The authors acknowledge Liyi Xu for providing MDA reagents and protocols. We also thank David Feldman and Navpreet Ranu for discussions relating to this work. This work was supported in part by a Burroughs Wellcome Career Award at the Scientific Interface to PCB.

Nota: fabricar el dispositivo de microfluidos no es necesario para este ensayo, en forma de gotas para este protocolo se pueden formar con los responsables de gotitas comerciales existentes 23,29. 1. Hacer que el dispositivo de microfluidos Gotita de formación <ol><li> Preparar molde maestro para los canales con el protocolo Fabrication Maestro SU-8 esbozó previamente 31, pero con un patrón de máscara generador de gotas 32. </li><li> Fabricar dispositivos en PDMS utilizando las técnicas de litografía blanda 32,33. </li></ol> 2. Prepare la mezcla de reacción para granel Gotita Lectura Nota: El protocolo se puede utilizar para cuantificar ácidos nucleicos utilizando muchos tipos de reacciones de amplificación. Como ejemplo, se dan los reactivos necesarios para MDA de varias concentraciones de ADN Lambda. Detalles de reactivos se enumeran en la Tabla de reactivos específicos. La distribución de plantilla dentro de las gotitas depende de suficient de mezcla de la muestra. <ol><li> Obtener o ADN polimerasa Phi29 Purify. <ol><li> Purificar Phi29 lo descrito previamente 7, o la compra de un proveedor. El Phi29 utilizado para los experimentos mostrados se purificó. </li></ol></li><li> Preparar 10 ml de desnaturalización tampón consistente en 65 mM de KOH, EDTA 1,65 mM, y DTT 14 mM. </li><li> Preparar 10 ml de tampón de neutralización que consisten en HCl 65 mM, 0,21 M Tris-Cl pH 7,0, y 9 Tris-Cl mM, pH 8,0. </li><li> Preparar dos estándares, uno no tiene control plantilla (NTC), como el agua libre de nucleasa, y una alta concentración de la plantilla (en torno a 4 pg de ADN Lambda / l). Desnaturalizar 3.3 l de cada estándar con 3,3 l de desnaturalización de búfer en un tubo de qPCR. Incubar a temperatura ambiente durante 3 min. Saciar cada uno con 3,3 l de tampón de neutralización. </li><li> Desnaturalizar 3.3 l de la plantilla de interés con 3,3 l de desnaturalización de búfer en un tubo de qPCR. Incubar a temperatura ambiente durante 3 min. Saciar con 3,3 lde tampón de neutralización. </li><li> Preparar 11 l de mezcla maestra por muestra en hielo. La mezcla maestra de reacción 2x ​​MDA consiste en ADN de doble cadena 2x (dsDNA) tinte vinculante, tinte referencia 2x qPCR, 50 M oligo aleatorizado, 2 mg / ml de BSA, ADN Phi29 2x Polimerasa tampón de reacción, 4,8 mM dNTPs, agua libre de nucleasa y 40 mg / ml de ADN polimerasa Phi29. Añadir ADN polimerasa Phi29 última para garantizar la polimerasa no encontrarse con niveles de pH mucho más alto o más bajo que 7.5.Mix bien. </li><li> Opcional: Para un menor número de falsos positivos, exponer mezcla maestra con luz UV antes de formar gotitas 34. <ol><li> Preparar 10 l de pre-mezcla por muestra en un tubo transparente de 0,5 ml o 1,5 ml en hielo. La premezcla se compone de 55 M oligo aleatorizado, 2,2 mg / ml de BSA, ADN polimerasa Phi29 1.1x tampón de reacción, 5,3 mM dNTPs, y el agua libre de nucleasa. </li><li> Se coloca el tubo en el agua en hielo como se describe 34 y exponer a la luz UV (254 nm) a un accuacu- dosis de 5,7 J / cm 2. </li><li> Añadir colorante dsDNA vinculante a 1x, tinte referencia a 1X, y Phi29 a 40 mg / ml en la pre-mezcla. Mezclar bien. </li></ol></li><li> Combine 10 l de plantilla desnaturalizado o estándar y 10 l de mezcla maestra. Mezclar bien. </li></ol> 3. Gotita Formación Nota: Las gotitas pueden ser muy sensibles a la electricidad estática y el esfuerzo cortante. Quitar las ropas que pueden causar electricidad estática, y la tierra antes de la formación de gotas. Manejar tubos de emulsión desde la parte superior del tubo, en la medida de la emulsión como sea posible. Emulsiones pipeta muy lentamente, de preferencia con una gran punta de la pipeta ánima. Cuando la dispensación de una punta de pipeta, ver la emulsión en el lado de la punta para determinar la velocidad de pipeteado. <ol><li> Gotas de formulario. Para los experimentos mostrados, el dispositivo de microfluidos tiene una entrada de aceite y dos entradas acuosas con un cruce de enfoque de flujo para la generación de gotitas. Utilice dos syriESN bombas para controlar las velocidades de flujo de 55 l de aceite con tensioactivo y un 20 l de mezcla de reacción a través del chip de microfluidos para generar 20.000 1 gotitas nl. </li><li> Nota: Es posible producir gotitas con muchos tipos de aceite con tensioactivo, pero la composición afectará en gran medida la estabilidad de gota a altas temperaturas y el tiempo. Una combinación posible es HFE aceite fluorado 7500 con un tensioactivo aniónico 19,35. </li><li> Producir gotitas en cualquier tamaño, con cualquier método de 13,36, pero la variabilidad del tamaño de la población de gotitas afectará la fluorescencia a granel, y por lo tanto la exactitud del ensayo. Para los experimentos mostrados, las gotitas eran monodispersas con un volumen de 1 nl. </li><li> Recoge todas las gotas y el aceite en tubos de PCR. Para cada muestra, alícuota de 30 l de aceite en tubos de PCR frescas con tapones ópticos y transferir 20 l de gotas en la parte superior del aceite. Los volúmenes consistentes garantizan el ensayo es como accomisariar posible. </li><li> Cerrar tubo de tapas con fuerza, como tapas flojas permitirán que el aceite se evapore. </li></ol> 4. La amplificación isotérmica <ol><li> El uso de un termociclador de PCR, qPCR termociclador o placa caliente, incubar las muestras a 30 ° C durante 7 horas, e inactivar durante 1 min a 75 ° C. Los tubos de las gotitas se pueden dejar en una nevera revestido con una lámina por un par de horas en este punto. </li></ol> 5. Adquisición de Datos y Análisis <ol><li> Inmediatamente después de la inactivación de reacción, medir los niveles de fluorescencia de colorante para todas las muestras utilizando el termociclador qPCR. Configuración del filtro óptima dependerá de excitación del colorante y espectros de emisión. Para este ejemplo, utilice el filtro de 516 nm-492 nm fijado para el tinte dsDNA vinculante, y el filtro 585 nm nm-610 fijado para el tinte de referencia. Otras técnicas de medición fluorescentes se pueden utilizar para cuantificar la fluorescencia. </li><li> Para cada muestra, dividir la intensidad de fluorescencia del colorante dsDNA vinculante porla intensidad de fluorescencia del colorante de referencia. Restar la fluorescencia de fondo, o la fluorescencia normalizada del control sin plantilla, de todas las muestras. </li><li> Crear una curva patrón lineal utilizando las medidas de fluorescencia corregidos de las normas. La norma NTC representa la fluorescencia para una muestra con 0% gotitas fluorescentes (&quot;todos negativos&quot;), y la medición de fluorescencia alta concentración de plantilla es la fluorescencia esperado para una muestra con 100% gotitas fluorescentes (&quot;todo es positivo&quot;). Utilizando la curva estándar correspondiente, predecir las proporciones intermedias de gotitas positivos y negativos sobre la base de su fluorescencia a granel. </li></ol> 6. producir gotas de Medidas de prueba de Principio <ol><li> Hacer fluorescentes gotitas (positivos): Preparar una mezcla de reacción PCR que consta de 0,1 ng de ADN Lambda, tinte 1x dsDNA vinculante, tinte de referencia 1x, 1,5 unidades de Taq ADN polimerasa, 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP, y 0,5 mM cebadores. Termociclo la mezcla de 30 veces (95 ° C durante 20 seg, 55 ° C durante 20 seg, 72 ° C durante 1 min), a continuación, formar gotitas como se describe anteriormente. </li><li> Hacer no fluorescentes gotitas (negativos): Preparar una mezcla de reacción de PCR que consiste en colorante 1x dsDNA vinculante, tinte de referencia 1x, 1,5 unidades de Taq ADN polimerasa, 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1,5 mM de MgCl 2, mM dNTP 0,2, y 0,5 mM cebadores. Termociclo las mezcla de 30 veces (95 ° C durante 20 s, 55 ° C durante 20 s, 72 ° C durante 1 min), entonces se forman gotitas. </li><li> La formación de relaciones de gotas premezclados <ol><li> Distribuir 20 l de aceite fluorado en tubos qPCR, cubrir con una tapa óptica para evitar la evaporación. </li><li> Pipetear suavemente 10 l de gotitas bien mezclados en proporciones de positivos deseados: negativos en la parte superior del aceite. En los resultados mostrados, positivos: relaciones de gotitas negativos fueron 1 (todas positivas), 0,8, 0,5, 0,2, 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001 y 0 (todo el negativa). </li></ol></li><li> Medir los niveles de colorante de fluorescencia para todas las muestras utilizando el termociclador qPCR. Para este protocolo, utilice el filtro de 516 nm-492 nm fijado para el tinte dsDNA vinculante, y el filtro 585 nm nm-610 fijado para el tinte de referencia. <ol><li> Normalizar dsDNA vinculante tinte de fluorescencia utilizando colorante de referencia de fluorescencia. Normalizar aún más por la fluorescencia de la &quot;todos positivos&quot; de la muestra. </li></ol></li><li> Crear una curva patrón lineal utilizando las medidas de fluorescencia normalizados de los &quot;todos positivos&quot; y &quot;negativos&quot; todas las muestras. Utilizando la curva estándar correspondiente, predecir las proporciones intermedias de gotitas positivos y negativos sobre la base de su fluorescencia a granel. </li><li> Repite el experimento para cada relación (n = 3) con la formación de gotas independiente y de mezcla para cada réplica. </li></ol> Experimento 7. La prueba de principio MDA <ol><li> Medir la concentración de solución madre de ADN Lambda con una especificaciónfotómetro. <ol><li> Calcular la concentración de plantilla necesario medias moléculas 10 de la plantilla por las gotitas. Para este protocolo, asumen volúmenes de gota son 1 nl y 1 ng de ADN Lambda contiene aproximadamente 1,9 x 10 7 copias. Por lo tanto, 10 plantillas por gotita será de 10 copias por nl o 526 fg de ADN Lambda por l. La plantilla se diluyó ~ 6x cuando se forman las gotitas, por lo tanto, la concentración inicial más alta plantilla será 3,2 pg / l. </li></ol></li><li> En serie diluir el ADN Lambda de 3.2 pg / l con desnaturalización Buffer e igual volumen de tampón de neutralización. Para un factor de dilución de 0,1, combinar muestra de 10 l con 45 l de tampón de desnaturalización e incubar a temperatura ambiente durante 3 min. Añadir 45 lL de tampón de neutralización para saciar. </li><li> Además diluir la muestra como se describe en el paso 7.2 para hacer que el resto de las muestras para el experimento. Las concentraciones iniciales de plantilla en las reacciones que se muestran fueron 3,2 pg, 320 fg,160 fg, 32 fg, 16 fg, 3,2 fg, y 1,6 fg por microlitro. Nota: Las concentraciones plantilla finales después de la adición de mezcla maestra eran 526 fg, 52,6 fg, 26,3 fg, 5,26 fg, 2,63 fg, 526 ag y 263 ag por microlitro. 10, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, y 0,005 esperados copias Lambda por gotita, respectivamente. </li><li> Generar y analizar las gotitas de cada muestra como se describe en los pasos 2.5-5.3. </li><li> Adquirir las imágenes de fluorescencia se muestra (Figura 2,3) utilizando una cámara digital montado en un microscopio de epi-fluorescencia con un objetivo 10x a TA. Adquirir doce campos de visión para cada muestra. Imágenes de fluorescencia Corregir una imagen de fondo obtenido con un tobogán fluorescente por. </li><li> Utilice una cámara contenida para imágenes 37 como el aceite de la emulsión se evaporará rápidamente. </li><li> Analizar intensidades de gotas individuales utilizando una macro ImageJ (archivo de código suplementario). <ol><li> Elija una intensidad de fluorescencia umbral que mejor separa gotitas no fluorescentes en el NImágenes de TC de las gotas fluorescentes en las imágenes de alta concentración de la plantilla. Para cada muestra desconocida, calcular la fracción de gotitas con una intensidad de fluorescencia por encima del umbral. </li></ol></li></ol> 8. reacciones de PCR a granel y MDA <ol><li> Preparar reacción de PCR. <ol><li> Diluir en serie de ADN plantilla con un factor de dilución de 0,1. Para cada dilución, se combinan 10 l de plantilla con 45 l de desnaturalización Buffer e incubar a temperatura ambiente durante 3 min. Combine la dilución con 45 l de tampón de neutralización. </li><li> Preparar 20 l de mezcla maestra de PCR por muestra. La mezcla maestra de reacción 1.1x PCR consta de 60 unidades / l de ADN polimerasa Taq, 11 mM Tris-HCl, KCl 55 mm, 1,65 mM MgCl2, 0,22 mM dNTP, tinte, tinte referencia 1,1x y 1,1x 550 nM dsDNA vinculante cada cebador. </li><li> Combinar 2 l de plantilla diluida y 20 l de mezcla maestra. Nota: Las concentraciones plantilla finales en tél PCR reacciones mostradas fueron 50 pg, 5 pg, 500 fg, 50 fg, 5 fg, 500 ag, y 0 g de ADN Lambda por microlitro, y se realizaron por triplicado. </li><li> Termociclo reacción PCR en la máquina qPCR con el siguiente programa. Ejecutar 40 ciclos de 95 ° C durante 30 seg, 57 ° C durante 20 seg, 72 ° C durante 30 seg antes de 2 min a 72 ° C durante 2 min y mantenimiento a 4 ° C. </li><li> Normalizar dsDNA vinculante tinte de fluorescencia utilizando referencia colorante fluorescente antes de su posterior análisis. </li></ol></li><li> Preparar reacción MDA. <ol><li> Diluir las muestras como se describe en el paso 8.1.1. </li><li> Preparar 11 l de mezcla maestra por muestra en hielo. La mezcla maestra de reacción 2x ​​MDA consiste tinte 2x dsDNA vinculante, tinte referencia 2x, 50 M oligo aleatorizado, 2 mg / ml de BSA, ADN phi29 2x Polimerasa tampón de reacción, 4,8 mM dNTPs, agua libre de nucleasa, y 40 mg / ml ADN polimerasa Phi29. </li><li> Añadir la ADN polimerasa Phi29 a 40 g / ml durar para asegurar la polimerasa does no encontrarse con niveles de pH mucho mayor o menor que 7,5. Mezclar bien. </li><li> Desnaturalizar 3,3 l de plantilla se diluye con 3,3 l de desnaturalización de búfer en un tubo de qPCR. Incubar a temperatura ambiente durante 3 min. Añadir 3,3 l de tampón de neutralización. </li><li> Combine 10 l de plantilla desnaturalizado y 10 l de mezcla maestra. Mezclar bien. </li><li> Ejecutar reacción MDA en máquina qPCR con el siguiente programa. </li><li> Mantenga a 30 ° C durante 4 horas, medir la fluorescencia cada 7,5 minutos. </li><li> Inactivar a 75 ° C durante 1 min. </li><li> Normalizar dsDNA vinculante tinte de fluorescencia utilizando colorante de referencia de fluorescencia. Normalizar aún más por la fluorescencia máxima para cada muestra. </li></ol></li></ol>

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<li>Fainman, Y. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFainman%2C+Y+%22Optofluidics+%3A+fundamentals%2C+devices%2C+and+applications%22">Optofluidics : fundamentals, devices, and applications</a>. , McGraw-Hill. (2010).</li>
<li>Xia, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G.M.+Softlithographie%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem%22%5BJournal%5D)">G.M. Softlithographie.</a> Angew Chem. 110 (5), 26(1998).</li>
<li>Woyke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decontamination+of+MDA+reagents+for+single+cell+whole+genome+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Decontamination of MDA reagents for single cell whole genome amplification.</a> PLoS One. 6 (10), e26161(2011).</li>
<li>System for hot-start amplification via a multiple emulsion. US patent. , (2014).</li>
<li>Utada, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monodisperse+double+emulsions+generated+from+a+microcapillary+device%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Monodisperse double emulsions generated from a microcapillary device.</a> Science. 308 (5721), 537-541 (2005).</li>
<li>Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picoinjection+enables+digital+detection+of+RNA+with+droplet+rt-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Picoinjection enables digital detection of RNA with droplet rt-PCR.</a> PLoS One. 8 (4), e62961(2013).</li>
<li>Dube, S., Qin, J., Ramakrishnan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mathematical+analysis+of+copy+number+variation+in+a+DNA+sample+using+digital+PCR+on+a+nanofluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mathematical analysis of copy number variation in a DNA sample using digital PCR on a nanofluidic device.</a> PLoS One. 3 (8), e2876(2008).</li>
<li>Shen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+quantification+of+nucleic+acids+with+large+dynamic+range+using+multivolume+digital+RT-PCR+on+a+rotational+SlipChip+tested+with+HIV+and+hepatitis+C+viral+load%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Multiplexed quantification of nucleic acids with large dynamic range using multivolume digital RT-PCR on a rotational SlipChip tested with HIV and hepatitis C viral load.</a> J Am. Chem. Soc. 133 (44), 17705-17712 (2011).</li>
<li>Link, D. R., Anna, S. L., Weitz, D. A., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometrically+mediated+breakup+of+drops+in+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Geometrically mediated breakup of drops in microfluidic devices.</a> Phys. Rev. Lett. 92 (5), 054503(2004).</li>
<li>Nisisako, T., Torii, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+large-scale+integration+on+a+chip+for+mass+production+of+monodisperse+droplets+and+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic large-scale integration on a chip for mass production of monodisperse droplets and particles.</a> Lab Chip. 8 (2), 287-293 (2008).</li>
<li>Romanowsky, M. B., Abate, A. R., Rotem, A., Holtze, C., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+production+of+single+core+double+emulsions+in+a+parallelized+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">High throughput production of single core double emulsions in a parallelized microfluidic device.</a> Lab Chip. 12 (4), 802-807 (2012).</li>
</ol>

The Broad Institute may move to file a patent application that includes aspects of this work.

Ensayos digitales son poderosos métodos que permiten la detección de células raras y contando de individual de moléculas de ácido nucleico. Sin embargo, los ensayos digitales aún no se aplican de forma rutinaria en los laboratorios de análisis, debido en parte al coste de equipo especializado asociados con los métodos disponibles comercialmente. Aquí se describe un ensayo digital de punto final para la cuantificación de ácidos nucleicos con una lectura analógica simplificada usando una cuantitativa en tiempo...

Ensayos digitales para la cuantificación de ácidos nucleicos (PCR digital) 1.4 y la base de la orden (secuencia) están impactando fuertemente las ciencias de la vida y la medicina. Digitales proporcionan ensayos de cuantificación de los recuentos moleculares en una escala absoluta (no respecto a un control), proporcionando una alta sensibilidad, lo que permite comparaciones fáciles a través de experimentos, y crucial, lo que permite la construcción de grandes bases de datos que contienen datos comparables 5 (Tabla 1). En los últimos 15 años, la amplificación del genoma (WGA) surgió junto PCR como una herramienta general para la amplificación de ácidos nucleicos. Al igual que la PCR, WGA es útil para aplicaciones analíticas y preparativas por amplificación de elementos de la muestra minuto hasta un nivel que puede ser fácilmente detectado o utilizado para los análisis posteriores, como la secuenciación de base. A diferencia de PCR, WGA no es específico de un locus particular de ADN, en lugar permitiendo la amplificación de todas las secuencias en la muestra, incluyendo secuencias desconocidas.Esta diferencia fundamental entre la PCR y WGA hace que los métodos complementarios entre sí y da lugar a diferentes desafíos en su aplicación. El alto rendimiento de las reacciones de WGA 6 permite la amplificación rutinaria de ADN genómico a partir de moléculas individuales 7, células individuales 8 y otras muestras de baja biomasa 9 para la cuantificación o análisis adicional. Los principales desafíos relacionados con la química WGA son su extrema sensibilidad a los contaminantes y la amplificación desigual entre moléculas plantilla individuales 6. Sin embargo, WGA está ganando popularidad como la secuenciación de una sola célula se ha convertido en la &quot;aplicación asesina&quot; de la tecnología WGA 10, y la plantilla de la cuantificación de Ventajas de Windows Original es importante en muchos campos de aplicación 7. Instrumentación para la cuantificación de ácido nucleico digital ha sido descrita previamente en una variedad de válvula y sin válvula forma de microfluidosts 11-14, incluyendo ensayos basados ​​en gotitas 15,16 (Tabla 2). Sin embargo, los sistemas de microfluidos comerciales para análisis digital requieren equipo especializado para la configuración de la reacción y la detección del producto 17. Microfluidos con válvula de encargo son flexibles, pero requieren de microfabricación de precisión y sistemas de control neumático 18. Si bien es relativamente sencillo de hacer monodispersas micro-gotas para los ensayos digitales basados ​​en emulsión 19,20, lectura digital es técnicamente onerosa, que requiere de formación de imágenes de campo amplio a gran escala (similar a las tecnologías de secuenciación populares de próxima generación) o 21,22 de alta velocidad de flujo basados ​​en la detección de gotas 23-25. Idealmente, un ensayo digitales sería simple a partir de la configuración de lectura de salida, reduciendo la necesidad de instrumentación compleja y permitiendo que un gran número de muestras para ser leído rápidamente. Aquí se describe un método simplificado para la lectura de los ensayos de gotitas digital que utiliza un tiempo real PCR convencional iNSTRUMENTO para medir la fluorescencia mayor parte de los ensayos digitales basados ​​en gotas. Mientras que el nuevo enfoque puede aplicarse a los ensayos de PCR digitales, es particularmente ventajoso para los ensayos de WGA digitales para el cual analógica ensayos de amplificación en tiempo real (que dan excelentes resultados para la PCR) son problemáticos. Ventajas de Windows Original se aplica comúnmente a las muestras con las moléculas de plantilla que son heterogéneos en secuencia, longitud y contenido de la base. Estas diferentes moléculas de molde se amplifican a diferentes velocidades 6, lo que exige el uso de una referencia (&quot;estándar&quot;) muestra con características coincidentes. A menudo, no hay tal estándar está disponible, o las características de las muestras entrantes son desconocidos. La heterogeneidad del material de entrada y la propiedad dependiente de la longitud de químicas de WGA 26 también complicar la interpretación de los resultados mediante la creación de ambigüedad en lo que se está cuantificado - la masa de entrada, el número de moléculas de entrada, una combinación de los dos, o ninguno. Finalmente, la secuencia de no especificidad de amplificación del desplazamiento hace que múltiple cuantitativa (MDA) más sensibles a la contaminación que la PCR cuantitativa ya que las moléculas contaminantes de cualquier secuencia tienen un potencial de interferir. Ensayos digitales microfluidos abordar la contaminación por segregar moléculas plantilla y la reducción de los volúmenes de reacción tales que menos contaminantes se muestrean. Aquí se utiliza un método WGA isotérmica popular, MDA 27. Es de destacar que varias otras químicas WGA incluyendo PicoPlex y MALBAC 28 dependen crucialmente de pasos iniciales de desplazamiento de hebra isotérmica. Pasos isotérmicos exacerban el reto de aplicar ensayos en tiempo real analógicos para WGA cuantitativo. WGA no puede ser ni impidió completamente durante la instalación, lo que lleva a no deseado de pre-amplificación variables, ni discretiza (&quot;ciclado&quot;) de una manera donde la replicación de moléculas heterogéneas puede ser conducido a la terminación y se detuvo antes de la siguiente ciclo de PCR como 11 </sup&gt; (Figura 1). Un formato de ensayo digital para WGA acoge procedimientos de configuración reacción típica debido a la segregación de cada molécula para la enumeración en el punto final de ensayo (de modo pre-amplificación no afecta a los resultados) de lectura original significa exactitud sería en gran medida independiente de la variación en la eficiencia de amplificación. El ensayo depende de las gotitas producidas en aceite con volúmenes uniformes, ya que el nivel de la señal por la gotita en el punto final del ensayo dependerá del volumen de gota, y no queremos que la consistencia de los resultados que dependen de un promedio a través de una distribución de tamaños de gota. Hacer gotitas monodispersas es ahora un procedimiento estándar (alrededor de 3.500 documentos de gotitas monodispersas se han publicado desde 2013), sino que requiere la instrumentación de microfluidos 25. De hecho, más de seis empresas han desarrollado productos comerciales independientes que dependen de la producción de este tipo de gotas, y los chips de microfluidos gotitas de decisiones sondisponible comercialmente 23,29. Para este estudio, se utilizaron dispositivos de microfluidos encargo de fabricación propia (véase el Protocolo). Las bombas de jeringa para conducir el flujo a través de los dispositivos también están disponibles comercialmente, pero, alternativamente, puede estar sustituido con un solo jeringa desechable para el flujo impulsado por vacío para reducir los costos 30.

<table><tbody><tr><td>Evagreen Dye</td><td>Biotium</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>New England Biotechnologies</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>Phi29 DNA Polymerase Reaction Buffer</td><td>New England Biotechnologies</td><td>B0269S</td><td>Vortex periodically until aggregate dissolves</td></tr><tr><td>Lambda DNA</td><td>New England Biotechnologies</td><td>N3011S</td><td>Heated to 50 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C and quenched on ice prior to dilution</td></tr><tr><td>Randomized MDA oligos</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5&#039;-NNNNN*N-3&#039;</td></tr><tr><td>PCR primers</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-CGGCAAACGGGAATGAAACGCC-3&amp;rsquo; and 5&amp;rsquo;-TGCGGCAAAGACAGCAACGG-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>UltraPure Nuclease-free water</td><td>Life Technologies</td><td>10977-015</td><td>UV-treated for 30 min in Stratalinker 2400 before use (optional)</td></tr><tr><td>ROX reference dye</td><td>Life Technologies</td><td>12223-012</td><td></td></tr><tr><td>PCR optical strip caps</td><td>Life Technologies</td><td>4323032</td><td></td></tr><tr><td>PCR tubes</td><td>Agilent Technologies</td><td>401428</td><td></td></tr><tr><td>dNTP (25 micromolar each)</td><td>Agilent Technologies</td><td>200415</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler - Mx3000P qPCR system</td><td>Agilent Technologies</td><td>401403</td><td></td></tr><tr><td>Barrier pipette tips</td><td>VWR</td><td>89003-046</td><td></td></tr><tr><td>Bio-rad oil for evagreen</td><td>Bio-rad</td><td>186-4005</td><td></td></tr><tr><td>JumpStart Taq ReadyMix</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2893-100RXN</td><td></td></tr></tbody></table>

simple bulk readout of digital nucleic acid quantification assays

Ensayos digitales son poderosos métodos que permiten la detección de células raras y recuento de moléculas de ácido nucleico individuales. Sin embargo, los ensayos digitales son todavía no se aplican de forma rutinaria, debido al coste y equipos específicos asociados con los métodos disponibles comercialmente. Aquí presentamos un método simplificado para la lectura de las pruebas de gota digitales utilizando un instrumento convencional PCR en tiempo real para medir la fluorescencia mayor parte de los ensayos digitales basados ​​en gotas. Caracterizamos el rendimiento del ensayo de lectura mayor usando mezclas de gotitas sintético y un digital de amplificación por desplazamiento múltiple (MDA) de ensayo de gotas. Cuantitativa MDA en particular se beneficia de un formato digital de la reacción, pero nuestro nuevo método se aplica a cualquier ensayo digital. Para protocolos de ensayo digitales establecidos, tales como PCR digital, este método sirve para acelerar y simplificar la lectura del ensayo. Nuestra metodología de lectura mayor aporta las ventajas de partitioned ensayos sin la necesidad de la instrumentación de lectura especializada. Las principales limitaciones de la metodología de lectura mayor se reducen rango dinámico en comparación con las plataformas de gotita de conteo y la necesidad de una muestra estándar, aunque los requisitos de esta norma son menos exigentes que para un experimento en tiempo real convencional. La amplificación del genoma completo cuantitativa (WGA) se utiliza para probar los contaminantes presentes en las reacciones de Ventajas de Windows Original y es la forma más sensible para detectar la presencia de fragmentos de ADN con secuencias desconocidas, dando el método de gran promesa en diversas áreas de aplicación incluyendo control de calidad farmacéutica y la astrobiología.

Mientras que las lecturas de mayor convencional / en tiempo real se pueden utilizar tanto para PCR cuantitativo y ensayos cuantitativos WGA (Figura 1), ensayos cuantitativos digitales proporcionan ventajas (Tabla 1). En el método descrito, leemos a cabo ensayos digitales en formato micro-gotita con una medición de punto final a granel sencilla (Figura 2). Si bien este método es ampliamente aplicable, nos centramos en WGA cuantitativa (MDA) ya que este método present...

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Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

Lectura granel simple de Digital ácidos nucleicos Cuantificación ensayos

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

simple-bulk-readout-of-digital-nucleic-acid-quantification-assays

Research

JoVE Journal

Biology

8.3K vistas.  Broad Institute. We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy. 

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Rapid Colorimetric Assays to Qualitatively Distinguish RNA and DNA in Biomolecular Samples

Biochemical experimentation generally requires accurate knowledge, at an early stage, of the nucleic acid, protein, and other biomolecular components in potentially heterogeneous specimens. Nucleic acids can be detected via several established approaches, including analytical methods that are spectrophotometric (e.g., A260), fluorometric (e.g., binding of fluorescent dyes), or colorimetric (nucleoside-specific chromogenic chemical reactions).1 Though it cannot readily distinguish RNA from DNA, the A260/A280 ratio is commonly employed, as it offers a simple and rapid2 assessment of the relative content of nucleic acid, which absorbs predominantly near 260 nm and protein, which absorbs primarily near 280 nm. Ratios &lt; 0.8 are taken as indicative of 'pure' protein specimens, while pure nucleic acid (NA) is characterized by ratios &gt; 1.53.
However, there are scenarios in which the protein/NA content cannot be as clearly or reliably inferred from simple uv-vis spectrophotometric measurements. For instance, (i) samples may contain one or more proteins which are relatively devoid of the aromatic amino acids responsible for absorption at &asymp;280 nm (Trp, Tyr, Phe), as is the case with some small RNA-binding proteins, and (ii) samples can exhibit intermediate A260/A280 ratios (~0.8 &lt; ~1.5), where the protein/NA content is far less clear and may even reflect some high-affinity association between the protein and NA components. For such scenarios, we describe herein a suite of colorimetric assays to rapidly distinguish RNA, DNA, and reducing sugars in a potentially mixed sample of biomolecules. The methods rely on the differential sensitivity of pentoses and other carbohydrates to Benedict's, Bial's (orcinol), and Dische's (diphenylamine) reagents; the streamlined protocols can be completed in a matter of minutes, without any additional steps of having to isolate the components. The assays can be performed in parallel to differentiate between RNA and DNA, as well as indicate the presence of free reducing sugars such as glucose, fructose, and ribose (Figure 1).

A suite of colorimetric assays is described for rapidly distinguishing protein, RNA, DNA, and reducing sugars in potentially heterogeneous biomolecular samples.

Rapid ensayos colorimétricos para distinguir cualitativamente ARN y ADN en muestras Biomolecular

Biochemical experimentation generally requires accurate knowledge, at an early stage, of the nucleic acid, protein, and other biomolecular components in ...

Investigación

Química

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near full-length (intact and defective), HIV-1 proviruses. FLIPS allows determination of the genetic composition of integrated HIV-1 within a cell population. Through identifying defects within HIV-1 proviral sequences that arise during reverse transcription, such as large internal deletions, deleterious stop codons/hypermutation, frameshift mutations, and mutations/deletions in cis acting elements required for virion maturation, FLIPS can identify integrated proviruses incapable of replication. The FLIPS assay can be utilized to identify HIV-1 proviruses that lack these defects and are&#160;therefore potentially replication-competent. The FLIPS protocol involves: lysis of HIV-1 infected cells, nested PCR of near full-length HIV-1 proviruses (using primers targeted to the HIV-1 5&#39; and 3&#39; LTR), DNA purification and quantification, library preparation for Next-generation Sequencing (NGS), NGS, de novo assembly of proviral contigs, and a simple process of elimination for identifying replication-competent proviruses. FLIPS provides advantages over traditional methods designed to sequence integrated HIV-1 proviruses, such as single-proviral sequencing. FLIPS amplifies and sequences near full-length proviruses enabling replication competency to be determined, and also uses fewer amplification primers, preventing the consequences of primer mismatches. FLIPS is a useful tool for understanding the genetic landscape of integrated HIV-1 proviruses, especially within the latent reservoir, however, its utilization can extend to any application in which the genetic composition of integrated HIV-1 is required.

Full-length individual proviral sequencing (FLIPS) provides an efficient and high-throughput method for the amplification and sequencing of single, near full-length (intact and defective) HIV-1 proviruses and allows for determination of their potential replication-competency. FLIPS overcomes limitations of previous assays designed to sequence the latent HIV-1 reservoir.

Amplificación de cerca integrales provirus VIH-1 para secuenciación de próxima generación

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Genética

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been linked to a disease state and has the potential to be used as disease biomarker. A sensitive and accurate method for circulating microRNA quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology has been recently developed. Specifically, using Locked Nucleic Acid (LNA)-based miRNA-specific primers with a green fluorescent DNA-binding dye in a compatible droplet digital PCR system it is possible to obtain the absolute quantification of specific miRNAs. Here, we describe how performing this technique to assess miRNA amount in biological fluids, such as plasma and serum, is both feasible and effective.

A sensitive and accurate method for cell-free microRNAs quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology is described.

Que circula MicroARN Cuantificación Usando ADN vinculante tinte Química y gotita de PCR digital

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

Bioingeniería

Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular biology assays such as synthesis and purification of DNA, diagnostic applications such as quantification of DNA amplification products, and detection of DNA molecules in drug preparations. During this video we will demonstrate the capability of the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a Micro Plate Reader accessory to perform dsDNA quantification using Molecular Probes Quant-it PicoGreen dye reagent kit.
The F-7000 Fluorescence Spectrophotometer offers high sensitivity and high speed measurements. It is a highly flexible system capable of measuring fluorescence, luminescence, and phosphorescence. Several measuring modes are available, including wavelength scan, time scan, photometry and 3-D scan measurement. The spectrophotometer has sensitivity in the range of 50 picomoles of fluorescein when using a 300 &#956;L sample volume in the microplate, and is capable of measuring scan speeds of 60,000 nm/minute. It also has a wide dynamic range of up to 5 orders of magnitude which allows for the use of calibration curves over a wide range of concentrations. The optical system uses all reflective optics for maximum energy and sensitivity. The standard wavelength range is 200 to 750 nm, and can be extended to 900 nm when using one of the optional near infrared photomultipliers. The system allows optional temperature control for the plate reader from 5 to 60 degrees Celsius using an optional external temperature controlled liquid circulator. The microplate reader allows for the use of 96 well microplates, and the measuring speed for 96 wells is less than 60 seconds when using the kinetics mode.
Software controls for the F-7000 and Microplate Reader are also highly flexible. Samples may be set in either column or row formats, and any combination of wells may be chosen for sample measurements. This allows for optimal utilization of the microplate. Additionally, the software allows importing micro plate sample configurations created in Excel and saved in comma separated values, or "csv" format. Microplate measuring configurations can be saved and recalled by the software for convenience and increased productivity. Data results can be output to a standard report, to Excel, or to an optional Report Generator Program.

Demonstration of quantification of dsDNA using Molecular Probes PicoGreen dye and Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a microplate reader accessory.

La cuantificación de ADN de doble cadena con el Hitachi F-7000 espectrofotómetro de fluorescencia y Dye PicoGreen

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular ...

Biología

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

NanoDrop microvolumen cuantificación de ácidos nucleicos

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

<meta charset="utf8"></head><body>Protocolo estandarizado para la cuantificación del genoma viral mediante PCR digital en gotas

Quantification of Adeno-Associated Viral Genomes in Purified Vector Samples by Digital Droplet Polymerase Chain Reaction

Adeno-associated virus (AAV) is a non-pathogenic virus used as a delivery vehicle to transfer therapeutic genes into patients. Accurate quantification of AAV genome copy number in vector preparations is essential for bioprocess optimization and dosage calculation in both preclinical and clinical studies of AAV-based gene therapy products. Currently, a consensus protocol for AAV viral genome titration is lacking. Here, we present a digital droplet PCR (dd_PCR) protocol for the quantification of viral genomes in purified vector samples. Samples are treated with DNase I to eliminate unpackaged contaminant DNA. DNase-treated samples are then mixed with an appropriate primer-probe set (designed according to the target AAV genome) and PCR reagents, and then loaded into a droplet generator. The prepared droplets are transferred into a PCR plate, where PCR amplification is performed and analyzed. The viral genome titer is calculated based on the concentration (copies/&#181;L), accounting for sample dilutions. A successful measurement shows a clear separation of the positive and negative droplet clouds, has at least 10,000 accepted droplets, shows a value between 10 copies/&#181;L and 10,000 copies/&#181;L, and has a coefficient of variation (CV) between repeats lower than 20%. Reliable viral genome titration will aid in the development of safe and effective AAV-based gene therapy products.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor destacado: Optimización del método de PCR digital en gotas para la cuantificación precisa del genoma viral adenoasociado

Precise quantification of adeno-associated virus (AAV) vector genome copies is critical, but a standardized protocol has yet to be established. This protocol describes a validated method for preparing purified AAV samples and conducting digital droplet polymerase chain reaction (dd_PCR) to reliably quantify the viral genome titer.

Cuantificación de genomas virales adenoasociados en muestras de vectores purificadas mediante reacción en cadena de la polimerasa por gotas digitales

Adeno-associated virus (AAV) is a non-pathogenic virus used as a delivery vehicle to transfer therapeutic genes into patients. Accurate quantification of ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) is the gold standard for SARS-CoV-2 diagnosis as no permanent solution is available. However effective this technique may be, research has emerged showing its limitations in detection and diagnosis especially when it comes to low abundant targets. In contrast, droplet digital PCR (ddPCR), a recent emerging technology with superior advantages over qPCR, has been shown to overcome the challenges of RT-qPCR in diagnosis of SARS-CoV-2 from low abundant target samples. Prospectively, in this article, the capabilities of RT-ddPCR are further expanded by showing steps on how to develop simplex, duplex, triplex probe mix, and quadruplex assays using a two-color detection system. Using primers and probes targeting specific sites of the SARS-CoV-2 genome (N, ORF1ab, RPP30, and RBD2), the development of these assays is shown to be possible. Additionally, step by step detailed protocols, notes, and suggestions on how to improve the assays workflow and analyze data are provided. Adapting this workflow in future works will ensure that the maximum number of targets can be sensitively detected in a small sample significantly improving on cost and sample throughput.

This work summarizes steps on developing different assays for SARS-CoV-2 detection using a two color ddPCR system. The steps are elaborate and notes have been included on how to improve the assays and experiment performance. These assays may be used for multiple SARS-CoV-2 RT-ddPCR applications.

Protocolos de PCR digital de gotas con transcripción inversa de dos pasos para la detección y cuantificación del SARS-CoV-2

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...

Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR

Digital droplet polymerase chain reaction (dd-PCR) is one of the most sensitive quantification methods; it fractionates the reaction into nearly 20,000 water-in-oil droplets, and the PCR occurs in the individual droplets. The dd-PCR has several advantages over conventional real-time qPCR, including increased accuracy in detecting low-abundance targets, omitting reference genes for quantification, eliminating technical replicates for samples, and showing high resilience to inhibitors in the samples. Recently, dd-PCR has become one of the most popular methods for accurately quantifying target DNA or RNA for gene expression analysis and diagnostics. Circular RNAs (circRNAs) are a large family of recently discovered covalently closed RNA molecules lacking 5' and 3' ends. They have been shown to regulate gene expression by acting as sponges for RNA-binding proteins and microRNAs. Furthermore, circRNAs are secreted into body fluids, and their resistance to exonucleases makes them serve as biomarkers for disease diagnosis. This article aims to show how to perform divergent primer design, RNA extraction, cDNA synthesis, and dd-PCR analysis to accurately quantify specific circular RNA (circRNA) levels in cells. In conclusion, we demonstrate the precise quantification of circRNAs using dd-PCR.

This protocol describes the detailed method of digital droplet PCR (dd-PCR) for precise quantification of circular RNA (circRNA) levels in cells using divergent primers.

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Digital droplet polymerase chain reaction (dd-PCR) is one of the most sensitive quantification methods; it fractionates the reaction into nearly 20,000 ...

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Resumen

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