Our sincere appreciation is expressed to the following people: Drs. Sam Johnson and Benjamin Carlson of the Duke Light Microscopy Core Facility for their assistance with data visualization software, and Ms. Valerie Lapham and Dr. John M. Mackenzie, Jr. of the Center for Electron Microscopy at North Carolina State University for their advice on electron microscopy. We thank Dr. Elaine B. Boh&#243;rquez for her editorial assistance. Authors contributed in the following manner: DVB, SM, and RAL designed experiments and analyzed data. DVB performed experiments and FH performed manual rendering of data. SM is director of Renovo Neural, where SBEM data was acquired. DVB wrote the manuscript and all authors reviewed and edited the final manuscript. This work was supported by NIH grants R01DK091946 and Veterans Affairs grant I01BX002230 to RAL, and F32DK094704, to DVB.

Todo el cuidado de los animales y los experimentos se realizaron de acuerdo con un protocolo aprobado por el Comité Institucional Animal Cuidado y Uso de la Universidad de Duke. Cocem3D se deriva de una combinación de protocolos publicados previamente 10,11 y se aplicó aquí para estudiar una célula enteroendocrina específica usando un ratón reportero PyyGFP 12. Este método se puede aplicar fácilmente a otras células de interés utilizando ratones transgénicos reportero disponibles comercialmente. El método se describe en tres secciones: microscopía confocal correlativa, bloque cara de microscopía electrónica de barrido de serie (SBEM), y datos de renderizado en 3D. Correlativa Microscopía Confocal El objetivo de esta sección es para cosechar un segmento de tejido del colon distal de dimensiones que permitan confocal correlativa e imágenes SBEM. El protocolo es el siguiente: 1. La recolección de Tejidos <ol><li> Preparar10 ml de solución / ml de heparina 50 g en PBS. </li><li> Preparar xilazina / ketamina anestésico de stock mediante la mezcla de 10 ml de ketamina (100 mg / ml) y 1 ml de xilazina (20 mg / ml). <ol><li> Diluir xilazina / ketamina agotadas 1: 4 en 0,1 M PBS. </li></ol></li><li> Preparar una 100 ml de solución de fijación que contiene 4% de paraformaldehído y 0,1% de glutaraldehído en PBS. </li><li> Anestesiar el ratón PyyGFP, de 6 a 10 semanas de edad, con una dosis letal de anestésico xilazina / ketamina. Se inyecta la anestesia por vía intraperitoneal a 0,15 ml por 20 g de peso del ratón. </li><li> Confirmar anestesia adecuada ratón apretando la cola o dedos de los pies, y el uso de la pomada en los ojos para evitar la sequedad. </li><li> Utilice un flujo de la bomba peristáltica variable para perfundir fijador intracardially 10. Con unas tijeras quirúrgicas (13 cm de longitud) corte abrir la cavidad abdominal para exponer los intestinos, el corazón y los pulmones. Mantenga corazón con pinzas de patrón estrecho curvos (longitud 12 cm) e inserte la aguja de mariposa (19 G) de la bomba peristáltica into dejó ventrículo. Inmediatamente, corte aurícula derecha con unas tijeras rectas de primavera (longitud 4 mm). Perfundir a una velocidad de 2 ml / min primero con solución de heparina durante 1 min, y luego con solución de fijación enfriado en hielo durante 15 min hasta que la cola del ratón es completamente rígida. Nota: Es muy importante para perfundir a un ritmo lento para evitar ruptura de pequeños vasos en la mucosa intestinal. Estallando de los vasos comprometerá ultraestructura del tejido. Si la perfusión es adecuada, el hígado debe palidecer en el color dentro de 3-5 min. </li><li> Usando tijeras pequeñas abren la cavidad abdominal y los impuestos especiales todo el colon desde el cruce con el ciego hasta el recto distal. Coloque el tejido en PBS enfriado con hielo. Mientras sumergida en PBS, corte abierto con pequeñas tijeras de primavera del colon a lo largo del mesenterio. </li></ol> 2. La disección y fijación de segmentos de tejido <ol><li> El uso de un bisturí, cortar cerca de 6 segmentos de tejido pequeños (2 mm 2) en el colon distal. Haga esto en una hoja oimprontas dentales f y sumergido en unas gotas de PBS. </li><li> Post-fijar los segmentos de tejido en solución fijadora durante 3 horas a 4 ° C. </li></ol> 3. Los bloques de tejido micro-disección <ol><li> Preparar 5% de baja fusión de agarosa en PBS y guárdelo en un baño de agua a 45 ° C. </li><li> Insertar los segmentos de tejido en el 5% bajo punto de fusión de agarosa utilizando un pequeño recipiente de plástico, al igual que el tamaño estándar Tissue-Tek criomolde. </li><li> Montar las secciones embebidas en un micrótomo lámina vibrante y llenar el baño tampón con helado de PBS. </li><li> Cortar 300 micras tiras de tejido en el 0,8 amplitud y 0,04 mm Velocidad / seg. Nota: En este punto, las tiras de tejido serán desalojados de la agarosa. </li><li> Vuelva a insertar 300 tiras de tejido micras de agarosa y montarlos en micrótomo perpendicularmente a la hoja de la vibratome. </li><li> El uso de un vibratome, cortar tiras de tejido con un espesor de 50 micras. Nota: Los bloques de tejido finales deben ser aproximadamente 300 micras de ancho x 50 m de espesor. Estos dIMENSIONES están optimizadas a partir de experimentos piloto que confocal mostró que el espesor de la célula enteroendocrina es entre 15-20 micras y la longitud de 30-70 nm de la neuropod. Por lo tanto, una célula entera podría estar contenida dentro de un bloque de tejido 300 micras de ancho por 50 m de espesor si la orientación de la celda es paralela a la cara del bloque de tejido. Variar estas dimensiones en función de los tejidos y células de tipo de interés. </li><li> Guarde los bloques de tejido en PBS a 4 ° C. </li></ol> 4. confocal de imágenes <ol><li> Preparar una solución de tinción nuclear DAPI diluyendo en PBS a 1: 4000. </li><li> Incubar bloques de tejido en tinción nuclear DAPI durante 5 min. Nota: DAPI facilita las células individuales que distinguen por sus núcleos, lo cual es útil para correlacionar las imágenes confocal y SBEM. </li><li> Bloques de tejido de montaje sobre portaobjetos de vidrio cargada, añadir unas gotas de PBS, y se cubren con un cubreobjetos. </li><li> Utilizando un microscopio confocal, identificar bloques con vellosidades intactas y células PyyGFP de interés y les fotografiada para obtener z-pilas secciones ópticas. <ol><li> Utilice un objetivo 20X / 0.8 Zeiss Plan de Apochromat obtener z-pilas de 1 micras secciones ópticas. </li><li> Para el z-stack, utilizar los canales de 405 nm (DAPI) para determinar la relación a otras células, 488 nm GFP endógeno para localizar la célula de interés, y el contraste de interferencia diferencial (DIC) para determinar la ubicación relativa de la celda a la lumen. </li><li> Utilice resolución de imagen de 1024 píxeles o superior. </li></ol></li></ol> 5. Bloques de integración en agarosa <ol><li> Preparar 10 ml de fijador que contiene 4% de paraformaldehído y 2,5% de glutaraldehído en PBS. </li><li> Retire los bloques de tejido de la lámina de vidrio mediante la adición de PBS cuidadosamente en los bordes de la hoja de la cubierta para deslizar el cubreobjetos lejos de la lámina de vidrio sin dañar el bloque de tejido. A continuación, utilice un pincel de arte fino para transferir el bloque de tejido de la diapositiva a una 10,5 ml tubo de microcentrífuga que contiene 4% de paraformaldehído y 2,5% fijador de glutaraldehído. </li><li> Bloques de tejido post-fix O / N a 4 ° C. </li><li> Transferir bloques de tejido de PBS. A continuación, incrustar bloques planos en el 5% bajo punto de fusión de agarosa intercalando ellos entre dos láminas de vidrio. Nota: Incorporación de los bloques en una capa delgada de agarosa facilita la manipulación posterior durante la tinción. </li><li> Cortar la agarosa en una plaza y hacer una muesca en el lado superior. Nota: Este paso es necesario para mantener la orientación en los pasos posteriores. </li><li> Cuadras de las tiendas en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con PBS a 4 ° C hasta su posterior procesamiento. </li></ol> Bloque cara de serie Microscopía Electrónica de Barrido (SBEM) En esta sección, se prepara el bloque de tejido y fotografiado con SBEM a baja magnificación. La imagen de encuesta de la cara del bloque se correlaciona entonces con los datos confocal para identificar la región que contiene la célula de interés. Una vez que la regiónse identifica, el tejido es proyectado en una resolución de 7 nm / pixel y rodajas de 70 nm. Esto fue suficiente para resolver y distinguir-denso grandes vesículas secretoras de núcleo de otros orgánulos. En las células enteroendocrinas, este tipo de vesículas varía entre 100 y 150 nm de diámetro 13. El protocolo es el siguiente: 6. Las secciones de tejido de tinción <ol><li> Retire el tejido de PBS y enjuagar tres veces, 5 minutos cada uno, en tampón cacodilato 0,1 M. </li><li> Bloques de la mancha de ácido tánico 1 h en 0,1% se disolvieron en tampón cacodilato 0,1 M para mejorar el contraste de las membranas celulares 14. </li><li> Llevar a cabo la posterior tinción y la deshidratación del tejido de acuerdo con el protocolo publicado 11. Siguiendo Deerinck et al. protocolo, preparar estas soluciones: 1) 1% (w / v) thiocarbonhydrazide (THC); 2) llevar solución aspartato; 3) acetato de uranilo al 1%, y 4) ferrocianuro tetraóxido de osmio / potasio (OsO4 / K Ferrocianuro). Mezcle 4% OsO4 y 2xK Ferrocianuro social [0,3 g K Ferrocianuro y 0,86 g de Na cacodilato en 10 ml de H2O] en proporción 1: 1 para hacer OsO4 / K Ferrocianuro. Nota: Tener el tejido embebido en agarosa facilita la manipulación durante la tinción. Retire con cuidado de agarosa para la infiltración de resina posterior. </li><li> Muestras Enjuague tres veces, 5 minutos cada uno, en tampón cacodilato 0,1 M y luego se tiñen con una solución de OsO4 / K Ferrocianuro durante 2 horas a 4 ° C. </li><li> Enjuague con agua ultra pura tres veces, 5 minutos cada uno, y la mancha con TCH durante 30 minutos a 60 ° C. </li><li> Enjuague en agua ultra pura tres veces, 5 min cada uno y las manchas con un 2% OsO4 (sin K Ferrocianuro) durante 60 minutos a temperatura ambiente. Enjuague de nuevo en agua ultra pura tres veces, 5 min cada uno. </li><li> Mancha con 1% de acetato de uranilo O / N a 4 ° C. Enjuague en agua ultra pura tres veces, 5 minutos cada uno. </li><li> Mancha con aspartato de plomo durante 30 min a 60 ° C. Enjuague en agua ultra pura tres veces, 5 minutos cada uno. </li><li> Deshidratar tejidos mediante lavado en solutions con concentraciones crecientes de etanol. Enjuague 2 veces, 5 minutos cada uno, con 50%, 75%, 85%, 95%, etanol absoluto y 100%. Al final, enjuague secciones con óxido de propileno dos veces, 10 min cada uno. </li></ol> 7. infiltrante y incrustación de tejidos Secciones en resina <ol><li> Infíltrate en los bloques de resina utilizando el kit comercialmente avaialble. Tejidos Insertar en resina utilizando un kit de empotramiento epon. Preparar una mezcla de resina de 48% Epoxy, 20% DDSA ml, 30 ml NMA%, y 2% DMP30. Agite la mezcla de resina vigorosamente durante 5 minutos y luego colocar la mezcla en vacío durante 30 minutos para permitir que las burbujas que salen a la superficie. </li><li> Mezclar la resina con óxido de propileno en proporción 1: 1 y agitar vigorosamente. Retire el enjuague final de la deshidratación de los tejidos, y añade resina mezclada con óxido de propileno. Lugar vial con muestras en un rotador O / N y dejar vial destapado. El día siguiente, añadir resina EPON recién hecho y se mezcla durante 90 min en los rotadores. </li><li> Insertar en bloques de resina lo más plana posible por intercalando enentre portaobjetos de vidrio que han sido curados con agente de liberación de líquido para evitar que se peguen entre sí 15. </li><li> Una vez que los bloques están incrustados plana, curar los bloques para una adición 48 horas a 60 ° C. </li><li> Tire de diapositivas aparte de liberar los bloques. </li></ol> 8. Montaje y Recorte de Tejidos Bloque de Imagen <ol><li> Bajo un microscopio de disección, que coincida con la orientación de los bloques de tejido embebido en resina con el de las micrografías confocales para facilitar la identificación de las regiones que contienen las células de interés antes de recortar el bloque. </li><li> Recorte el bloque de resina incrustado manualmente hasta un m bloque cara ~ 500 x 500. </li><li> Monte el bloque plano en un perno que contiene epoxi conductora y seco durante 30 min. Luego, coloque el bloque plano sobre una superficie seca y O / N a 60 ° C. </li><li> Escudo del bloque con el líquido de plata coloidal. Mantener las secciones de tejido plano para asegurar el corte en lonchas del bloque en ángulo recto para facilitar la correlating los bloques de la cara y micrografías confocales en serie. </li></ol> 9. SBEM <ol><li> Image el bloque usando un microscopio de barrido de electrones equipado con un sistema SBEM (e .g., 3Ver). </li><li> Establecer sección espesor inicial en ~ 2 micras incrementos y cortar hasta que la cara del tejido se desprende del bloque. </li><li> Adquirir una imagen Surver de toda la cara del bloque. </li><li> Uso de software de Fiji, tomar mediciones tanto del bloque de cara de serie y confocal micrografías para generar un denominador común y cuenta para la muestra deformaciones durante la fijación y tinción de 16. </li><li> Localice el área de interés en la cara del bloque multiplicando el denominador de las coordenadas en las imágenes confocal. Utilice también otras características estructurales, como la posición de las microvellosidades, células caliciformes o lámina propia, como una referencia. </li><li> Imagen de la región de interés a un 2,25 kV y 7 nm / pixel (o ampliación 15,147X) en el modo de vacío de alta. Incrementos Slice deben establecerseen 70 nm o menos. </li><li> Recopilar datos SBEM en formato .dm3 prima de 16 bits. </li></ol> 10. Optimización SBEM Imágenes en Segmentación de superficie <ol><li> Convertir imágenes SBEM de formato .dm3 prima de 8 bits .tiff. </li><li> Filtra .tiff imágenes utilizando un filtro de 0,8 desenfoque gaussiano en Fiji. </li><li> Escala hacia abajo el conjunto de datos al 25% del tamaño original y guardarlo como una pila .tiff para reducir al mínimo la cantidad de memoria RAM necesaria para manejar el juego. </li><li> Alinee la pila de imágenes SBEM utilizando el plugin Fiji &quot;alineación pila lineal con SIFT&quot; en el modo de traducción y cosechado usando el plugin &quot;3D de cultivos&quot;. Nota: El recorte ayuda a reducir aún más la cantidad de memoria RAM necesaria para la segmentación y la representación de volumen. </li></ol> Representación de datos en 3D 11. Microscopía Confocal <ol><li> Reconstruir z-pilas utilizando el modo automático de la herramienta &quot;superficies&quot; superan. Figura 1D, muestra una reconstrucción de cada canal utilizando la opción suave en el área de detalle de las superficies a 0.126 m, y de umbral como la intensidad absoluta. </li></ol> 12. Serie Bloque cara SEM Nota: la segmentación manual de datos es un proceso muy lento y en función de las características para ser prestados el procedimiento puede tardar varias semanas. La segmentación de los videos y las cifras presentadas en Bohórquez et al. 2014 8 se realiza de forma manual y tomó cerca de 500 horas de mano de obra. Se recomienda dar prioridad a las características esenciales que necesitan representación antes de comenzar el proceso de segmentación. El procedimiento es el siguiente: <ol><li> Utilice la herramienta de &quot;superficies&quot; en el modo de sorteo y la opción &quot;contorno&quot; en el modo de 50 ms dibujo segmentar manualmente y el volumen prestado la célula de interés. </li><li> Trazar contorno en cada rebanada de la célula para la representación más suave o cada 5 rebanadas de renderizado más rápido. </li><li> Exportación im definitivaedades utilizando la herramienta &quot;instantánea&quot; con una resolución de 300 dpi o más. </li></ol>

<ol>
	<li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 314, 1-340 (1986).</li><li>Smith, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cell+types,+neurosecretory+cells,+and+body+plan+of+the+early-diverging+metazoan+Trichoplax+adhaerens.">Novel cell types, neurosecretory cells, and body plan of the early-diverging metazoan Trichoplax adhaerens.</a> Current biology : CB. 24, 1565-1572 (2014).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS biology. 2, e329 (2004).</li><li>Engelstoft, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven+transmembrane+G+protein-coupled+receptor+repertoire+of+gastric+ghrelin+cells.">Seven transmembrane G protein-coupled receptor repertoire of gastric ghrelin cells.</a> Molecular metabolism. 2, 376-392 (2013).</li><li>Chandra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoglobulin-like+domain+containing+receptor+1+mediates+fat-stimulated+cholecystokinin+secretion.">Immunoglobulin-like domain containing receptor 1 mediates fat-stimulated cholecystokinin secretion.</a> The Journal of clinical investigation. 123, 3343-3352 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acids+stimulate+cholecystokinin+release+through+the+Ca2+-sensing+receptor.">Amino acids stimulate cholecystokinin release through the Ca2+-sensing receptor.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300, G528-G537 (2011).</li><li>Rogers, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+activity-triggered+glucagon-like+peptide-1+secretion+from+primary+murine+L-cells.">Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells.</a> The Journal of physiology. 589, 1081-1093 (2011).</li><li>Boh&#243;rquez, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enteroendocrine+cell-enteric+glia+connection+revealed+by+3D+electron+microscopy.">An enteroendocrine cell-enteric glia connection revealed by 3D electron microscopy.</a> PloS one. 9, e89881 (2014).</li><li>Boh&#243;rquez, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroepithelial+circuit+formed+by+innervation+of+sensory+enteroendocrine+cells.">Neuroepithelial circuit formed by innervation of sensory enteroendocrine cells.</a> The Journal of clinical investigation. , (2015).</li><li>Knott, G. W., Holtmaat, A., Trachtenberg, J. T., Svoboda, K., Welker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+preparing+GFP-labeled+neurons+previously+imaged+in+vivo+and+in+slice+preparations+for+light+and+electron+microscopic+analysis.">A protocol for preparing GFP-labeled neurons previously imaged in vivo and in slice preparations for light and electron microscopic analysis.</a> Nature protocols. 4, 1145-1156 (2009).</li><li>Deerinck, T., Bushong, E., Thor, A., Ellisman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NCMIR methods for 3D EM: a new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. , (2010).</li><li>Boh&#243;rquez, D. V., Chandra, R., Samsa, L. A., Vigna, S. R., Liddle, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+basal+pseudopod-like+processes+in+ileal+and+colonic+PYY+cells.">Characterization of basal pseudopod-like processes in ileal and colonic PYY cells.</a> Journal of molecular histology. 42, 3-13 (2011).</li><li>Nilsson, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+immunocytochemical+colocalization+of+peptide+YY+and+enteroglucagon+in+endocrine+cells+of+the+rabbit+colon.">Distribution and immunocytochemical colocalization of peptide YY and enteroglucagon in endocrine cells of the rabbit colon.</a> Endocrinology. 129, 139-148 (1991).</li><li>Mizuhira, V., Futaesaku, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+fixation+method+for+biological+membranes+using+tannic+acids.">New fixation method for biological membranes using tannic acids.</a> Acta Histochem Cytochem. 5, 233-236 (1972).</li><li>Reymond, O. L., Pickett-Heaps, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+routine+flat+embedding+method+for+electron+microscopy+of+microorganisms+allowing+selection+and+precisely+orientated+sectioning+of+single+cells+by+light+microscopy.">A routine flat embedding method for electron microscopy of microorganisms allowing selection and precisely orientated sectioning of single cells by light microscopy.</a> Journal of microscopy. 130, 79-84 (1983).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature. 9, 676-682 (2012).</li><li>Boh&#243;rquez, D., Chandra, R., Samsa, L., Vigna, S., Liddle, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+basal+pseudopod-like+processes+in+ileal+and+colonic+PYY+cells.">Characterization of basal pseudopod-like processes in ileal and colonic PYY cells.</a> J Mol Histol. 42, 3-13 (2011).</li><li>Jang, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut-expressed+gustducin+and+taste+receptors+regulate+secretion+of+glucagon-like+peptide-1.">Gut-expressed gustducin and taste receptors regulate secretion of glucagon-like peptide-1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 15069-15074 (2007).</li><li>Liou, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G-protein-coupled+receptor+GPR40+directly+mediates+long-chain+fatty+acid-induced+secretion+of+cholecystokinin.">The G-protein-coupled receptor GPR40 directly mediates long-chain fatty acid-induced secretion of cholecystokinin.</a> Gastroenterology. 140, 903-912 (2011).</li><li>Reimann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+sensing+in+L+cells:+a+primary+cell+study.">Glucose sensing in L cells: a primary cell study.</a> Cell metabolism. 8, 532-539 (2008).</li><li>Bohorquez, D. V., Liddle, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon-like+basal+processes+in+enteroendocrine+cells:+characteristics+and+potential+targets.">Axon-like basal processes in enteroendocrine cells: characteristics and potential targets.</a> Clinical and translational science. 4, 387-391 (2011).</li><li>Batterham, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+hormone+PYY(3-36)+physiologically+inhibits+food+intake.">Gut hormone PYY(3-36) physiologically inhibits food intake.</a> Nature. 418, 650-654 (2002).</li><li>Flint, A., Raben, A., Astrup, A., Holst, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucagon-like+peptide+1+promotes+satiety+and+suppresses+energy+intake+in+humans.">Glucagon-like peptide 1 promotes satiety and suppresses energy intake in humans.</a> The Journal of clinical investigation. 101, 515-520 (1998).</li><li>Hayworth, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+ATUM+ultrathin+section+libraries+with+WaferMapper:+a+multi-scale+approach+to+EM+reconstruction+of+neural+circuits.">Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits.</a> Frontiers in neural circuits. 8, 68 (2014).</li></ol>

Dr. Satish Medicetty es un empleado del 100% y recibe sueldo de Renovo Neural Inc; Sin embargo, esto no altera la adherencia del autor a las políticas JoVE en los datos y materiales de uso compartido. Sin conflicto de intereses se declara para los autores restantes.

<html> Chemosensation Gastrointestinal está surgiendo como un nuevo campo emocionante en la investigación biomédica. Esto es en gran parte debido al descubrimiento de los receptores del gusto funcionales en las células enteroendocrinas 18. Estudios posteriores han demostrado que las células enteroendocrinas expresan receptores específicos para nutrientes, incluyendo hidratos de carbono, lípidos y aminoácidos 5,6,19,20. El factor catalítico para estos descubrimientos ha sido el desarrollo de los ratones reportero, en el que las células enteroendocrinas están etiquetados con fluorescencia 20. Hemos desarrollado uno de estos ratones, el ratón PyyGFP, para estudiar las células enteroendocrinas del intestino delgado y el colon distal 17,21. Estas células son de interés debido a que secretan PYY y péptido similar al glucagón 1, ambos de los cuales son inductores de saciedad 22,23. En ese momento, una cuenta de ultra-estructural completa de estas células faltaba, lo que creíamos era esencial para comprender sus mecanismos de señalización. ontenido &quot;&gt; En este sentido, describe un visualmente un método para superar la microscopía confocal con SBEM. El método se conoce como Cocem3D, lo que nos permitió documentar la ultraestructura completa de las células enteroendocrinas. Nos han informado de que estas células tienen una neuropod que contiene tres cuartas partes de todas las vesículas secretoras 8. Dentro del neuropod, hay neurofilamentos y al igual que los axones neuronales, neuropods se nutren de las células gliales entéricas 8. Más importante, es cuando estos neuropods que enteroendocrinas células se conectan físicamente a las neuronas que inervan el intestino y 9 de colon. Uno de los puntos fuertes de cocem3D es su simplicidad. La reducción de la muestra de tejido en un bloque que puede ser imaginada por confocal y SBEM facilita la identificación de una celda específica dentro de un tejido. Vesículas secretoras y otros orgánulos se pueden identificar con facilidad a una resolución de 7 nm / pixel. Debido a que las secciones en SBEM se descartan, más procescantar de los tejidos para identificar proteínas específicas no es una opción en este momento. Sin embargo, el desarrollo de métodos tales como ATUM 24, en el que se conservan las secciones del bloque de tejido, es probable que permitir la identificación de proteínas específicas en la célula. La determinación de la ubicación específica de los receptores quimiosensoriales en células enteroendocrinas es información esencial para el desarrollo de terapias de fármacos para la obesidad, porque las células enteroendocrinas son una interfaz sensorial entre la comida en el intestino y la saciedad en el cerebro.

La vida interior de una célula tiene lugar en el tiempo y el espacio. Cambios en el tiempo se estudian a menudo utilizando microscopía de lapso de tiempo combinado con técnicas de imagen de fluorescencia, como super-resolución microscopía. Espacio, en particular la disposición de los orgánulos dentro de una célula o interacciones célula a célula, sólo puede ser derivada por una cuenta completa de la estructura fina de la célula. Una relación completa de la estructura fina de una célula también puede aportar claridad a la función genómica en los casos en que el genoma está disponible, al igual que el C. elegans nematodos 1 o la tricoplax Placozoa plana adherentes 2. Microscopía electrónica de seccionamiento de serie es ahora un reproducible, eficiente en tiempo, y menos costosos de trabajo gracias al desarrollo de tecnologías automatizadas de microscopía electrónica 3D, como bloque cara de serie microscopía electrónica de barrido 3 (SBEM). La necesidad de información estructural de la función dilucidar es muy evidente en cierta cell tipos en función depende de las interacciones físicas de célula a célula, tales como neuronas, células gliales, o células epiteliales sensoriales. Estamos particularmente interesados ​​en la aclaración de cómo las señales sensoriales de los nutrientes en el lumen del intestino se transducen en una señal eléctrica que modula en última instancia comportamientos apetitiva. El circuito es compleja, pero comienza en la pared del intestino donde los nutrientes entran en contacto con las células epiteliales sensoriales, llamadas células enteroendocrinas. A diferencia de otras células epiteliales sensoriales, tales como las células gustativas, las células enteroendocrinas están dispersos por todo el epitelio intestinal en una proporción de uno a mil 4-7. En consecuencia, han sido difíciles de identificar y estudiar, y por mucho tiempo fueron vistos sólo como una fuente de hormonas intestinales. Pero con el desarrollo de los ratones reportero de fluorescencia de células específicas, la función sensorial complejo de estas células está emergiendo. Utilizando uno de estos ratones reportero, un YY-GFP (PyyGFP) ratón péptido, se encontró que enteroendocrine células tienen una cola citoplasmática prominente que nombramos neuropod. La aparición de neuropods sugiere una función conservada en la comunicación de célula a célula. Por lo tanto, razonó que mediante la documentación de la ultraestructura de una célula enteroendocrina, la función de neuropods podría derivarse. La necesidad de comprender la estructura de un apéndice en una célula dispersa que es difícil de identificar fue la razón principal para el desarrollo de un método para combinar la microscopía confocal y SBEM. La célula de interés se identificó utilizando ratones informadora de célula específica PyyGFP enteroendocrina. El método nos permitió documentar toda la ultraestructura de una célula enteroendocrina y su neuropod. Dentro neuropods, encontramos características estructurales de los axones neuronales, y fuera neuropods, encontramos una relación física con la glía entérica 8. De hecho, neuropods contienen aproximadamente 70% de todas las vesículas secretoras que sugieren un papel esencial en la función secretora de estas células. Basándose en eldatos estructurales, más recientemente, se encontró que a través de estos neuropods, células enteroendocrinas y las neuronas que inervan el intestino formar un circuito neuroepitelial, similar a la de las células gustativas en la lengua 8,9. El descubrimiento de estas características de los mecanismos chemosensory gastrointestinales tallo de datos estructurales reunió con este método de microscopía correlativa. Creemos que este método podría ser útil en otras áreas de la biología celular, en particular cuando las células se dispersan dentro de los tejidos en una proporción muy baja. Nos referimos al método como confocal correlativa y la cara del bloque de microscopía electrónica de barrido de serie en 3D (Cocem3D). El método se compone de los siguientes pasos principales: la disección de tejidos, microscopía confocal, imagen SBEM, SBEM y correlación de imágenes confocal, y la segmentación manual. En comparación con otros métodos correlativos, el concepto es bastante simple debido a que la correlación es física en lugar de química.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>4%, freshly made in PBS, final pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental wax</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-melting agarose</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>16520-100</td>
			<td>5%, freshly made in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Tissue-Tek Cryomold</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>62534-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160; nuclear stain</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Postively charged glass slides and coverslips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine art paintbrush #1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cacodylate buffer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>11650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tannic acid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>21700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMbed 812 kit&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>14120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid releasing agent&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid silver colloidal&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>12630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CircuitWorks conductive epoxy&#160;&#160;</td>
			<td>ITW Chemtronics</td>
			<td>CW2400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variable flow peristaltic pump</td>
			<td>VWR</td>
			<td>70730-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VT1200S Vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss 780i confocal microscope</td>
			<td>Carl Zeiss&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma VP Scanning Electron Microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3view system</td>
			<td>Gatan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Renovo Neural Inc (Cleveland, OH)</td>
			<td></td>
			<td>http://www.renovoneural.com</td>
			<td>Renovo provides 3d EM services</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji software</td>
			<td>Open access software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer station with 16GB of RAM or more</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data visualization software Imaris 7.5&#160;</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

correlative confocal and 3d electron microscopy of a specific sensory cell

Delineación de la ultraestructura de una célula es importante para la comprensión de su función. Esto puede ser un proyecto de enormes proporciones para tipos de células raras difundido a través de los tejidos hechos de diversos tipos de células, tales como células enteroendocrinas del epitelio intestinal. Estos sensores gastrointestinales de alimentos y bacterias han sido difíciles de estudiar debido a que se dispersan entre otras células epiteliales en una proporción de 1: 1000. Recientemente, los ratones transgénicos reportero se han generado para identificar células enteroendocrinas por medio de fluorescencia. Uno de ellos es el péptido YY-GFP ratón. El uso de este ratón, hemos desarrollado un método para correlacionar confocal y el bloque cara microscopía electrónica de barrido de serie. Hemos llamado el método cocem3D y aplicamos para identificar una célula enteroendocrina específico en el tejido y desvelar ultraestructura de las células en 3D. La resolución de cocem3D es suficiente para identificar orgánulos tan pequeño como vesículas secretoras y para distinguir las membranas celulares para el volumen de rendering. Cocem3D se puede adaptar fácilmente para estudiar la ultraestructura 3D de otros tipos de células específicos en su tejido nativo.

El método presentado aquí se utilizó para estudiar la ultraestructura de una celda específica dentro de una capa de epitelio. La célula de interés en este caso es la célula enteroendocrina difícil de alcanzar. Su identificación in situ ha sido posible sólo en los últimos años con el desarrollo de los ratones reportero de fluorescencia de células específicas. En 2011, hemos desarrollado un ratón en el que el promotor de la hormona PYY impulsa la expresión de la proteína verde fluorescente 17. En este ratón PyyGFP, células enteroendocrinas de la parte distal del intestino delgado y el colon se distinguen fácilmente bajo la luz ultravioleta. Este modelo de ratón fue una base para identificar un bloque de tejido que contiene una célula enteroendocrina y procesarla para SBEM. El método de correlación se conoce aquí como cocem3D y fue construido en los protocolos publicados previamente 10,11. La optimización de las dimensiones del bloque de tejido es crítica para la correlación. En experimentos preliminares,se determinó que en un bloque de tejido 300 m de largo x 50 m de espesor el número de imágenes SBEM se reduce a un mínimo al tiempo que cubre todo el cuerpo de la célula de interés. La Figura 1A muestra una vista panorámica de la disección utilizando una cuchilla que vibra a microtrome obtener el bloque de tejido con las dimensiones adecuadas. Al menos 100 bloques se obtuvieron antes de la clasificación a través de ellos para recoger aquellos con células intactas de interés. Bloques seleccionados se crean imágenes por microscopía confocal y de imagen z-pilas están separadas ópticamente cada 1 m (Figura 1B y C). La figura 1D muestra una vista renderizada volumen de una célula enteroendocrina en el íleon del ratón. Su neuropod prominente extiende por debajo de las células epiteliales para ~ 60 micras. La célula de interés se encuentra mediante la correlación de los confocal z-pilas una imagen SBEM de toda la cara del bloque con. Un ejemplo se presenta aquí de un bloque en el colon distal de un PyyGFPratón. Después de obtener confocal z-pilas (Figura 2a), el bloque está incrustado en una capa delgada de agarosa de bajo punto de fusión (Figura 2B). Esto es necesario para la posterior manipulación del bloque. Es importante mantener la orientación del bloque lo más plana posible para que coincida con las rodajas ópticas con las rodajas SBEM. En la Figura 2C, una imagen representativa se muestra de toda la cara del bloque de tejido. Partes de esta cifra se publicaron anteriormente en Bohorquez et al., 2014 8. Esta se correlacionó posteriormente con la imagen confocal, tomando en cuenta las señales de tejido y dimensiones. Figura 2D muestra una superposición de la imagen SBEM confocal y de la manzana, que revela la ubicación precisa de nuestra célula de interés. Una vez que la célula ha sido identificado, SBEM de imágenes se realiza en una resolución lo suficientemente alta para identificar vesículas secretoras y otros orgánulos celulares. El conjunto de datos que presentóre fue fotografiada en 7 nm por píxel como imágenes de la cuadra se tomaron cada 70 nm. El conjunto de datos contenían 643 imágenes que abarcan 45 m de la profundidad del tejido. A pocas micras se afeitan durante la exploración inicial de toda la cara del bloque a bajo aumento. El conjunto de datos SBEM prima fue adquirida en formato .dm3 y transformado a .tiff para la manipulación posterior. La pila SBEM fue recortada utilizando el software Fiji plugin &quot;de cultivos (3D)&quot; bloque que quede únicamente la región de interés. Esto reduce la cantidad de memoria RAM necesaria para la representación de volumen. La célula fue identificado por su posición y vesículas secretoras, y segmentado usando software Imaris. La figura 3 contiene una representación en 3D de la célula enteroendocrina. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52918/52918fig1.jpg" /> Figura 1:. Microscopía confocal correlativa (A) de flujo de trabajo para diseccionar un pedazo detejido intestinal en un tejido bloque 300 x 50 m de espesor. (B) Un bloque de tejido representativo de las dimensiones correctas. Tenga en cuenta que un bloque de tejido de estas dimensiones desde el intestino delgado de ratón abarca aproximadamente 3 vellosidades o, en el caso de los dos puntos sobre 8 criptas. (C) Una de las vellosidades en el intestino delgado que contiene una célula de interés. (D) Un confocal z-pila rendido en 3D usando el software Imaris muestra una célula enteroendocrina con un neuropod prominente corriendo debajo del epitelio intestinal. Azul = DAPI mancha nuclear. Bares = 10 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52918/52918fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52918/52918fig2.jpg" /> Figura 2: Bloque cara microscopía electrónica de barrido de serie (A) Imagen confocal de un sele.Dirección Ejecutiva bloque de tejido del colon que contiene células PyyGFP enteroendocrina (verde) de interés. (B) Una vez que el bloque se forma la imagen por microscopía confocal, se incrusta entonces plana en bajo punto de fusión de agarosa utilizando portaobjetos de vidrio. La reproducción del bloque de tejido en agarosa facilita la manipulación posterior, y la muesca en la esquina izquierda de ayuda para montar el bloque dentro del SBEM en la orientación correcta. (C) SBEM imagen de la cara del bloque. (D) Correlación de datos confocal con SBEM para identificar célula de interés (flecha blanca). Imágenes en cyd de esta figura son modificados de Bohórquez et al., 2014 8. Azul = tinción nuclear DAPI. Bares = 10 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52918/52918fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52918/52918fig3.jpg" /> Figura 3:. Datos renderizado en 3D (A) Interpretación de volumen de célula enteroendocrina utilizando software Imaris. La celda contiene un neuropod lleno de vesículas secretoras. Para una descripción completa de la ultraestructura de una célula enteroendocrina, consulte Bohórquez et al., 2014 8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52918/52918fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell at JoVE.com

Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

Here, we introduce a method, cocem3D, to unveil the ultrastructure of a specific cell in its native tissue by bridging confocal and serial block-face scanning electron microscopy.

Correlativa confocal y microscopía electrónica de 3D de una célula sensorial específica

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused ...

correlative-confocal-3d-electron-microscopy-specific-sensory

Research

JoVE Journal

Biology

11.3K vistas.  Duke University Medical Center. Here, we introduce a method, cocem3D, to unveil the ultrastructure of a specific cell in its native tissue by bridging confocal and serial block-face scanning electron microscopy. 

Video: Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Basado en la fluorescencia de medición de la entrada de calcio de la tienda que funciona en las células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas de fibra muscular esquelética

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Investigación

Biología

Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

The eukaryotic cell relies on complex, highly regulated, and functionally distinct membrane bound compartments that preserve a biochemical polarity necessary for proper cellular function. Understanding how the enzymes, proteins, and cytoskeletal components govern and maintain this biochemical segregation is therefore of paramount importance. The use of fluorescently tagged molecules to localize to and/or perturb subcellular compartments has yielded a wealth of knowledge and advanced our understanding of cellular regulation. Imaging techniques such as fluorescent and confocal microscopy make ascertaining the position of a fluorescently tagged small molecule relatively straightforward, however the resolution of very small structures is limited 1.
On the other hand, electron microscopy has revealed details of subcellular morphology at very high resolution, but its static nature makes it difficult to measure highly dynamic processes with precision 2,3. Thus, the combination of light microscopy with electron microscopy of the same sample, termed Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) 4,5, affords the dual advantages of ultrafast fluorescent imaging with the high-resolution of electron microscopy 6. This powerful technique has been implemented to study many aspects of cell biology 5,7. Since its inception, this procedure has increased our ability to distinguish subcellular architectures and morphologies at high resolution. 
Here, we present a streamlined method for performing rapid microinjection followed by CLEM (Fig. 1). The microinjection CLEM procedure can be used to introduce specific quantities of small molecules and/or proteins directly into the eukaryotic cell cytoplasm and study the effects from millimeter to multi-nanometer resolution (Fig. 2). The technique is based on microinjecting cells grown on laser etched glass gridded coverslips affixed to the bottom of live cell dishes and imaging with both confocal fluorescent and electron microscopy. Localization of the cell(s) of interest is facilitated by the grid pattern, which is easily transferred, along with the cells of interest, to the Epon resin used for immobilization of samples and sectioning prior to electron microscopy analysis (Fig. 3). Overlay of fluorescent and EM images allows the user to determine the subcellular localization as well as any morphological and/or ultrastructural changes induced by the microinjected molecule of interest (Fig. 4). This technique is amenable to time points ranging from &le;5 s up to several hours, depending on the nature of the microinjected sample.

Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

The CLEM technique has been adapted to analyze ultrastructural morphology of membranes, organelles, and subcellular structures affected by microinjected molecules. This method combines the powerful techniques of micromanipulation/microinjection, confocal fluorescent microscopy, and electron microscopy to allow millimeter to multi-nanometer resolution. This technique is amenable to a wide variety of applications.

Luz correlativa y Microscopía Electrónica (CLEM) como una herramienta para visualizar moléculas microinyección y sus objetivos eucariotas subcelulares


The eukaryotic cell relies on complex, highly regulated, and functionally distinct membrane bound compartments that preserve a biochemical polarity ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical clarity and amenability to genetic manipulation, the zebrafish embryo has become a popular model organism with which to perform time-lapse analysis of morphogenesis in living embryos. Confocal imaging of a live zebrafish embryo requires that a tissue of interest is persistently labeled with a fluorescent marker, such as a transgene or injected dye. The process demands that the embryo is anesthetized and held in place in such a way that healthy development proceeds normally. Parameters for imaging must be set to account for three-dimensional growth and to balance the demands of resolving individual cells while getting quick snapshots of development. Our results demonstrate the ability to perform long-term in vivo imaging of fluorescence-labeled zebrafish embryos and to detect varied tissue behaviors in the cranial neural crest that cause craniofacial abnormalities. Developmental delays caused by anesthesia and mounting are minimal, and embryos are unharmed by the process. Time-lapse imaged embryos can be returned to liquid medium and subsequently imaged or fixed at later points in development. With an increasing abundance of transgenic zebrafish lines and well-characterized fate mapping and transplantation techniques, imaging any desired tissue is possible. As such, time-lapse in vivo imaging combines powerfully with zebrafish genetic methods, including analyses of mutant and microinjected embryos.

Time-lapse confocal imaging is a powerful technique useful for characterizing embryonic development. Here, we describe the methodology and characterize craniofacial morphogenesis in wild-type, as well as pdgfra, smad5, and smo mutant embryos.

Analizando Craneofacial en la morfogénesis de pez cebra Utilizando 4D Microscopía Confocal

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The synchronization of cell populations at specific stages of the cell cycle has been found to be very useful in such experimental endeavors. Synchronization of cells by treatment with chemicals that are relatively less toxic can be advantageous over the use of pharmacological inhibitory drugs for the study of consequent cell cycle events and to obtain specific enrichment of selected mitotic stages. Here, we describe the protocol for synchronizing human cells at different stages of the cell cycle, including both in S phase and M phase with a double thymidine block and release procedure for studying the functionality of mitotic proteins in chromosome alignment and segregation. This protocol has been extremely useful for studying the mitotic roles of multifunctional proteins which possess established interphase functions. In our case, the mitotic role of Cdt1, a protein critical for replication origin licensing in G1 phase, can be studied effectively only when G2/M-specific Cdt1 can be depleted. We describe the detailed protocol for depletion of G2/M-specific Cdt1 using double thymidine synchronization. We also explain the protocol of cell fixation, and live cell imaging using high resolution confocal microscopy after thymidine release. The method is also useful for analyzing the function of mitotic proteins under both physiological and perturbed conditions such as for Hec1, a component of the Ndc80 complex, as it enables one to obtain large sample sizes of mitotic cells for fixed and live cell analysis as we show here.&#160;&#160;

We present a protocol for double thymidine synchronization of HeLa cells followed by analysis using high resolution confocal microscopy. This method is key to obtaining large number of cells that proceed synchronously from S phase to mitosis, enabling studies on mitotic roles of multifunctional proteins which also possess interphase functions.

Combina la sincronización celular mitótica y microscopia Confocal de alta resolución para estudiar el papel de las proteínas multifuncional ciclo celular durante la Mitosis

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Preparación de muestras biológicas por congelación de alta presión, realce del contraste asistida por microondas y mínima inclusión de proyección de imagen de volumen

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.

Preparación de la rejilla microscópica crio-electrónica para estudios resueltos en el tiempo utilizando un nuevo sistema robótico, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo-Electron Tomography

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has become the method of choice for investigating cellular ultrastructure and molecular complexes in their native, frozen-hydrated state. However, cryo-ET requires that samples are thin enough to not scatter or block the incident electron beam. For thick cellular samples, this can be achieved by cryo-focused ion beam (FIB) milling. This protocol describes how to target specific cellular sites during FIB milling using a 3D-correlative approach, which combines three-dimensional fluorescence microscopy data with information from the FIB-scanning electron microscope. Using this technique, rare cellular events and structures can be targeted with high accuracy and visualized at molecular resolution using cryo-transmission electron microscopy (cryo-TEM).

Here, we present a pipeline for 3D-correlative focused ion beam milling on guiding the preparation of cellular samples for cryo-electron tomography. The 3D position of fluorescently tagged proteins of interest is first determined by cryo-fluorescence microscopy, and then targeted for milling. The protocol is suitable for mammalian, yeast, and bacterial cells.

Preparación de muestras mediante fresado por haz de iones focalizado correlativo en 3D para tomografía crioelectrónica de alta resolución

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has become the method of choice for investigating cellular ultrastructure and molecular complexes in their native, ...

Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal details that are important for understanding the autophagic process. However, EM methods often lack molecular information, obstructing the correlation of ultrastructural information obtained by EM to fluorescence microscopy-based localization of specific autophagy proteins. Furthermore, the rarity of autophagosomes in unaltered cellular conditions hampers investigation by EM, which requires high magnification, and hence provides a limited field of view.
In answer to both challenges, an on-section correlative light-electron microscopy (CLEM) method based on fluorescent labeling was applied to correlate a common autophagosomal marker, LC3, to EM ultrastructure. The method was used to rapidly screen cells in fluorescence microscopy for LC3 labeling in combination with other relevant markers. Subsequently, the underlying ultrastructural features of selected LC3-labeled spots were identified by CLEM. The method was applied to starved cells without adding inhibitors of lysosomal acidification.
In these conditions, LC3 was found predominantly on autophagosomes and rarely in autolysosomes, in which LC3 is rapidly degraded. These data show both the feasibility and sensitivity of this approach, demonstrating that CLEM can be used to provide ultrastructural insights on LC3-mediated autophagy in native conditions-without drug treatments or genetic alterations. Overall, this method presents a valuable tool for ultrastructural localization studies of autophagy proteins and other scarce antigens by bridging light microscopy to EM data.

Here, we present a protocol for optimized on-section correlative light-electron microscopy based on endogenous, fluorescent labeling as a tool to investigate the localization of rare proteins in relation to cellular ultrastructure. The power of this approach is demonstrated by ultrastructural localization of endogenous LC3 in starved cells without Bafilomycin treatment.

Localización ultraestructural de LC3 endógena mediante microscopía óptica correlativa en sección

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal ...

Obtención de imágenes de peróxido mitocondrial en células de levadura vivas mediante mtHyper7

Imaging of mtHyPer7, a Ratiometric Biosensor for Mitochondrial Peroxide, in Living Yeast Cells

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, cancer, and normal aging. Here, an approach is described to assess mitochondrial function in living yeast cells at cellular and subcellular resolutions using a genetically encoded, minimally invasive, ratiometric biosensor. The biosensor, mitochondria-targeted HyPer7 (mtHyPer7), detects hydrogen peroxide (H2O2) in mitochondria. It consists of a mitochondrial signal sequence fused to a circularly permuted fluorescent protein and the H2O2-responsive domain of a bacterial OxyR protein. The biosensor is generated and integrated into the yeast genome using a CRISPR-Cas9 marker-free system, for&#160;more consistent expression compared to plasmid-borne constructs.
mtHyPer7 is quantitatively targeted to mitochondria, has no detectable effect on yeast growth rate or mitochondrial morphology, and provides a quantitative readout for mitochondrial H2O2 under normal growth conditions and upon exposure to oxidative stress. This protocol explains how to optimize imaging conditions using a spinning-disk confocal microscope system and perform quantitative analysis using freely available software. These tools make it possible to collect rich spatiotemporal information on mitochondria both within cells and among cells in a population. Moreover, the workflow described here can be used to validate other biosensors.

Autor destacado: Avance de la investigación mitocondrial - Biosensor mtHyper7 para análisis subcelular 

Hydrogen peroxide (H2O2) is both a source of oxidative damage and a signaling molecule. This protocol describes how to measure mitochondrial H2O2 using mitochondria-targeted HyPer7 (mtHyPer7), a genetically encoded ratiometric biosensor, in living yeast. It details how to optimize imaging conditions and perform quantitative cellular and subcellular analysis using freely available software.

Obtención de imágenes de mtHyPer7, un biosensor radiométrico para el peróxido mitocondrial, en células vivas de levadura

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, ...