

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

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11.2K vistas.  University of California, Los Angeles.  Se demuestra un ensayo basado en microfluídica para medir la escala de tiempo de tránsito para las células a través de una secuencia de constricciones a escala micrométrica. 

Video: A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Measurement of Bioelectric Current with a Vibrating Probe

Electric fields, generated by active transport of ions, are present in many biological systems and often serve important functions in tissues and organs. For example, they play an important role in directing cell migration during wound healing. Here we describe the manufacture and use of ultrasensitive vibrating probes for measuring extracellular electric currents. The probe is an insulated, sharpened metal wire with a small platinum-black tip (30-35 &mu;m), which can detect ionic currents in the &mu;A/cm2 range in physiological saline. The probe is vibrated at about 200 Hz by a piezoelectric bender. In the presence of an ionic current, the probe detects a voltage difference between the extremes of its movement. A lock-in amplifier filters out extraneous noise by locking on to the probe's frequency of vibration. Data are recorded onto computer. The probe is calibrated at the start and end of experiments in appropriate saline, using a chamber which applies a current of exactly 1.5 &mu;A/cm2. We describe how to make the probes, set up the system and calibrate. We also demonstrate the technique of cornea measurement, and show some representative results from different specimens (cornea, skin, brain).

The manufacture, calibration and use of non-invasive vibrating probes to measure bioelectric current in various biological systems is described.

Medición de la corriente bioeléctrica con una sonda vibrante

Electric fields, generated by active transport of ions, are present in many biological systems and often serve important functions in tissues and organs. ...

Investigación

Bioingeniería

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Diseño de un biorreactor de presión cíclica de la Ex Vivo Estudio de las válvulas aórtica del corazón

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This technology has shown potential in addressing previously challenging applications; including, delivery to primary immune cells, cell reprogramming, carbon nanotube, and quantum dot delivery. This vector-free microfluidic platform relies on mechanical disruption of the cell membrane to facilitate cytosolic delivery of the target material. Herein, we describe the detailed method of use for these microfluidic devices including, device assembly, cell preparation, and system operation. This delivery approach requires a brief optimization of device type and operating conditions for previously unreported applications. The provided instructions are generalizable to most cell types and delivery materials as this system does not require specialized buffers or chemical modification/conjugation steps. This work also provides recommendations on how to improve device performance and trouble-shoot potential issues related to clogging, low delivery efficiencies, and cell viability.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This protocol provides detailed steps on how to use the system for a broad range of applications.

Exprimir la célula como un robusto, Microfluidic intracelular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren system is constructed from a Hoffman modulation contrast microscope, which provides easy access to the rear focal plane of the objective lens, by removing the slit plate and replacing the modulator with a knife-edge. The working principle of microscale schlieren technique relies on detecting light deflection caused by variation of refractive index1-3. The deflected light either escapes or is obstructed by the knife-edge to produce a bright or a dark band, respectively. If the refractive index of the mixture varies linearly with its composition, the local change in light intensity in the image plane is proportional to the concentration gradient normal to the optical axis. The micro-schlieren image gives a two-dimensional projection of the disturbed light produced by three-dimensional inhomogeneity.
To accomplish quantitative analysis, we describe a calibration procedure that mixes two fluids in a T-microchannel. We carry out a numerical simulation to obtain the concentration gradient in the T-microchannel that correlates closely with the corresponding micro-schlieren image. By comparison, a relationship between the grayscale readouts of the micro-schlieren image and the concentration gradients presented in a microfluidic device is established. Using this relationship, we are able to analyze the mixing inhomogeneity from associate micro-schlieren image and demonstrate the capability of microscale schlieren technique with measurements in a microfluidic oscillator4. For optically transparent fluids, microscale schlieren technique is an attractive diagnostic tool to provide instantaneous full-field information that retains the three-dimensional features of the mixing process.

Herein, we describe a procedure that employs microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. Through calibration, distribution of concentration gradient can be derived from the micro-schlieren image.

Analizando Mezcla falta de homogeneidad en un dispositivo de microfluidos por Microscale Schlieren Técnica

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

Microfluidic Genipin Deposition Technique for Extended Culture of Micropatterned Vascular Muscular Thin Films

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular behaviors on disease-relevant time scales. Previously, microcontact printing has been used to fabricate two-dimensional functional arterial mimics through patterning of extracellular matrix protein as guidance cues for tissue organization. Vascular muscular thin films utilized these mimics to assess functional contractility. However, the microcontact printing fabrication technique used typically incorporates hydrophobic PDMS substrates. As the tissue turns over the underlying extracellular matrix, new proteins must undergo a conformational change or denaturing in order to expose hydrophobic amino acid residues to the hydrophobic PDMS surfaces for attachment, resulting in altered matrix protein bioactivity, delamination, and death of the tissues.
Here, we present a microfluidic deposition technique for patterning of the crosslinker compound genipin. Genipin serves as an intermediary between patterned tissues and PDMS substrates, allowing cells to deposit newly-synthesized extracellular matrix protein onto a more hydrophilic surface and remain attached to the PDMS substrates. We also show that extracellular matrix proteins can be patterned directly onto deposited genipin, allowing dictation of engineered tissue structure. Tissues fabricated with this technique show high fidelity in both structural alignment and contractile function of vascular smooth muscle tissue in a vascular muscular thin film model. This technique can be extended using other cell types and provides the framework for future study of chronic tissue- and organ-level functionality.

We present a method for microfluidic deposition of patterned genipin and fibronectin on PDMS substrates, allowing extended viability of vascular smooth muscle cell-dense tissues. This tissue fabrication method is combined with previous vascular muscular thin film technology to measure vascular contractility over disease-relevant time courses.

Microfluidic genipina Deposición Técnica de Cultura extendido de micropatterned vasculares musculares Thin Films

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

El uso de adhesivo Patrones para construir dispositivos de microfluidos de papel 3D

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Una plataforma microfluídica para el aislamiento de gran procesamiento de celda única y Cultura

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one particular implementation of the MFP, the hierarchical hydrodynamic flow confinement (hHFC), multiple liquids are simultaneously brought in contact with a substrate. Local chemical action and liquid shaping using the hHFC, is exploited to create cell patterns by locally lysing and removing cells. By utilizing the scanning ability of the MFP, user-defined patterns of cell monolayers are created. This protocol enables rapid, real-time and spatially controlled cell patterning, which can allow selective cell-cell and cell-matrix interaction studies.

We present a protocol to perform subtractive patterning of live cell monolayers on a surface. This is achieved by local and selective lysis of adherent cells using a microfluidic probe (MFP). The cell lysate retrieved from local regions can be used for downstream analysis, enabling molecular profiling studies.

Patrones sustractiva rápida de las capas de células vivas con una sonda de microfluidos

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to entry for non-specialists who would benefit greatly from the ability to develop their own microfluidic devices to address research questions. Particularly lacking has been the open dissemination of protocols related to photolithography, a key step in the development of a replica mold for the manufacture of polydimethylsiloxane (PDMS) devices. While the fabrication of single height silicon masters has been explored extensively in literature, fabrication steps for more complicated photolithography features necessary for many interesting device functionalities (such as feature rounding to make valve structures, multi-height single-mold patterning, or high aspect ratio definition) are often not explicitly outlined. 
Here, we provide a complete protocol for making multilayer microfluidic devices with valves and complex multi-height geometries, tunable for any application. These fabrication procedures are presented in the context of a microfluidic hydrogel bead synthesizer and demonstrate the production of droplets containing polyethylene glycol (PEG diacrylate) and a photoinitiator that can be polymerized into solid beads. This protocol and accompanying discussion provide a foundation of design principles and fabrication methods that enables development of a wide variety of microfluidic devices. The details included here should allow non-specialists to design and fabricate novel devices, thereby bringing a host of recently developed technologies to their most exciting applications in biological laboratories.

Multilayer microfluidic devices often involve the fabrication of master molds with complex geometries for functionality. This article presents a complete protocol for multi-step photolithography with valves and variable height features tunable to any application. As a demonstration, we fabricate a microfluidic droplet generator capable of producing hydrogel beads.

Múltiples pasos Fotolitografia variable Altura de múltiples capas con válvula dispositivos de microfluidos

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Large-area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment and Its Application to Substrate Fabrication for Cell Culture Studies

Scanning probe microscopy has enabled the creation of a variety of methods for the constructive (&#39;additive&#39;) top-down fabrication of nanometer-scale features. Historically, a major drawback of scanning probe lithography has been the intrinsically low throughput of single probe systems. This has been tackled by the use of arrays of multiple probes to enable increased nanolithography throughput. In order to implement such parallelized nanolithography, the accurate alignment of probe arrays with the substrate surface is vital, so that all probes make contact with the surface simultaneously when lithographic patterning begins. This protocol describes the utilization of polymer pen lithography to produce nanometer-scale features over centimeter-sized areas, facilitated by the use of an algorithm for the rapid, accurate, and automated alignment of probe arrays. Here, nanolithography of thiols on gold substrates demonstrates the generation of features with high uniformity. These patterns are then functionalized with fibronectin for use in the context of surface-directed cell morphology studies.

Here we present a protocol for wide-area scanning probe nanolithography enabled by the iterative alignment of probe arrays, as well as the utilization of lithographic patterns for cell-surface interaction studies.