Estos protocolos se pueden utilizar para desarrollar ensayos internos de ddPCR multiplex para la detección del SARS-CoV-2 utilizando un sistema ddPCR de dos colores. Esto es útil para las personas que desean desarrollar sus propios kits para la detección del SARS-CoV-2 y otros patógenos. En comparación con la RT-qPCR estándar de oro, la RT-ddPCR se puede utilizar para cuantificar múltiples genes del SARS-CoV-2 sin la necesidad de una curva estándar.
Dado que la ddPCR es una técnica emergente, la demostración visual es importante para ayudar a los usuarios actuales y futuros a comprender y desarrollar fácilmente ensayos multiplex para la detección del SARS-CoV-2 y otros patógenos. Para la síntesis de ADNc, agregue dos microlitros de mezcla maestra de transcripción inversa 5X, cinco microlitros de la muestra de ARN de interés y tres microlitros de agua doble destilada libre de RNasa en un tubo de PCR de 100 o 200 microlitros a un volumen final de 10 microlitros como solución, y coloque el tubo en hielo. Cuando se hayan agregado los reactivos, cargue la muestra en un termociclador y configure el instrumento para ejecutar una transcripción inversa a 37 grados centígrados durante 15 minutos, una inactivación térmica de la transcripción inversa durante 5 segundos a 85 grados centígrados y una retención infinita final a cuatro grados centígrados.
Antes de realizar la PCR digital de gotas, agregue 19,8 microlitros de mezcla maestra recién preparada al número apropiado de pocillos de una placa de PCR digital de 96 pocillos libre de nucleasas. Agregue 2,2 microlitros de ADNc a cada pocillo de mezcla maestra a un volumen final de 22 microlitros de mezcla de reacción por pocillo y selle la placa con un sellador de placas de PCR desechable. Luego, haga un vórtice de la placa durante 15 a 30 segundos en centrífuga durante 10 a 15 segundos para recoger el contenido del pozo en el fondo de la placa.
Para la generación automatizada de gotas en la pantalla táctil del generador automatizado de gotas, haga clic en configurar placa de muestra y seleccione las columnas en las que se encuentran las muestras en la placa de muestra. Haga clic en Aceptar y abra la puerta del generador de gotas automatizado. Cargue las placas de generación de muestras y gotas y los demás materiales necesarios para el experimento en las ubicaciones respectivas dentro del instrumento y cierre la puerta.
Cuando la pantalla táctil se vuelva verde, lo que indica que todos los materiales se han cargado en sus posiciones correctas, seleccione aceite para las sondas y comience la generación de gotas. Espere a que la generación de gotas se ejecute hasta su finalización de acuerdo con el tiempo indicado en la pantalla. Cuando la pantalla diga Gotlets listos, abra la puerta para quitar la placa que contiene las gotas y use un sellador de placas durante cinco segundos a 180 grados centígrados para sellar la placa con un sello de lámina perforable.
Dentro de los 30 minutos posteriores a la generación de gotas, coloque la placa de gotas sellada en un termociclador de pozo de 96 pozos profundos. Ajuste el volumen de muestra a 40 microlitros y la temperatura de la tapa a 105 grados centígrados. Luego, la PCR amplifica las gotitas.
Para la lectura de gotas, después de la amplificación, transfiera la placa de 96 pocillos con ciclo térmico a un lector de gotas y abra el software que lo acompaña en una computadora conectada al lector de gotas. En el modo de configuración, seleccione Nuevo y haga doble clic en cualquier pozo para abrir el cuadro de diálogo del editor de pozos. Seleccione los pocillos a leer y establezca el experimento en cuantificación absoluta, supermezcla a supermezcla de PCR digital de gotas para sondas.
Apunte un tipo al canal 1 desconocido y el tipo dos al canal 2 desconocido. Asigne los nombres de muestra según el diseño de la placa y haga clic en aplicar y aceptar. Después de guardar la plantilla, haga clic en Ejecutar.
Cuando el software se lo solicite, seleccione el color FAM/HEX. Al final de la adquisición de datos, retire la placa del lector. Antes de analizar los datos, verifique los datos de todos los pozos para obtener el número total de gotas.
Y establezca un límite para aceptar un número mínimo de gotitas que se contarán como resultados positivos o negativos. Para el análisis de ensayos símplex y dúplex, haga doble clic en el archivo QLP que se va a analizar y seleccione Analizar. Utilice las herramientas de amplitud 1D y umbral de amplitud 2D para distinguir entre las gotas positivas y negativas para cada pocillo en el canal correcto, utilizando el control de plantilla de nodo y las muestras de control positivo como guía.
A continuación, exporte los resultados como un archivo CSV para un análisis adicional. Para un ensayo de mezcla de sonda triplex, abra el archivo QLP y seleccione los pocillos que se analizarán en la pestaña del editor de placas. Establezca el tipo de experimento en cuantificación directa y el ensayo en mezcla de sonda triplex, e introduzca el nombre del objetivo.
A continuación, haga clic en Aplicar. Utilice las herramientas de gráficos para asignar colores específicos a diferentes clústeres de destino según las sugerencias emergentes de la ventana seleccionada para asignar clústeres. Cuando se hayan asignado todos los colores objetivo, los datos de cuantificación se mostrarán en la ventana de datos del pozo.
Exporte los datos como un archivo CSV para el análisis posterior. Para un ensayo cuádruplex, establezca el tipo de experimento en cuantificación directa y el ensayo en múltiplex de amplitud. Introduzca el nombre de destino y haga clic en Aplicar.
Utilice las herramientas de gráficos para asignar colores específicos a diferentes clústeres de destino según las sugerencias emergentes de la ventana seleccionada para asignar clústeres. Cuando se hayan asignado todos los colores objetivo, los datos de cuantificación se mostrarán en la ventana de datos del pozo. Exporte los datos como un archivo CSV para un análisis adicional.
Como se observó en este análisis representativo del gradiente de temperatura, las temperaturas más altas de rodillas no pudieron distinguir claramente las gotas positivas de las negativas cuando se realizó un ensayo dúplex. Sin embargo, con una disminución en la temperatura de rodillas, se logró una separación óptima entre gotas positivas y negativas. Utilizando un sistema de detección de PCR digital de gotas RT de dos colores, es posible detectar uno, dos, tres y cuatro objetivos de SARS-CoV-2 dentro de una sola muestra.
Se puede usar una muestra de control sin plantilla para localizar gotas negativas para ayudar a establecer el umbral negativo en ensayos simplex. En los ensayos dúplex, el análisis se puede realizar en canales individuales o en la amplitud 2D. Aunque el análisis de datos de ensayos multiplex de orden superior no es sencillo, estos ensayos son útiles, ya que permiten evaluar hasta ocho grupos de gotas en ensayos de mezcla de sonda triplex y hasta 16 grupos de gotas para ensayos basados en amplitud cuádruplex.
Dependiendo del ensayo que se vaya a desarrollar, asegúrese de que se agreguen las concentraciones correctas de cebador y sonda a la mezcla maestra. Usando este procedimiento, se pueden alternar los objetivos para desarrollar nuevos ensayos de RT-ddPCR. Estos ensayos se pueden utilizar para diferentes propósitos de investigación o para el diagnóstico de enfermedades infecciosas emergentes.
Desde su desarrollo, esta técnica se ha utilizado para la determinación precisa de copias de ácidos nucleicos virales en diferentes estándares, el cuerpo humano y muestras ambientales.
