Prior work with regard to susceptibility testing of dalbavancin has been valuable in development of a standardized methods and acknowledgement for this work is given to JMI Laboratories, Robert Rennie and Beth Goldstein.

הערה: עיין במסמכי CLSI M7-A10 וM100-S25 ו / או ISO / FDIS 20,776-1 לפרטים מלאים של שיטת microdilution מרק ההתייחסות לרגישות מיקרוביאלית 2, 3, 4 שיטות ההתייחסות לאפשר לאפשרויות בחלק מ. נהלים ספציפיים לייצור הכנת הבידוד ופנל MIC כדי להשיג את אותה תוצאה סופית. השיטה המפורטת כאן מתייחסת לסוכן, dalbavancin אחד מיקרוביאלית, וחלק מהצעדים מייצג את אחד עלול להיות כמה דרכים הליך ההתייחסות ניתן לעשות. אמצעי בטיחות מתאימה (בקנה אחד עם רמת בטיחות ביולוגית 2) צריך להיות מנוצל 10. פורמט פנל MIC משמש לצורך פרסום וידאו זה מוצג בטבלה 1. 1. חנות Dalbavancin אבקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם קבלת אבקת dalbavancin הכיתה אבחון, חנות ב -20 מעלות צלסיוס בסביבה מיובשת בהקפאת הפשרה שאינה. לפני השימוש, האבקה צריכה לאזן ללהגיע RT לפני הפתיחה. </li></ol> 2. הכן דילולי MIC לוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות לא נעלה על 1,600 מיקרוגרם / מיליליטר של dalbavancin בDMSO המסודר (הטהור) בצינורות זכוכית או פלסטיק סטרילי, ולהשתמש באותו היום של הכנה או חנות ב -20 לC -60 o או מתחת לשימוש עתידי ב מקפיא ההפשרה אינה. קח בחשבון את העוצמה של dalbavancin כאמור בתיעוד קיבל עם האבקה, כאשר במשקל האבקה (ראה המשוואה 1 לדוגמא 800 מיקרוגרם / הכנת מניית מיליליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את מניות הדילול דומה לתכנית כפי שמוצג בטור 1 (&quot;ריכוז מקור&quot;) בטבלה 2 עם DMSO המסודר בצינורות זכוכית או פלסטיק סטרילי. השתמש pipet אחד למדידת diluent וpipet אחר להוספת מניית dalbavancin הראשונית לצינור הראשון. לכל ריכוז מניית dalbavancin לאחר מכן להשתמש pipet חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן concent לוח MIC הסופי 100Xדילולים מנה (ריכוזי ביניים) עם DMSO המסודר. כפי שמוצג בעמודים 2-4 בטבלה 2, לשלב כרכים מתאימים של מקור וDMSO כדי להשיג ריכוז ביניים רצוי (כרכים לשמש יהיו תלוי במספר פנלי MIC להתבצע). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 0.004% P80: הכן פתרון מניות עובד טרי של P80 2% על ידי הוספת P80 0.1 מיליליטר ל -4.9 מיליליטר DH 2 א &#39; לעקר על ידי עובר דרך פתרון סינון ושימוש 0.22 מיקרון באותו היום של הכנה. הכן 0.004% diluent P80 על ידי הפיכת 1: P80 500 דילול של 2% (לדוגמא, 0.3 מיליליטר של 2% P80 ל149.7 מיליליטר של CAMHB). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהמשך לדלל את ריכוזי ביניים מוכנים בשלב 2.2 1: 100 במרק קטיון הותאם מולר הינטון (CAMHB) בתוספת 0.004% (V / V) polysorbate-80 (P-80) P-80 ו / או LHB (לסטרפטוקוקוס) הוסיפה בכפול הריכוז הסופי כי תוספת של הבידוד (שלב 4.3) תגרום לדילול 1: 2. ראו עמודים 6 ו -7 בטבלה 2 </stRong&gt;. </li></ol> 3. להכין פנלי MIC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 50 μl של כל פתרון dalbavancin מוכן בשלב 2.3 לתוך בארות מתאימות של לוח MIC וכולל תקשורת רק באחד היטב (שליטת צמיחה גם). Pipet רב ערוצית עם טיפים סטרילי יכול לשמש לצעד זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בלוחות מייד או לאטום עם סרט פלסטיק, מקום בשקיות ניילון ומניח מייד במקפיא שאינו הפשרה ב- 20 ≤ o C (רצוי ב- 60 ≤ o C) עד צורך. אם לוחות קפוא משמשים, להסיר חותמות ולמקם את הלוחות בודדים במעבדת ספסל במשך 15-30 דקות (עד שהתוכן גם הם הפשירו) לפני שתמשיכו לחיסון פנל. </li></ol> 4. לחסן פנלי MIC, בצע ספירת טהרה ומושבת ההתקנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר כמה מושבות מבודדות היטב מאגר דם 18-24 שעות או צלחת אגר הלא סלקטיבי אחר. לגעת בחלק העליון של כל מושבה עם לולאה סטרילית או מטלית והעברה לCAMHB מיליליטר 1-5 או שלאלין עד העכירות הוא שווה ערך לסטנדרטי מק &#39;פרלנד 0.5. להעריך עכירות על ידי השוואה ויזואלית למק &#39;פרלנד 0.5 או עם מכשיר photometric. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך 15-30 דקות של הכנה, לדלל את הבידוד 1: 100 בCAMHB (10 מיליליטר לCAMHB 100 μl). עבור רוב החיידקים שנבדקו נגד dalbavancin, למעט ס pneumoniae, דילול זה יספק ריכוז גם סופי של 5 x 10 5 CFU / מיליליטר (טווח מקובל הוא 2-8 x 10 5 CFU / ml). לס pneumoniae, ריכוז חיידקים המבוסס על השוואה של עכירות למק &#39;פרלנד 0.5 הוא בדרך כלל הרבה פחות, ולכן, לדלל את הבידוד 01:25 (400 μl לתוך 10 מיליליטר CAMHB + 10% + LHB). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך 15 דקות לאחר הכנת הבידוד, להעביר 50 μl של הבידוד הסופי היטב כל אחד (עם חריג של שליטת העקרות גם) של לוח MIC מוכן בשלב 3. pipet רב ערוצית באמצעות טיפים סטרילי יכול לשמש לצעד זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע בדיקת טוהרעל ידי העברה והפצת aliquot 1-10 μl משליטת הצמיחה החיובית גם באמצעות לולאה סטרילי לאגר סלקטיבי (לדוגמא, אגר סויה trypticase עם 5% דם כבשים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת מושבה התקנה על ידי הסרת 10 μl משליטת הצמיחה היטב עם pipet ערוץ אחד וקצה סטרילי ולהעביר 10 מיליליטר של תמיסת מלח (1: 1,000 דילול). לערבב ולהעביר עם pipet ערוץ אחד וקצה סטרילי 100 μl למדיום מתאים, לא סלקטיבי אגר (למשל, אגר trypticase סויה עם 5% דם כבשים) ומשתרע על פני השטח אגר כל עם לולאת סטרילי, חוזר פעמיים בכיוונים שונים כדי להבטיח חלוקה שווה של הבידוד (דילול 1:10). </li></ol> 5. פנלי דגירה MIC, מושבה רוזן וצלחות טוהר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום כל פנל או ערימת MIC של לא יותר מ 4 פנלים בשקית ניילון, עם סרט פלסטי או עם כיסוי פלסטיק צמוד לפני דוגרים. לחלופין, למקם את פנל MIC ריק על top של ערימה של לא יותר מ 4 פנלי MIC, למקם מגבת נייר לחה במכל פלסטיק, לוחות MIC המקום במכל הפלסטיק ומכל קרוב מאובטח עם מכסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה לוחות MIC בחממת אוויר סביבה ב 35 ° C ± 2 מעלות צלזיוס במשך 16-20 שעות (staphylococci וenterococci) ו20-24 שעות (סטרפטוקוקוס) בתוך 30 דקות של חיסון. דגירה ספירת המושבה וצלחות טוהר תחת אותם תנאים מלבד סטרפטוקוקוס דגירה ב5% CO 2 באינקובטור. </li></ol> 6. קראו MIC ומושבת רוזן צלחות; בדוק פלייט טוהר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו MIC כריכוז הנמוך ביותר שמעכב צמיחת חיידקים בבארות כפי שזוהה על ידי בעין בלתי מזוינת לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת מושבות על צלחת ספירת מושבה. הכפל כל מושבה על ידי גורם דילול (1: 10,000) (לדוגמא, 50 מושבות היא שווה ערך ל 5 x 10 5 CFU / ml). טווח מקובל הוא 20-80 מושבות (2-8 x 10 5 CFU / ml) ומשמש כapproקו מנחה ximate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק צלחת טוהר. אם כל המושבות דומות למושבות משמשות בשלב 4.1, ולאחר מכן את הבידוד יכול להיחשב טהור. אם יש מושבות אחרות בהווה, אז יש פוטנציאל לזיהום להיות נוכח בלוח MIC והבדיקה יש לחזור. </li></ol> תוצאות בקרת איכות 7. בדוק. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיין בטבלה 3 לטווחים צפויים של זני בקרת איכות CLSI. לדווח רק תוצאות של בדיקה מבודדת אם תוצאות MIC dalbavancin לאורגניזם בקרת איכות (ים) נמצאות בטווח הצפוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם MIC של ≥0.25 מיקרוגרם / מיליליטר מתקבל לכל ס קליני aureus לבודד, לחזור על בדיקות MIC dalbavancin ו / או לשלוח למעבדה התייחסות לאימות. </li></ol>

<ol>
	<li>Boucher, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Once-weekly+dalbavancin+versus+daily+conventional+therapy+for+skin+infection.">Once-weekly dalbavancin versus daily conventional therapy for skin infection.</a> The New England journal of medicine. 370, 2169-2179 (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> M07-A10. Methods for Dilution Antimicrobial Tests for Bacteria that Grow Aerobically.: Approved Standard. , (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> M100-S25. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-Fifth Informational Supplement. , (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+laboratory+testing+and+in+vitro+diagnostic+test+systems+--+Susceptibility+testing+of+infectious+agents+and+evaluation+of+performance+of+antimicrobial+susceptibility+test+devices+--+Part+1:+Reference+method+for+testing+the+in+vitro+activity+of+antimicrobial+agents+against+rapidly+growing+aerobic+bacteria+involved+in+infectious+diseases.">Clinical laboratory testing and in vitro diagnostic test systems -- Susceptibility testing of infectious agents and evaluation of performance of antimicrobial susceptibility test devices -- Part 1: Reference method for testing the in vitro activity of antimicrobial agents against rapidly growing aerobic bacteria involved in infectious diseases.</a> ISO/FDIS. 20776-1, (2006).</li><li>Jones, R. N., Farrell, D. J., Flamm, R. K., Sader, H. S., Dunne, M. W., Mendes, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surrogate+analysis+of+vancomycin+to+predict+susceptible+categorization+of+dalbavancin.">Surrogate analysis of vancomycin to predict susceptible categorization of dalbavancin.</a> Diagn Microbiol Infect Dis. , (2015).</li><li>Turnidge, J., Paterson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Setting+and+revising+antibacterial+susceptibility+breakpoints.">Setting and revising antibacterial susceptibility breakpoints.</a> Clinical microbiology reviews. 20, 391-408 (2007).</li><li>Rennie, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+broth+microdilution+antimicrobial+susceptibility+test+results+for+dalbavancin,+a+new+glycopeptide+agent.">Factors influencing broth microdilution antimicrobial susceptibility test results for dalbavancin, a new glycopeptide agent.</a> Journal of clinical microbiology. 45, 3151-3154 (2007).</li><li>Arhin, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+polysorbate+80+on+oritavancin+binding+to+plastic+surfaces:+implications+for+susceptibility+testing.">Effect of polysorbate 80 on oritavancin binding to plastic surfaces: implications for susceptibility testing.</a> Antimicrobial agents and chemotherapy. 52, 1597-1603 (2008).</li><li>Farrell, D. J., Mendes, R. E., Rhomberg, P. R., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+reference+broth+microdilution+method+for+testing+telavancin:+effect+on+MIC+results+and+correlation+with+other+testing+methodologies.">Revised reference broth microdilution method for testing telavancin: effect on MIC results and correlation with other testing methodologies.</a> Antimicrobial agents and chemotherapy. 58, 5547-5551 (2014).</li><li>Ribbon Panel, B. l. u. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+Safe+Work+Practices+in+Human+and+Animal+Medical+Diagnostic+Laboratories.">Guidelines for Safe Work Practices in Human and Animal Medical Diagnostic Laboratories.</a> MMWR Supplements. 61 (01), 1-101 (2012).</li><li>Anderegg, T. R., Biedenbach, D. J., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+quality+control+evaluations+for+susceptibility+testing+of+Dalbavancin+(BI397),+an+investigational+glycopeptide+with+potent+gram-positive+activity.">Initial quality control evaluations for susceptibility testing of Dalbavancin (BI397), an investigational glycopeptide with potent gram-positive activity.</a> Journal of clinical microbiology. 41, 2795-2796 (2003).</li><li>Koeth, L. M., Windau, A. R., Goldstein, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Broth+Microdilution+and+Agar+Dilution+Dalbavancin+and+Vancomycin+MIC+Results+for+42+Aerobic+Gram-positive+Bacteria.+Poster+132.">Comparison of Broth Microdilution and Agar Dilution Dalbavancin and Vancomycin MIC Results for 42 Aerobic Gram-positive Bacteria. Poster 132.</a> ASM. , (2012).</li><li>Fritsche, T. R., Rennie, R. P., Goldstein, B. P., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+dalbavancin+MIC+values+determined+by+Etest+(AB+BIODISK)+and+reference+dilution+methods+using+gram-positive+organisms.">Comparison of dalbavancin MIC values determined by Etest (AB BIODISK) and reference dilution methods using gram-positive organisms.</a> Journal of clinical microbiology. 44, 2988-2990 (2006).</li><li>Mushtaq, S., Warner, M., Johnson, A. P., Livermore, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+dalbavancin+against+staphylococci+and+streptococci,+assessed+by+BSAC+and+NCCLS+agar+dilution+methods.">Activity of dalbavancin against staphylococci and streptococci, assessed by BSAC and NCCLS agar dilution methods.</a> The Journal of antimicrobial chemotherapy. 54, 617-620 (2004).</li><li>Jones, R. N., Flamm, R. K., Sader, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveillance+of+dalbavancin+potency+and+spectrum+in+the+United+States+(2012).">Surveillance of dalbavancin potency and spectrum in the United States (2012).</a> Diagnostic microbiology and infectious disease. 76, 122-123 (2013).</li></ol>

סנדרה מק&#39;קרדי הנו עובד Therapeutics Durata; מומחי מעבדה, Inc, מעסיק של לורה Koeth וJeanna פישר, היה חוזה על ידי Therapeutics Durata להכין את כתב היד. עמלות פרסום לכתבה זו שולמו על ידי מומחי מעבדה, Inc.

פרטי השיטה הבאות מוצגים לשיקולים נוספים בעת הכנה לבדיקת MIC dalbavancin. העיצוב של לוח MIC יהיה תלוי במספר סוכני מיקרוביאלית להיבדק (כלומר., Dalbavancin לבד או סוכנים מרובים) והמינים של חיידקים להיבדק. ריכוזי dalbavancin צריכים להקיף את נקודות העצירה הפרשניות לכל מיני החיידקים שנבדקו ואת כל הטווח של דילולים צפויים לפחות אחד זן QC. סדרת דילול מיקרוביאלית יכולה להיות מאורגנת בשורות או עמודות בהתאם למספר סוכני מיקרוביאלית ו / או מבודד / צלחת ושיטה של ​​חיסון. הנפח של אבקת מרק dalbavancin וצריך להיות מחושב כדי להבטיח שכמויות אופטימליות מיוצרות והפסולת היא מינימאלית. לדוגמא בשימוש בפרסום זה, כרכים מבוססים על הכנת שני פנלי MIC. מרק מילר הינטון קטיון הותאם צריך להיות מוכן וautoclaved לפי אדםההוראות ועקרות של התקשורת של ufacturer מאומתים. לוחות MIC יכולים להתבצע ומשמשים באותו יום של הכנה או שהם יכולים להיבדק עם אורגניזמים בקרת האיכות מתאימים ולוחות תוקף מאוחסנים קפוא לשימוש עתידי. חשוב להשתמש בטכניקות סטרילי לאורך כל ההליך. אין קריטריונים נוקשים לאימות של ריכוז הבידוד עם ספירת מושבה. ספירת מושבה יכולה להיבדק בתחילה לכל מינים נבדקו ו / או מעת לעת כדי לאמת את צעד הדילול מתבצע בשלב 4.2. חשוב שהתוקף של תקן מק &#39;פרלנד 0.5 גם בדק באופן שיגרתי עם E. coli ATCC 25922 באמצעות הליך דומה לצעד 4.5. אם התוצאות אינן שווה ערך ל1-2 x 10 8 CFU / ml, יש לקבל סטנדרטי מק &#39;פרלנד 0.5 חדש. אם ספירת המושבה מבארות MIC נמצא מחוץ לטווח המקובל (2-8 10 5 CFU תוצאות x / מיליליטר וMIC לבודד הקליני (ים) משתנות מהדואר צפוי התפלגות נורמלית (לדוגמא. 0.03-.12 UG / מיליליטר לS. aureus) ו / או תוצאות MIC לבודד בקרת איכות (ים) נמצאות מחוץ לטווח צפוי, בדיקות אימות היא הכרחיות ושינוי שיטה עשוי להיות מוצדקים. הוא הציע כי 0.5 סטנדרטי מק &#39;פרלנד תוקף משמש לחזור על ספירת המושבה (ים), ואם תוצאות הן שוב מחוץ לתוצאות צפויות, דילול הבידוד כפי שבוצע בשלב 4.2 צריך להיות בהתאם וMIC חוזר ונשנה. שים לב שבדיקת טוהר היא הכרחית גם אם ספירת מושבה מתבצעת כי הליך ספירת המושבה משתמש נפח מדולל שלא בהכרח לזהות ריכוזים נמוכים של אורגניזמים מזהמים. לבדיקת MIC להיחשב חוקית, צמיחה מקובלת חייבת להתרחש בשליטת הצמיחה גם. עבור רוב החיידקים שייבחנו נגד dalbavancin (כלומר., Staphylococci, סטרפטוקוקוס וenterococci, צמיחה שנראה כמו כפתור (בדרך כלל&gt; 2 מ&quot;מ) ופחות frequently, צמיחה עשויה להופיע כעכירות בבאר. בניגוד לכמה סוכני מיקרוביאלית שעשויה להפגין נגררים השפעת הריכוזים להגדיל, נקודות קצה dalbavancin מוגדרות בדרך כלל היטב. ישנם מכשירים שונים שנועדו להקל על הצפייה בדיקות microdilution הקריאה, אשר עשוי לשמש לקריאת צלחות המכילות dalbavancin כל עוד אין פשרה ביכולת להבחין בצמיחת הבארות. השלבים הקריטיים בפרוטוקול הקשורות לחלקים של ההליך שאינם קשורים למסיסות של dalbavancin ותוספת של P80. חשוב שאת הריכוז המרבי של dalbavancin משמש הוא לא יותר מ -1,600 / מיקרוגרם מיליליטר, DMSO המשמש כממס וכי ריכוזי ביניים ערוכים DMSO לפני ביצוע דילולים המרק כך שהריכוז הסופי של DMSO בMIC פנל הבארות אינן עולים על 1%. DMSO הוא hygroscopic ולכן, השימוש בבקבוקים ישנים יותר של DMSO היה consideratיון ביחס למסיסות dalbavancin. עם זאת, בעוד שמחקר BMD קטן עם זני בקרת האיכות הוכיח את זה לא כדי להיות משתנה חשוב (ראה סעיף תוצאות), זה תרגול טוב להשתמש בבקבוקים חדשים או שנפתחו לאחרונה של DMSO. כמו כן, חשוב שP80 מתווסף המרק בשלב האחרון של הכנת דילול תרופה והוא בריכוז סופי של 0.002% בMIC כן. הליך BMD כלול כאן מנצל הכנת לוחות MIC באמצעות 50 μl / גם בdalbavancin ו- P-80 ריכוזים שתי פעמים הריכוז הסופי ותוספת של הבידוד עם 50 μl / כל כך טוב שנפח סופי / גם הוא 100 μl. שיטה זו מאפשרת לפורמט פנל MIC אחד להיות מיוצר לבדיקה של שני ס aureus וס pneumoniae כי דם סוס lysed ניתן להוסיף לבידוד. שיטות אלטרנטיביות להכנת לוחות MIC באמצעות 100 μl / גם עם תוספת של עד 10 μl / גם מתוארות בנהלי CLSI ו- ISO. נקודת העצירה רגישה dalbavancin לס aureus הוא ≤0.12 מיקרוגרם / מיליליטר (עלון FDA). כפי שמוצג במעקב האחרון, רוב מבודדים מעוכבים על ידי dalbavancin ברמות של 0.06 מיקרוגרם / מיליליטר 15. עם נקודת עצירה רגישה קרוב לMIC מודאלית, כל שינוי בMIC כתוצאה מהבדלים בשיטה יכול להשפיע על שיעורי רגישות. בגלל הליך BMD לdalbavancin כולל כמה שלבים ייחודיים (במיוחד, השימוש בDMSO בהכנת מניות ודילולי תרופת ביניים וP80 0.002% בMIC טוב, זה הכרחי כי השיטה המיושמת בדיוק. האורגניזם S. aureus QC (ATCC 29,213) עם MIC מודאלי dalbavancin מאוד ברור של 0.06 מיליליטר מיקרוגרם /, היה אינדיקטור טוב של וריאציה שיטה ויש להשתמש באופן שיגרתי כדי לאמת את שיטת BMD. אם תוצאות MIC הן עם הטווח הצפוי של .03-.12 מיקרוגרם / מיליליטר, אך במגמה לאו נמוך או HIGצד שעות של טווח זה, אימות נוספת של השיטה היא מוצדקת. התוספת של P80 0.002% מומלצת לכל היצורים גרם-חיובי רלוונטי (staphylococcci, enterococci, וסטרפטוקוקוס.) עם זאת, ראוי לציין כי זה כבר הראה כי lysed דם סוס פועל בדומה לP-80 ביחס לה אנטי-מחייב יכולת וכי התוספת של P-80 לCAMHB + LHB אין כל השפעה נוספת על תוצאות MIC סטרפטוקוקוס dalbavancin. אין כרגע שיטת דיפוזיה דיסק לdalbavancin בדיקות ובגלל עניי המתאם של BMD ותוצאות הספירה, בדיקת רגישות של dalbavancin בשיטת הספירה אינו מומלצת 12, 14. שיטת BMD צריכה לשמש להערכה העתידית של רגישות dalbavancin וכתקן זהב לפיתוח בדיקות רגישות מיקרוביאלית מסחריות.

Dalbavancin הוא lipoglycopeptide חצי סינטטי שאושר על ידי ה- FDA מאי 2014 לטיפול בדלקות עור ומבנה עור חיידקים חריפים הנגרמות על ידי אורגניזמים גרם-חיובי 1. המטרה העיקרית של שיטה זו מפרטת בפורמט וידאו היא לספק הדרכה ברורה למדענים במעבדה ומחקרים הקליניים לבדיקה ודיווח של תוצאות רגישות dalbavancin מדויקות ושחזור. הנחישות של סוכן מיקרוביאלית MIC בשיטות מסחריות מבוצעת באופן שגרתי במעבדות קליניות להערכת הפעילות במבחנה של סוכן נגד חיידקים פתוגניים. השיטה המתוארת כאן היא שיטת microdilution מרק כפי שהומלץ על ידי CLSI וISO 2,3,4. מאז dalbavancin שיטות רגישות מסחריות אינן זמינות כעת (בזמן של פרסום זה) ודיפוזיה דיסק ושיטות דילול אגר אינם מומלצים F כרגעאו dalbavancin, שיטות דילול מרק התייחסות הן האפשרויות הזמינות הנוכחיות 12,14. כשיטת התייחסות זו היא לא מסחרית וFDA פינה במבחנה שיטת אבחון, מעבדות קליניות בארה&quot;ב המשתמשת בהליך זה לבדיקת מטופל חייב לציית לדרישות הרגולטוריות לבדיקת מעבדה פיתחה (LDT). זה צפוי כי ככל שעולה שימוש dalbavancin, תהיה יותר מעבדות צורך לבדוק מתחם זה. בדיקות Vancomycin כתחליף לקביעת רגישות dalbavancin של ס aureus אומת 5. עם זאת, dalbavancin עשוי להיות פעיל נגד ס ביניים vancomycin aureus (ויזה) ולכן, רופאים יכולים לבקש תוצאות MIC dalbavancin. בנוסף, תוצאות MIC למיני חיידקים אחרים ניתן לבקש. נקודת העצירה רגישה FDA לdalbavancin נגד ס aureus כבר נקבע ב≤0.12 מיקרוגרם / מיליליטר. ה- FDA הוקצה רק susceptiהקטגוריה ble בגלל המחסור בנתונים על בידודים עמידים. הפצת MIC הנורמלית בין הסוג בר ס aureus המבודד הוא בין 0.03-.12 מיקרוגרם / מיליליטר, עם MIC מודאלי ברור של 0.06 מיקרוגרם / מיליליטר. וריאציה קלה בתוצאות MIC בשל הבדל בשיטה, בנוסף לוריאצית BMD הטבועה של ± אחד דילול, עלולה להיות השפעה משמעותית על שיעורי הרגישות. 6 דומים לסוכני lipoglycopeptide אחרים, בדיקת רגישות dalbavancin יכולה להיות מאתגרות כתוצאה של מסיסות והגודל גדול יחסית של המולקולה ומאפייניה מחייבים 7,8,9. שיטת BMD ההתייחסות המתוארת כאן כוללת שני צעדים ספציפיים שהנם ייחודיים לסוכנים מסיסים ו / או סוכני lipoglycopeptide: (1) השימוש בDMSO להכנת פתרונות מניות ו( 2) תוספת של 0.002% P-80 בלוח MIC הסופי דילולים. המטרה של פרסום וידאו זה היא לספק בהירות לשיטת BMD dalbavancin ולspecifically להתמקד בצעדים מפתח אלה, כדי להבטיח תוצאות MIC מדויקות ושחזור.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dalbavancin</td>
			<td>Metrics, Inc.</td>
			<td>Greenville, NC</td>
			<td>BI-397</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vancomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>St. Louis, MO</td>
			<td>C5793</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cation Adjusted Mueller Hinton Broth</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>Sparks, MD</td>
			<td>212322</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysed horse blood</td>
			<td>Cleveland Scientific</td>
			<td>Bath, OH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dose-it peristaltic pump</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>Hudson, NH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-channel pipet (Viaflo II)</td>
			<td>Integra</td>
			<td>Hudson, NH</td>
			<td>4164</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 channel pipet (Matrix)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Waltham, MA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channelpPipets (Ovation 10 &#181;L - 100 &#181;L)</td>
			<td>VistaLab</td>
			<td>Brewster, NY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well microplate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>Monroe, NC</td>
			<td>650161</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL flat cap conical bottom centrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Waltham, MA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16x125mm disposable glass tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Waltham, MA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12x17mm snap cap, polystyrene tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Waltham, MA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 mL centrifuge tubes</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>Kaysville, UT</td>
			<td>C-3394-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent reservoirs</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>Hudson, NH</td>
			<td>4312</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable sterilelLoops (1 uL &#38; 10 uL)</td>
			<td>Biologix</td>
			<td>Lenexa, KA</td>
			<td>65-0001,65-0010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soy agar + 5% sheep blood</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>Sparks, MD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (ambient)</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (5% CO2)</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Waltham, MA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td></td>
			<td>52817</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab coats</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a reference broth microdilution method for dalbavancin in vitro susceptibility testing of bacteria that grow aerobically

בדיקת רגישות מיקרוביאלית (AST) מתבצעת על מנת להעריך את הפעילות במבחנה של סוכני מיקרוביאלית נגד חיידקים שונים. תוצאות AST, שבאות לידי ביטוי כריכוזים מעכבים מינימליים (מיקרופונים) משמשות במחקר לפיתוח ולניטור מיקרוביאלית של פיתוח עמידות ובהגדרה הקלינית להדרכת טיפול אנטיביוטיה. Dalbavancin הוא סוכן מיקרוביאלית lipoglycopeptide חצי סינטטי שאושר מאי 2014 על ידי מנהל המזון והתרופות אמריקניות (FDA) לטיפול בדלקות עור ומבנה עור חיידקים חריפים הנגרמות על ידי אורגניזמים גרם-חיוביים. היתרון של dalbavancin על טיפולים אנטי-staphylococcal הנוכחיים הוא זמן מחצית החיים הארוכים שלה, המאפשר למינון של פעם בשבוע. יש Dalbavancin פעילות נגד Staphylococcus aureus (כולל שני וmethicillin-רגיש S. aureus [MSSA] methicillin-resistant S. aureus [MRSA]) staphylococci, coagulase-שלילי, <em&gt; Streptococcus pneumoniae, קבוצת סטרפטוקוקוס anginosus, סטרפטוקוקוס β-המוליטית וenterococci רגיש vancomycin. בדומה לסוכנים אחרים האחרונים lipoglycopeptide, אופטימיזציה של שיטות בדיקת רגישות CLSI ומרק ISO כולל את השימוש של sulfoxide דימתיל (DMSO) כממס בעת הכנת פתרונות מניות וpolysorbate 80 (P80) כדי להקל על דבקותו של הסוכן לפלסטיק. לפני המחקרים הקליניים ובפיתוח הראשוני של dalbavancin, מחקרי רגישות לא בוצעו תוך השימוש בP-80 ותוצאות MIC נטו להיות גבוה פי 2-4 ובאופן דומה הגבוה MIC תוצאות שהושגו עם שיטת רגישות הדילול אגר. Dalbavancin נכלל לראשונה בשולחנות מתודולוגיה microdilution מרק CLSI בשנת 2005 ותוקן בשנת 2006 כדי להבהיר שימוש בDMSO ו- P-80. Microdilution מרק ההליך (BMD) מוצג כאן הוא ספציפי לdalbavancin והנו בהתאם לשיטות CLSI ו- ISO, עם פירוט וfoc צעד-אחר-צעדשלנו בשלבים הקריטיים הוסיף לבהירות.

Watch this Scientific Journal Video about A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically at JoVE.com

A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

Here, we present a protocol for determination of dalbavancin susceptibility of clinically relevant Gram-positive bacteria using a broth microdilution reference methodology.

Microdilution שיטת ההפניה מרק לDalbavancin<em&gt; במבחנה</em&gt; בדיקה של רגישות חיידקים שגדלות אירובי

Antimicrobial susceptibility testing (AST) is performed to assess the in vitro activity of antimicrobial agents against various bacteria. The AST results, ...

a-reference-broth-microdilution-method-for-dalbavancin-vitro

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

28.7K Views.  Laboratory Specialists, Inc. Here, we present a protocol for determination of dalbavancin susceptibility of clinically relevant Gram-positive bacteria using a broth microdilution reference methodology. 

Video: A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third most common infection in US hospitals. Different manifestations of candidiasis are associated with biofilm formation, both on host tissues and/or medical devices (i.e. catheters). Biofilm formation carries negative clinical implications, as cells within the biofilms are protected from host immune responses and from the action of antifungals. We have developed a simple, fast and robust in vitro model for the formation of C. albicans biofilms using 96 well microtiter-plates, which can also be used for biofilm antifungal susceptibility testing. The readout of this assay is colorimetric, based on the reduction of XTT (a tetrazolium salt) by metabolically active fungal biofilm cells. A typical experiment takes approximately 24 h for biofilm formation, with an additional 24 h for antifungal susceptibility testing. Because of its simplicity and the use of commonly available laboratory materials and equipment, this technique democratizes biofilm research and represents an important step towards the standardization of antifungal susceptibility testing of fungal biofilms.

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

We describe a simple, rapid and robust method for the formation of Candida albicans biofilms using 96 well microtiter plates and its utility in antifungal susceptibility testing of cells within biofilms.

96 microtiter ובכן פלייט מבוססי שיטה ליצירת ניטור ובדיקה של רגישות נגד פטריות קנדידה אלביקנס Biofilms

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third ...

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. Biofilms are community-associated bacteria attached to a surface and encased in a matrix. The role of the extracellular matrix is multifaceted, including facilitating nutrient acquisition, and offers significant protection against environmental stresses (e.g. host immune responses). In an effort to acquire a better understanding as to how the bacteria within a biofilm respond to environmental stresses we have used a protocol wherein we visualize bacterial biofilms which have formed in an 8-well chamber slide. The biofilms were stained with the BacLight Live/Dead stain and examined using a confocal microscope to characterize the relative biofilm size, and structure under varying incubation conditions. Z-stack images were collected via confocal microscopy and analyzed by COMSTAT. This protocol can be used to help elucidate the mechanism and kinetics by which biofilms form, as well as identify components that are important to biofilm structure and stability.

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

This article describes the procedure for the formation and visualization of a bacterial biofilm grown within an 8-well chamber slide

ב גיבוש biofilm חוץ גופית ב 8-Slide גם לשכת

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Antimicrobial Susceptibility Testing of Mycobacterium Tuberculosis Complex for First and Second Line Drugs by Broth Dilution in a Microtiter Plate Format

The rapid detection of antimicrobial resistance is important in the effort to control the increase in resistant Mycobacterium 
tuberculosis (Mtb). Antimicrobial susceptibility testing (AST) of Mtb has traditionally been performed by the agar method of proportion or by 
macrobroth testing on an instrument such as the BACTEC (Becton Dickinson, Sparks, MD), VersaTREK (TREK Diagnostics, Cleveland, OH) or BacT/ALERT (bioM&eacute;rieux, Hazelwood, MO). The agar proportion method, while considered the &#x201C;gold&#x201D; standard of AST, is labor intensive and requires calculation of resistance by performing colony counts on drug-containing agar as compared to drug-free agar. If there is &ge;1% growth on the drug-containing medium as compared to drug-free medium, the organism is considered resistant to that drug. The macrobroth methods require instrumentation and test break point ("critical") drug concentrations for the first line drugs (isoniazid, ethambutol, rifampin, and pyrazinamide). The method described here is commercially available in a 96 well microtiter plate format [MYCOTB (TREK Diagnostics)] and contains increasing concentrations of 12 antimicrobials used for treatment of tuberculosis including both first (isoniazid, rifampin, ethambutol) and second line drugs (amikacin, cycloserine, ethionamide, kanamycin, moxifloxacin, ofloxacin, para-aminosalicylic acid, rifabutin, and streptomycin). Pyrazinamide, a first line drug, is not included in the microtiter plate due to its need for acidic test conditions. Advantages of the microtiter system include both ease of set up and faster turn around time (14 days) compared with traditional agar proportion (21 days). In addition, the plate can be set up from inoculum prepared using either broth or solid medium. Since the microtiter plate format is new and since Mtb presents unique safety challenges in the laboratory, this protocol will describe how to safely setup, incubate and read the microtiter plate.

Antimicrobial susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis is challenging but critical for patient care. This microtiter plate format offers testing of 12 antimycobacterial drugs and provides minimum inhibitory concentration (MIC) values, which will aid in appropriate treatment.

רגישות בדיקת Antimicrobial של קומפלקס שחפת Mycobacterium עבור תרופות הקו הראשון והשני על ידי דילול מרק בפורמט פלייט microtiter

The rapid detection of antimicrobial resistance is important in the effort to control the increase in resistant Mycobacterium 
tuberculosis (Mtb). ...

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in the thymus proper vasculature formation and patterning is essential for thymocyte entry into the organ and mature T-cell exit to the periphery. The spatial arrangement of blood vessels in the thymus is dependent upon signals from the local microenvironment, namely thymic epithelial cells (TEC). Several recent reports suggest that disruption of these signals results in thymus blood vessel defects 1,2. Previous studies have described techniques used to label the neonatal and adult thymus vasculature 1,2. We demonstrate here a technique for labeling blood vessels in the embryonic thymus. This method combines the use of FITC-dextran or Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I (GSL 1 - isolectin B4) facial vein injections and CD31 antibody staining to identify thymus vascular structures and PDGFR-&beta; to label thymic perivascular mesenchyme 3-5. The option of using cryosections or vibratome sections is also provided. This protocol can be used to identify thymus vascular defects, which is critical for defining the roles of TEC-derived molecules in thymus blood vessel formation. As the method labels the entire vasculature, it can also be used to analyze the vascular networks in multiple organs and tissues throughout the embryo including skin and heart 6-10.

This article describes a method for labeling embryonic skin and thymus blood vessels.

שיטה תיוג vasculature ב עכברים עובריים

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional identification requires the sub-culture of signaled blood culture broth with identification available only after colonies on solid agar have matured. MALDI-TOF MS is a reliable, rapid method for identification of the majority of clinically relevant bacteria when applied to colonies on solid media. The application of MALDI-TOF MS directly to blood culture broth is an attractive approach as it has potential to accelerate species identification of bacteria and improve clinical management. However, an important problem to overcome is the pre-analysis removal of interfering resins, proteins and hemoglobin&#160;contained in blood culture specimens which, if not removed, interfere with the MS spectra and can result in insufficient or low discrimination identification scores. In addition it is necessary to concentrate bacteria to develop spectra of sufficient quality. The presented method describes the concentration, purification, and extraction of Gram negative bacteria allowing for the early identification of bacteria from a signaled blood culture broth.

The application of matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) directly to blood culture broth expedites the identification of bacteria. The presented method is a rapid and reliable method for identification of Gram negative bacteria directly from blood culture broth.

זיהוי מהיר של חיידקים גראם שליליים מהדם תרבות מרק שימוש MALDI-TOF המוני ספקטרומטריית

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a rapid identification of the infectious agent to guide optimal antibiotic treatment. The analysis of Gram stains from positive blood culture can be rapidly conducted and already significantly impact the antibiotic regimen. However, the accurate identification of the infectious agent is still required to establish the optimal targeted treatment. We present here a simple and fast bacterial pellet preparation from a positive blood culture that can be used as a sample for several essential downstream applications such as identification by MALDI-TOF MS, antibiotic susceptibility testing (AST) by disc diffusion assay or automated AST systems and by automated PCR-based diagnostic testing. The performance of these different identification and AST systems applied directly on the blood culture bacterial pellets is very similar to the performance normally obtained from isolated colonies grown on agar plates. Compared to conventional approaches, the rapid acquisition of a bacterial pellet significantly reduces the time to report both identification and AST. Thus, following blood culture positivity, identification by MALDI-TOF can be reported within less than 1 hr whereas results of AST by automated AST systems or disc diffusion assays within 8 to 18 hr, respectively. Similarly, the results of a rapid PCR-based assay can be communicated to the clinicians less than 2 hr following the report of a bacteremia. Together, these results demonstrate that the rapid preparation of a blood culture bacterial pellet has a significant impact on the identification and AST turnaround time and thus on the successful outcome of patients suffering from bloodstream infections.

A rapid bacterial pellet preparation from a positive blood culture can be used as a sample for applications such as identification by MALDI-TOF, Gram staining, antibiotic susceptibility testing and PCR-based test. The results can be rapidly communicated to clinicians to improve the outcome of patients suffering from bloodstream infections.

הכנה של תרבות דם כדוריים לראפיד בקטריאלי זיהוי ואנטיביוטיקת רגישות בדיקה

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

במבחנה פירוק של וירוס שפעת capsids ידי צנטריפוגה שיפוע

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

הקמת הגדרת תפוקה גבוהה להקרנה מולקולות קטנות לווסת ג-di-GMP איתות<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in the caseous cores of cavities and lesions is especially crucial because they harbor subpopulations of drug-tolerant bacteria also commonly referred to as persisters. Existing methods for the measurement of drug penetration in tuberculosis lesions involve costly and time-consuming in vivo pharmacokinetic studies coupled to bioanalytical or imaging techniques. The in vitro measurement of drug binding to caseum macromolecules was proposed as an alternative to such techniques since this binding hinders the passive diffusion of drug molecules through caseum. Rapid equilibrium dialysis is a fast and reliable system for performing plasma protein and tissue binding studies. In this protocol, we used a rapid equilibrium dialysis (RED) device to measure drug binding to homogenates of caseum that is excised from the lesions and cavities of tuberculosis-infected rabbits. The protocol also describes how to generate a surrogate matrix from lipid loaded THP-1 macrophages to use in place of caseum. This caseum/surrogate binding assay is an important tool in tuberculosis drug discovery and can be adapted to help study drug distribution in lesions or abscesses caused by other diseases.

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Here we describe a rapid equilibrium dialysis (RED) method to measure drug binding to caseum from pulmonary tuberculosis lesions and cavities. The protocol is also used with a foamy macrophage-derived matrix that is an effective surrogate to caseum.

An<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay מחייב Assay כי חוזה חדירה לסמים בשחפת נגעים

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

קרינה המבוססת Assay Neuraminidase העיכוב להעריך את הרגישות של שפעת וירוסים אל Neuraminidase המונע המחלקה של תרופות אנטי-ויראליות

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...