Prior work with regard to susceptibility testing of dalbavancin has been valuable in development of a standardized methods and acknowledgement for this work is given to JMI Laboratories, Robert Rennie and Beth Goldstein.

Nota: Consulte los documentos del CLSI M7-A10 y M100-S25 y / o ISO / FDIS 20776-1 para los detalles completos del método de referencia de caldo de microdilución para susceptibilidad antimicrobiana 2, 3, 4 Los métodos de referencia permiten opciones en algunos de los. procedimientos específicos para la preparación del inóculo y el panel MIC producción para lograr el mismo resultado final. El método detallado aquí se refiere a un agente antimicrobiano, dalbavancina, y algunos de los pasos representan potencialmente una de varias maneras el procedimiento de referencia se puede hacer. Precauciones de seguridad apropiada (en consonancia con el nivel de bioseguridad 2) se deben utilizar 10. El formato de panel MIC utilizado para el propósito de esta publicación de vídeo se muestra en la Tabla 1. 1. Tienda Dalbavancina Polvo <ol><li> Tras la recepción de diagnóstico polvo dalbavancina grado, almacenar a -20 ° C en un ambiente desecado en un congelador sin descongelar. Antes de su uso, el polvo debe equilibrar allegar a RT antes de abrir. </li></ol> 2. Prepare diluciones Panel MIC <ol><li> Preparar una solución madre no superior a 1.600 g / ml de dalbavancina ordenada en DMSO (puro) en tubos de vidrio o de plástico estériles, y el uso en el mismo día de la preparación o almacenar a -20 a -60 ° C o por debajo para su uso futuro en un congelador sin descongelar. Tome en cuenta la potencia de dalbavancina lo dispuesto en la documentación recibida con el polvo, al pesar el polvo (véase la ecuación 1, por ejemplo, 800 mg de preparación de pasta / ml). </li><li> Diluir la dilución Stock similar al esquema como se muestra en la columna 1 (&quot;Concentración Fuente&quot;) en la Tabla 2 con DMSO puro en tubos de vidrio o de plástico estériles. Utilice una pipeta para medir diluyente y otra pipeta para añadir el dalbavancina el stock inicial al primer tubo. Para cada una posterior concentración dalbavancina Stock utilizar una nueva pipeta. </li><li> Preparar 100X última concent panel de MICdiluciones de racionamiento (concentraciones intermedias) con DMSO puro. Como se muestra en las columnas 2-4 de la Tabla 2, combinar volúmenes apropiados de origen y DMSO para lograr concentración intermedia deseada (volúmenes que se utilizarán dependerá del número de paneles MIC a realizar). </li><li> Preparar 0,004% P80: Se prepara una solución madre de trabajo fresca del 2% P80 mediante la adición de 0,1 ml a 4,9 ml P80 H2Od Esterilizar pasando a través de un filtro y el uso solución de 0,22 micras en el mismo día de la preparación. Preparar 0.004% de diluyente P80 haciendo una dilución 1: 500 de 2% P80 (por ejemplo, 0,3 ml de 2% P80 a 149,7 ml de CAMHB). </li><li> Además diluir las concentraciones intermedio preparado en el Paso 2.2 1: 100 en catión ajustado Mueller Hinton caldo (CAMHB) suplementado con 0,004% (v / v) de polisorbato-80 (80 P) P-80 y / o LHB (por estreptococos) añadido al doble de la concentración final debido a la adición de inóculo (paso 4.3) se traducirá en una dilución 1: 2. Ver las columnas 6 y 7 de la Tabla 2 </strong&gt;. </li></ol> 3. Prepare los paneles MIC <ol><li> Dispensar 50 l de cada solución dalbavancina preparado en la etapa 2.3 en los pozos apropiados del panel de MIC e incluir los medios de comunicación sólo en un pocillo (control de crecimiento también). Una pipeta de múltiples canales con puntas estériles se puede utilizar para este paso. </li><li> Utilice los paneles inmediatamente o sellar con una película de plástico, colocar en bolsas de plástico y colocar inmediatamente en un congelador no descongelar a ≤-20 o C (preferiblemente a ≤-60 ° C) hasta que se necesite. Si se utilizan paneles congelados, retire los sellos y colocar paneles individuales de mesa de laboratorio durante 15-30 minutos (hasta que se descongelan contenidos así) antes de proceder al panel de la inoculación. </li></ol> 4. Inocular paneles MIC, Realizar Pureza y Colonia Configuración Conde <ol><li> Seleccione varias colonias bien aisladas de un agar sangre 18-24 hr u otra placa de agar no selectivo. Toque la parte superior de cada colonia con un asa estéril o hisopo y traslado a 1.5 ml CAMHB o saline hasta que la turbidez es equivalente a un estándar McFarland 0,5. Evaluar la turbidez por comparación visual al 0,5 McFarland o con un dispositivo fotométrico. </li><li> Dentro de 15-30 min de preparación, diluir el inóculo 1: 100 en CAMHB (100 l en 10 ml CAMHB). Para la mayoría de bacterias probadas contra dalbavancina, con la excepción de S. pneumoniae, esta dilución será así proporcionar una concentración final de 5 x 10 5 UFC / ml (intervalo aceptable a 2-8 x 10 5 CFU / ml). Para S. pneumoniae, concentración bacteriana basada en la comparación de la turbidez a un 0,5 McFarland es típicamente considerablemente menor, por lo tanto, diluir el inóculo 1:25 (400 l en 10 ml CAMHB + 10% + LHB). </li><li> Dentro de 15 min después de la preparación del inóculo, transferir 50 l de la inóculo final a cada pocillo (con excepción del control de la esterilidad también) del panel MIC preparada en el paso 3. Una pipeta multicanal usando puntas estériles se puede utilizar para este paso. </li><li> Realizar una comprobación de la purezamediante la transferencia y la difusión de una parte alícuota de 1 a 10 l del testigo de crecimiento positivo utilizando un asa estéril a un agar no selectivo (por ejemplo, agar tripticasa de soja con 5% de sangre de oveja). </li><li> Configuración de recuento de colonias mediante la eliminación de 10 l del control de crecimiento bien con un solo canal pipeta y la punta estéril y transferencia a 10 ml de solución salina (1: 1000 dilución). Mezclar y transferir 100 l con un solo canal pipeta y la punta estéril para un medio adecuado, no selectivo de agar (por ejemplo, agar tripticasa de soja con 5% de sangre de oveja) y se extendió sobre toda la superficie de agar con un asa estéril, repitiendo dos veces en diferentes direcciones para asegurar una distribución uniforme del inóculo (dilución 1:10). </li></ol> 5. Paneles Incubar MIC, Colonia Conde y placas Pureza <ol><li> Selle cada panel MIC o pila de no más de 4 paneles en una bolsa de plástico, con cinta de plástico o con una cubierta de plástico hermética antes de incubar. Como alternativa, coloque el panel MIC vacío en el top de la pila de no más de 4 paneles MIC, coloque una toalla de papel húmeda en un recipiente de plástico, paneles lugar de MIC en el recipiente de plástico y cerca de contenedores de forma segura con tapa. </li><li> Incubar paneles MIC en una incubadora de aire ambiente a 35 ° C ± 2 ° C durante 16-20 horas (estafilococos y enterococos) y 20 a 24 h (estreptococos) dentro de los 30 minutos de la inoculación. Incubar el recuento de colonias y placas de pureza en las mismas condiciones, excepto los estreptococos incubado en un incubador de CO2 al 5%. </li></ol> 6. Lea el MIC y Colonia Conde placas; Compruebe la Pureza Plate <ol><li> Lea el MIC como la concentración más baja que inhibe completamente el crecimiento bacteriano en los pozos detectada por el ojo humano. </li><li> Recuento de las colonias de la placa de recuento de colonias. Multiplicar cada colonia por factor de dilución (1: 10.000) (por ejemplo, 50 colonias es equivalente a 5 x 10 5 CFU / ml). Un rango aceptable es de 20-80 colonias (2-8 x 10 5 UFC / ml) y se utiliza como un aprodirectriz ximate. </li><li> Compruebe la placa de pureza. Si todas las colonias son similares a las colonias utilizados en el paso 4.1, entonces el inóculo puede ser considerado puro. Si hay otras colonias presentes, entonces existe la posibilidad de un contaminante esté presente en el panel de MIC y la prueba debe repetirse. </li></ol> 7. Verificar resultados de control de calidad. <ol><li> Consulte la Tabla 3 para los rangos esperados de las cepas de control de calidad del CLSI. Sólo informar los resultados de la prueba de los aislamientos si los resultados de CIM para dalbavancina organismo (s) de control de calidad se encuentran dentro del rango esperado. </li><li> Si se obtiene una MIC de ≥0.25 mu g / ml para cualquier S. clínica aureus aislar, repita la prueba MIC dalbavancina y / o enviar a un laboratorio de referencia para la verificación. </li></ol>

<ol>
	<li>Boucher, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Once-weekly+dalbavancin+versus+daily+conventional+therapy+for+skin+infection.">Once-weekly dalbavancin versus daily conventional therapy for skin infection.</a> The New England journal of medicine. 370, 2169-2179 (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> M07-A10. Methods for Dilution Antimicrobial Tests for Bacteria that Grow Aerobically.: Approved Standard. , (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> M100-S25. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-Fifth Informational Supplement. , (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+laboratory+testing+and+in+vitro+diagnostic+test+systems+--+Susceptibility+testing+of+infectious+agents+and+evaluation+of+performance+of+antimicrobial+susceptibility+test+devices+--+Part+1:+Reference+method+for+testing+the+in+vitro+activity+of+antimicrobial+agents+against+rapidly+growing+aerobic+bacteria+involved+in+infectious+diseases.">Clinical laboratory testing and in vitro diagnostic test systems -- Susceptibility testing of infectious agents and evaluation of performance of antimicrobial susceptibility test devices -- Part 1: Reference method for testing the in vitro activity of antimicrobial agents against rapidly growing aerobic bacteria involved in infectious diseases.</a> ISO/FDIS. 20776-1, (2006).</li><li>Jones, R. N., Farrell, D. J., Flamm, R. K., Sader, H. S., Dunne, M. W., Mendes, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surrogate+analysis+of+vancomycin+to+predict+susceptible+categorization+of+dalbavancin.">Surrogate analysis of vancomycin to predict susceptible categorization of dalbavancin.</a> Diagn Microbiol Infect Dis. , (2015).</li><li>Turnidge, J., Paterson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Setting+and+revising+antibacterial+susceptibility+breakpoints.">Setting and revising antibacterial susceptibility breakpoints.</a> Clinical microbiology reviews. 20, 391-408 (2007).</li><li>Rennie, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+broth+microdilution+antimicrobial+susceptibility+test+results+for+dalbavancin,+a+new+glycopeptide+agent.">Factors influencing broth microdilution antimicrobial susceptibility test results for dalbavancin, a new glycopeptide agent.</a> Journal of clinical microbiology. 45, 3151-3154 (2007).</li><li>Arhin, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+polysorbate+80+on+oritavancin+binding+to+plastic+surfaces:+implications+for+susceptibility+testing.">Effect of polysorbate 80 on oritavancin binding to plastic surfaces: implications for susceptibility testing.</a> Antimicrobial agents and chemotherapy. 52, 1597-1603 (2008).</li><li>Farrell, D. J., Mendes, R. E., Rhomberg, P. R., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+reference+broth+microdilution+method+for+testing+telavancin:+effect+on+MIC+results+and+correlation+with+other+testing+methodologies.">Revised reference broth microdilution method for testing telavancin: effect on MIC results and correlation with other testing methodologies.</a> Antimicrobial agents and chemotherapy. 58, 5547-5551 (2014).</li><li>Ribbon Panel, B. l. u. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+Safe+Work+Practices+in+Human+and+Animal+Medical+Diagnostic+Laboratories.">Guidelines for Safe Work Practices in Human and Animal Medical Diagnostic Laboratories.</a> MMWR Supplements. 61 (01), 1-101 (2012).</li><li>Anderegg, T. R., Biedenbach, D. J., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+quality+control+evaluations+for+susceptibility+testing+of+Dalbavancin+(BI397),+an+investigational+glycopeptide+with+potent+gram-positive+activity.">Initial quality control evaluations for susceptibility testing of Dalbavancin (BI397), an investigational glycopeptide with potent gram-positive activity.</a> Journal of clinical microbiology. 41, 2795-2796 (2003).</li><li>Koeth, L. M., Windau, A. R., Goldstein, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Broth+Microdilution+and+Agar+Dilution+Dalbavancin+and+Vancomycin+MIC+Results+for+42+Aerobic+Gram-positive+Bacteria.+Poster+132.">Comparison of Broth Microdilution and Agar Dilution Dalbavancin and Vancomycin MIC Results for 42 Aerobic Gram-positive Bacteria. Poster 132.</a> ASM. , (2012).</li><li>Fritsche, T. R., Rennie, R. P., Goldstein, B. P., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+dalbavancin+MIC+values+determined+by+Etest+(AB+BIODISK)+and+reference+dilution+methods+using+gram-positive+organisms.">Comparison of dalbavancin MIC values determined by Etest (AB BIODISK) and reference dilution methods using gram-positive organisms.</a> Journal of clinical microbiology. 44, 2988-2990 (2006).</li><li>Mushtaq, S., Warner, M., Johnson, A. P., Livermore, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+dalbavancin+against+staphylococci+and+streptococci,+assessed+by+BSAC+and+NCCLS+agar+dilution+methods.">Activity of dalbavancin against staphylococci and streptococci, assessed by BSAC and NCCLS agar dilution methods.</a> The Journal of antimicrobial chemotherapy. 54, 617-620 (2004).</li><li>Jones, R. N., Flamm, R. K., Sader, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveillance+of+dalbavancin+potency+and+spectrum+in+the+United+States+(2012).">Surveillance of dalbavancin potency and spectrum in the United States (2012).</a> Diagnostic microbiology and infectious disease. 76, 122-123 (2013).</li></ol>

Sandra McCurdy es un empleado de Durata Terapéutica; Especialistas de Laboratorio, Inc., patrona de Laura Koeth y Jeanna Fisher, fue contratado por Durata Terapéutica para preparar el manuscrito. Tasas de publicación para este artículo fueron pagados por Especialistas de Laboratorio, Inc.

Los siguientes detalles de método se presentan consideraciones adicionales en la preparación para las pruebas de MIC dalbavancina. El diseño del panel MIC dependerá del número de agentes antimicrobianos a ensayar (es decir., Dalbavancina solo o múltiples agentes) y las especies de bacterias a ensayar. Las concentraciones dalbavancina deben abarcar los puntos de corte de interpretación para todas las especies bacterianas a ensayar y toda la gama de diluciones esperados durante al menos una cepa de control de calidad. La serie de dilución antimicrobiana puede ser organizada ya sea en filas o columnas en función del número de agentes antimicrobianos y / o aislados / placa y el método de la inoculación. El volumen de polvo dalbavancina y el caldo debe calcularse para asegurar que las cantidades óptimas son producidos y de los residuos es mínima. Para el ejemplo usado en esta publicación, los volúmenes se basan en preparación de dos paneles MIC. Cationes ajustados caldo Mueller Hinton debe estar preparado y en autoclave de acuerdo con el hombreinstrucciones y la esterilidad de los medios de ufacturer verificados. Paneles MIC se pueden hacer y se utilizan en el mismo día de la preparación o pueden ser probados con los organismos de control de calidad apropiados y los paneles validados almacenados congelados para uso futuro. Es importante utilizar técnicas estériles durante todo el procedimiento. No hay criterios estrictos para la verificación de la concentración de inóculo con recuentos de colonias. Recuentos de colonias pueden ser revisados ​​inicialmente para cada especie probados y / o periódicamente para validar el paso de dilución efectuada en el paso 4.2. Es importante que la validez de la norma McFarland 0.5 también se comprueba rutinariamente con E. coli ATCC 25922 usando un procedimiento similar al paso 4.5. Si los resultados no son equivalentes a 1.2 x 10 8 UFC / ml, se debe obtener un nuevo estándar McFarland 0,5. Si los recuentos de colonias de pozos MIC están fuera del rango aceptable (2-8 x / resultados ml y CIM 10 5 UFC para el aislado clínico (s) puede variar en cada ªe esperada distribución normal (por ejemplo. 0,03 a 0,12 ug / ml para S. aureus) y / o resultados de CIM para el aislado de control de calidad (s) están fuera de los rangos esperados, las pruebas de validación es necesaria y la modificación de métodos puede estar justificada. Se sugiere que un estándar McFarland 0,5 validado se utiliza para repetir el count (s) de la colonia y si los resultados son de nuevo fuera de los resultados esperados, la dilución del inóculo tal como se realiza en el paso 4.2 se debe ajustar en consecuencia y el MIC repite. Tenga en cuenta que un cheque pureza es necesario incluso si un recuento de colonias se realiza debido a que el procedimiento de recuento de colonias utiliza un volumen diluida que no se puede detectar necesariamente menores concentraciones de microorganismos contaminantes. Para una prueba de MIC se considere válida, el crecimiento aceptable debe ocurrir en el control del crecimiento también. Para la mayoría de las bacterias que se pondrá a prueba en contra dalbavancina (es decir., Estafilococos, estreptococos y enterococos, el crecimiento se verá como un botón (típicamente&gt; 2 mm) y menos frequently, el crecimiento puede aparecer como turbidez en el pozo. A diferencia de algunos agentes antimicrobianos que pueden presentar trailing efecto que las concentraciones aumentan, los puntos finales dalbavancina son bien definidos. Hay varios dispositivos de visualización destinadas a facilitar pruebas de microdilución de lectura, que se pueden usar para leer placas que contienen dalbavancina, siempre y cuando no hay compromiso en la capacidad de discernir el crecimiento en los pocillos. Los pasos críticos en el protocolo están relacionadas con las partes del procedimiento que están relacionados con la solubilidad de dalbavancina y la adición de P80. Es importante que la concentración máxima de dalbavancina utilizado es no mayor de 1,600 g / ml, que el DMSO se usa como un disolvente y que las concentraciones de intermedios se preparan en DMSO antes de hacer las diluciones de caldo de modo que la concentración final de DMSO en el MIC panel de pozos no es mayor que 1%. DMSO es higroscópico y, por tanto, el uso de botellas más antiguas de DMSO era un EXAMENde iones con respecto a la solubilidad dalbavancina. Sin embargo, mientras que un estudio de la densidad mineral ósea pequeña con cepas de control de calidad ha demostrado que esto no sea una variable importante (ver sección de resultados), es una buena práctica utilizar botellas de DMSO nuevos o recientemente abiertos. También es importante que P80 se añade al caldo en la etapa final de la preparación de dilución de fármaco y está a una concentración final de 0,002% en el MIC también. El procedimiento de la DMO incluye aquí utiliza preparación de paneles MIC utilizando 50 l / pocillo en dalbavancina y P-80 concentraciones dos veces la concentración final y la adición de inóculo con 50 l / pocillo de manera que el volumen final / pocillo es de 100 microlitros. Este método permite a un formato de panel MIC que deben prepararse para la prueba de ambos S. aureus y S. pneumoniae porque la sangre de caballo lisada se puede añadir al inóculo. Los métodos alternativos para la preparación de paneles MIC utilizando 100 l / pocillo con la adición de hasta 10 l / pocillo se describen en laProcedimientos CLSI e ISO. El punto de ruptura susceptibles dalbavancina para S. aureus es ≤0.12 mg / ml (FDA prospecto). Como se muestra en la vigilancia reciente, la mayoría de los aislamientos son inhibidas por Dalbavancina a niveles de 0,06 g / ml 15. Con un punto de interrupción susceptible cerca de la MIC modal, cualquier variación en MIC como resultado de las diferencias de método puede afectar las tasas de susceptibilidad. Debido a que el procedimiento de la DMO para dalbavancina incluye algunos pasos únicos (en concreto, el uso de DMSO en la preparación de acciones y diluciones de fármaco intermedios y 0,002% P80 en el MIC bien, es imperativo que el método se sigue exactamente. El organismo S. aureus QC (ATCC 29213) con una muy clara MIC modal dalbavancina de 0,06 g / ml, ha sido un buen indicador de la variación de método y debe utilizarse de forma rutinaria para validar el método de la DMO. Si los resultados de CIM están con el rango esperado de 0,03 hasta 0,12 mg / ml, pero están en tendencia ya sea a la baja o high lado de este rango, mayor validación del método se justifica. Se recomienda la adición de 0,002% P80 para todos los organismos Gram-positivas relevante (staphylococcci, enterococos y estreptococos.) Sin embargo, hay que destacar que se ha demostrado que lisadas sangre de caballo actúa similar a P-80 en relación con sus propiedades anti-unión capacidad y que la adición de P-80 a CAMHB + LHB no tiene ningún efecto adicional sobre los resultados de CIM estreptococos dalbavancina. Actualmente no hay ningún método de difusión en disco para la prueba dalbavancina y debido a la pobre correlación de DMO y los resultados de AD, las pruebas de sensibilidad de dalbavancina utilizando el método de AD no se recomienda 12, 14. El método de la DMO se debe utilizar para la futura evaluación de la susceptibilidad dalbavancina y como método de referencia para el desarrollo de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana comerciales.

Dalbavancina es un lipoglicopéptido semi-sintético que fue aprobado por la FDA en mayo de 2014 en el tratamiento de infecciones de la piel y la estructura de la piel bacterianas agudas causadas por organismos Gram-positivas 1. El principal objetivo de detallar este método en un formato de vídeo es proporcionar una orientación clara a los científicos de laboratorio y la investigación clínica para las pruebas y la notificación de los resultados de sensibilidad dalbavancina exactos y reproducibles. La determinación de un agente antimicrobiano MIC por métodos comerciales se realiza rutinariamente en los laboratorios clínicos para la evaluación de la actividad de un agente in vitro contra bacterias patógenas. El método aquí descrito es el método de microdilución en caldo según lo recomendado por CLSI e ISO 2,3,4. Desde dalbavancina métodos de susceptibilidad comerciales no están disponibles actualmente (en el momento de esta publicación) y de difusión en disco y los métodos de dilución en agar no se recomiendan actualmente fo dalbavancina, métodos de dilución de caldo de referencia son las opciones actuales disponibles 12,14. Como este método de referencia no es un comercial y aprobado por la FDA método de diagnóstico in vitro, los laboratorios clínicos en los EE.UU. que utilizan este procedimiento para las pruebas de los pacientes deben cumplir con los requisitos reglamentarios para una prueba desarrollada laboratorio (LDT). Se prevé que como el uso dalbavancina aumenta, más laboratorios tendrán una necesidad de probar este compuesto. Pruebas de vancomicina como un sustituto para la determinación de la susceptibilidad de S. dalbavancina aureus ha sido validado 5. Sin embargo, dalbavancina puede ser activo frente a la vancomicina intermedia S. aureus (VISA) y por lo tanto, los médicos pueden solicitar resultados de CIM dalbavancina. Además, los resultados de CIM para otras especies bacterianas pueden ser solicitados. El punto de interrupción susceptible FDA para dalbavancina contra S. aureus se ha establecido en ≤0.12 mu g / ml. FDA asignado solamente un suscepticategoría ble debido a la falta de datos sobre cepas resistentes. La distribución normal MIC entre los de tipo salvaje S. aureus aislados es de entre 0,03 a 0,12 mg / ml, con una clara MIC modal de 0,06 g / ml. Una ligera variación en los resultados de CIM debido a la diferencia método, además de la variación inherente BMD de ± una dilución, lo que potencialmente podría tener un impacto significativo sobre las tasas de susceptibilidad. 6 De manera similar a otros agentes lipoglicopéptido, las pruebas de sensibilidad dalbavancina puede ser un reto como resultado de solubilidad y el tamaño relativamente grande de la molécula y sus propiedades de unión 7,8,9. El método BMD referencia aquí descrita incluye dos pasos específicos que son únicos a los agentes insolubles y / o agentes lipoglicopéptido: (1) el uso de DMSO para la preparación de las soluciones madre y (2) la adición de 0,002% P-80 en el panel MIC definitiva diluciones. El objetivo de esta publicación es de vídeo para proporcionar claridad al método BMD dalbavancina y para specificaLLY centrarse en estos pasos clave, para asegurar resultados de CIM exactos y reproducibles.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dalbavancin</td>
			<td>Metrics, Inc.</td>
			<td>Greenville, NC</td>
			<td>BI-397</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vancomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>St. Louis, MO</td>
			<td>C5793</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cation Adjusted Mueller Hinton Broth</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>Sparks, MD</td>
			<td>212322</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysed horse blood</td>
			<td>Cleveland Scientific</td>
			<td>Bath, OH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dose-it peristaltic pump</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>Hudson, NH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-channel pipet (Viaflo II)</td>
			<td>Integra</td>
			<td>Hudson, NH</td>
			<td>4164</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 channel pipet (Matrix)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Waltham, MA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channelpPipets (Ovation 10 &#181;L - 100 &#181;L)</td>
			<td>VistaLab</td>
			<td>Brewster, NY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well microplate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>Monroe, NC</td>
			<td>650161</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL flat cap conical bottom centrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Waltham, MA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16x125mm disposable glass tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Waltham, MA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12x17mm snap cap, polystyrene tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Waltham, MA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 mL centrifuge tubes</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>Kaysville, UT</td>
			<td>C-3394-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent reservoirs</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>Hudson, NH</td>
			<td>4312</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable sterilelLoops (1 uL &#38; 10 uL)</td>
			<td>Biologix</td>
			<td>Lenexa, KA</td>
			<td>65-0001,65-0010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soy agar + 5% sheep blood</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>Sparks, MD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (ambient)</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (5% CO2)</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Waltham, MA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td></td>
			<td>52817</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab coats</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a reference broth microdilution method for dalbavancin in vitro susceptibility testing of bacteria that grow aerobically

Las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos (AST) se lleva a cabo para evaluar la actividad in vitro de agentes antimicrobianos contra diversas bacterias. Los resultados de AST, que se expresan como concentraciones inhibitorias mínimas (CIM) se utilizan en la investigación para el desarrollo de los antimicrobianos y la supervisión del desarrollo de resistencia y en el ámbito clínico como guía la terapia antimicrobiana. Dalbavancina es un agente antimicrobiano lipoglicopéptido semi-sintético que fue aprobado en mayo de 2014 la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) para el tratamiento de infecciones de la piel y la estructura de la piel bacterianas agudas causadas por organismos Gram-positivos. La ventaja de dalbavancina sobre las terapias anti-estafilocócicas actuales es su larga vida media, lo que permite la dosificación una vez por semana. Dalbavancina tiene actividad frente a Staphylococcus aureus (incluyendo tanto el S. aureus [MSSA] y resistente a la meticilina S. aureus [MRSA] sensible a meticilina), estafilococos coagulasa negativos, <em&gt; Streptococcus pneumoniae, Streptococcus grupo anginosus, estreptococos β-hemolítico y vancomicina enterococos susceptibles. Similar a otros agentes lipoglicopéptido recientes, la optimización de métodos de ensayo de susceptibilidad CLSI y el caldo ISO incluye el uso de sulfóxido de dimetilo (DMSO) como disolvente en la preparación de las soluciones madre y polisorbato 80 (P80) para aliviar la adherencia del agente de plástico. Antes de los estudios clínicos y durante el desarrollo inicial de dalbavancina, los estudios de susceptibilidad no se llevaron a cabo con el uso de P-80 y los resultados de CIM tendían a ser 2-4 veces mayor y de manera similar más alta MIC resultados se obtuvieron con el método de la susceptibilidad de dilución en agar. Dalbavancina se incluyó por primera vez en CLSI mesas metodología microdilución caldo en 2005 y enmendada en 2006 para aclarar el uso de DMSO y P-80. El procedimiento de microdilución en caldo (BMD) se muestra aquí es específico para dalbavancina y está en conformidad con los métodos CLSI e ISO, con el detalle paso a paso y FOCnosotros en los pasos críticos añadido para mayor claridad.

Métodos MIC estandarizados son necesarias a fin de supervisar el desarrollo de resistencia, un objetivo importante de los diversos programas de vigilancia de antimicrobianos. Resultados Dalbavancina MIC para aislamientos colectados en Europa y EE.UU. en 2011-2013 eran &lt;0,25 mg / ml para el 99,9% de S. aureus y el 100% de los estreptococos (Tabla 4). Para evaluar la importancia de utilizar fresca (sellado) DMSO, pruebas por triplicado de los PRM DMO dalbavancina para QC cepas de S. aureus ATCC 29213, y E. faecalis ATCC 29212 y duplicar pruebas para S. pneumoniae ATCC 49619 se ha realizado mediante (1) DMSO de ampollas sellados, (2) DMSO de una botella de 1 L que estaba dentro de la fecha de caducidad y que había sido utilizado anteriormente para 2 años y (3) una parte alícuota de DMSO de la misma 1 L botella (muestra 2), que se dejó reposar en un vaso de precipitados abierto durante 72 horas antes de su uso. Dalbavancina resultados de CIM utilizando paneles hechos con las tres muestras de DMSO fueron similares y wentro de los rangos aceptables de control de calidad (Tabla 5). La pérdida de actividad dalbavancina después de la exposición de la solución madre de plástico y sin la adición de P-80 ha sido bien documentado 7. En 2 estudios adicionales, la adición de P-80 a las soluciones madre iniciales e intermedias (Tabla 6) y el uso de tubos de vidrio o de plástico para la preparación de las soluciones madre iniciales e intermedias (Tabla 7) no tuvo un efecto sobre la los resultados de CIM dalbavancina. También hubo ningún efecto sobre los resultados de CIM dalbavancina cuando se utilizaron polipropileno y poliestireno placas de tres fabricantes (Tabla 7). La presencia de sangre de caballo lisada en los medios de caldo para las pruebas de los estreptococos se ha demostrado que tienen una actividad de tipo tensioactivo, comparable a P-80 7, 8. El método de referencia dalbavancina para Streptococcus Qué incluye tanto sangre de caballo P-80 y se lisaron ,Sin embargo, a diferencia de estafilococos y enterococos, dalbavancina resultados de CIM para los estreptococos son similares (dentro de +/- 1 dilución) con y sin la adición de P-80. Como se ha presentado y se muestra en la Figura 1 previamente, de dilución en agar dalbavancina (AD) MICs son típicamente 2 a 8 veces mayor en comparación con la corriente de referencia BMD 12, 13, 14. A diferencia de la DMO, la adición de 0,002% P-80 no lo hace afectar AD dalbavancina MIC como resultado 12. <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/53028/53028eq1.jpg" /> Ecuación 1: Ejemplo de Dalbavancina Stock Solution Preparación pasos de preparación para 25 ml de 800 mg / ml solución dalbavancina.. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53028/53028fig1.jpg" /> Figura 1. Comparación de Dalbavancina y vancomicina DMO a AD. Los resultados del estudio que comparó dalbavaNCIN y vancomicina DMO y AD MIC resultados para seleccionar cepas bacterianas Gram-positivas. Media (A) Dalbavancina y (B) La vancomicina microdilución en caldo y agar Dilución MIC Los resultados en mg / ml para 15 Staphylococcus aureus, 8 estafilococos coagulasa negativos (CNS), 5 Enterococcus faecalis y 14 estreptococos (Grupos A, B, y C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53028/53028fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 11 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> LA </td><td> DAL 0.002 </td><td> DAL 0.004 </td><td> DAL 0.008 </td><td> DAL 0.015 </td><td> Dal 0.03 </td><td> DAL; 0.06 </td><td> DAL 0.12 </td><td> DAL 0.25 </td><td> DAL 0.5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td> B </td><td> DAL 0.002 </td><td> DAL 0.004 </td><td> DAL 0.008 </td><td> DAL 0.015 </td><td> Dal 0.03 </td><td> DAL 0.06 </td><td> DAL 0.12 </td><td> DAL 0.25 </td><td> DAL 0.5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td> C </td><td> DAL 0.002 </td><td> DAL 0.004 </td><td> DAL 0.008 </td><td> DAL 0.015 </td><td> Dal 0.03 </td><td> DAL 0.06 </td><td> DAL0.12 </td><td> DAL 0.25 </td><td> DAL 0.5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td> D </td><td> DAL 0.002 </td><td> DAL 0.004 </td><td> DAL 0.008 </td><td> DAL 0.015 </td><td> Dal 0.03 </td><td> DAL 0.06 </td><td> DAL 0.12 </td><td> DAL 0.25 </td><td> DAL 0.5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td> E </td><td> DAL 0.002 </td><td> DAL 0.004 </td><td> DAL 0.008 </td><td> DAL 0.015 </td><td> Dal 0.03 </td><td> DAL 0.06 </td><td> DAL 0.12 </td><td> DAL 0.25 </td&gt; <td> DAL 0.5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td> F </td><td> DAL 0.002 </td><td> DAL 0.004 </td><td> DAL 0.008 </td><td> DAL 0.015 </td><td> Dal 0.03 </td><td> DAL 0.06 </td><td> DAL 0.12 </td><td> DAL 0.25 </td><td> DAL 0.5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td> G </td><td> DAL 0.002 </td><td> DAL 0.004 </td><td> DAL 0.008 </td><td> DAL 0.015 </td><td> Dal 0.03 </td><td> DAL 0.06 </td><td> DAL 0.12 </td><td> DAL 0.25 </td><td> DAL 00.5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td> H </td><td> DAL 0.002 </td><td> DAL 0.004 </td><td> DAL 0.008 </td><td> DAL 0.015 </td><td> Dal 0.03 </td><td> DAL 0.06 </td><td> DAL 0.12 </td><td> DAL 0.25 </td><td> DAL 0.5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> DAL </td><td colspan="2"> Dalbavancina </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td&gt; </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="12"> Las concentraciones se expresan en g / ml después de 50 l / pocillo de inoculación </td></tr></tbody></table> Tabla 1. MIC Plate Formato. La muestra la ubicación formato de placa de 96 pocillo de diluciones dalbavancina y pocillos de control positivo utilizado como ejemplo en esta publicación de vídeo <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Conc Fuente. (g / ml) </td><td> Volumen Fuente (ml) </td><td> DMSO Volumen (ml) </td><td> Intermedio Conc. en DMSO (g / ml) </td><td> Volumen Intermedio Conc. (ml) </td><td> CAMHB Volumen + 0,004% P80 * (ml) </td><td> 2X Conc. Después de 1: 100 dilución en CAMHB (g / ml) </td><td> Concentración Final Grupo. Después de la inoculación (g / ml) </td></tr><tr><td> 800 </td><td> 1.0 </td><td>1.0 </td><td> 400 </td><td> 0.02 </td><td> 1.98 </td><td> 4 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> 400 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 200 </td><td> 0.02 </td><td> 1.98 </td><td> 2 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 400 </td><td> 0.5 </td><td> 15 </td><td> 100 </td><td> 0.02 </td><td> 1.98 </td><td> 1 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> 400 </td><td> 0.5 </td><td> 3.5 </td><td> 50 </td><td> 0.02 </td><td> 1.98 </td><td> 0.5 </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 25 </td><td> 0.02 </td><td> 1.98 </td><td> 0.25 </td><td> 0,125 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 0.5 </td><td> 15 </td><td> 12.5 </td><td> 0.02 </td><td> 1.98 </td><td> 0,125 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 0.5 </td><td> 3.5 </td><td> 6.25 </td><td> 0.02 </td><td> 1.98 </td><td> 0.06 </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> 6.25 </td><td> 0.5 &lt;/ td&gt; <td> 0.5 </td><td> 3.13 </td><td> 0.02 </td><td> 1.98 </td><td> 0.03 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> 6.25 </td><td> 0.5 </td><td> 15 </td><td> 15 </td><td> 0.02 </td><td> 1.98 </td><td> 0,015 </td><td> 0,008 </td></tr><tr><td> 6.25 </td><td> 0.5 </td><td> 3.5 </td><td> 0.8 </td><td> 0.02 </td><td> 1.98 </td><td> 0,008 </td><td> 0,004 </td></tr><tr><td> 0.8 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0.4 </td><td> 0.02 </td><td> 1.98 </td><td> 0,004 </td><td> 0,002 </td></tr><tr><td colspan="5"> Esta tabla ha sido modificado desde CLSI M100-S25, la Tabla 8B 3 </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 2. Esquema para la preparación de diluciones de agentes antimicrobianos insolubles en agua que se utiliza en caldo Prueba diluciones susceptibilidad. Los volúmenes de las soluciones de trabajo dalbavancina y diluyentes para la preparación de MIC definitivasoluciones Dalbavancina de 0,002 a 2 g / ml. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> La cepa de control de calidad </td><td> Esperado Dalbavancina MIC (mg / ml) </td></tr><tr><td> S. aureus ATCC 29213 </td><td> 0,03-0,12 </td></tr><tr><td> E. faecalis ATCC 29212 </td><td> 0,03-0,12 </td></tr><tr><td> S. pneumoniae ATCC 49619 </td><td> 0,008-0,03 </td></tr></tbody></table> Tabla 3. esperado Dalbavancina MIC Resultados para cepas de control de calidad 3, 11. Los resultados de control de calidad del CLSI para cepas sugeridas a ensayar junto con aislados clínicos con el fin de verificar la metodología adecuada <img alt="Tabla 4" src="/files/ftp_upload/53028/53028table4.jpg" /> Tabla 4. Distribución de Dalbavancina Resultados MIC (Número en cada MIC) de EE.UU. y Europa 2011 a 2.013 SurveillANCE Estudio 15. Dalbavancina resultados de CIM de un estudio publicado de aislados clínicos recientes como un indicador de dalbavancina actual actividad in vitro. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><colgroup></colgroup><tbody><tr><td rowspan="2"> Aislar # </td><td colspan="3"> Dalbavancina MIC (mg / ml) </td></tr><tr><td> DMSO 1 </td><td> DMSO 2 </td><td> DMSO 3 </td></tr><tr><td rowspan="3"> S. aureus ATCC 29213 </td><td> 0.12 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> 0.12 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td rowspan="3"> E. faecalis ATCC 29212 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td rowspan="2"><em&gt; S. pneumoniae ATCC 49619 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> 0.03 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td colspan="4"> DMSO 1 = llama sin abrir sellado 10 ml ampollas </td></tr><tr><td colspan="2"> DMSO 2 = botella 1L abierto frecuentes </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> DMSO 3 = botella 1L abierto frecuentes - se sentó en el banco en vaso de precipitados destapado durante 72 horas </td></tr></tbody></table> Tabla 5. Resultados Dalbavancina MIC (mg / ml) utilizando DMSO Stock y el Intermedio diluciones Preparación con DMSO de 3 fuentes. Los resultados de un estudio que comparaba MIC dalbavancina efecto del uso de diferentes disolventes de DMSO en la preparación de las acciones dalbavancina y diluciones intermedias. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td rowspan="2"> Aislar Número </td><td rowspan="2"> Replicar Número </td><td colspan="2"> Dalbavancina MIC (mg / ml) </td></tr><tr><td> Dalb w / P80 en DMSO </td><td> Dalb w / o P80 en DMSO </td></tr><tr><td rowspan="4"> S. aureus ATCC 29213 </td><td> 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> S. aureus DP80-002SA clínica </td><td> 1 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> S. aureus ATCC 700699 </td><td> 1 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td rowspan="4"> S. pneumoniae ATCC 49619 </td><td> 1 </td><td> 0.03 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 0.03 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 0.03 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 0.03 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td>S. pyogenes clínicos: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DP80-004PY </td><td> 1 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> DP80-005PY </td><td> 1 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> DP80-006PY </td><td> 1 </td><td> 0.03 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> DP80-007PY </td><td> 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> DP80-008PY </td><td> 1 </td><td> 0.03 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> S. agalactiae clínica: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DP80-009AG </td><td> 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0.12 </td></tr><tr><td> DP80-010AG </td><td> 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> DP80-011AG </td><td> 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> DP80-012AG </td><td> 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> S. dysgalactiae clinical DP80-013DY </td><td> 1 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> S. pneumoniae clínica: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DP80-014SP </td><td> 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> DP80-015SP </td><td> 1 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> DP80-016SP </td><td> 1 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> DP80-017SP </td><td> 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr></tbody></table> Tabla 6. Resultados Dalbavancina MIC utilizando DMSO Stock e Intermedio diluciones Preparación con y sin 0,002% P-80. Resultados de un estudio MIC dalbavancina que comparó el efecto de la adición de 0,002% P-80 a dalbavancina acciones y diluciones intermedias. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td rowspan="3"> Aislar </td><td rowspan="3"> Replicar Número </td&gt; <td colspan="4" rowspan="2"> Stock dilución Tubos </td><td colspan="4"> Placa de microtitulación (tipo de plástico) </td></tr><tr><td rowspan="2"> Poli-propileno, Greiner </td><td colspan="3"> Poliestireno </td></tr><tr><td> Vaso </td><td> Plástico </td><td> 1 hora de plástico </td><td> 1hr Plástico / 1 hora Intermedio </td><td> Greiner </td><td> Corning </td><td> Nunc </td></tr><tr><td rowspan="3"> S. aureus ATCC 29213 </td><td> 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.06 </td><td> 0.03 </td><td> 0.06 </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td rowspan="3"> E. faecalis ATCC 29212 </td><td&gt; 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.06 </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.06 </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.06 </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td rowspan="2"> S. pneumoniae ATCC 49619 </td><td> 1 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td><td> 0,008 </td><td> 0,008 </td><td> 0,008 </td><td> 0,008 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td><td> 0,008 </td><td> 0,015 </td><td> 0,008 </td><td> 0,008 </td></tr><tr><td colspan="10"> Glass = valores iniciales recogidas en botella de vidrio, utilizado inmediatamente para hacer la concentración intermedias en tubos de plástico, que se utiliza de inmediato para hacer diluciones caldo. </td></tr><tr><td colspan="10"> Plástico = Inicial social realizado en tubo de centrífuga de plástico, se utiliza inmediatamente para hacer concentraciones intermedias en tubos de plástico, que se utiliza de inmediato para hacer diluciones caldo. </td></tr><tr><td colspan="10"> Plástico 1 hr = valores inicial realizado en tubo de centrífuga de plástico, deje reposar en el banco durante 1 hora y luego se utiliza para hacer concentraciones intermedias en tubos de plástico, que se utiliza de inmediato para hacer concentraciones en caldo. </td></tr><tr><td colspan="10"> Plástico 1 hora / Intermedio 1 hr = valores inicial realizado en tubo de centrífuga de plástico, deje reposar en el banco durante 1 hora y luego se utiliza para hacer concentraciones intermedias en tubos de plástico, deje reposar en el banco durante 1 hora y luego se utiliza para hacer concentraciones en caldo. </td></tr></tbody></table> Tabla 7. Resultados Dalbavancina MIC utilizando diluciones de la preparación en plástico y vidrio Tubos y MIC Tipos de plástico Plate. Resultados ofa dalbavancina estudio MIC que comparó efecto del uso de tubos de plástico o de vidrio en la preparación de las soluciones madre y también efecto del uso de diferentes fuentes y tipos de plástico para placas de microtitulación.

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A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

Here, we present a protocol for determination of dalbavancin susceptibility of clinically relevant Gram-positive bacteria using a broth microdilution reference methodology.

Una referencia Caldo método de microdilución para Dalbavancina<em&gt; In Vitro</em&gt; Pruebas de Susceptibilidad de bacterias que crecen en aerobiosis

Antimicrobial susceptibility testing (AST) is performed to assess the in vitro activity of antimicrobial agents against various bacteria. The AST results, ...

a-reference-broth-microdilution-method-for-dalbavancin-vitro

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

28.7K vistas.  Laboratory Specialists, Inc. Here, we present a protocol for determination of dalbavancin susceptibility of clinically relevant Gram-positive bacteria using a broth microdilution reference methodology. 

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A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third most common infection in US hospitals. Different manifestations of candidiasis are associated with biofilm formation, both on host tissues and/or medical devices (i.e. catheters). Biofilm formation carries negative clinical implications, as cells within the biofilms are protected from host immune responses and from the action of antifungals. We have developed a simple, fast and robust in vitro model for the formation of C. albicans biofilms using 96 well microtiter-plates, which can also be used for biofilm antifungal susceptibility testing. The readout of this assay is colorimetric, based on the reduction of XTT (a tetrazolium salt) by metabolically active fungal biofilm cells. A typical experiment takes approximately 24 h for biofilm formation, with an additional 24 h for antifungal susceptibility testing. Because of its simplicity and the use of commonly available laboratory materials and equipment, this technique democratizes biofilm research and represents an important step towards the standardization of antifungal susceptibility testing of fungal biofilms.

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

We describe a simple, rapid and robust method for the formation of Candida albicans biofilms using 96 well microtiter plates and its utility in antifungal susceptibility testing of cells within biofilms.

A 96 de microtitulación y placa basada en el método para la formación de Control y pruebas de sensibilidad antifúngica Candida albicans Las biopelículas

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third ...

Investigación

Inmunología e Infección

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. Biofilms are community-associated bacteria attached to a surface and encased in a matrix. The role of the extracellular matrix is multifaceted, including facilitating nutrient acquisition, and offers significant protection against environmental stresses (e.g. host immune responses). In an effort to acquire a better understanding as to how the bacteria within a biofilm respond to environmental stresses we have used a protocol wherein we visualize bacterial biofilms which have formed in an 8-well chamber slide. The biofilms were stained with the BacLight Live/Dead stain and examined using a confocal microscope to characterize the relative biofilm size, and structure under varying incubation conditions. Z-stack images were collected via confocal microscopy and analyzed by COMSTAT. This protocol can be used to help elucidate the mechanism and kinetics by which biofilms form, as well as identify components that are important to biofilm structure and stability.

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

This article describes the procedure for the formation and visualization of a bacterial biofilm grown within an 8-well chamber slide

En la formación de biofilm in vitro en una diapositiva Cámara de 8 pocillos

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Antimicrobial Susceptibility Testing of Mycobacterium Tuberculosis Complex for First and Second Line Drugs by Broth Dilution in a Microtiter Plate Format

The rapid detection of antimicrobial resistance is important in the effort to control the increase in resistant Mycobacterium 
tuberculosis (Mtb). Antimicrobial susceptibility testing (AST) of Mtb has traditionally been performed by the agar method of proportion or by 
macrobroth testing on an instrument such as the BACTEC (Becton Dickinson, Sparks, MD), VersaTREK (TREK Diagnostics, Cleveland, OH) or BacT/ALERT (bioM&eacute;rieux, Hazelwood, MO). The agar proportion method, while considered the &#x201C;gold&#x201D; standard of AST, is labor intensive and requires calculation of resistance by performing colony counts on drug-containing agar as compared to drug-free agar. If there is &ge;1% growth on the drug-containing medium as compared to drug-free medium, the organism is considered resistant to that drug. The macrobroth methods require instrumentation and test break point ("critical") drug concentrations for the first line drugs (isoniazid, ethambutol, rifampin, and pyrazinamide). The method described here is commercially available in a 96 well microtiter plate format [MYCOTB (TREK Diagnostics)] and contains increasing concentrations of 12 antimicrobials used for treatment of tuberculosis including both first (isoniazid, rifampin, ethambutol) and second line drugs (amikacin, cycloserine, ethionamide, kanamycin, moxifloxacin, ofloxacin, para-aminosalicylic acid, rifabutin, and streptomycin). Pyrazinamide, a first line drug, is not included in the microtiter plate due to its need for acidic test conditions. Advantages of the microtiter system include both ease of set up and faster turn around time (14 days) compared with traditional agar proportion (21 days). In addition, the plate can be set up from inoculum prepared using either broth or solid medium. Since the microtiter plate format is new and since Mtb presents unique safety challenges in the laboratory, this protocol will describe how to safely setup, incubate and read the microtiter plate.

Antimicrobial susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis is challenging but critical for patient care. This microtiter plate format offers testing of 12 antimycobacterial drugs and provides minimum inhibitory concentration (MIC) values, which will aid in appropriate treatment.

Pruebas de susceptibilidad antimicrobiana de Mycobacterium tuberculosis complex para drogas de primera línea y la segunda por dilución en caldo en un formato de placa de microtitulación

The rapid detection of antimicrobial resistance is important in the effort to control the increase in resistant Mycobacterium 
tuberculosis (Mtb). ...

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in the thymus proper vasculature formation and patterning is essential for thymocyte entry into the organ and mature T-cell exit to the periphery. The spatial arrangement of blood vessels in the thymus is dependent upon signals from the local microenvironment, namely thymic epithelial cells (TEC). Several recent reports suggest that disruption of these signals results in thymus blood vessel defects 1,2. Previous studies have described techniques used to label the neonatal and adult thymus vasculature 1,2. We demonstrate here a technique for labeling blood vessels in the embryonic thymus. This method combines the use of FITC-dextran or Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I (GSL 1 - isolectin B4) facial vein injections and CD31 antibody staining to identify thymus vascular structures and PDGFR-&beta; to label thymic perivascular mesenchyme 3-5. The option of using cryosections or vibratome sections is also provided. This protocol can be used to identify thymus vascular defects, which is critical for defining the roles of TEC-derived molecules in thymus blood vessel formation. As the method labels the entire vasculature, it can also be used to analyze the vascular networks in multiple organs and tissues throughout the embryo including skin and heart 6-10.

This article describes a method for labeling embryonic skin and thymus blood vessels.

Un método para etiquetar los Vasos sanguíneos en embriones de ratones

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional identification requires the sub-culture of signaled blood culture broth with identification available only after colonies on solid agar have matured. MALDI-TOF MS is a reliable, rapid method for identification of the majority of clinically relevant bacteria when applied to colonies on solid media. The application of MALDI-TOF MS directly to blood culture broth is an attractive approach as it has potential to accelerate species identification of bacteria and improve clinical management. However, an important problem to overcome is the pre-analysis removal of interfering resins, proteins and hemoglobin&#160;contained in blood culture specimens which, if not removed, interfere with the MS spectra and can result in insufficient or low discrimination identification scores. In addition it is necessary to concentrate bacteria to develop spectra of sufficient quality. The presented method describes the concentration, purification, and extraction of Gram negative bacteria allowing for the early identification of bacteria from a signaled blood culture broth.

The application of matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) directly to blood culture broth expedites the identification of bacteria. The presented method is a rapid and reliable method for identification of Gram negative bacteria directly from blood culture broth.

La identificación rápida de bacterias gram negativas de Cultura sangre caldo de cultivo utilizando MALDI-TOF espectrometría de masas

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a rapid identification of the infectious agent to guide optimal antibiotic treatment. The analysis of Gram stains from positive blood culture can be rapidly conducted and already significantly impact the antibiotic regimen. However, the accurate identification of the infectious agent is still required to establish the optimal targeted treatment. We present here a simple and fast bacterial pellet preparation from a positive blood culture that can be used as a sample for several essential downstream applications such as identification by MALDI-TOF MS, antibiotic susceptibility testing (AST) by disc diffusion assay or automated AST systems and by automated PCR-based diagnostic testing. The performance of these different identification and AST systems applied directly on the blood culture bacterial pellets is very similar to the performance normally obtained from isolated colonies grown on agar plates. Compared to conventional approaches, the rapid acquisition of a bacterial pellet significantly reduces the time to report both identification and AST. Thus, following blood culture positivity, identification by MALDI-TOF can be reported within less than 1 hr whereas results of AST by automated AST systems or disc diffusion assays within 8 to 18 hr, respectively. Similarly, the results of a rapid PCR-based assay can be communicated to the clinicians less than 2 hr following the report of a bacteremia. Together, these results demonstrate that the rapid preparation of a blood culture bacterial pellet has a significant impact on the identification and AST turnaround time and thus on the successful outcome of patients suffering from bloodstream infections.

A rapid bacterial pellet preparation from a positive blood culture can be used as a sample for applications such as identification by MALDI-TOF, Gram staining, antibiotic susceptibility testing and PCR-based test. The results can be rapidly communicated to clinicians to improve the outcome of patients suffering from bloodstream infections.

Preparación de una Cultura de pellets de sangre para Rapid bacteriana Identificación y Prueba de Susceptibilidad a los antibióticos

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

In Vitro El desmontaje de virus de influenza A cápsides por centrifugación en gradiente

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

Establecimiento de un programa de instalación de alto rendimiento para la detección de pequeñas moléculas que modulan la c-di-GMP Señalización en el<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in the caseous cores of cavities and lesions is especially crucial because they harbor subpopulations of drug-tolerant bacteria also commonly referred to as persisters. Existing methods for the measurement of drug penetration in tuberculosis lesions involve costly and time-consuming in vivo pharmacokinetic studies coupled to bioanalytical or imaging techniques. The in vitro measurement of drug binding to caseum macromolecules was proposed as an alternative to such techniques since this binding hinders the passive diffusion of drug molecules through caseum. Rapid equilibrium dialysis is a fast and reliable system for performing plasma protein and tissue binding studies. In this protocol, we used a rapid equilibrium dialysis (RED) device to measure drug binding to homogenates of caseum that is excised from the lesions and cavities of tuberculosis-infected rabbits. The protocol also describes how to generate a surrogate matrix from lipid loaded THP-1 macrophages to use in place of caseum. This caseum/surrogate binding assay is an important tool in tuberculosis drug discovery and can be adapted to help study drug distribution in lesions or abscesses caused by other diseases.

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Here we describe a rapid equilibrium dialysis (RED) method to measure drug binding to caseum from pulmonary tuberculosis lesions and cavities. The protocol is also used with a foamy macrophage-derived matrix that is an effective surrogate to caseum.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Caseosa Ensayo de unión que permite predecir la penetración de fármacos en la tuberculosis lesiones

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

La neuraminidasa Ensayo de inhibición basado en la fluorescencia para evaluar la susceptibilidad de los virus de la influenza a El Inhibidor de la neuraminidasa clase de antivirales

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...