The research leading to these AirPROM results has received funding from the European Union under grant agreement&#160;n&#176; 270194.This work was also funded by the National Centre for the Replacement, Refinement, and Reduction of Animals in Research (NC3Rs), and the Engineering and Physical Research Centre (EPSRC) Doctoral Training Centre (DTC) in Regenerative Medicine, U.K.

ASM células primarias de individuos no asmáticos fueron aisladas de biopsias bronquiales en el Hospital Glenfield (Leicester, Reino Unido) como se describe anteriormente. La investigación fue aprobado por el Comité de Ética de Leicestershire y los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito. 1. Electrohilado PET Andamios (Figura 2) <ol><li> Preparar una solución (10 ml) de la botella de bebida de grado PET en un 1: 1 diclorometano (DCMro) - ácido trifluoroacético solución (TFA). Se requieren concentraciones de PET de 8%, 30% y 10% peso / volumen (peso / vol) para nanofibras, microfibra y andamios alineados respectivamente y luego se agita la solución de O / N a TA durante la PET se disuelva. </li><li> Transferir la solución de PET en una jeringa y adjuntar un 23-G (para nanofibras) o un 18-G (para microfibra y alineado) aguja a la jeringa y coloque la jeringa en una bomba de jeringa motorizada. Asegúrese de que la punta de la aguja se hace girar a la parte inferior. </li><li> Coloque el mandrel 15 cm de distancia de la punta de la aguja, lo que garantiza que la aguja está orientado hacia el centro del tambor. </li><li> Conecte el suministro de electricidad a la punta de la aguja con pinzas de cocodrilo y tierra el mandril (vía el zócalo de plátano) a la tierra. Conectar la fuente de alimentación al mandril y velocidad ajustada a 60 rpm (equivalente a aproximadamente 13,2 m · min -1) para nanofibras y microfibra andamios. Velocidad establecida para 2000 rpm (equivalente a aproximadamente 440 m · min -1) andamios para alineados. </li><li> Ajuste la bomba de jeringa a una velocidad de flujo de 0,5 ml · h -1 para nanofibras andamios azar y alineados o 2.0 ml · h -1 para andamios de microfibra. Deje que la bomba funcione hasta que la solución se extruye desde la punta de la aguja con el fin de eliminar el aire en la aguja. Luego parar la bomba. </li><li> En la bomba de jeringa, ajustar el volumen total de la solución a ser expulsado a 2 ml y arrancar la bomba. </li><li> Conjunto de alimentación de tensión de 14 kV, y el interruptor en la supl poderly. </li><li> Electrospin hasta que ha sido electrospun 2 ml de solución (4 h para andamios nanofibras y alineados, 1 hr para andamios de microfibra). </li><li> Cortar el andamio con una cuchilla a lo largo de la anchura del mandril. Esto produce una hoja 2D de andamio el tamaño del área de superficie del mandril (en este caso, una hoja rectangular 22 cm x 11 cm) que puede ser cuidadosamente se quitó el mandril). Guarde el andamio en papel de aluminio para reducir la carga electrostática). Nota: Los andamios bifásicos son producidos por secuencial electrospinning un andamiaje de nanofibras directamente sobre un andamio de microfibra. </li></ol> 2. Esterilización de andamios antes del uso en cultivo celular <ol><li> De la hoja de andamio, perforar discos de andamios bifásicos o alineados utilizando una biopsia de la pluma 0,8 mm de diámetro y se adhieren a la empaquetadura usando pegamento acuario no tóxico. </li><li> Esterilizar andamios utilizando irradiación ultravioleta durante 30 min en cada lado de los andamios antes de sumergirse en un 20% Vol / vol solución antibiótica / antimicótica (2x10 ml -1 5 unidades de penicilina G, 2.000 mg ml -1 de sulfato de estreptomicina y 500 mg ml -1 anfotericina B) O / N a 4 ° C. </li><li> Lave los andamios con PBS 3 veces, y luego almacenar los andamios en placas de pocillos TCP en PBS a 4 ° C hasta su uso. </li></ol> 3. Teléfonos Constituyentes Cultura Medios <ol><li> Células epiteliales Cultura CALU3 en medio DMEM-F12 suplementado con suero de 10% vol / vol de ternera fetal (FCS), solución 2 nM L-glutamina, 1% vol / vol antibiótico / antimicótico solución (10.000 unidades ml -1 penicilina G, 100 mg ml -1 de sulfato de estreptomicina y 25 mg ml -1 anfotericina B). </li><li> Cultivo de fibroblastos y células ASM MRC5 en medio DMEM suplementado con suero de 10% vol / vol de ternera fetal (FCS), solución 2 nM L-glutamina, 1% vol / vol antibiótico / antimicótico solución (10.000 unidades de penicilina G ml -1, 100 mg ml -1 de sulfato de estreptomicina y 25 mg ml -1 anfotericina B). </li><li> Cultura co-cultivos de células epiteliales, fibroblastos-ASM en un DMEM-F12 70:30: mezcla de medio DMEM. </li></ol> 4. Siembra de fibroblastos y células epiteliales en bifásica Andamios <ol><li> En una placa de cultivo de tejidos, remojar los andamios en medio suplementado DMEM-e incubar a 37 ° C durante 1 hora antes de la siembra de células. </li><li> Retire los medios suplementados con DMEM, coloque la fase de microfibra de andamio apical y sembrar 1.5 x10 4 MRC5 células de fibroblastos en 30 l de medio suplementado-DMEM. Agite la placa en un agitador orbital durante 2 horas, antes de salir en una incubadora a 37 ° C 5% de CO 2 en el aire O / N. </li><li> Gire el andamio sobre lo que la fase de nanofibras de andamio enfrenta apical, semillas 3.0 x10 4 CALU3 células epiteliales en 30 l de los medios de comunicación-F12 suplementado DMEM en la fase de nanofibras del andamio y se incuba for 2 horas a 37 ° C, 5% de CO 2 en el aire antes de sumergirse en el andamio 70:30 DMEM-F12: DMEM suplementado con medios de comunicación O / N antes de transferir al biorreactor. </li></ol> 5. La siembra de células ASM en la Alineados Andamios <ol><li> En una placa de cultivo de tejidos, remojar los andamios en medio suplementado DMEM-e incubar durante 1 hora a 37 ° C antes de la siembra 2,5 x10 4 células en 30 l de medio suplementado DMEM-e incubando durante 2 hr (37 ° C, 5% de CO 2 en el aire). Sumerja andamio a cambio medio suplementado-DMEM a la incubadora y dejar O / N antes de la creación de una cultura tri en el biorreactor. </li></ol> 6. Configurando el Tri-cultivo utilizando el Sistema de biorreactor (Figura 7) <ol><li> Coloque la junta andamio bifásica en la ranura dentro de una cámara con la fase epitelial hacia arriba en la cámara. </li><li> Coloque el andamio alineados debajo del andamio bifásica (por lo que es adyacente a la microfiber fase del andamio bifásica) y bloquee las dos cámaras del biorreactor juntos. </li><li> Montar dos circuitos de flujo de perfusión conectados a dos depósitos medianas (medio suplementado DMEM-F12-en reservorio apical, DMEM-F12 / DMEM-medios suplementados en depósito basal) y medios de comunicación de la bomba alrededor de los dos circuitos en aproximadamente 0,1 ml / min usando una bomba peristáltica (40 ml de medio se recicla a través de cada circuito). Casa todas las partes del sistema dentro de una incubadora a 37 ° C, 5% de CO2 en aire. </li><li> Después de una semana, retire el soporte de la cámara apical, y la cultura de las células epiteliales en el ALI durante una semana más antes de su análisis. </li></ol>

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	<li>Macchiarini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+transplantation+of+a+tissue-engineered+airway.">Clinical transplantation of a tissue-engineered airway.</a> Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).</li><li>Song, J., Guyette, J., Gilpin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+and+experimental+orthotopic+transplantation+of+a+bioengineered+kidney.">Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney.</a> Nature medicine. 19 (5), 646-651 (2013).</li><li>Wenzel, S., Holgate, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+trap:+it+still+yields+few+answers+in+asthma.">The mouse trap: it still yields few answers in asthma.</a> American journal of respiratory and critical. 174 (11), 1171-1173 (2006).</li><li>Zosky, G. R., Sly, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+asthma.">Animal models of asthma.</a> Clinical and experimental allergy journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. 37 (7), 973-988 (2007).</li><li>Bates, J. H. T., Rincon, M., Irvin, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+asthma.+American+journal+of+physiology.">Animal models of asthma. American journal of physiology.</a> Lung cellular and molecular physiology. 297 (3), L401-L410 (2009).</li><li>Johansson, F., Carlberg, P., Danielsen, N., Montelius, L., Kanje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+outgrowth+on+nano-imprinted+patterns.">Axonal outgrowth on nano-imprinted patterns.</a> Biomaterials. 27 (8), 1251-1258 (2006).</li><li>Paik, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+micropatterning+of+cell+lines+and+human+pluripotent+stem+cells+on+elastomeric+membranes.">Rapid micropatterning of cell lines and human pluripotent stem cells on elastomeric membranes.</a> Biotechnology and bioengineering. 109 (10), 2630-2641 (2012).</li><li>Williams, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aligned+Cell+Sheets+Grown+on+Thermo-Responsive+Substrates+with+Microcontact+Printed+Protein+Patterns.">Aligned Cell Sheets Grown on Thermo-Responsive Substrates with Microcontact Printed Protein Patterns.</a> Advanced Materials. 21 (21), 2161-2164 (2009).</li><li>Schindler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+nanofibrillar+matrix+promotes+in+vivo-like+organization+and+morphogenesis+for+cells+in+culture.">A synthetic nanofibrillar matrix promotes in vivo-like organization and morphogenesis for cells in culture.</a> Biomaterials. 26 (28), 5624-5631 (2005).</li><li>Schindler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+in+Three+Dimensions.">Living in Three Dimensions.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 45 (14), 215-227 (2006).</li><li>Ahmed, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology,+cytoskeletal+organization,+and+myosin+dynamics+of+mouse+embryonic+fibroblasts+cultured+on+nanofibrillar+surfaces.">Morphology, cytoskeletal organization, and myosin dynamics of mouse embryonic fibroblasts cultured on nanofibrillar surfaces.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 301 (1-2), 241-249 (2007).</li><li>Flemming, R., Murphy, C., Abrams, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+synthetic+micro-and+nano-structured+surfaces+on+cell+behavior.">Effects of synthetic micro-and nano-structured surfaces on cell behavior.</a> Biomaterials. 20, 573-588 (1999).</li><li>Sun, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+3D+Cell+Culture+System+for+Investigating+Cell+Interactions+With+Electrospun+Fibers.">Development of a 3D Cell Culture System for Investigating Cell Interactions With Electrospun Fibers.</a> Biotechnol. Bioeng. 97 (5), 1318-1328 (2007).</li><li>Kim, D. -. H., Provenzano, P. P., Smith, C. L., Levchenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+nanotopography+as+a+regulator+of+cell+function.">Matrix nanotopography as a regulator of cell function.</a> The Journal of cell biology. 197 (3), 351-360 (2012).</li><li>Jeffery, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+in+Asthma+and+Chronic+Obstructive+Lung+Disease.">Remodeling in Asthma and Chronic Obstructive Lung Disease.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 164 (10 pt 2), S28-S38 (2001).</li><li>Jungebluth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracheobronchial+transplantation+with+a+stem-cell-seeded+bioartificial+nanocomposite:+a+proof-of-concept+study.">Tracheobronchial transplantation with a stem-cell-seeded bioartificial nanocomposite: a proof-of-concept study.</a> Lancet. 378 (9808), 1997-2004 (2011).</li><li>Miller, C., George, S., Niklason, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+tissue-engineered+model+of+the+human+bronchiole.">Developing a tissue-engineered model of the human bronchiole.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative. (July), 619-627 (2010).</li><li>West, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+3D+multicell+microtissue+culture+model+of+airway+smooth+muscle.+American+journal+of+physiology.">Development and characterization of a 3D multicell microtissue culture model of airway smooth muscle. American journal of physiology.</a> Lung cellular and molecular physiology. 304 (1), L4-L16 (2013).</li><li>Nesmith, A. P., Agarwal, A., McCain, M. L., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+airway+musculature+on+a+chip:+an+in+vitro+model+of+allergic+asthmatic+bronchoconstriction+and+bronchodilation.">Human airway musculature on a chip: an in vitro model of allergic asthmatic bronchoconstriction and bronchodilation.</a> Lab on a chip. , (2014).</li><li>Hadjizadeh, A., Ajji, A., Bureau, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano/micro+electro-spun+polyethylene+terephthalate+fibrous+mat+preparation+and+characterization.">Nano/micro electro-spun polyethylene terephthalate fibrous mat preparation and characterization.</a> Journal of the mechanical behavior of biomedical materials. 4 (3), 340-351 (2011).</li><li>Morris, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+airway+smooth+muscle+maintain+in+situ+cell+orientation+and+phenotype+when+cultured+on+aligned+electrospun+scaffolds.">Human airway smooth muscle maintain in situ cell orientation and phenotype when cultured on aligned electrospun scaffolds.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (1), L38-L47 (1999).</li><li>Morris, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+electrospun+biphasic+scaffold+provides+optimal+three-dimensional+topography+for+in+vitro+co-culture+of+airway+epithelial+and+fibroblast+cells.">A novel electrospun biphasic scaffold provides optimal three-dimensional topography for in vitro co-culture of airway epithelial and fibroblast cells.</a> Biofabrication. 6 (3), 035014 (2014).</li><li>Sell, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Natural+Polymers+in+Tissue+Engineering:+A+Focus+on+Electrospun+Extracellular+Matrix+Analogues.">The Use of Natural Polymers in Tissue Engineering: A Focus on Electrospun Extracellular Matrix Analogues.</a> Polymers. 2 (4), 522-553 (2010).</li><li>Subbiah, T., Bhat, G. S., Tock, R. W., Parameswaran, S., Ramkumar, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospinning+of+nanofibers.">Electrospinning of nanofibers.</a> Journal of Applied Polymer Science. 96 (2), 557-569 (2005).</li><li>Dalton, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospinning+and+additive+manufacturing:+converging+technologies.">Electrospinning and additive manufacturing: converging technologies.</a> Biomaterials Science. 1 (2), 171 (2013).</li><li>Boland, E. D., Wnek, G. E., Simpson, D. G., Pawlowski, K. J., Bowlin, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+tissue+engineering+scaffolds+using+electrostatic+processing+techniques:+A+study+of+poly(glycolic+acid)+electrospinning.">Tailoring tissue engineering scaffolds using electrostatic processing techniques: A study of poly(glycolic acid) electrospinning.</a> Journal of Macromolecular Science-Pure and Applied Chemistry. 38 (12), 1231-1243 (2001).</li><li>Stitzel, J. D., Bowlin, G. L., Mansfield, K., Wnek, G. E., Simpson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospraying+and+electrospinning+of+polymers+for+biomedical+applications.+Poly(lactic-co-glycolic+acid)+and+poly(ethylene-co-vinylacetate).">Electrospraying and electrospinning of polymers for biomedical applications. Poly(lactic-co-glycolic acid) and poly(ethylene-co-vinylacetate).</a> Revolutionary Materials: Technology And Economics. 32, 205-211 (2000).</li><li>Liu, W., Thomopoulos, S., Xia, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+nanofibers+for+regenerative+medicine.">Electrospun nanofibers for regenerative medicine.</a> Advanced healthcare materials. 1 (1), 10-25 (2012).</li><li>Veleirinho, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solvent+and+concentration+effects+on+the+properties+of+electrospun+poly+(ethylene+terephthalate)+nanofiber+mats.">Solvent and concentration effects on the properties of electrospun poly (ethylene terephthalate) nanofiber mats.</a> Journal of Polymer. , 460 (2008).</li><li>Balguid, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+Fiber+Diameter+in+Electrospun+Poly(epsilon-Caprolactone)+Scaffolds+for+Optimal+Cellular+Infiltration+in+Cardiovascular+Tissue+Engineering.">Tailoring Fiber Diameter in Electrospun Poly(epsilon-Caprolactone) Scaffolds for Optimal Cellular Infiltration in Cardiovascular Tissue Engineering.</a> Tissue Engineering Part A. 15 (2), 437-444 (2009).</li><li>Shalumon, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+three-dimensional+nano,+micro+and+micro/nano+scaffolds+of+porous+poly(lactic+acid)+by+electrospinning+and+comparison+of+cell+infiltration+by+Z-stacking/three-dimensional+projection+technique.">Fabrication of three-dimensional nano, micro and micro/nano scaffolds of porous poly(lactic acid) by electrospinning and comparison of cell infiltration by Z-stacking/three-dimensional projection technique.</a> IET nanobiotechnology / IET. 6 (1), 16-25 (2012).</li><li>Thevenot, P., Nair, A., Dey, J., Yang, J., Tang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+to+Analyze+Three-Dimensional+Cell+Distribution+and+Infiltration+in+Degradable+Scaffolds.">Method to Analyze Three-Dimensional Cell Distribution and Infiltration in Degradable Scaffolds.</a> Tissue Engineering Part C-Methods. 14 (4), 319-331 (2008).</li><li>Rose, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gelatin-Based+Materials+in+Ocular+Tissue+Engineering.">Gelatin-Based Materials in Ocular Tissue Engineering.</a> Materials. 7 (4), 3106-3135 (2014).</li><li>Liliensiek, S. J., Nealey, P., Murphy, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Endothelial+Basement+Membrane+Nanotopography+in+Rhesus+Macaque+as+a+Guide+for+Vessel+Tissue+Engineering.">Characterization of Endothelial Basement Membrane Nanotopography in Rhesus Macaque as a Guide for Vessel Tissue Engineering.</a> Tissue Engineering Part A. 15 (9), (2009).</li><li>Abrams, G. A., Murphy, C. J., Wang, Z. -. Y., Nealey, P. F., Bjorling, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+basement+membrane+topography+of+the+bladder+epithelium.">Ultrastructural basement membrane topography of the bladder epithelium.</a> Urological research. 31 (5), 341-346 (2003).</li><li>Abrams, G. A., Bentley, E., Nealey, P. F., Murphy, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Microscopy+of+the+Canine+Corneal+Basement+Membranes.">Electron Microscopy of the Canine Corneal Basement Membranes.</a> Cells Tissues Organs. 170 (4), 251-257 (2002).</li><li>Reichl, S., Bednarz, J., Muller-Goymann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+corneal+equivalent+as+cell+culture+model+for+in+vitro+drug+permeation+studies.">Human corneal equivalent as cell culture model for in vitro drug permeation studies.</a> British Journal of Ophthalmology. 88 (4), 560-565 (2004).</li></ol>

The Authors have nothing to disclose.

La capacidad de electrospin fibras poliméricas con propiedades estructurales comparables a ECM natural ha llevado a numerosos polímeros naturales o sintéticos, o mezclas de polímero que se está electrospun para recrear estos ambientes,. La manipulación de los parámetros del proceso (incluyendo la elección del polímero, la concentración de polímero,, distancia punta de la aguja disolvente y temperatura) ¿pueden todas las características de la influencia de andamios; sin embargo, algunos parámetros pueden tener un mayor impacto en las propiedades de andamios que otros 25,. Cuando la modificación de PET diámetro de la fibra, encontramos los parámetros clave a ser la concentración del polímero utilizado, la velocidad a la que la solución de polímero era electrospun, y el diámetro de la aguja. Cuando electrospinning fibras alineadas los parámetros clave son el método de recogida utilizado (un mandril giratorio), y la velocidad a la que gira el mandril. A través de la reducción de la velocidad del mandril a 60 rpm, encontramos los andamios alineados al azar producidos mostraron mayor uni andamiola conformidad en comparación con electrospinning sobre una placa de colector plano. Se analizaron las características de los tejidos de las vías respiratorias descelularizado proporcionar orientación para las distintas topografías de andamios desarrollados por la cultura de cada uno de las vías respiratorias de tipo celular. Nanofibras electrohiladas son un andamio atractivo para replicar estructuras de la membrana basal debido al tamaño de poro pequeño pero de alta porosidad global que permite una mayor difusión metabolito mientras restringir el movimiento celular. 9 Mientras que la optimización de los parámetros de electrospinning, un intervalo de concentraciones de PET y las tasas de flujo fueron probados. Las fibras más finas se lograron utilizando una solución peso / vol PET 6%, utilizado anteriormente por otros grupos. Sin embargo, los altos niveles de abalorios, y una falta de uniformidad eran constantes problemas. Los intentos iniciales para eliminar el rebordear incluyeron la adición de un tensioactivo catiónico, bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB), a la solución para disminuir la tensión superficial, y prueba de varias fuentesde PET. La adición de tensioactivo redujo la cantidad de gotear, pero no completamente. Después de probar un número de fuentes comerciales de gránulos de PET, se utilizó botella de bebida de calidad alimentaria PET, cortando botellas de bebidas y disolviendo estos en el DCM: TFA solución de disolvente. Usando esto como la fuente de PET resultó en un aumento en la uniformidad de fibra y una reducción en fibra rebordear. Al aumentar la concentración de la solución ligeramente a 8% en peso / vol y reduciendo el diámetro de la aguja (18G a 23G) hemos producido consistentemente nanofibras defecto libres con un diámetro de fibra de aproximadamente 250 nm. Andamios nanofibras electrohiladas pueden ser altamente electrostática a la recogida del mandril haciendo la manipulación manual de los andamios difíciles. Esto fue mejorado mediante el almacenamiento de los andamios en papel de aluminio después de girar y sumergirse en un 70% IMS antes de su uso. Este apareció para ayudar a disipar la carga electrostática residual que queda en el patíbulo del proceso de electrospinning. Para proporcionar la parte superiorographies similar a los microambientes individuales encontradas por los tres tipos de células de las vías respiratorias principales dentro de la pared de la vía aérea, un protocolo básico electrospinning se adaptó para producir tres andamios únicos para estos tipos de células: por electrospinning una solución de bajo PET concentración lentamente, se generaron nanofibras alineados al azar, en el que las células epiteliales se sembraron (imitando el RBM). Por electrospinning una solución PET concentración más alta a una velocidad mayor, se generaron microfibras alineadas al azar (produciendo un andamio más porosa), en las que se sembraron fibroblastos (imitando la zona sub-mucosa inmediatamente debajo de la RBM). Por electrospinning una solución de baja concentración de PET en una gran velocidad de rotación del mandril alineado nanofibras se produjeron, en el cual las células musculares lisas orientadas en la dirección de la fibra, produciendo capas de células alineadas. Diámetros de las fibras sin mayor problema al aumento del tamaño de los poros, lo que permite una mayor penetratio celularn en los andamios y así ayudar a crear un verdadero entorno 3D,. Se emplearon los andamios de microfibra para el cultivo de fibroblastos en el estudio para asegurar que las células residían en múltiples planos dentro del andamio. Al aumentar la concentración de PET a 30% en peso / vol, se produjeron fibras de PET con un diámetro medio de 2,5 micras. Fibras de mayor diámetro (≈ 4 micras) se produjeron utilizando una solución de PET peso / volumen 35%, pero la uniformidad de espesor andamio se perdió, y la mayor variabilidad entre las fibras individuales era evidente. Los poros en el andamio de microfibra eran más de 7 veces mayor que los medidos en las nanofibras andamios (10.45 micras vs 1,43 micras, respectivamente), pero todavía estática siembra de las células proporcionan la penetración celular limitada. Esto se ha mejorado mediante la siembra de las células dinámicamente usando un mezclador orbital, un método demostrado ser eficaz previamente. Andamios nanofibras altamente alineados fueron creados por electrospinning un 10%p / solución PET vol sobre el mandril que gira a 2000 rpm (≈ 440 m · min -1). La concentración de PET se aumentó de 8% para evitar una morfología similar a una onda irregular que las fibras expuestas a concentraciones más bajas. A pesar del aumento en la concentración, la alineación de las fibras reducido el diámetro promedio de la fibra (216 nm vs. 255 nm, alineado vs. aleatorio). La alta velocidad del mandril dibujo las fibras fuera antes de que se hayan secado es probable que cause este efecto. La alineación de las fibras influido en la alineación de las células ASM, y también tiene otros efectos fisiológicos en las células ASM que se han caracterizado en otra parte 21. La principal limitación de este protocolo es la incapacidad de las células vivas imagen sobre / en los andamios que hacen las células apego o la diferenciación inicial durante un periodo de tiempo prolongado imposible determinar sin sacrificar muestras. Esto significa que la mayoría de optimización se produce después de que el período de cultivo, es decir, fijaring muestras y luego medir si el cultivo celular fue exitosa después de no durante el cultivo celular. La observación de un cambio de color en los andamios incubadas en alamarBlue (azul a rosa) indica células están presentes y viable, pero no es lo ideal. Electrospinning polímeros más transparentes tales como gelatina podrían ayudar en la visualización de las células en los andamios. El electrospinning de un andamio de nanofibras dentro de nuestro modelo permitió la replicación del RBM de las vías respiratorias, de manera similar compuesta de nanofibras densos en la que residen las células epiteliales. Previamente se ha demostrado que las células estructurales no puede migrar a través del andamio de nanofibras 22, aunque las células inmunes son capaces de (datos no mostrados). Mientras ventajoso para el cultivo de tipos de células específicas en una superficie 3D (tales como células epiteliales y endoteliales), esta prevención de la migración celular estructural a través de las nanofibras pueden ser perjudiciales para el cultivo de otros tipos celulares. Como el músculo liso no es capaz de migrar a través de THe alineados de nanofibras andamio que monta el tri-capas cocultivo con el músculo liso y capas de fibroblastos uno frente al otro (en oposición a la andamio alineados que separa los dos tipos de células). Mientras que esto permite que las células estén en estrecha aposición, el estudio actual no puede concluir si un tipo de célula (ya sea el fibroblasto o músculo liso) superaría toda la capa durante un período de cultivo más prolongado. A pesar de estas limitaciones, un modelo tri-capa viable de la pared de las vías respiratorias ha sido desarrollado que proporciona una plataforma alternativa para investigar las interacciones entre estos múltiples tipos de células. Un estudio tri-capas similar se ha publicado recientemente, donde los fibroblastos fueron incorporados dentro de un colágeno cilíndrica I hidrogel con músculo liso sembradas en la superficie exterior y células epiteliales dentro de la superficie luminal 17. La estabilidad mecánica de los andamios electrospun desarrollados aquí permitiría tubular similares construye a formar, y sigue siendo un resea actualrch objetivo dentro de nuestro grupo. Mientras que el estudio se ha centrado en la vía aérea, varios órganos dentro del cuerpo de la cuota de esta unidad estructural básica de la mucosa, y por medio de la modificación de los inquilinos de relieve en este estudio, plataformas similares podrían ser desarrollados para tejidos que contienen una unidad de membrana basal, incluyendo los vasos sanguíneos, la vejiga y la córnea, donde se han empleado modelos basados ​​en múltiples capas de colágeno.

El campo de la medicina regenerativa y la ingeniería de tejidos está avanzando rápidamente, con los avances en la tráquea y el riñón regeneración dos logros recientes notables. Los biomateriales desarrollados en la ingeniería de tejidos son cada vez más accesibles, con oportunidades para la transferencia de dichos protocolos a los laboratorios menos especializados. Un campo de cebada para beneficiarse a través de aumentar el uso de biomateriales es el diagnóstico in vitro. Los estudios in vitro son una importante plataforma para investigar vías de señalización intracelulares en tipos de células individuales, y han ayudado a delinear mecanismos subyacentes numerosos fisiopatologías enfermedad. Estos estudios se basan generalmente en un solo tipo de células que se cultiva como una monocapa sobre plástico de cultivo de tejidos (TCP); un (2D) superficie rígida de dos dimensiones mucho menos elástica y porosa que las células (3D) entorno tridimensional están expuestos a dentro de un tejido u órgano. Los modelos animales han sido tradicionalmente correomployed para confirmar los efectos encontrados in vitro también traducir a todo el tejido, y también se puede utilizar como plataformas pre-clínicos para investigar enfermedades humanas. Sin embargo, entre las especies diferencias socavan esta confianza en los modelos animales en nuestra comprensión de las enfermedades humanas -. Por ejemplo, gran comprensión de la enfermedad pulmonar del asma se basa en un modelo de ratón pesar de las diferencias inherentes entre la condición humana y este modelo incluyendo poca evidencia de la infiltración de mastocitos del haz de músculo liso de las vías respiratorias, o la capacidad de desarrollo espontáneo de la enfermedad en el animal modelar 3,4. También hay consideraciones éticas relacionadas con el uso de modelos animales, con la norma &quot;3Rs&quot; de &quot;reemplazo, refinamiento y reducción&quot; en la experimentación animal que está siendo alentado en el Reino Unido y otros países. Una alternativa atractiva sería la recapitulación de los tejidos humanos en la estructura de creación vitros para investigar la naturaleza de cooperación entre los tipos de células humanas adultas en una sola unidad. Existen células en estructuras multicelulares 3D dentro del tejido, cada uno dentro de un micro-entorno único. El cultivo de las células en TCP sólo permite la cultura de monocapas de células, incapaces de replicar este entorno, o proporcionar la capacidad para la cultura de varias celdas. Biomateriales avance ofrece la oportunidad de desarrollar ambas plataformas 3D naturales y sintéticos para el cultivo celular. ECM descelularizado se puede utilizar para el cultivo celular 3D cuando recelularizado con otros tipos de células, incluyendo células madre 1, sin embargo, tales protocolos pueden ser complejo y consume mucho tiempo, con la disponibilidad de tejido limitada y en gran parte de origen no humano. Otros protocolos permiten un mayor control sobre los entornos celulares creados como nanoimpresión, la deposición de ECM, las tecnologías de la hoja de la célula, o electrospinning. Electrohilado crea esteras porosas no tejidas 3D de fibras con diámetros que van desde nanómetros a micrómetros, replicating dimensiones ECM naturales. Andamios electrospun se están empleando cada vez más como plataformas de cultivo de células en 3D -. La manipulación de los parámetros de electrospinning permite el control intrincada sobre características de andamio, tales como tamaño de poro, diámetro de la fibra, la topografía y la alineación, y la química de superficie. Alteraciones de tales parámetros han sido demostrado que afectan directamente la adhesión celular y el crecimiento, cuando las células se cultivaron en el aislamiento. Estas ventajas han sido explotados en el presente estudio para permitir el cultivo de múltiples tipos de células como una sola construcción de tejido 3D, utilizando el bronquiolo de las vías respiratorias como una estructura de tejido 3D modelo. La pared bronquiolo consta de tres regiones principales (Figura 1). La mucosa es donde las células epiteliales de las vías respiratorias se sientan en la interfase aire-líquido (ALI), proporcionando una barrera importante para el medio ambiente externo. Ellos residen en la membrana basal reticular (RBM), una ECM bien compacta compone principalmente de collagen IV, perlecans, y lamininas. La capa de sub-mucosa se encuentra directamente debajo de la mucosa, una región más porosa compuesta de múltiples tipos de células, incluyendo fibroblastos, miofibroblastos y la infiltración de leucocitos en condiciones de enfermedad. Finalmente haces musculares lisas envuelven alrededor de la vía aérea en una forma helicoidal, y se componen de hojas alineadas de músculo liso de las vías respiratorias (ASM). Es estado contráctil relativa del músculo liso que controla el tono de las vías respiratorias. El empleo de andamios electrospun dentro del sistema pulmonar había hasta hace poco ha limitado a fines regenerativos; con una sustitución traqueal electrospun siendo trasplantado con éxito. Mientras éxito, tales tratamientos son limitados en número, y se centran en la tráquea debido a la naturaleza relativamente simple de la función del tejido. Existen ejemplos limitadas de los modelos de la vía aérea se utilizan para diagnóstico in vitro, y se centran principalmente en las mediciones de contracción del músculo liso,. El no tóxico y non-degradable tereftalato de polietileno polímero (PET) ha sido previamente electrospun, y fue empleada en el presente estudio para asegurar andamios producidos podrían ser almacenados por largos períodos sin degradar (lo que les permite ser utilizados &quot;off the shelf&quot;), y también pueden ser adecuados para el cultivo celular estable durante períodos de tiempo prolongados. Los estudios previos de nuestro grupo han demostrado que el empleo de tres variaciones de un protocolo básico de electrospinning, tres andamios electrospun PET individuales pueden ser producidos para proporcionar topografías óptimas para el cultivo de las vías respiratorias epiteliales, fibroblastos y células del músculo liso en el aislamiento 21,22 y el cocultivo de las vías respiratorias células epiteliales y fibroblastos 22. Diámetro de fibra se encontró que afectará en gran medida la funcionalidad del epitelio 22, y la alineación de la fibra permite la generación de hojas alineadas de músculo liso 21. Estos estudios se realizaron de forma independiente el uno del otro en condiciones estáticas. En el presente estudio, estos difereandamios NT, que contienen células humanas adultas completamente diferenciada han sido cocultivadas durante una semana a la ALI en un biorreactor disponible comercialmente como una sección 3D de la pared de las vías respiratorias, proporcionando un fisiológicamente relevantes modelo in vitro para investigar las vías respiratorias respuestas inter-celulares. Mientras que este protocolo está utilizando el bronquiolo de las vías respiratorias como un sistema modelo, podría ser adaptado como una plataforma para el cocultivo 3D de unidades de la mucosa de otros órganos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Polyethylene terephthalate (PET)</td>
			<td>Lucozade (GSK) bottles</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Source of PET for electrospinning. Cut into small pieces and weigh out as necessary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (DCM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solvent for PET</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Solvent for PET</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating Mandrel</td>
			<td>Built in house</td>
			<td></td>
			<td>Used to collect electrospun fibres. By rotating at different speeds, fibres can be aligned or randomly oriented</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td></td>
			<td>used in the electrospinning process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td>Culture medium for CALU3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td>Culture medium for HASM cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td>Culture medium for MRC5 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic/ antimycotic solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital mixer (Orbital shake 503)</td>
			<td>Stuart Scientific</td>
			<td></td>
			<td>For dynamic seeding of cells onto microfibre scaffolds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump&#160;</td>
			<td>Watson Marlow</td>
			<td></td>
			<td>For providing media flow through bioreactor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3DKube</td>
			<td>Kiyatec</td>
			<td></td>
			<td>Bioreactor for 3D cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adapting the electrospinning process to provide three unique environments for a tri-layered in vitro model of the airway wall

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to intrinsic parameters within the process allow a high degree of control over scaffold characteristics including fiber diameter, alignment and porosity. By developing scaffolds with similar dimensions and topographies to organ- or tissue-specific extracellular matrices (ECM), micro-environments representative to those that cells are exposed to in situ can be created. 
The airway bronchiole wall, comprised of three main micro-environments, was selected as a model tissue. Using decellularized airway ECM as a guide, we electrospun the non-degradable polymer, polyethylene terephthalate (PET), by three different protocols to produce three individual electrospun scaffolds optimized for epithelial, fibroblast or smooth muscle cell-culture. Using a commercially available bioreactor system, we stably co-cultured the three cell-types to provide an in vitro model of the airway wall over an extended time period.
This model highlights the potential for such methods being employed in in vitro diagnostic studies investigating important inter-cellular cross-talk mechanisms or assessing novel pharmaceutical targets, by providing a relevant platform to allow the culture of fully differentiated adult cells within 3D, tissue-specific environments.

Imágenes de microscopio electrónico de barrido de los tejidos de las vías respiratorias descelularizado o imágenes inmunohistoquímico de las biopsias de las vías respiratorias identificados características deseables de la ECM vía aérea hemos querido introducir en topografías de andamios electrospun: matriz de RBM nativo consta de fibras de aproximadamente 153 nm ± 30,6 nm (media ± SD n = 50 mediciones ) de diámetro (Figura 3A y 5A), mientras que la matriz que rodea el RBM era más porosa en la naturaleza (Figura 3C). Inmunohistológicos secciones a través de haces musculares lisas muestran ASM presente como hojas alineadas de células 21 (Figura 3E). Esta información fue utilizada para guiar las características introducidas en los andamios electrospun. Un mandril giratorio era capaz de girar de forma estable a altas velocidades (&gt; 2000 rpm / 440 m · min -1) para producir andamios con fibras alineadas. Rotación mandril lenta (60 rpm 13,2 m · min -1) no afectó la orientación de las fibras, Sino que se produce andamios con espesor más uniforme que cuando electrospinning sobre una placa estática. Mediante la alteración de los parámetros de electrospinning (concentración PET y caudal de la solución), fue posible para crear fibras de andamios con diámetros de varios micrómetros o cientos de nanómetros (electrospinning parámetros se indican en la Tabla 1). Electrospun fibras con diámetros de fibra equivalentes a las fibras naturales de GBR (150 nm) se produjo usando una solución de PET 6%, sin embargo a concentraciones tan bajas de PET, el gotear de las fibras se produjeron (Figura 4A). Esta fue eliminado mediante el aumento de la concentración de la solución de PET a 8%, lo que produce nanofibras uniformes que posee un diámetro medio de 255 nm ± 2,4 nm (media ± SEM) y el tamaño medio de poro de 1,43 micras ± 0,02 micras (figuras 4B, 5A y B). Para electrospin nanofibras fue necesario reducir el tamaño de la aguja de 18 G a 23 G, lo que permite velocidades de flujo más lentas whilst mantener una velocidad de flujo superior y reducir la obstrucción de la aguja, un problema recurrente con la aguja más grande. Cuando electrospinning microfibras, un aumento en la solución de PET a&gt; 30% de plomo PET a una falta de uniformidad en fibra de diámetro (Figura 4F), además de múltiples bloqueos en la punta de la aguja debido a la alta viscosidad de la solución. Esteras de microfibra uniformes que poseen un diámetro promedio de fibra de 2,50 m ± 0,02 m (media ± SEM) y el tamaño medio de poro de 10,45 micras ± 0,13 micras fueron producidos cuando electrospinning una solución PET peso / vol 30% a una velocidad de flujo de 2 ml / h -1 (figuras 4F, 5A y B). Electrospinning secuencial del andamiaje de nanofibras directamente sobre un andamio de microfibra (todavía unido al mandril) creó un andamio bifásica (Figura 3D). Los diámetros medios de fibra eran 280 nm ± 20 nm y 2,30 m ± 0,06 m para las fases de nanofibras y microfibras respectivamente,comparable a las dimensiones de nanofibras y microfibras andamios individuales. Además, el espesor de la andamio bifásica fue similar a la suma de las nanofibras y microfibras andamios individuales (Figura 5C). Mediante el aumento de la velocidad de mandril (2000 rpm / 440 m · min -1), se produjeron nano o microfibra andamios altamente alineados. La solución PET peso / volumen 8% no era óptima para la producción de nanofibras alineados y fibras producidas poseen una morfología de onda (Figura 3F). Un aumento de 10% de PET anuló este efecto, pero aún así resultó en un diámetro de fibra reducida (216 nm ± 2,2 nm (media ± SEM)) en comparación con las nanofibras andamios alineadas al azar. Alineación de la fibra se calculó mediante la determinación de la desviación del ángulo de cada fibra de la fibra de ángulo medio. En andamios nanofibras alineados 79% de fibras fueron alineados (± 10 ° de ángulo de fibra media) en comparación con el 10,2% de fibras en alineadas al azar Scaff nanofibrasedad (Figura 5D). El andamiaje de nanofibras 8% se utilizó para recapitular la RBM en el que residen las células epiteliales, y fue utilizado para apoyar el cultivo de células CALU3 (una línea celular epitelial de las vías respiratorias). El peso / vol andamio de microfibra 30%, siendo más poroso en la naturaleza se utiliza para imitar la región sub-mucosa, y se cultivó con células MRC5 (una línea celular de fibroblastos-vías respiratorias). El 10% p / v andamiaje nanofibras alineados proporcionado referenciación topológica para asegurar la alineación de células ASM cuando se cultivan en el cadalso. Todos los tres tipos de células mostraron un aumento en la viabilidad cuando se cultivan en sus andamios individuales durante un período de 2 semanas (Figura 6A), y expresaron las proteínas específicas del tipo de célula después del período de 2 semanas de cultivo (Figura 6B, 6C, y 6D). Además de la caracterización de las interacciones individuales celular andamios han sido reportados en otros lugares 21,. El electrospinning secuencial del andamiaje de nanofibrasen el andamio de microfibra produjo un andamio bifásica para el cocultivo de las células epiteliales CALU3 y células de fibroblastos MRC5 en las fases de nanofibras y microfibras respectivamente. El cultivo de las dos células juntos bajo condiciones estáticas se ha informado en otras partes 22. Más trabajo de intentar agregar otras capas de células o extender los tiempos de cultivo bifásicos más allá de 2 semanas bajo condiciones estáticas no tuvo éxito (datos no mostrados). Para la cultura un modelo de tres capas que durante un período prolongado, se utilizó un biorreactor de flujo de perfusión. El CALU3 y MRC5 células fueron sembradas en el andamio bifásica, y las células ASM sembradas en un andamio alineados, y ambos se cultivaron por separado durante 2 días. Los dos andamios fueron comprados juntos para formar un modelo de tres capas de la pared de las vías respiratorias dentro del biorreactor (Figura 7). Ambas cámaras fueron perfundidos con los medios de comunicación durante 7 días antes de la cámara epitelial apical tenía sus medios de comunicación eliminan, y las células epiteliales se cultivaron en elALI durante 7 días. Los andamios se fijaron y seccionaron y se tiñeron o bien, andamios o enteros se inmunotiñeron para los marcadores específicos de células. Secciones a través de la cultura tri-capa mostraron núcleos de células distribuidas a través de las tres capas de la cocultivo (Figura 8B). Cuando las células se inmunotiñeron para los marcadores específicos de células, las células epiteliales poblaron la fase de nanofibras como una célula apical-capa confluente y se tiñeron positivas para citoqueratina (Figura 8C), en la fase de microfibra, fibroblastos tiñeron positivo para S100A4 (Figura 8D), y en los 10% de células ASM andamio alineados manchadas positivo para SM22α (Figura 8E), lo que indica una buena supervivencia de cada tipo de célula en el modelo 3D de la pared de la vía aérea. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52986/52986fig1.jpg" /> Figura 1. El bronquiolo de las vías respiratorias. Biopsia bronquial de una gravevías respiratorias asmáticas que muestra el epitelio de la membrana basal reticular (RBM), con la región submucosa subyacente poblada con células mesenquimales, y los haces de músculo liso que rodean pobladas con células de músculo liso teñidas para alfa-actina de músculo liso (marrón). La barra de escala indica 200 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52986/52986fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52986/52986fig2.jpg" /> Figura 2. Un diagrama esquemático del equipo de electrospinning. Una jeringa que contiene la solución de polímero / disolvente (con aguja fija) se coloca en una bomba de jeringa frente al mandril. Un potencial eléctrico se establece entre las fibras de la aguja y el mandril causando a ser expulsado de la punta de la aguja y depositado sobre el mandril giratorio. A medida que la fibra pasa a través de la atmósfera,el disolvente se evapora causan la deposición de fibras de polímero en el mandril. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52986/52986fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52986/52986fig3.jpg" /> Figura 3. Comparación de los andamios electrospun a ECM de las vías respiratorias nativo. Imágenes de microscopio electrónico de barrido de la membrana descelularizado sótano (A), de las vías respiratorias descelularizado bronquiolo sección transversal (C) y una sección histológica de un paquete de músculo liso de las vías respiratorias (teñidas con hematoxilina y eosina, escala barra de 40 micras) (E) en comparación con nanofibras (B) bifásica (D) y alineados (F) andamios PET. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52986/52986fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver</a>una versión más grande de esta figura. Tabla 1. Parámetros utilizados para electrospinning la microfibra, nanofibras y alineados andamios de forma individual y para el andamio bifásica. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52986/52986fig4.jpg" /> Figura 4. La alteración de las concentraciones de PET afecta características de la fibra. Imágenes de microscopio electrónico de barrido de andamios electrospun hiladas a partir de 6%, 8%, 10% (AC), 25%, 30% y 35% (EG) (peso / volumen) de soluciones de PET . También se muestran los andamios alineados producen a partir de 8% (D) y el 30% de soluciones de PET (H) en peso / vol. AD fotografiada con una ampliación 5.000x, EH fotografiado con una ampliación 1.000X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52986/52986fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una mayor</a>versión de esta figura. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52986/52986fig5.jpg" /> Figura 5. Propiedades de los andamios de PET. Electrospun curvas (A) de distribución que muestran la distribución de diámetro de la fibra de la membrana basal reticular la matriz extracelular (ECM RBM), andamios nano y micro-fibras alineadas al azar, y el andamiaje de nanofibras alineados. (B) del histograma muestra la distribución de tamaño de poro relativa en nano y micro-fibra de andamios. (C) Espesor medio de las nanofibras, microfibra, andamios bifásicos y alineados (media ± desviación estándar, n = 6). (D) histograma que muestra la desviación de la orientación media de fibra en nanofibras andamios aleatorios o alineados análisis de fibra Andamios se llevó a cabo utilizando el software ImageJ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52986/52986fig5large.jpg" target="_blank">P</a>arrendar clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52986/52986fig6.jpg" /> Figura 6. La cultura de los tipos de células individuales en los andamios individuales. (A) Resultados de ensayo de viabilidad celular alamarBlue para las células ASM en andamios alineados, las células CALU3 en andamios nanofibras y células MRC5 en andamios de microfibra (media ± SEM, n = 3- 20). Imágenes de microscopio electrónico de barrido de la nanofibra, microfibra y andamios fibra alineados (B, C y D, respectivamente) y las imágenes de inmunofluorescencia de células teñidas CALU3 para E-cadherina (rojo), MRC5 células teñidas para vinculina (rojo) y las células ASM manchadas de SM22α (rojo) todo en su andamio especializada (E, F y G respectivamente). Hoechst fue utilizado para teñir los núcleos (azul), barra de escala indica 40 &amp;# 181;. M <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52986/52986fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52986/52986fig7.jpg" /> Figura 7. sistema de perfusión para el modelo de la pared de la vía aérea tri-capa. (A) Fotografía del recipiente biorreactor conectado a la bomba peristáltica y embalses medios 2x. (B) Esquema de los andamios tri-capas. (C) Esquema de los dos circuitos de biorreactor cuando el modelo de la vía aérea se mantiene en la interfase aire-líquido. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52986/52986fig7large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/52986/52986fig8.jpg" /> Figura 8. Completar 3D modelo de la pared de la vía aérea. (A) biopsia bronquial de la pared de la vía aérea con la capa mucosa resaltado en rojo, la región submucosa resaltado en verde, y el haz del músculo liso de relieve en oro. (B) Sección a través de la pared de la vía aérea de tres capas que consiste en andamios bifásicos y alineados pobladas con epiteliales, fibroblastos y células musculares lisas fijos después de 2 semanas cocultivo. Los núcleos celulares se tiñeron con DAPI (azul) con reflectancia andamio (gris) al mismo tiempo fotografiado. Los andamios también se fijaron y immunostained para marcadores específicos de células después de 2 semanas, con células CALU3 teñidas para citoqueratina (verde) (C), MRC5 células teñidas para S100A4 (verde) (D), y las células musculares lisas teñidas para SM22α (rojo) ( E). La barra de escala indica 200 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52986/52986fig8large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Mesa 1.

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Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Advancements in biomaterial technologies enable the development of three-dimensional multi-cell-type constructs. We have developed electrospinning protocols to produce three individual scaffolds to culture the main structural cells of the airway to provide a 3D in vitro model of the airway bronchiole wall.

Adaptación del Proceso Electrohilado para proporcionar tres ambientes únicos para un Tri-capa<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de la pared de la vía aérea

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

12.3K vistas.  University of Nottingham. Advancements in biomaterial technologies enable the development of three-dimensional multi-cell-type constructs. We have developed electrospinning protocols to produce three individual scaffolds to culture the main structural cells of the airway to provide a 3D in vitro model of the airway bronchiole wall. 

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Tri-layered Electrospinning to Mimic Native Arterial Architecture using Polycaprolactone, Elastin, and Collagen: A Preliminary Study

Throughout native artery, collagen and elastin play an important role, providing a mechanical backbone, preventing vessel rupture, and promoting recovery under pulsatile deformations. The goal of this study was to mimic the structure of native artery by fabricating a multi-layered electrospun conduit composed of poly(caprolactone) (PCL) with the addition of elastin and collagen with blends of 45-45-10, 55-35-10, and 65-25-10 PCL-ELAS-COL to demonstrate mechanical properties indicative of native arterial tissue, while remaining conducive to tissue regeneration. Whole grafts and individual layers were analyzed using uniaxial tensile testing, dynamic compliance, suture retention, and burst strength. Compliance results revealed that changes to the middle/medial layer changed overall graft behavior with whole graft compliance values ranging from 0.8 - 2.8 % / 100 mmHg, while uniaxial results demonstrated an average modulus range of 2.0 - 11.8 MPa. Both modulus and compliance data displayed values within the range of native artery. Mathematical modeling was implemented to show how changes in layer stiffness affect the overall circumferential wall stress, and as a design aid to achieve the best mechanical combination of materials. Overall, the results indicated that a graft can be designed to mimic a tri-layered structure by altering layer properties.

The aim of this study was to mimic the native three layered architecture of the arterial wall. To accomplish this, electrospinning was employed with the use of a 3-1 (input-output) nozzle and blends of polycaprolactone, elastin, and collagen.

Tri-capa electrospinning que imita la arquitectura nativa arterial con policaprolactona, elastina, colágeno y: un estudio preliminar

Throughout native artery, collagen and elastin play an important role, providing a mechanical backbone, preventing vessel rupture, and promoting recovery ...

Investigación

Bioingeniería

The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells behave differently when they are grown within a 3D extra-cellular matrix and also interact with other cells (1-5). Mouse models have been broadly utilized to study tissue morphogenesis in vivo. However mouse and human skin have significant differences in cellular architecture and physiology, which makes it difficult to extrapolate mouse studies to humans. Since melanocytes in mouse skin are mostly localized in hair follicles, they have distinct biological properties from those of humans, which locate primarily at the basal layer of the epidermis. The recent development of 3D human skin reconstruct models has enabled the field to investigate cell-matrix and cell-cell interactions between different cell types. The reconstructs consist of a "dermis" with fibroblasts embedded in a collagen I matrix, an "epidermis", which is comprised of stratified, differentiated keratinocytes and a functional basement membrane, which separates epidermis from dermis. Collagen provides scaffolding, nutrient delivery, and potential for cell-to-cell interaction. The 3D skin models incorporating melanocytic cells recapitulate natural features of melanocyte homeostasis and melanoma progression in human skin. As in vivo, melanocytes in reconstructed skin are localized at the basement membrane interspersed with basal layer keratinocytes. Melanoma cells exhibit the same characteristics reflecting the original tumor stage (RGP, VGP and metastatic melanoma cells) in vivo. Recently, dermal stem cells have been identified in the human dermis (6). These multi-potent stem cells can migrate to the epidermis and differentiate to melanocytes.

In this report, we describe the three-dimensional skin reconstruct model which mimics human skin in architecture and composition. Melanocyte physiology, melanoma progression and the fate of dermal stem cells have been investigated using the skin reconstruct model. The model is also useful as a preclinical tool for drug assessment.

La piel humana tridimensional Reconstrucción del modelo: una herramienta para estudiar la piel normal y la progresión del melanoma

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

A Toolkit to Enable Hydrocarbon Conversion in Aqueous Environments

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The toolkit consists of multiple standard interchangeable parts (BioBricks)9 addressing the conversion of alkanes, regulation of gene expression and survival in toxic hydrocarbon-rich environments.
A three-step pathway for alkane degradation was implemented in E. coli to enable the conversion of medium- and long-chain alkanes to their respective alkanols, alkanals and ultimately alkanoic-acids. The latter were metabolized via the native &beta;-oxidation pathway. To facilitate the oxidation of medium-chain alkanes (C5-C13) and cycloalkanes (C5-C8), four genes (alkB2, rubA3, rubA4and rubB) of the alkane hydroxylase system from Gordonia sp. TF68,21 were transformed into E. coli. For the conversion of long-chain alkanes (C15-C36), theladA gene from Geobacillus thermodenitrificans was implemented. For the required further steps of the degradation process, ADH and ALDH (originating from G. thermodenitrificans) were introduced10,11. The activity was measured by resting cell assays. For each oxidative step, enzyme activity was observed.
To optimize the process efficiency, the expression was only induced under low glucose conditions: a substrate-regulated promoter, pCaiF, was used. pCaiF is present in E. coli K12 and regulates the expression of the genes involved in the degradation of non-glucose carbon sources.
The last part of the toolkit - targeting survival - was implemented using solvent tolerance genes, PhPFD&alpha; and &beta;, both from Pyrococcus horikoshii OT3. Organic solvents can induce cell stress and decreased survivability by negatively affecting protein folding. As chaperones, PhPFD&alpha; and &beta; improve the protein folding process e.g. under the presence of alkanes. The expression of these genes led to an improved hydrocarbon tolerance shown by an increased growth rate (up to 50%) in the presences of 10% n-hexane in the culture medium were observed.
Summarizing, the results indicate that the toolkit enables E. coli to convert and tolerate hydrocarbons in aqueous environments. As such, it represents an initial step towards a sustainable solution for oil-remediation using a synthetic biology approach.

A sustainable auto regulating bacterial system for the remediation of oil pollutions was designed using standard interchangeable DNA parts (BioBricks). An engineered E. coli strain was used to degrade alkanes via &beta;-oxidation in toxic aqueous environments. The respective enzymes from different species showed alkane degradation activity. Additionally, an increased tolerance to n-hexane was achieved by introducing genes from alkane-tolerant bacteria.

Un juego de herramientas para la conversión de hidrocarburos en ambientes acuosos

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The ...

Investigating the Three-dimensional Flow Separation Induced by a Model Vocal Fold Polyp

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. Polyps and nodules, which are geometric abnormalities that form on the medial surface of the vocal folds, can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Our laboratory has reported particle image velocimetry (PIV) measurements, within an investigation of a model polyp located on the medial surface of an in&#160;vitro driven vocal fold model, which show that such a geometric abnormality considerably disrupts the glottal jet behavior. This flow field adjustment is a likely reason for the severe degradation of the vocal quality in patients with polyps. A more complete understanding of the formation and propagation of vortical structures from a geometric protuberance, such as a vocal fold polyp, and the resulting influence on the aerodynamic loadings that drive the vocal fold dynamics, is necessary for advancing the treatment of this pathological condition. The present investigation concerns the three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted prolate hemispheroid with a 2:1 aspect ratio in cross flow, i.e. a model vocal fold polyp, using an oil-film visualization technique. Unsteady, three-dimensional flow separation and its impact of the wall pressure loading are examined using skin friction line visualization and wall pressure measurements.

Vocal fold polyps can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted model polyp and its impact on the wall pressure loading are examined using particle image velocimetry, skin friction line visualization, and wall pressure measurements.

Investigación De La Separación De Flujo Tridimensional Inducida Por Un Pólipo Modelo De Pliegue Vocal

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. ...

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to model well differentiated human airway epithelium and heart muscle cells. This could be an invaluable tool to study the deleterious effects of toxic inhaled chemicals, such as chlorine, that can normally interact with the cell surfaces, and form various byproducts upon reacting with water, and limiting their effects in submerged cultures. Our model using well differentiated human airway epithelial cell cultures at air-liqiuid interface circumvents this limitation as well as provides an opportunity to evaluate critical mechanisms of toxicity of potential poisonous inhaled chemicals. We describe enhanced loss of membrane integrity, caspase release and death upon toxic inhaled chemical such as chlorine exposure. In this article, we propose methods to model chlorine exposure in mammalian heart and airway epithelial cells in culture and simple tests to evaluate its effect on these cell types.

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

This protocol is designed to demonstrate exposure method of cell cultures to inhaled toxic chemicals. Exposure of differentiated air-liquid&#160;interface (ALI) cultures of airway epithelial cells provides a unique model of airway exposure to toxic gases such as chlorine. In this manuscript we describe effect of chlorine exposure on air-liquid&#160;interface cultures of epithelial cells and submerged culture of cardiomyocytes. In vitro exposure systems allow important mechanistic studies to evaluate pathways that could then be utilized to develop novel therapeutic agents.

In vitro modelo de cultivo celular para Toxic inhalado Prueba química

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

Generación de una tridimensional grosor de la piel completa y automatizada Equivalente Heridas

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Irritación de los ojos de prueba (IET) para la identificación del peligro de los ojos: Irrita los productos químicos que utilizan Reconstruido humana Córnea-como epitelial (RHCE) Modelo de Tejidos

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). In fact, it is widely recognized that cells grown in flasks or dishes tend to de-differentiate and lose specialized features of the tissues from which they were derived. Currently, there are mainly two types of 3-D culture systems where the cells are seeded into scaffolds mimicking the native extracellular matrix (ECM): (a) static models and (b) models using bioreactors. The first breakthrough was the static 3-D models. 3-D models using bioreactors such as the rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors are a more recent development. The original concept of the RWV bioreactors was developed at NASA&#39;s Johnson Space Center in the early 1990s and is believed to overcome the limitations of static models such as the development of hypoxic, necrotic cores. The RWV bioreactors might circumvent this problem by providing fluid dynamics that allow the efficient diffusion of nutrients and oxygen. These bioreactors consist of a rotator base that serves to support and rotate two different formats of culture vessels that differ by their aeration source type: (1) Slow Turning Lateral Vessels (STLVs) with a co-axial oxygenator in the center, or (2) High Aspect Ratio Vessels (HARVs) with oxygenation via a flat, silicone rubber gas transfer membrane. These vessels allow efficient gas transfer while avoiding bubble formation and consequent turbulence. These conditions result in laminar flow and minimal shear force that models reduced gravity (microgravity) inside the culture vessel. Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa composed of an intestinal epithelial cell line and primary human lymphocytes, endothelial cells and fibroblasts cultured under microgravity provided by the RWV bioreactor.

Cells growing in a three-dimensional (3-D) environment represent a marked improvement over cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa cultured under microgravity provided by rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors.

Desarrollo de un Modelo Organotípicos multicelular tridimensional de la mucosa intestinal humanas cultivadas en condiciones de microgravedad

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Órgano Cultura Modelo Murino del disco intervertebral

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.