Damos las gracias al Fondo del Instituto Wistar Animal, Servicio de Microscopía, el Fondo para Histotechnology y el Centro de Investigación de suministro. Este estudio fue financiado en parte por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud de CA 076674, 098101 CA, CA y CA 10815 025874.

1. La piel humana tridimensional Reconstrucción del modelo: <ol><li> Preparación de la capa acelular: Mezclar los siguientes reactivos en un tubo de 50 ml en hielo: 0,59 ml de EMEM 10 veces, 50 l 200 mM L-glutamina, 0,6 mL de SFB, 120 l de bicarbonato de sodio al 7,5% y 4,6 ml de colágeno bovino I. Añadir 1 ml de la mezcla en cada inserción de las bandejas de cultivo de tejidos. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente y permitir que el gel se seque. Color de la mezcla debe ser de color amarillo pajizo al color de rosa. </li><li> Trypsinize fibroblastos humanos de los frascos de cultivo con el 0,25% de tripsina / EDTA, añadir DMEM con 10% de SFB para neutralizar. Recoger las células por centrifugación y se resuspenden 0,45 x 10 6 células en 1,5 ml de DMEM con FBS al 10%. De las células madre dérmicas, recoger 6.600 esferas dérmica (cuando las células madre dérmicas crecer en medio de células madre, que forman las esferas de una manera similar a neuroesferas) tocando frasco para separar las esferas, la centrifugación. </li><li> Preparación de la capa celular: Mezclar los siguientes en un tubo de 50 ml en hielo: 1,65 ml de 10X EMEM, 150 l 200 mM L-glutamina, 1,85 ml de SFB, 350 l de bicarbonato de sodio al 7,5%, 14 ml de colágeno I bovino y 1,5 ml de suspensión de fibroblastos desde el paso 2 (otra alternativa es utilizar una combinación de 0,45 x 10 6 fibroblastos dérmicos y 6600 las esferas en 1,5 ml de la piel reconstruir medio que para las células madre dérmicas reconstruye), mezclar bien. Añadir 3 ml de la mezcla a cada capa acelular recubierto de inserción. Incubar durante 45 min a 37 ° C en un 5% de CO 2 incubadora de cultivo de tejidos. Color de la mezcla debe ser de color amarillo pajizo con rosa. Después de que el gel se solidifica, añadir DMEM conteniendo FBS al 10% (2 ml en el interior y 10 exterior ml de insertar en cada pocillo de la piel reconstruir las bandejas). Incubar durante 4 días y asegurarse de que los contratos de gel. </li><li> Aspirar medio de dentro y fuera de cada inserción. Añadir lavado medio (HBSS con el 1% de SFB dializados) 2 ml en el interior y 10 ml en el exterior de inserción con el fin de lavar el suero normal. Incubar durante 1 hora a 37 ° C. </li><li> Preparación de la piel reconstruir medio: <ol><li> Por normal de las células madre de melanocitos dérmicos y reconstruye: Para medio básico (500 ml), mezclar los reactivos siguientes: 490 ml de queratinocitos medio libre de suero, 1,8 ml de extracto hipofisario bovino, 10 ml de suero fetal bovino dializado, 500 l de 10 mg / mL SCF, 562,5 l de 4 mg / mL bFGF y 500 l de 264 mg / mL ET-3. Medio I: Añadir 10 l de medio FEAG ml 100 mg / ml y 100 básica. Medio II: Añadir 2 FEAG l de 100 ml de medio básico. Medio III: Añadir 720 l de CaCl 2 1 M de 300 ml de medio básico. </li><li> Para la piel melanoma reconstruir: Para hacer media I (100 ml), mezclar los reactivos siguientes: 72,5 ml de DMEM, 24 ml de F12 (HAM), 2 ml de L-glutamina de 200 mm, 200 hidrocortisona l de 269 g / ml, 200 ITES l de 500X, 200 l O-phosphorylethanolamine de 0,05 M, 200 l de adenina de 90 mm, 200 l de progesterona 2 nM, 240 l de CaCl2 1 M, 200 triyodotironina l de 10 nm y 100 l de suero chelexed ternero recién nacido (disolver 3 g de Chelex 100 en 100 ml de suero, revolver 1,5 horas a 4 ° C, filtro de esterilización). Para hacer media II (100 ml), mezclar los reactivos siguientes: 72,5 ml de DMEM, 24 ml de F12 (HAM), 2 ml de L-glutamina de 200 mm, 200 hidrocortisona l de 269 g / ml, 200 ITES l de 500X, 200 l O-phosphorylethanolamine de 0,05 M, 200 l de adenina de 90 mm, 200 l de progesterona 2 nM, 240 l CaCl2 de 1 M, 200 triyodotironina l de 10 nm y 100 ul suero ternero recién nacido. Para hacer media III (300 ml), mezclar los reactivos siguientes: 142,5 ml de DMEM, 142,5 ml de F12 (HAM), 6 mL de L-glutamina de 200 mm, 600 hidrocortisona l de 269 g / ml, 600 ITES l de 500X , 600 l O-phosphorylethanolamine de 0,05 M, 600 l de adenina de 90 mm, 600 l de progesterona 2 nM, 720 l de CaCl2 1 M, 600 triyodotironina l de 10 nM y 6 ml de suero ternero recién nacido. </li></ol></li><li> Trypsinize queratinocitos humanos de los frascos de cultivo con 0,05% de tripsina / EDTA, neutralizar la tripsina de soja con inhibidor de tripsina (250 mg / L en 1x tampón fosfato salino), la desaceleración resuspender un sedimento celular de 4,17 x 10 6 células / ml en la piel de la reconstrucción a medio I. </li><li> Trypsinize melanocitos o células de melanoma de frascos de cultivo con 0,05% de tripsina / EDTA, neutralizar la tripsina de soja con inhibidor de la tripsina, la desaceleración resuspender un sedimento celular en 0.83 x 10 6 células / ml en la piel de la reconstrucción de mediano I. </li><li> Retirar la ropa medio de dentro y fuera de cada inserción. </li><li> Añadir la piel reconstruir medio I (1,5 ml para el interior y 10 ml en el exterior de cada inserción). </li><li> Tomar 600 l de suspensión celular de los queratinocitos y 600 l de suspensión de células melanocitos o células de melanoma, mezclar bien. Prescindir de 200 l gota mezclada suspensión de células por la caída en el interior de cada inserción. De las células madre dérmicas reconstruir, utilice 100 l de suspensión de queratinocitos solamente. Incubar durante 2 días a 37 º C. </li><li> Aspirar reconstruir la piel medio quetanto desde el interior y el exterior de cada inserción. Añadir la piel reconstruir medio II (2 ml para el interior y 10 ml en el exterior). Incubar durante 2 días a 37 º C. </li><li> Aspirar reconstruir la piel de mediano II desde el interior y el exterior de cada inserción, agregar 7,5 ml reconstruir la piel de mediano III sólo el exterior. Desde este punto, la superficie de la reconstruye empieza a ser expuesto al aire. Cambio de medio III en días alternos hasta el día 18. </li><li> La piel de la cosecha reconstruir el día 18: <ol><li> Aspirar los medios de comunicación desde el interior y el exterior de las inserciones. </li><li> Retire de la bandeja de inserciones con las pinzas. </li><li> Cortar la reconstrucción (incluyendo el filtro de policarbonato), trazando un círculo cerca del borde con una hoja de bisturí. </li><li> Cortar la reconstrucción y el filtro en la mitad sobre una superficie dura. </li></ol></li><li> Para las secciones de parafina: el lugar de la mitad de la reconstrucción en un cassette histología entre dos papeles de negro TBS biopsia y disfrutar de la cinta entera en formol al 10% por más de 4 horas. A continuación, coloque el cassette en el 70% de etanol y almacenar a 4 ° C hasta que esté listo para procesar la reconstrucción de inclusión en parafina. </li><li> Para las secciones de congelados: <ol><li> Coloque la otra mitad de reconstruir en el 50% de sacarosa a 4 ° C durante 1-2 horas, a continuación, cambiar la sacarosa 2M y lo almacenan a 4 ° C durante 1-2 horas. </li><li> Prescindir de los medios de comunicación de corte óptima temperatura de congelación (OCT) en un molde de base disponible para que ocupe el 50% de la embarcación. Evitar las burbujas en la OCT. </li><li> Agarra el borde de la reconstrucción con una pinza y retire la reconstrucción de la sacarosa. Colócalo en Kimwipes hasta el Kimwipes absorber la sacarosa. </li><li> La transferencia de la reconstrucción en la base del molde en la parte superior de la OCT, el uso de fórceps y una espátula. Cubra la parte superior de la reconstrucción de octubre con más hasta que la base del molde está completamente llena. Asegúrese de que usted no tiene todas las burbujas de octubre en el que se hará el corte difícil. </li><li> Coloque la base del molde de manera uniforme sobre el hielo seco triturado, y permitir que el octubre de congelar por completo. </li><li> Envuelva la base del molde en papel de aluminio y lo almacenan a -70 ° C hasta que esté listo para cortar con un criostato. </li></ol></li><li> Injerto de piel en la reconstrucción de un ratón: <ol><li> Preparar un tubo Falcon de 50 ml con 5 ml de DMEM (para congelar y descongelar la piel del ratón). </li><li> Use una hembra de ratón SCID outbred pelo alrededor de 6 semanas. </li><li> El ratón es anestesiados con (sistema de anestesia EZ) isoflurano: la anestesia inicial se realiza en la cámara de inducción con isoflurano 4% (antes de que el ratón se mueve en el lecho quirúrgico) y mantener la anestesia a través de un respiradero del cono de nariz durante el procedimiento (isoflurano: 1,5-2% ). El calor ayuda de un cojín calentado para prevenir la hipotermia y el lubricante oftálmica estéril aplicada para evitar lesiones oculares durante la anestesia. </li><li> Ponga 600 ml de agua en un vaso y dejar en la parte superior de un plato caliente para mantener la temperatura del agua entre 40 - 60 ° C. </li><li> Limpie la piel del ratón con la tintura de benjuí compuesta e hisopos con alcohol de preparación. </li><li> Marcar una línea en la parte superior de la espalda del ratón para mantener la misma posición de sutura después. </li><li> Corte un lecho de la herida alrededor de 1,2 cm de diámetro en la parte posterior superior del ratón usando tijeras y pinzas de Iris. Cubra la herida con gasas estériles. Poner la piel de ratón ronda en 5 ml de DMEM, luego dejar en el contenedor de nitrógeno líquido hasta que totalmente congelados. Descongelar el tubo en agua caliente en la parte superior de una placa caliente hasta que estén completamente descongeladas. Repetir 3 veces. </li><li> Separe la piel de reconstruir a partir de la Transwell con hoja de bisturí y quitar la membrana con mucho cuidado, la transferencia de la piel reconstruir (lado epidermis hacia arriba) en la parte superior del lecho de la herida. </li><li> Lugar de la piel del ratón (lado epidermis hacia arriba) en la parte superior de la piel reconstruir. </li><li> Hacer la primera sutura en el marcador antes marcados, el segundo en la parte inferior, a continuación, dos puntos de sutura más en los lados para fijar la piel de ratón. </li><li> Limpie la piel del ratón después del injerto. Quitar ojiva y mantener ratón en el teclado se calienta hasta que despierto y ambulatoria. </li><li> Poner el ratón en una jaula nueva. </li><li> Analgesia post-operatorio: Meloxicam (1 mg / kg) por vía subcutánea inmediatamente después de la cirugía, 24 y 48 horas después de la cirugía. </li></ol></li></ol> 2. Los resultados representativos: Reconstruye la piel con melanocitos normales y células dérmicas madre La piel se reconstruye se cultivan en un especial de 6 y bandeja con insertos. El compartimiento de la dermis se cultivaron en DMEM con FBS al 10% para los primeros cuatro días (Fig. 1A). La piel reconstruir medio que se utiliza cuando los queratinocitos se siembran con los melanocitos o células de melanoma (Fig. 1B). La epidermis es expuesto al aire en el día 9 y esto permite que los queratinocitos de diferenciar (Fig. 1C). En el día 18, la epidermis de la piel reconstruye está compuesto por capas estratificadas de queratinocitos. La capa basal indiferenciada y capas secuencialmente diferenciados se orientan verticalmente (Fig. 1D). Manchación de la sección reconstruye con la melanocíticos S100 marcador muestra que los melanocitos se alinean en la capa basal de la epidermis y se comunican con los queratinocitos a través de múltiples extensiones dendríticas (Fig. 1E). El compartimiento de la dermis contiene fibroblastos embebidos en una matriz de colágeno tipo I. Depositado colágeno IV indica la membrana basal, que separa la epidermis de la dermis (Fig. 1F). Cuando las células madre dérmicas (marcado con GFP lentiviral vector) se encajan con los fibroblastos en una matriz de colágeno I, emigran a la epidermis y se diferencian en melanocitos (1), (Fig. 2). Las múltiples capas de queratinocitos de la epidermis se desarrollan. Reconstruye la piel de los tumores de melanoma Los estudios clínico-patológicos indican que los melanomas progreso en una forma gradual: los nevos adquiridos comunes, nevos displásicos, RGP (fase de crecimiento radial) melanomas, VGP (fase de crecimiento vertical) y melanomas metastásicos melanomas (7). Las diferentes etapas de líneas celulares de melanoma son morfológicamente similares entre sí en 2-D de cultivo (Fig. 3A-D), pero cuando se incorporan en la piel reconstruye, el comportamiento de las células refleja sus características en vivo. La ubicación y la tasa de crecimiento de melanocitos normales son estrictamente controlados en la piel reconstruye (Fig. 3E). RGP principal melanomas WM35 proliferan sobre todo en la epidermis (Fig. 3F), mientras que los melanomas VGP WM793 crecer invasiva en la dermis (Fig. 3G). Metastásico melanomas 1205Lu agresiva invadir profundamente en la dermis (Fig. 3H). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/2937/2937fig1.jpg" /> Figura 1. Reconstruye la piel con melanocitos normales. El aspecto macroscópico de la piel reconstruye se muestra en la AC. Los fibroblastos A. mezclado con colágeno son cultivadas en DMEM con 10% de SFB y compartimiento de la forma cutánea. B. Los queratinocitos y los melanocitos se siembran en la parte superior de la dermis y crecer en la piel reconstruir medio. C. La epidermis es expuesto al aire en el día 9. D. H &amp; E manchadas de la piel se presenta la reconstrucción de la epidermis compuesta vertical, orientada a la capa basal, y de forma secuencial las capas de células diferenciadas estratificado. La dermis contiene fibroblastos embebidos en una matriz de colágeno tipo I. E. S100-positivo melanocitos (flechas en negro) se alinean en la membrana basal y se comunican con múltiples queratinocitos. F. El colágeno IV-tinción indica la membrana basal, que separa la epidermis de la dermis. Todos los marcajes en el DF se realizaron en fijado en formol e incluidos en parafina secciones. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/2937/2937fig2.jpg" /> Figura 2. Células de la dermis de la piel del tallo reconstruye migrar a la epidermis y se diferencian en melanocitos. En el día 5 después de la siembra de los queratinocitos, las células individuales GFP-positivo (verde) de iniciar la migración hacia fuera de las esferas. La epidermis está todavía compuesta de una sola capa. A los 8 días, unas pocas células llegar a la interfaz de la epidermis-dermis. El día 10, las buenas prácticas agrarias de células positivas están estrechamente alineadas en la posición de la membrana basal. La GFP-positivas las células migran en el marcador epidermis expresar melanocíticos HMB45 (rojo, como indican las flechas blancas). Los núcleos se tiñeron con DAPI (azul). La epidermis se desarrolla en forma de capas múltiples. La membrana basal está indicada con líneas blancas punteadas. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/2937/2937fig3.jpg" /> Figura 3. Reconstruye la piel de las diferentes etapas de los melanomas: AD. Melanocitos normales y células de melanoma en cultivos 2D. A. Los melanocitos del prepucio. B. RGP WM35 células. C. VGP WM793 células. D. las células del melanoma metastásico 1205Lu. E. melanocitos normales se encuentran en la membrana basal. F. RGP melanoma WM35 las células crecen en grupos de células en la epidermis. G. VGP melanoma WM793 células invaden la dermis a través de la membrana basal. H. melanoma metastásico 1205Lu agresiva células invaden profundamente en la dermis. Solución de problemas <table border="1"><tbody><tr><td> Problema </td><td> Solución de problemas </td></tr><tr><td> Mezcla de colágeno no se solidifica </td><td> Color colágeno mezcla debe ser de color amarillo pajizo con rosa, de lo contrario el pH es malo y el colágeno no gel. Si el color es amarillo brillante, más bicarbonato de sodio se debe agregar gota a gota. </td></tr><tr><td> Colágeno antes de tiempo se precipita en la mixuture </td><td> Mantenga todos los componentes en el hielo hasta que la mezcla de colágeno se coloca en la inserción </td></tr><tr><td> Colágeno contratados ni siquiera es (un lado es más grueso que el otro lado) </td><td> Calibrar la plataforma de la incubadora </td></tr><tr><td> La epidermis está formada por al menos tres capas de queratinocitos. </td><td> Use los queratinocitos no diferenciados a menor pasajes </td></tr></tbody></table>

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	<li>Sun, T., Jackson, S., Haycock, J. W., MacNeil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+skin+cells+in+3D+rather+than+2D+improves+their+ability+to+survive+exposure+to+cytotoxic+agents.">Culture of skin cells in 3D rather than 2D improves their ability to survive exposure to cytotoxic agents.</a> J Biotechnol. 122, 372-381 (2006).</li><li>Smalley, K. S., Lioni, M., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+isn't+flat:+taking+cancer+biology+to+the+next+dimension.">Life isn't flat: taking cancer biology to the next dimension.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 42, 242-247 (2006).</li><li>Sun, T., Norton, D., McKean, R. J., Haycock, J. W., Ryan, A. J., MacNeil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+3D+cell+culture+system+for+investigating+cell+interactions+with+electrospun+fibers.">Development of a 3D cell culture system for investigating cell interactions with electrospun fibers.</a> Biotechnol Bioeng. 97, 1318-1328 (2007).</li><li>Kremer, M., Lang, E., Berger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypical+engineering+of+differentiated+composite-skin+equivalents+of+human+keratinocytes+in+a+collagen-GAG+matrix+(INTEGRA+Artificial+Skin)+in+a+perfusion+culture+system.">Organotypical engineering of differentiated composite-skin equivalents of human keratinocytes in a collagen-GAG matrix (INTEGRA Artificial Skin) in a perfusion culture system.</a> Langenbecks Arch Surg. 386, 357-363 (2001).</li><li>Esc&#225;mez, M. J., Garc&#237;, M., Larcher, F., Meana, A., Mu&#241;oz, E., Jorcano, J. L., Del R&#237;o, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+model+of+wound+healing+in+genetically+modified+skin-humanized+mice.">An in vivo model of wound healing in genetically modified skin-humanized mice.</a> J Invest Dermatol. 123, 1182-1191 (2004).</li><li>Li, L., Fukunaga-Kalabis, M., Yu, H., Xu, X., Kong, J., Lee, J. T., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+dermal+stem+cells+differentiate+into+functional+epidermal+melanocytes.">Human dermal stem cells differentiate into functional epidermal melanocytes.</a> J Cell Sci. 123, 853-860 (2010).</li><li>Meier, F., Nesbit, M., Hsu, M. Y., Martin, B., Van Belle, P., Elder, D. E., Schaumburg-Lever, G., Garbe, C., Walz, T. M., Donatien, P., Crombleholme, T. M., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+melanoma+progression+in+skin+reconstructs:+biological+significance+of+bFGF.">Human melanoma progression in skin reconstructs: biological significance of bFGF.</a> Am J Pathol. 156, 193-200 (2000).</li><li>Yu, H., McDaid, R., Lee, J., Li, L., Kumar, S. M., Elder, D. E., Van Belle, P., Gimotty, P., Guerra, M., Hammond, R., Nathanson, K. L., Dalla Palma, M., Herlyn, M., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+BRAF+mutation+and+p53+inactivation+during+transformation+of+a+subpopulation+of+primary+human+melanocytes.">The role of BRAF mutation and p53 inactivation during transformation of a subpopulation of primary human melanocytes.</a> Am J Pathol. 174, 2367-2377 (2009).</li><li>Lee, J. T., Li, L., Brafford, P. A., van den Eijnden, M., Halloran, M. B., Sproesser, K., Haass, N. K., Smalley, K. S., Tsai, J., Bollag, G., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PLX4032,+a+potent+inhibitor+of+the+B-Raf+V600E+oncogene,+selectively+inhibits+V600E-positive+melanomas.">PLX4032, a potent inhibitor of the B-Raf V600E oncogene, selectively inhibits V600E-positive melanomas.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 23, 820-827 (2010).</li><li>Tsai, J., Lee, J. T., Wang, W., Zhang, J., Cho, H., Mamo, S., Bremer, R., Gillette, S., Kong, J., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+selective+inhibitor+of+oncogenic+B-Raf+kinase+with+potent+antimelanoma+activity.">Discovery of a selective inhibitor of oncogenic B-Raf kinase with potent antimelanoma activity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 3041-3046 (2008).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Hemos descrito la generación de la piel 3D reconstruye con melanocitos humanos normales, células de la piel del tallo y las células del melanoma. Cuando se cultiva en un cultivo monocapa, las células pigmentadas presentan una morfología similar (aplanado, eje o más dendríticas en forma), independientemente de su origen de la etapa clínica. En contraste, la piel 3D reconstruye recapitular etapa específica de las propiedades de las células del melanoma. Normal de melanocitos humanos residen en la membrana basal entre la epidermis y la dermis como células individuales. Las células de melanoma primario RGP crecer como pequeños grupos a lo largo de la membrana basal mientras que las células VGP más agresivo melanoma creciendo a medida que grandes grupos romper a través de la membrana basal en la dermis. Las células de melanoma metastásico crecer en todas direcciones e invadir profundamente en la dermis como células individuales o grupos. El análisis cuantitativo se puede realizar en este modelo, midiendo la profundidad de la invasión y el grado de proliferación. Además de la caracterización de las células melanocitos normales y malignos, utilizando el modelo que directamente puede inducir la diferenciación de las células madre dérmicas en los melanocitos madurado, que el hogar de la capa basal de la epidermis y establecer una comunicación de buena fe con los queratinocitos a través de la regulación positiva de la E-cadherina ( 6). Usando vectores virales, que son capaces de activar o desactivar la función del gen para una mejor comprensión de la dinámica y la importancia funcional de los genes expresados ​​por cada tipo de células en la piel reconstruye, que promete ser un modelo eficiente para estudiar no sólo los mecanismos de transformación de los melanocitos , sino también la progresión del melanoma (8). Observación a largo plazo de fenotipos de células ha sido posible a través de injertos de piel reconstruye a animales inmunodeficientes. Como un ser humano de la piel del ratón quimera es una excelente herramienta de investigación para estudiar melanomagenesis y metástasis de melanoma. Reconstruye la piel también puede ser una plataforma útil para la evaluación de medicamentos. Muchos medicamentos que erradicar células de cáncer en condiciones de cultivo 2D a menudo tienen poco efecto en solicitudes experimentales como clínicos. Como se observa en el tumor en vivo, las células del melanoma en cultivos de 3D ​​a menudo son resistentes a los fármacos que las células en cultivos de responder a las 2D, lo que sugiere que el microambiente modula las vías de señalización en el melanoma. Para el descubrimiento de fármacos con éxito, la piel 3D reconstruir el modelo es una herramienta ideal preclínicos para predecir los efectos de los compuestos in vivo (9,10). En resumen, la piel reconstruir modelos de cerrar la brecha entre in vitro e in vivo. Que conducirá a una mejor comprensión de cuáles son los genes involucrados en la transformación y cómo las células madre contribuyen a esa transformación.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> EMEM 10x </td><td> Bio Whittaker </td><td> 12-684F </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Gibco </td><td> 25030-081 </td></tr><tr><td> De suero fetal bovino </td><td> Hyclone </td><td> SH-30071.02 </td></tr><tr><td> Tendón bovino extraídas con ácido colágeno </td><td> Organogénesis </td><td> 200/50 </td></tr><tr><td> Cultivo de tejidos de 6 pocillos bandejas con anillos </td><td> Organogénesis </td><td> 9285 </td></tr><tr><td> Queratinocitos medio libre de suero </td><td> Gibco </td><td> 17005042 </td></tr><tr><td> Suero de ternera fetal dializado </td><td> Hyclone </td><td> SH-30079.03 </td></tr><tr><td> recombinante madre humanas factor de células </td><td> Fitzgerald Industrias </td><td> RDI-307-255X </td></tr><tr><td> FGF básico </td><td> Fitzgerald Industrias </td><td> 30R-AF015 </td></tr><tr><td> La endotelina-3, humanos </td><td> Estadounidense péptido Co. </td><td> 88-5-10 </td></tr><tr><td> Cloruro de calcio </td><td> Sigma </td><td> C-7902 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> JRH Biosciences </td><td> 56430-10L </td></tr><tr><td> F12 (HAM) </td><td> Gibco </td><td> 11765-54 </td></tr><tr><td> Hidrocortisona </td><td> Sigma </td><td> H-0888 </td></tr><tr><td> La insulina, transferrina, etanolamina, selenio (ITES) </td><td> BioWhittaker </td><td> 17839Z </td></tr><tr><td> O-Phosphorylethanolamine </td><td> Sigma </td><td> P0503 </td></tr><tr><td> Adenina </td><td> Sigma </td><td> A9795 </td></tr><tr><td> Progesterona </td><td> Sigma </td><td> P-8783 </td></tr><tr><td> Triyodotironina </td><td> Sigma </td><td> T-5516 </td></tr><tr><td> De suero de ternero recién nacido </td><td> Hyclone </td><td> SH3011802 </td></tr><tr><td> 10% de tampón de formol </td><td> Surgipath </td><td> 00600 </td></tr><tr><td> Los medios de comunicación de corte óptimo de temperatura de congelación (OCT) </td><td> Sakura </td><td> 4583 </td></tr><tr><td> Cintas de múltiples </td><td> Surgipath </td><td> 02293-BX </td></tr><tr><td> TBS biopsia papeles </td><td> Triángulo de Ciencias Biomédicas </td><td> BP-B </td></tr><tr><td> TBS biopsia papeles </td><td> Triángulo de Ciencias Biomédicas </td><td> BP-B </td></tr><tr><td> Moldes desechables Base </td><td> Pescador </td><td> 15 a 182-501C </td></tr><tr><td> Compuesto de tintura de benjuí </td><td> Desechables profesional, Inc, </td><td> S42450 </td></tr><tr><td> El alcohol de preparación hisopos </td><td> CVS Pharmacy </td><td></td></tr><tr><td> De seda trenzada 5-0 Negro </td><td> Ethicon </td><td> 682G </td></tr><tr><td> Esponjas de gasa (estéril) </td><td> CVS Pharmacy </td><td></td></tr><tr><td> Fórceps </td><td> Roboz </td><td> RS5070 </td></tr><tr><td> Iris tijeras </td><td> Roboz </td><td> RS5913 </td></tr><tr><td> Hojas de bisturí </td><td> Pluma </td><td> 2976 </td></tr><tr><td> EZ anestesia </td><td> Euthanex Corp. </td><td></td></tr><tr><td> SCID ratón sin pelo outbred </td><td> Charles River </td><td></td></tr></tbody></table>

the three-dimensional human skin reconstruct model: a tool to study normal  skin and melanoma progression

La mayoría de los estudios in vitro en la biología de la piel experimentales se han realizado en los monocultivos de dos dimensiones (2D), mientras que la evidencia acumulada sugiere que las células se comportan de manera diferente cuando son cultivadas en un 3D matriz extracelular y también interactuar con otras células (1-5) . Los modelos de ratón han sido ampliamente utilizados para estudiar la morfogénesis de tejidos in vivo. Sin embargo ratón y la piel humana tiene diferencias significativas en la arquitectura celular y la fisiología, lo que hace difícil extrapolar los estudios en ratones a los seres humanos. Dado que los melanocitos de la piel del ratón son en su mayoría localizadas en los folículos pilosos, que tienen distintas propiedades biológicas de los humanos, que localizan principalmente en la capa basal de la epidermis. El desarrollo reciente de la piel humana en 3D los modelos ha permitido reconstruir el campo para investigar célula-matriz y célula-célula la interacción entre diferentes tipos de células. El reconstruye consistirá en una &quot;dermis&quot; con fibroblastos embebidos en una matriz de colágeno I, un &quot;epidermis&quot;, que se compone de queratinocitos estratificada y diferenciada y una membrana basal funcional, que separa la epidermis de la dermis. El colágeno proporciona andamios, transporte de nutrientes, y las posibilidades de interacción de célula a célula. Los modelos de piel en 3D que incorpora células melanocíticas recapitular las características naturales de la homeostasis de los melanocitos y la progresión del melanoma en la piel humana. Como in vivo, los melanocitos de la piel reconstruida se localizan en la membrana basal intercaladas con queratinocitos capa basal. Las células del melanoma exhiben las mismas características que reflejan la etapa del tumor original (RGP, VGP y células metastásicas de melanoma) en vivo. Recientemente, las células madre dérmicas han sido identificados en la dermis humana (6). Estas células madre multi-potentes pueden migrar a la epidermis y se diferencian de los melanocitos.

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The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

En este informe se describe la piel en tres dimensiones reconstruir el modelo que imita la piel humana en la arquitectura y la composición. Fisiología de los melanocitos, la progresión del melanoma y el destino de las células madre dérmicas han sido investigados con la piel reconstruir el modelo. El modelo es también útil como una herramienta para la evaluación preclínica de medicamentos.

La piel humana tridimensional Reconstrucción del modelo: una herramienta para estudiar la piel normal y la progresión del melanoma

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

the-three-dimensional-human-skin-reconstruct-model-tool-to-study

Research

JoVE Journal

Bioengineering

49.4K vistas.  The Wistar Institute. En este informe se describe la piel en tres dimensiones reconstruir el modelo que imita la piel humana en la arquitectura y la composición. Fisiología de los melanocitos, la progresión del melanoma y el destino de las células madre dérmicas han sido investigados con la piel reconstruir el modelo. El modelo es también útil como una herramienta para la evaluación preclínica de medicamentos.

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Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical devices1-3. In this paper, we focus on one- (1D), two- (2D), and three-dimensional (3D) printing of conductive metallic inks in the form of flexible, stretchable, and spanning microelectrodes.
Direct-write assembly4,5 is a 1-to-3D printing technique that enables the fabrication of features ranging from simple lines to complex structures by the deposition of concentrated inks through fine nozzles (~0.1 - 250 &mu;m). This printing method consists of a computer-controlled 3-axis translation stage, an ink reservoir and nozzle, and 10x telescopic lens for visualization. Unlike inkjet printing, a droplet-based process, direct-write assembly involves the extrusion of ink filaments either in- or out-of-plane. The printed filaments typically conform to the nozzle size. Hence, microscale features (&lt; 1 &mu;m) can be patterned and assembled into larger arrays and multidimensional architectures.
In this paper, we first synthesize a highly concentrated silver nanoparticle ink for planar and 3D printing via direct-write assembly. Next, a standard protocol for printing microelectrodes in multidimensional motifs is demonstrated. Finally, applications of printed microelectrodes for electrically small antennas, solar cells, and light-emitting diodes are highlighted.

Planar and three-dimensional printing of conductive metallic inks is described. Our approach provides new avenues for fabricating printed electronic, optoelectronic, and biomedical devices in unusual layouts at the microscale.

Impresión plana y tridimensional de tintas conductoras

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Investigación

Bioingeniería

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. Clinically, this protein is widely used for cosmetic surgery, dermal injections, bone grafting, and reconstructive surgery. The sources of COL1 for these procedures are commonly nonhuman, which increases the potential for inflammation and rejection as well as xenobiotic disease transmission. In view of this, a method to efficiently and quickly purify COL1 from limited quantities of autologously-derived tissues would circumvent many of these issues; however, standard isolation protocols are lengthy and often require large quantities of collagenous tissues. Here, we demonstrate an efficient COL1 extraction method that reduces the time needed to isolate and purify this protein from about 10 days to less than 3 hr. We chose the dermis as our tissue source because of its availability during many surgical procedures. This method uses traditional extraction buffers combined with forceful agitation and centrifugal filtration to obtain highly-pure, soluble COL1 from small amounts of corium. Briefly, dermal biopsies are washed thoroughly in ice-cold dH2O after removing fat, connective tissue, and hair. The skin samples are stripped of noncollagenous proteins and polysaccharides using 0.5 M sodium acetate and a high speed bench-top homogenizer. Collagen from residual solids is subsequently extracted with a 0.075 M sodium citrate buffer using the homogenizer. These extracts are purified using 100,000 MW cut-off centrifugal filters that yield COL1 preparations of comparable or superior quality to commercial products or those obtained using traditional procedures. We anticipate this method will facilitate the utilization of autologously-derived COL1 for a multitude of research and clinical applications.

Traditional procedures for the isolation of soluble type 1 collagen (COL1) require about 10 days from start to finish because of lengthy buffer incubations and laborious resuspensions of fibrils. Here, we describe a means to purify COL1 from small dermal biopsies in less than 3 hr.

Un método mejorado para la preparación de colágeno tipo I De Piel

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Investigating the Three-dimensional Flow Separation Induced by a Model Vocal Fold Polyp

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. Polyps and nodules, which are geometric abnormalities that form on the medial surface of the vocal folds, can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Our laboratory has reported particle image velocimetry (PIV) measurements, within an investigation of a model polyp located on the medial surface of an in&#160;vitro driven vocal fold model, which show that such a geometric abnormality considerably disrupts the glottal jet behavior. This flow field adjustment is a likely reason for the severe degradation of the vocal quality in patients with polyps. A more complete understanding of the formation and propagation of vortical structures from a geometric protuberance, such as a vocal fold polyp, and the resulting influence on the aerodynamic loadings that drive the vocal fold dynamics, is necessary for advancing the treatment of this pathological condition. The present investigation concerns the three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted prolate hemispheroid with a 2:1 aspect ratio in cross flow, i.e. a model vocal fold polyp, using an oil-film visualization technique. Unsteady, three-dimensional flow separation and its impact of the wall pressure loading are examined using skin friction line visualization and wall pressure measurements.

Vocal fold polyps can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted model polyp and its impact on the wall pressure loading are examined using particle image velocimetry, skin friction line visualization, and wall pressure measurements.

Investigación De La Separación De Flujo Tridimensional Inducida Por Un Pólipo Modelo De Pliegue Vocal

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and regenerative medicine. With digital control&#160;cells, scaffolds, and growth factors can be precisely deposited to the desired two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) locations rapidly. Therefore, this technology is an ideal approach to fabricate tissues mimicking their native anatomic structures. In order to engineer cartilage with native zonal organization, extracellular matrix composition (ECM), and mechanical properties, we developed a bioprinting platform using a commercial inkjet printer with simultaneous photopolymerization capable for 3D cartilage tissue engineering. Human chondrocytes suspended in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) were printed for 3D neocartilage construction via layer-by-layer assembly. The printed cells were fixed at their original deposited positions, supported by the surrounding scaffold in simultaneous photopolymerization. The mechanical properties of the printed tissue were similar to the native cartilage. Compared to conventional tissue fabrication, which requires longer UV exposure, the viability of the printed cells with simultaneous photopolymerization was significantly higher. Printed neocartilage demonstrated excellent glycosaminoglycan (GAG) and collagen type II production, which was consistent with gene expression. Therefore, this platform is ideal for accurate cell distribution and arrangement for anatomic tissue engineering.

The methods described in this paper show how to convert a commercial inkjet printer into a bioprinter with simultaneous UV polymerization. The printer is capable of constructing 3D tissue structure with cells and biomaterials. The study demonstrated here constructed a 3D neocartilage.

El cartílago humano Tissue Fabrication Usando tridimensional Tecnología de impresión inyección de tinta

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to evaluate new strategies that aim at improving vascularization, reliable methods are required to make the in-growth of new blood vessels into bio-artificial scaffolds visible and quantify the results. Over the past couple of years, our group has introduced a full skin defect model that enables the direct visualization of blood vessels by transillumination and provides the possibility of quantification through digital segmentation. In this model, one surgically creates full skin defects in the back of mice and replaces them with the material tested. Molecules or cells of interest can also be incorporated in such materials to study their potential effect. After an observation time of one&#8217;s own choice, materials are explanted for evaluation. Bilateral wounds provide the possibility of making internal comparisons that minimize artifacts among individuals as well as of decreasing the number of animals needed for the study. In comparison to other approaches, our method offers a simple, reliable and cost effective analysis. We have implemented this model as a routine tool to perform high-resolution screening when testing vascularization of different biomaterials and bio-activation approaches.

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Vascularization is key to approaches in successful tissue engineering. Therefore, reliable technologies are required to evaluate the development of vascular networks in tissue-constructs. Here we present a simple and cost-effective method to visualize and quantify vascularization in vivo.

Una piel llena de defectos modelo para evaluar la vascularización de Biomateriales<em&gt; En Vivo</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

Generación de una tridimensional grosor de la piel completa y automatizada Equivalente Heridas

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). In fact, it is widely recognized that cells grown in flasks or dishes tend to de-differentiate and lose specialized features of the tissues from which they were derived. Currently, there are mainly two types of 3-D culture systems where the cells are seeded into scaffolds mimicking the native extracellular matrix (ECM): (a) static models and (b) models using bioreactors. The first breakthrough was the static 3-D models. 3-D models using bioreactors such as the rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors are a more recent development. The original concept of the RWV bioreactors was developed at NASA&#39;s Johnson Space Center in the early 1990s and is believed to overcome the limitations of static models such as the development of hypoxic, necrotic cores. The RWV bioreactors might circumvent this problem by providing fluid dynamics that allow the efficient diffusion of nutrients and oxygen. These bioreactors consist of a rotator base that serves to support and rotate two different formats of culture vessels that differ by their aeration source type: (1) Slow Turning Lateral Vessels (STLVs) with a co-axial oxygenator in the center, or (2) High Aspect Ratio Vessels (HARVs) with oxygenation via a flat, silicone rubber gas transfer membrane. These vessels allow efficient gas transfer while avoiding bubble formation and consequent turbulence. These conditions result in laminar flow and minimal shear force that models reduced gravity (microgravity) inside the culture vessel. Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa composed of an intestinal epithelial cell line and primary human lymphocytes, endothelial cells and fibroblasts cultured under microgravity provided by the RWV bioreactor.

Cells growing in a three-dimensional (3-D) environment represent a marked improvement over cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa cultured under microgravity provided by rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors.

Desarrollo de un Modelo Organotípicos multicelular tridimensional de la mucosa intestinal humanas cultivadas en condiciones de microgravedad

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol applies a macromolecular crowding (MMC) technique to mimic this physiological crowding through the addition of neutral polymers (crowders) to cell cultures in vitro. Previous studies using Ficoll or dextran as crowders demonstrate that the expression of collagen I and fibronectin in WI38 and WS-1 cell lines are significantly enhanced using the MMC technique. However, this technique has not been validated in primary hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts (hHSFs). As hypertrophic scarring arises from the excessive deposition of collagen, this protocol aims to construct a collagen-rich in vitro hypertrophic scar model by applying the MMC technique with hHSFs. This optimized MMC model has been shown to possess more similarities with in vivo scar tissue compared to traditional 2-dimensional (2-D) cell culture systems. In addition, it is cost-effective, time-efficient, and ethically desirable compared to animal models. Therefore, the optimized model reported here offers an advanced &#8220;in vivo-like&#8221; model for hypertrophic scar-related studies.

This protocol describes the use of macromolecular crowding to create an in vitro human hypertrophic scar tissue model that resembles in vivo conditions. When cultivated in a crowded macromolecular environment, human skin fibroblasts exhibit phenotypes, biochemistry, physiology, and functional characteristics resembling scar tissue.

Modelo In Vitro de Cicatrices Hipertróficas Cutáneas Humanas usando Crowding Macromolecular

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process and the characterization of the model is described. Neonatal primary keratinocytes are grown submerged on permeable polycarbonate inserts and lifted to the air-liquid interface three days after seeding. After fourteen days of stimulation with defined growth factors and ascorbic acid in high calcium culture medium, the model is fully differentiated. Histological analysis revealed a completely stratified epidermis, mimicking the morphology of native human skin. To characterize the model and its barrier functions, protein levels and localization specific for early-stage keratinocyte differentiation (i.e., keratin 10), late-stage differentiation (i.e., involucrin, loricrin, and filaggrin) and tissue adhesion (i.e., desmoglein 1), were assessed by immunofluorescence. The tissue barrier integrity was further evaluated by measuring transepithelial electrical resistance. Reconstructed human epidermis was responsive to proinflammatory stimuli (i.e., lipopolysaccharide and tumor necrosis factor alpha), leading to increased cytokine release (i.e., interleukin 1 alpha and interleukin 8). This protocol represents a straightforward and reproducible in vitro method to cultivate reconstructed human epidermis as a tool to assess environmental effects and a broad range of skin-related studies.

This protocol describes a straightforward method to cultivate three-dimensional reconstituted human epidermis in a reproducible and robust manner. Additionally, it characterizes the structure-function relationship of the epidermal barrier model. The biological responses of the reconstituted human epidermis upon proinflammatory stimuli are also presented.

El cultivo de una epidermis humana reconstruida tridimensional a gran escala

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...

Generation of Self-assembled Vascularized Human Skin Equivalents

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to study skin development, wound healing, and grafting techniques. Many HSEs continue to lack vasculature and are additionally analyzed through post-culture histological sectioning which limits volumetric assessment of the structure. Presented here is a straightforward protocol utilizing accessible materials to generate vascularized human skin equivalents (VHSE); further described are volumetric imaging and quantification techniques of these constructs. Briefly, VHSEs are constructed in 12 well culture inserts in which dermal and epidermal cells are seeded into rat tail collagen type I gel. The dermal compartment is made up of fibroblast and endothelial cells dispersed throughout collagen gel. The epidermal compartment is made up of keratinocytes (skin epithelial cells) that differentiate at the air-liquid interface. Importantly, these methods are customizable based on needs of the researcher, with results demonstrating VHSE generation with two different fibroblast cell types: human dermal fibroblasts (hDF) and human lung fibroblasts (IMR90s). VHSEs were developed, imaged through confocal microscopy, and volumetrically analyzed using computational software at 4- and 8-week timepoints. An optimized process to fix, stain, image, and clear VHSEs for volumetric examination is described. This comprehensive model, imaging, and analysis techniques are readily customizable to the specific research needs of individual labs with or without prior HSE experience.

The goal of this protocol is to describe the generation and volumetric analysis of vascularized human skin equivalents using accessible and simple techniques for long term culture. To the extent possible, the rationale for steps is described to allow researchers the ability to customize based on their research needs.

Generación de equivalentes de piel humana vascularizada autoensamblada

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to ...