Name: a reference broth microdilution method for dalbavancin in vitro susceptibility testing of bacteria that grow aerobically
Uploaded: 2015-09-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically at JoVE.com

Prior work with regard to susceptibility testing of dalbavancin has been valuable in development of a standardized methods and acknowledgement for this work is given to JMI Laboratories, Robert Rennie and Beth Goldstein.

Nota: Consulte a documentação do CLSI M7-A10 e M100-S25 e / ou ISO / FDIS 20776-1 Para maiores detalhes sobre o método de referência de microdiluição para susceptibilidade aos antimicrobianos 2, 3, 4 Os métodos de referência para permitir opções em alguns dos arquivos. Procedimentos específicos para a preparação do inóculo e painel MIC produção para alcançar o mesmo resultado final. O método descrito aqui refere-se a um agente antimicrobiano, dalbavancin, e alguns dos passos representam uma das várias maneiras potencialmente o procedimento de referência pode ser feito. Precauções de segurança apropriado (consistentes com o nível de biossegurança 2) deve ser utilizado 10. O formato do painel de MIC usado para os fins da presente publicação de vídeo é mostrado na Tabela 1. 1. Loja Dalbavancin Pó <ol><li> Após o recebimento do diagnóstico pó dalbavancin grau, armazenar a -20 ° C em um ambiente desidratado num congelador non-descongelamento. Antes da utilização, o pó deve equilibrar aRT chegar antes da abertura. </li></ol> 2. Preparar diluições do painel MIC <ol><li> Prepara-se uma solução de reserva não maior do que 1.600 ug / mL de dalbavancin em DMSO puro (puro) em vidro ou plástico tubos estéreis, e utilizar no mesmo dia da preparação ou armazenar a -20 a -60 ° C ou abaixo para utilização futura em um freezer não-descongelamento. Leve em consideração a potência de dalbavancin conforme previsto na documentação recebida com o pó, quando pesando o pó (ver Equação 1, por exemplo, 800 mg / ml de preparação de estoque). </li><li> Dilui-se a diluição da similar ao esquema como se mostra na coluna 1 (&quot;Concentração Fonte&quot;) na Tabela 2 com DMSO puro em vidro ou plástico tubos estéreis. Use uma pipeta para medir diluente e outra pipeta para adicionar o estoque inicial dalbavancin ao primeiro tubo. Para cada concentração estoque dalbavancin posterior usar uma pipeta nova. </li><li> Prepare 100X última concent painel MICdiluições de racionamento (concentrações intermediárias) com DMSO puro. Como é mostrado nas colunas 2-4 da Tabela 2, combinar volumes apropriados de fonte e DMSO para atingir a concentração desejada (intermediário volumes a serem utilizados dependerá do número de painéis de MIC a ser efectuada). </li><li> Prepare a 0,004% P80: Prepara-se uma solução fresca de estoque de trabalho de 2% P80 por adição de 0,1 ml de P80 a 4,9 ml de dH 2 O. Esterilizar por passagem através de uma solução de filtro de 0,22 micron e a utilização, no mesmo dia da preparação. Prepare a 0,004% P80 diluente, fazendo uma diluição 1: 500 de 2% P80 (por exemplo, 0,3 ml de 2% P80 para 149,7 mL de CAMHB). </li><li> Diluir as concentrações intermédias preparado no passo 2.2 a 1: 100 em catião ajustado caldo de Mueller Hinton (CAMHB), suplementado com 0,004% (v / v) de polisorbato-80 (-80 P) P-80 e / ou LHB (para estreptococos) adicionou com o dobro da concentração final por causa da adição de inoculo (passo 4.3) vai resultar em uma diluição de 1: 2. Ver colunas 6 e 7 do quadro 2 </strong&gt;. </li></ol> 3. Prepare Painéis MIC <ol><li> Dispensar 50 ul de cada solução dalbavancin preparado no passo 2.3 em poços apropriados de painel de MIC e incluem meios de num único poço (controlo de crescimento bem). Uma pipeta de multi-canal com pontas estéreis podem ser utilizadas para este passo. </li><li> Use painéis imediatamente ou selo com filme plástico, coloque em sacos de plástico e colocar imediatamente em um freezer não-descongelação à ≤-20 ° C (de preferência a ≤-60 o C) até que seja necessário. Se forem utilizados painéis congelados, remover os selos e colocar painéis individuais em bancada de laboratório durante 15-30 minutos (até que o conteúdo bem são descongelados), antes de prosseguir para o painel inoculação. </li></ol> 4. Inocular Painéis MIC, Execute Pureza e Colony Setup Contagem <ol><li> Seleccione várias colónias bem isoladas a partir de um agar de sangue de 18-24 h ou outra placa de agar não selectivas. Toque no topo de cada colônia com uma ansa estéril ou cotonete e transferência para 1-5 ml CAMHB ou sAline até turvação é equivalente a um padrão McFarland 0,5. Avaliar turbidez por comparação visual ao 0,5 McFarland ou com um dispositivo de medição fotométrica. </li><li> Dentro de 15-30 minutos de preparação, dilui-se o inoculo de 1: 100 em CAMHB (100 ul para 10 ml CAMHB). Para a maioria das bactérias testadas contra dalbavancin, com excepção de S. pneumoniae, esta diluição irá proporcionar uma concentração final do poço de 5 x 10 5 CFU / mL (intervalo aceitável é de 2-8 x 10 5 CFU / mL). Para S. pneumoniae, concentração bacteriana com base na comparação de turbidez McFarland 0.5 para um é tipicamente consideravelmente menor, por conseguinte, diluir a 1:25 inoculo (400 ul em 10 ml de CAMHB + 10% + LHB). </li><li> Dentro de 15 minutos após a preparação do inóculo, transferir 50 ul do inoculo final a cada poço (com excepção do controlo de esterilidade bem) do painel MIC preparado no passo 3. Uma pipeta multi-canais usando pontas estéreis podem ser utilizadas para este passo. </li><li> Executar uma verificação de purezapor transferência e espalhamento de uma alíquota de 1-10 ul de controlo positivo de crescimento bem utilizando uma ansa estéril para um meio de ágar não selectivo (por exemplo, ágar de tripticase de soja com 5% de sangue de ovelha). </li><li> Configuração do número de colónias, removendo 10 ul do controlo de crescimento bem com uma única ponta de pipeta estéril e canal e transferência para 10 ml de solução salina (1: 1000 de diluição). Misturar e transferir 100 ul com uma única pipeta de canal e ponta estéril para um meio adequado, não selectivo de agar (por exemplo, agar de tripticase de soja com 5% de sangue de ovelha) e distribuídos por toda a superfície do agar com um lacete estéril, repetindo duas vezes em direcções diferentes para assegurar uma distribuição uniforme do inoculo (diluição 1:10). </li></ol> 5. Painéis Incubar MIC, Contagem Colony e Pureza Plates <ol><li> Selar cada painel MIC ou pilha de não mais de 4 painéis em um saco plástico, com uma fita de plástico ou com uma capa de plástico apertada antes da incubação. Alternativamente, coloque o painel MIC vazio na top da pilha de não mais de 4 painéis de CIM, coloque uma toalha de papel úmido em um recipiente de plástico, painéis de CIM lugar no recipiente de plástico e perto recipiente com tampa de forma segura. </li><li> Incubar painéis MIC em uma incubadora de ar ambiente a 35 ° C ± 2 ° C durante 16-20 hr (estafilococos e enterococos) e 20-24 h (estreptococos) dentro de 30 min de inoculação. Incubar a contagem de colónias e placas de pureza nas mesmas condições excepto estreptococos Incubar em 5% de CO2. </li></ol> 6. Leia o MIC e Colony Contagem placas; Verifique Pureza Placa <ol><li> Leia a MIC como a concentração mais baixa que inibe completamente o crescimento bacteriano nas cavidades como detectadas pelo olho nu. </li><li> Contagem das colónias na placa de contagem de colônias. Multiplicar cada colónia pelo factor de diluição (1: 10.000) (por exemplo, 50 colónias é equivalente a 5 x 10 5 CFU / mL). Um intervalo aceitável é de 20-80 colónias (2-8 x 10 5 CFU / ml) e é usado como um aproorientação ximate. </li><li> Verifique placa de pureza. Se todas as colónias são semelhantes para as colónias usados ​​no passo 4.1, em seguida, o inoculo pode ser considerado puro. Se existem quaisquer outras colónias presentes, então há potencial para um contaminante para estar presente no painel de MIC e o ensaio deverá ser repetido. </li></ol> 7. Verifique Resultados controle de qualidade. <ol><li> Consulte a Tabela 3 para intervalos esperados de cepas de controle de qualidade CLSI. Apenas relatar resultados de teste isolados, se os resultados de CIM dalbavancin para organismo (s) de controle de qualidade estão dentro do intervalo esperado. </li><li> Se uma MIC de ≥0.25 ug / ml é obtida por qualquer S. clínica aureus isolado, repetir os testes MIC dalbavancin e / ou enviar para um laboratório de referência para a verificação. </li></ol>

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	<li>Boucher, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Once-weekly+dalbavancin+versus+daily+conventional+therapy+for+skin+infection.">Once-weekly dalbavancin versus daily conventional therapy for skin infection.</a> The New England journal of medicine. 370, 2169-2179 (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> M07-A10. Methods for Dilution Antimicrobial Tests for Bacteria that Grow Aerobically.: Approved Standard. , (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> M100-S25. 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Poster 132.</a> ASM. , (2012).</li><li>Fritsche, T. R., Rennie, R. P., Goldstein, B. P., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+dalbavancin+MIC+values+determined+by+Etest+(AB+BIODISK)+and+reference+dilution+methods+using+gram-positive+organisms.">Comparison of dalbavancin MIC values determined by Etest (AB BIODISK) and reference dilution methods using gram-positive organisms.</a> Journal of clinical microbiology. 44, 2988-2990 (2006).</li><li>Mushtaq, S., Warner, M., Johnson, A. P., Livermore, D. 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Sandra McCurdy é um empregado de DURATA Therapeutics; Especialistas de Laboratório, Inc., empregador de Laura Koeth e Jeanna Fisher, foi contratada pela DURATA Therapeutics para preparar o manuscrito. Taxas de publicação do presente artigo foram pagos pela Especialistas de Laboratório, Inc.

Os seguintes detalhes do método são apresentados para considerações adicionais quando se preparava para testes dalbavancin MIC. O design do painel de MIC dependerá do número de agentes antimicrobianos para ser testado (isto é., Dalbavancin sozinho ou vários agentes) e as espécies de bactérias a ser testado. As concentrações dalbavancin deve englobar os pontos de quebra de interpretação para todas as espécies bacterianas a serem testados e toda a gama de diluições esperada para pelo menos uma estirpe de CQ. A série de diluição antimicrobiana podem ser organizados em linhas ou colunas, dependendo do número de agentes anti-microbianos e / ou isolados / placa e método de inoculação. O volume de dalbavancin pó e caldo deve ser calculado para assegurar que quantidades ideais são produzidos e dos resíduos é mínima. Para o exemplo utilizado na presente publicação, os volumes são baseados na preparação de dois painéis de MIC. Cátion ajustado caldo Mueller Hinton deve ser preparado e autoclavado de acordo com homeminstruções e esterilidade dos meios de comunicação de ufacturer verificada. MIC painéis pode ser feito e utilizado na preparação do mesmo dia, ou podem ser testadas com os organismos de controlo de qualidade adequados e os painéis validados armazenado congelado para uso futuro. É importante a utilização de técnicas de esterilidade durante todo o procedimento. Não há critérios estritos para a verificação da concentração de inóculo com contagem de colônias. Contagens de colónias pode ser verificado inicialmente para cada espécie testada e / ou periodicamente para validar o passo de diluição realizada no passo 4.2. É importante que a validade do padrão 0,5 de McFarland também é verificado rotineiramente com E. coli ATCC 25922, utilizando um procedimento semelhante ao passo 4.5. Se os resultados não são equivalentes a 1-2 x 10 8 CFU / ml, um novo padrão de 0,5 McFarland deve ser obtida. Se as contagens de colónias a partir de poços de CIM estão fora da gama aceitável (2-8 x 10 5 resultados UFC / mL e de MIC para o isolado clínico (s) pode variar de the esperado distribuição normal (ex. 0,03-0,12 ug / ml para S. aureus) e / ou resultados de MIC para o isolado de controle de qualidade (s) estão fora dos limites esperados, o teste de validação é necessário e modificação método pode ser garantido. Sugere-se que um padrão McFarland 0,5 validado é utilizada para repetir a contagem (s) de colónias e se os resultados são mais uma vez fora dos resultados esperados, a diluição do inoculo, realizada no passo 4.2 deve ser ajustado em conformidade e a MIC repetido. Note-se que uma verificação de pureza é necessário, mesmo se um número de colónias é realizada porque o procedimento de contagem de colónia utiliza um volume diluídos que podem não ser necessariamente detectar concentrações mais baixas de organismos contaminantes. Para um teste MIC seja considerado válido, o crescimento aceitável deve ocorrer no controle do crescimento bem. Para a maioria das bactérias que irá ser testados contra dalbavancin (isto é., Os estafilococos, estreptococos e enterococos, o crescimento irá ser visto como um botão (tipicamente&gt; 2 mm) e menos frequently, o crescimento pode aparecer como turbidez no poço. Ao contrário de alguns agentes antimicrobianos que podem apresentar fuga efeito que as concentrações de aumentar, endpoints dalbavancin são tipicamente bem definido. Existem vários dispositivos de visualização, destinadas a facilitar a leitura testes de microdiluição, que podem ser usados ​​para ler dalbavancin placas contendo desde que não há nenhum compromisso na capacidade de discernir o crescimento nos poços. Os passos críticos dentro do protocolo estão relacionadas com as partes do procedimento que estão relacionados com a solubilidade do dalbavancin e adição de P80. É importante que a concentração máxima de dalbavancin utilizada não é maior do que 1.600 ug / ml, que o DMSO é utilizado como um solvente e que as concentrações intermédias são preparadas em DMSO, antes de fazer as diluições de caldo de modo a que a concentração final de DMSO no MIC painel poços não é maior do que 1%. DMSO é higroscópico e, por conseguinte, a utilização de garrafas mais velhos de DMSO foi de um consideratíon que diz respeito à dalbavancin solubilidade. No entanto, não enquanto um estudo BMD pequeno com cepas de controle de qualidade tem mostrado que isso seja uma variável importante (ver secção Resultados), é uma boa prática para usar garrafas novos ou recentemente abertos de DMSO. É também importante que P80 é adicionado ao caldo no passo final da preparação de diluição da droga e é a uma concentração final de 0,002% na MIC bem. O processo da DMO incluído aqui utiliza preparação de painéis de MIC utilizando 50 ul / poço em dalbavancin e P-80 concentrações, duas vezes a concentração final e da adição de inoculo com 50 ul / poço de modo a que o volume final / poço é 100 ul. Este método permite a um formato de painel MIC a ser produzida para o ensaio de ambos S. aureus e S. pneumoniae, porque o sangue de cavalo lisado pode ser adicionado ao inoculo. Métodos alternativos para a preparação de painéis de MIC utilizando 100 uL / ​​poço com a adição de até 10 ul / poço são descritos naCLSI e ISO procedimentos. O ponto de interrupção suscetível dalbavancin para S. aureus é ≤0.12 ug / ml (FDA folheto informativo). Como é mostrado na vigilância recente, a maioria dos isolados são inibidos por dalbavancin em níveis de 0,06 ug / ml 15. Com um ponto de interrupção suscetível perto do MIC modal, qualquer variação de MIC como resultado de diferenças de método pode afetar as taxas de susceptibilidade. Porque o procedimento de BMD para dalbavancin inclui alguns passos únicos (especificamente, o uso de DMSO na preparação de estoque e diluições do fármaco intermédios e 0,002% de P80 na MIC bem, é imperioso que o método é seguido exactamente. O organismo S. aureus QC (ATCC 29213), com uma muito clara MIC dalbavancin modal de 0,06 mg / ml, tem sido um bom indicador de variação método e deve ser usado rotineiramente para validar o método de BMD. Se os resultados MIC estão com o intervalo esperado de 0,03-,12 ug / ml, mas são tendências, quer ao baixo ou high lado desta gama, é garantido uma validação adicional do método. A adição de 0,002% de P80 é recomendada para todos os organismos relevantes Gram-positivo (staphylococcci, enterococos e estreptococos.) No entanto, é de notar que foi demonstrado que lisadas sangue de cavalo age semelhante a P-80 relativamente ao seu anti-obrigatório capacidade e que a adição de P-80 de CAMHB + LHB não tem qualquer efeito suplementar sobre os resultados de MIC dalbavancin estreptococos. Não há atualmente nenhum método de difusão em disco para testes dalbavancin e por causa da fraca correlação da DMO e os resultados AD, testes de susceptibilidade de dalbavancin usando o método AD não é recomendada 12, 14. O método de BMD devem ser utilizados para a avaliação futura do dalbavancin susceptibilidade e como um padrão-ouro para o desenvolvimento de testes comerciais de susceptibilidade aos antimicrobianos.

Dalbavancin é um lipoglycopeptide semi-sintético que foi aprovado pela FDA em Maio de 2014 no tratamento da pele e da estrutura da pele infecções bacterianas agudas causadas por organismos Gram-positivos 1. O principal objetivo de detalhar esse método em um formato de vídeo é fornecer uma orientação clara para os cientistas de laboratório e de pesquisa clínica para testes e relatórios de resultados precisos e reprodutíveis dalbavancin suscetibilidade. A determinação de um agente antimicrobiano MIC por métodos comerciais é realizada rotineiramente em laboratórios clínicos para a avaliação da atividade in vitro de um agente contra bactérias patogênicas. O método descrito aqui é o método de microdiluição do caldo como recomendado pelo CLSI e ISO 2,3,4. Desde dalbavancin métodos de suscetibilidade comerciais não estão disponíveis no momento (no momento desta publicação) e de difusão de disco e métodos de diluição de agar não são atualmente recomendadas fou dalbavancin, métodos de diluição de caldo de referência são as atuais opções disponíveis 12,14. Como este método de referência não é um comercial e FDA apuradas in vitro método de diagnóstico, laboratórios de análises clínicas nos EUA que usar este procedimento para testes paciente deve respeitar os requisitos regulamentares para um teste de laboratório desenvolvido (LDT). Prevê-se que como a utilização dalbavancin aumenta, mais laboratórios terá uma necessidade de testar este composto. Vancomicina teste como um substituto para a determinação da susceptibilidade de S. dalbavancin aureus foi validado 5. No entanto, dalbavancin podem ser activos contra vancomicina S. intermediário aureus (VISA) e, portanto, os médicos podem solicitar resultados dalbavancin MIC. Além disso, pode ser requerida resultados de MIC para as outras espécies bacterianas. O ponto de interrupção suscetível FDA para dalbavancin contra S. aureus foi estabelecida em ≤0.12 ug / ml. FDA atribuído apenas uma suscepticategoria ble por causa da falta de dados sobre os isolados resistentes. A distribuição normal de MIC entre tipo selvagem S. aureus é entre 0,03-0,12 ug / ml, com uma MIC modal clara de 0,06 ug / ml. Uma ligeira variação nos resultados de MIC, devido ao método de diferença, para além da variação de DMO inerente de ± uma diluição, poderia potencialmente ter um impacto significativo sobre as taxas de susceptibilidade. 6 À semelhança de outros agentes lipoglycopeptide, testes de susceptibilidade dalbavancin pode ser um desafio, como resultado de solubilidade e a dimensão relativamente grande da molécula e as suas propriedades de ligação 7,8,9. O método DMO referência aqui descrito inclui dois passos específicos que são únicas para agentes insolúveis e / ou agentes lipoglycopeptide: (1) a utilização de DMSO, para preparação de soluções de reserva e (2) adição de 0,002% de P-80 no painel MIC definitiva diluições. O objetivo desta publicação de vídeo é fornecer clareza para o método BMD dalbavancin e specifically focar essas etapas-chave, para garantir resultados precisos e reprodutíveis MIC.

<table><tbody><tr><td>Dalbavancin</td><td>Metrics, Inc.</td><td>Greenville, NC</td><td>BI-397</td></tr><tr><td>Vancomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>St. Louis, MO</td><td>C5793</td></tr><tr><td>Cation Adjusted Mueller Hinton Broth</td><td>Becton Dickinson</td><td>Sparks, MD</td><td>212322</td></tr><tr><td>Lysed horse blood</td><td>Cleveland Scientific</td><td>Bath, OH</td><td></td></tr><tr><td>Dose-it peristaltic pump</td><td>Integra Biosciences</td><td>Hudson, NH</td><td></td></tr><tr><td>Multi-channel pipet (Viaflo II)</td><td>Integra</td><td>Hudson, NH</td><td>4164</td></tr><tr><td>12 channel pipet (Matrix)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Waltham, MA</td><td></td></tr><tr><td>Single channelpPipets (Ovation 10 &amp;micro;l - 100 &amp;micro;l)</td><td>VistaLab</td><td>Brewster, NY</td><td></td></tr><tr><td>96 well microplate</td><td>Greiner Bio-one</td><td>Monroe, NC</td><td>650161</td></tr><tr><td>50 ml flat cap conical bottom centrifuge tubes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Waltham, MA</td><td></td></tr><tr><td>16x125 mm disposable glass tubes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Waltham, MA</td><td></td></tr><tr><td>12x17 mm snap cap, polystyrene tubes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Waltham, MA</td><td></td></tr><tr><td>16 ml centrifuge tubes</td><td>BioExpress</td><td>Kaysville, UT</td><td>C-3394-2</td></tr><tr><td>Reagent reservoirs</td><td>Integra Biosciences</td><td>Hudson, NH</td><td>4312</td></tr><tr><td>Disposable sterilelLoops (1 &amp;micro;l &amp;amp; 10 &amp;micro;l)</td><td>Biologix</td><td>Lenexa, KA</td><td>65-0001,65-0010</td></tr><tr><td>Tryptic soy agar + 5% sheep blood</td><td>Becton Dickinson</td><td>Sparks, MD</td><td></td></tr><tr><td>Incubator (ambient)</td><td>Sanyo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator (5% CO2)</td><td>Sanyo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analytical balance&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Waltham, MA</td><td></td></tr><tr><td>Gloves</td><td>Kimberly-Clark</td><td></td><td>52817</td></tr><tr><td>Lab coats</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a reference broth microdilution method for dalbavancin in vitro susceptibility testing of bacteria that grow aerobically

Teste de susceptibilidade antimicrobiana (AST) é realizada para avaliar a actividade in vitro dos agentes antimicrobianos contra várias bactérias. Os resultados da AST, que são expressos em concentrações inibitórias mínimas (MICs) são usados ​​em pesquisas para desenvolvimento antimicrobiana e acompanhamento do desenvolvimento de resistência e no contexto clínico para orientação terapêutica antimicrobiana. Dalbavancin é um lipoglycopeptide semi-sintético agente antimicrobiano que foi aprovado em Maio de 2014 pela Food and Drug Administration (FDA) para o tratamento da pele e da estrutura da pele infecções bacterianas agudas causadas por organismos Gram-positivos. A vantagem de dalbavancin sobre terapias anti-estafilococos actuais é a sua longa meia-vida, o que permite uma dosagem de uma vez por semana. Dalbavancin tem atividade contra Staphylococcus aureus (incluindo tanto sensível à meticilina S. aureus [MSSA] e resistente à meticilina S. aureus [MRSA]), estafilococos coagulase-negativo, <em&gt; Streptococcus pneumoniae, Streptococcus grupo anginosus, estreptococos β-hemolíticos e os enterococos sensíveis à vancomicina. Tal como outros agentes lipoglycopeptide recentes, a optimização de métodos de ensaio e de caldo de susceptibilidade do CLSI ISO inclui o uso de dimetilsulfóxido (DMSO) como solvente quando se preparam soluções de reserva e de polissorbato 80 (P80) para aliviar a adesão do agente de plástico. Antes dos estudos clínicos e durante o desenvolvimento inicial de dalbavancin, estudos de susceptibilidade não foram realizados com a utilização de P-80 e os resultados de MIC tendiam a ser 2-4 vezes mais elevada e da mesma forma superior MIC resultados foram obtidos com o método de diluição em ágar susceptibilidade. Dalbavancin foi incluída pela primeira vez no CLSI tabelas metodologia caldo de microdiluição em 2005 e alterada em 2006 para esclarecer o uso de DMSO e P-80. O procedimento de microdiluição de caldo (DMO) mostrado aqui é específico para dalbavancin e está de acordo com os métodos do CLSI e ISO, com detalhe passo-a-passo e foc-nos sobre os passos críticos para maior clareza.

Métodos MIC padronizados são necessários a fim de acompanhar o desenvolvimento de resistência, um objetivo importante de vários programas de vigilância antimicrobianos. Dalbavancin resultados de MIC para isolados recolhidos na Europa e EUA em 2011-2013 eram &lt;0,25 ug / ml para 99,9% de S. aureus e 100% de estreptococos (Tabela 4). Para avaliar a importância do uso de fresco (selado) DMSO, testes triplicado de MICs BMD dalbavancin para QC estirpes S. aureus ATCC 29213, e E. faecalis ATCC 29212 e duplicação de ensaios para S. pneumoniae ATCC 49619 foi realizada utilizando (1) de DMSO a partir de ampolas selados, (2) de DMSO a partir de um frasco de 1 L que estava dentro da data de expiração e que tinha sido utilizado anteriormente para 2 anos e (3) uma alíquota de DMSO a partir do mesmo de 1 L garrafa (amostra 2) que foi deixada em repouso num copo aberto durante 72 h antes da utilização. Dalbavancin resultados MIC usando painéis feitos com todas as três amostras de DMSO foram semelhantes e Within as gamas aceitáveis ​​QC (Tabela 5). A perda de actividade dalbavancin após a exposição da solução de estoque de plástico e sem a adição de P-80 tem sido bem documentada 7. Em 2 estudos adicionais, a adição de P-80 para as soluções iniciais e intermédios banco (Tabela 6) e a utilização de tubos de vidro ou de plástico para a preparação das soluções stock iniciais e intermédios (Tabela 7) não tem um efeito sobre os resultados dalbavancin microfone. Também não houve efeito no resultado do MIC dalbavancin quando polipropileno e poliestireno placas de três fabricantes foram utilizados (Tabela 7). A presença de sangue de cavalo lisado nos meios de caldo para testes de estreptococos foi demonstrado que possuem uma actividade surfactante semelhante, comparável à P-80 7, 8. O método de referência dalbavancin para Streptococcus não incluem o cavalo de sangue P-80 e lisadas ,No entanto, ao contrário de estafilococos e enterococos, dalbavancin resultados de MIC para estreptococos são semelhantes (dentro de +/- 1 de diluição) com e sem a adição de P-80. Tal como foi apresentado anteriormente e mostrado na Figura 1, diluição de agar dalbavancin (AD) MICs são tipicamente 2-8 vezes mais elevada em comparação com a corrente de referência DMO 12, 13, 14. Ao contrário de BMD, a adição de 0,002% de P-80 não faz AD afetam dalbavancin MIC resulta 12. <img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/53028/53028eq1.jpg" /> Equação 1: Exemplo de Dalbavancin solução Stock Preparação etapas de preparação para 25 ml de 800 mg / ml solução dalbavancin.. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53028/53028fig1.jpg" /> Figura 1. Comparação de Dalbavancin e Vancomicina BMD para AD. Os resultados do estudo que comparou dalbavaNCIN e vancomicina BMD e AD MIC resultados para selecionar isolados bacterianos Gram-positivas. Médio (A) Dalbavancin e (B) Vancomicina de microdiluição em caldo e ágar de diluição MIC resulta em ug / ml para 15 Staphylococcus aureus, 8 coagulase negativa estafilococos (SNC), 5 Enterococcus faecalis e 14 Streptococci (Grupos A, B, e C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53028/53028fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 11 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> UMA </td><td> DAL 0,002 </td><td> DAL 0,004 </td><td> DAL 0,008 </td><td> DAL 0,015 </td><td> Dal 0,03 </td><td> DAL; 0.06 </td><td> DAL 0,12 </td><td> DAL 0,25 </td><td> DAL 0,5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td> B </td><td> DAL 0,002 </td><td> DAL 0,004 </td><td> DAL 0,008 </td><td> DAL 0,015 </td><td> Dal 0,03 </td><td> DAL 0,06 </td><td> DAL 0,12 </td><td> DAL 0,25 </td><td> DAL 0,5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td> C </td><td> DAL 0,002 </td><td> DAL 0,004 </td><td> DAL 0,008 </td><td> DAL 0,015 </td><td> Dal 0,03 </td><td> DAL 0,06 </td><td> DAL0,12 </td><td> DAL 0,25 </td><td> DAL 0,5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td> D </td><td> DAL 0,002 </td><td> DAL 0,004 </td><td> DAL 0,008 </td><td> DAL 0,015 </td><td> Dal 0,03 </td><td> DAL 0,06 </td><td> DAL 0,12 </td><td> DAL 0,25 </td><td> DAL 0,5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td> E </td><td> DAL 0,002 </td><td> DAL 0,004 </td><td> DAL 0,008 </td><td> DAL 0,015 </td><td> Dal 0,03 </td><td> DAL 0,06 </td><td> DAL 0,12 </td><td> DAL 0,25 </td&gt; <td> DAL 0,5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td> F </td><td> DAL 0,002 </td><td> DAL 0,004 </td><td> DAL 0,008 </td><td> DAL 0,015 </td><td> Dal 0,03 </td><td> DAL 0,06 </td><td> DAL 0,12 </td><td> DAL 0,25 </td><td> DAL 0,5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td> G </td><td> DAL 0,002 </td><td> DAL 0,004 </td><td> DAL 0,008 </td><td> DAL 0,015 </td><td> Dal 0,03 </td><td> DAL 0,06 </td><td> DAL 0,12 </td><td> DAL 0,25 </td><td> DAL 0.5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td> H </td><td> DAL 0,002 </td><td> DAL 0,004 </td><td> DAL 0,008 </td><td> DAL 0,015 </td><td> Dal 0,03 </td><td> DAL 0,06 </td><td> DAL 0,12 </td><td> DAL 0,25 </td><td> DAL 0,5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> DAL </td><td colspan="2"> Dalbavancin </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td&gt; </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="12"> As concentrações são expressas em ug / ml depois de 50 ul / poço a inoculação </td></tr></tbody></table> Tabela 1. MIC Formato de placa. O formato de placa de 96 mostrando a localização de diluições dalbavancin e poços de controlo positivo utilizado como um exemplo na presente publicação vídeo <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Fonte Conc. (ug / ml) </td><td> Fonte Volume (ml) </td><td> DMSO Volume (ml) </td><td> Conc intermediário. em DMSO (ug / ml) </td><td> Volume Intermediário Conc. (ml) </td><td> Volume CAMHB + 0,004% P80 * (ml) </td><td> 2X Conc. Depois de diluição 1: 100 em CAMHB (ug / ml) </td><td> Final Conc Panel. Após a inoculação (ug / ml) </td></tr><tr><td> 800 </td><td> 1.0 </td><td>1.0 </td><td> 400 </td><td> 0,02 </td><td> 1.98 </td><td> 4 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> 400 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td><td> 200 </td><td> 0,02 </td><td> 1.98 </td><td> 2 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 400 </td><td> 0,5 </td><td> 1,5 </td><td> 100 </td><td> 0,02 </td><td> 1.98 </td><td> 1 </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td> 400 </td><td> 0,5 </td><td> 3,5 </td><td> 50 </td><td> 0,02 </td><td> 1.98 </td><td> 0,5 </td><td> 0,25 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td><td> 25 </td><td> 0,02 </td><td> 1.98 </td><td> 0,25 </td><td> 0,125 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 0,5 </td><td> 1,5 </td><td> 12,5 </td><td> 0,02 </td><td> 1.98 </td><td> 0,125 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 0,5 </td><td> 3,5 </td><td> 6.25 </td><td> 0,02 </td><td> 1.98 </td><td> 0.06 </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td> 6.25 </td><td> 0,5 &lt;/ td&gt; <td> 0,5 </td><td> 3.13 </td><td> 0,02 </td><td> 1.98 </td><td> 0,03 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> 6.25 </td><td> 0,5 </td><td> 1,5 </td><td> 1,5 </td><td> 0,02 </td><td> 1.98 </td><td> 0,015 </td><td> 0,008 </td></tr><tr><td> 6.25 </td><td> 0,5 </td><td> 3,5 </td><td> 0,8 </td><td> 0,02 </td><td> 1.98 </td><td> 0,008 </td><td> 0,004 </td></tr><tr><td> 0,8 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td><td> 0,4 </td><td> 0,02 </td><td> 1.98 </td><td> 0,004 </td><td> 0,002 </td></tr><tr><td colspan="5"> Este quadro foi modificado a partir do CLSI M100-S25, Tabela 8B 3 </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 2. Esquema de Preparação de diluições de Agentes Antimicrobianos insolúvel em água para ser usado em Caldo diluições Suscetibilidade Testing. Os volumes de soluções de trabalho dalbavancin e diluentes para a preparação do MIC definitivasoluções dalbavancin de 0,002-2 ug / ml. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Estirpe de controlo de qualidade </td><td> Esperado Dalbavancin MIC (ug / ml) </td></tr><tr><td> S. aureus ATCC 29213 </td><td> 0,03-0,12 </td></tr><tr><td> E. faecalis ATCC 29212 </td><td> 0,03-0,12 </td></tr><tr><td> S. pneumoniae ATCC 49619 </td><td> 0,008-0,03 </td></tr></tbody></table> Tabela 3. Resultados Esperados Dalbavancin MIC para controle de qualidade Estirpes 3, 11. CLSI resultados de controlo de qualidade para as estirpes sugeridas a ser testado juntamente com isolados clínicos, a fim de verificar a metodologia adequada <img alt="Tabela 4" src="/files/ftp_upload/53028/53028table4.jpg" /> Tabela 4. Distribuição de Dalbavancin Resultados MIC (Número de cada MIC) dos EUA e Europeia 2011-2013 Surveillance Study 15. Dalbavancin resultados de MIC de um estudo publicado de isolados clínicos recentes como um indicador de corrente dalbavancin actividade in vitro. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><colgroup></colgroup><tbody><tr><td rowspan="2"> Isolar # </td><td colspan="3"> Dalbavancin MIC (ug / ml) </td></tr><tr><td> DMSO 1 </td><td> DMSO 2 </td><td> DMSO 3 </td></tr><tr><td rowspan="3"> S. aureus ATCC 29213 </td><td> 0,12 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> 0,12 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td rowspan="3"> E. faecalis ATCC 29212 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td rowspan="2"><em&gt; S. pneumoniae ATCC 49619 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> 0,03 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td colspan="4"> DMSO 1 = chama Unopened selado ampolas de 10 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> DMSO 2 = 1L garrafa aberta Frequentes </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> DMSO 3 = 1L garrafa aberta frequentes - sentou-se no banco no copo descoberto durante 72 horas </td></tr></tbody></table> Tabela 5. Resultados Dalbavancin CIM (ug / ml) utilizando DMSO e da Intermediate diluições Preparação com DMSO a partir de 3 Sources. Os resultados de um estudo que comparou MIC dalbavancin efeito do uso de diferentes solventes DMSO na preparação do estoque dalbavancin e diluições intermediárias. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td rowspan="2"> Isolar Número </td><td rowspan="2"> Número replicar </td><td colspan="2"> Dalbavancin MIC (ug / ml) </td></tr><tr><td> DALB w / P80 em DMSO </td><td> DALB w / o P80 em DMSO </td></tr><tr><td rowspan="4"> S. aureus ATCC 29213 </td><td> 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> S. aureus DP80-002SA clínica </td><td> 1 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td> S. aureus ATCC 700699 </td><td> 1 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td rowspan="4"> S. pneumoniae ATCC 49619 </td><td> 1 </td><td> 0,03 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 0,03 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 0,03 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 0,03 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td>S. pyogenes clínicos: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DP80-004PY </td><td> 1 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> DP80-005PY </td><td> 1 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td> DP80-006PY </td><td> 1 </td><td> 0,03 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> DP80-007PY </td><td> 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td> DP80-008PY </td><td> 1 </td><td> 0,03 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> S. agalactiae clínica: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DP80-009AG </td><td> 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0,12 </td></tr><tr><td> DP80-010AG </td><td> 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td> DP80-011AG </td><td> 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> DP80-012AG </td><td> 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> S. dysgalactiae clinical DP80-013DY </td><td> 1 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td> S. pneumoniae clínica: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DP80-014SP </td><td> 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> DP80-015SP </td><td> 1 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td> DP80-016SP </td><td> 1 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td> DP80-017SP </td><td> 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr></tbody></table> Tabela 6. Resultados Dalbavancin MIC utilizando DMSO e da Intermediate diluições Preparação com e sem 0,002% P-80. Resultados de um estudo que comparou MIC dalbavancin efeito da adição de 0,002% P-80 para dalbavancin estoque e diluições intermediárias. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td rowspan="3"> Isolar </td><td rowspan="3"> Número replicar </td&gt; <td colspan="4" rowspan="2"> Diluição da Tubes </td><td colspan="4"> Microplaca (Tipo de plástico) </td></tr><tr><td rowspan="2"> Poli-propileno, Greiner </td><td colspan="3"> Poliestireno </td></tr><tr><td> Vidro </td><td> Plástico </td><td> 1hr plástico </td><td> 1hr plástico / 1hr Intermediate </td><td> Greiner </td><td> Corning </td><td> Nunc </td></tr><tr><td rowspan="3"> S. aureus ATCC 29213 </td><td> 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0.06 </td><td> 0,03 </td><td> 0.06 </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td rowspan="3"> E. faecalis ATCC 29212 </td><td&gt; 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0.06 </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0.06 </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0.06 </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td rowspan="2"> S. pneumoniae ATCC 49619 </td><td> 1 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td><td> 0,008 </td><td> 0,008 </td><td> 0,008 </td><td> 0,008 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td><td> 0,008 </td><td> 0,015 </td><td> 0,008 </td><td> 0,008 </td></tr><tr><td colspan="10"> Vidro = estoque inicial feita em garrafa de vidro, usado imediatamente para tornar a concentração intermediárias em tubos de plástico, utilizados imediatamente para fazer diluições caldo. </td></tr><tr><td colspan="10"> Estoque de plástico = inicial feita em tubo de centrífuga de plástico, usado imediatamente para fazer concentrações intermediárias em tubos de plástico, utilizados imediatamente para fazer diluições caldo. </td></tr><tr><td colspan="10"> 1 hr = estoque inicial de plástico feito em tubo de centrífuga de plástico, vamos sentar no banco durante 1 hora, em seguida, usado para fazer concentrações intermediárias em tubos de plástico, utilizados imediatamente para fazer concentrações em caldo. </td></tr><tr><td colspan="10"> 1 hr Intermediário 1 hr = estoque de plástico / inicial feita em tubo de centrífuga de plástico, vamos sentar no banco durante 1 hora, em seguida, usado para fazer concentrações intermediárias em tubos de plástico, vamos sentar no banco durante 1 hora, em seguida, usado para fazer as concentrações em caldo. </td></tr></tbody></table> Tabela 7. Resultados Dalbavancin MIC utilizando diluições da preparação em plástico e vidro Tubos e MIC tipos de chapas de plástico. Resultados ofa dalbavancin estudo MIC que, em comparação efeito do uso de tubos de plástico ou de vidro na preparação das soluções de reserva e também efeito da utilização de diferentes fontes e tipos de plástico para placas de microtitulação.

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A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

Here, we present a protocol for determination of dalbavancin susceptibility of clinically relevant Gram-positive bacteria using a broth microdilution reference methodology.

Um método de microdiluição em caldo de referência para Dalbavancin<em&gt; In Vitro</em&gt; Teste à Susceptibilidade de bactérias que crescem aeròbia

Antimicrobial susceptibility testing (AST) is performed to assess the in vitro activity of antimicrobial agents against various bacteria. The AST results, ...

a-reference-broth-microdilution-method-for-dalbavancin-vitro

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

28.9K visualizações.  Laboratory Specialists, Inc. Here, we present a protocol for determination of dalbavancin susceptibility of clinically relevant Gram-positive bacteria using a broth microdilution reference methodology. 

Vídeo: A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

Antimicrobial Susceptibility Testing of Mycobacterium Tuberculosis Complex for First and Second Line Drugs by Broth Dilution in a Microtiter Plate Format

The rapid detection of antimicrobial resistance is important in the effort to control the increase in resistant Mycobacterium 
tuberculosis (Mtb). Antimicrobial susceptibility testing (AST) of Mtb has traditionally been performed by the agar method of proportion or by 
macrobroth testing on an instrument such as the BACTEC (Becton Dickinson, Sparks, MD), VersaTREK (TREK Diagnostics, Cleveland, OH) or BacT/ALERT (bioM&eacute;rieux, Hazelwood, MO). The agar proportion method, while considered the &#x201C;gold&#x201D; standard of AST, is labor intensive and requires calculation of resistance by performing colony counts on drug-containing agar as compared to drug-free agar. If there is &ge;1% growth on the drug-containing medium as compared to drug-free medium, the organism is considered resistant to that drug. The macrobroth methods require instrumentation and test break point ("critical") drug concentrations for the first line drugs (isoniazid, ethambutol, rifampin, and pyrazinamide). The method described here is commercially available in a 96 well microtiter plate format [MYCOTB (TREK Diagnostics)] and contains increasing concentrations of 12 antimicrobials used for treatment of tuberculosis including both first (isoniazid, rifampin, ethambutol) and second line drugs (amikacin, cycloserine, ethionamide, kanamycin, moxifloxacin, ofloxacin, para-aminosalicylic acid, rifabutin, and streptomycin). Pyrazinamide, a first line drug, is not included in the microtiter plate due to its need for acidic test conditions. Advantages of the microtiter system include both ease of set up and faster turn around time (14 days) compared with traditional agar proportion (21 days). In addition, the plate can be set up from inoculum prepared using either broth or solid medium. Since the microtiter plate format is new and since Mtb presents unique safety challenges in the laboratory, this protocol will describe how to safely setup, incubate and read the microtiter plate.

Antimicrobial susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis is challenging but critical for patient care. This microtiter plate format offers testing of 12 antimycobacterial drugs and provides minimum inhibitory concentration (MIC) values, which will aid in appropriate treatment.

Teste de susceptibilidade antimicrobiana do complexo Mycobacterium tuberculosis da Droga primeira e segunda linha de diluição em caldo em um formato de placa de microtitulação

The rapid detection of antimicrobial resistance is important in the effort to control the increase in resistant Mycobacterium 
tuberculosis (Mtb). ...

Imunologia e Infecção

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

Uso de meio de escarro Artificial para testar a eficácia antibiótica contra<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Em condições mais relevantes para o Pulmão Fibrose Cística

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a rapid identification of the infectious agent to guide optimal antibiotic treatment. The analysis of Gram stains from positive blood culture can be rapidly conducted and already significantly impact the antibiotic regimen. However, the accurate identification of the infectious agent is still required to establish the optimal targeted treatment. We present here a simple and fast bacterial pellet preparation from a positive blood culture that can be used as a sample for several essential downstream applications such as identification by MALDI-TOF MS, antibiotic susceptibility testing (AST) by disc diffusion assay or automated AST systems and by automated PCR-based diagnostic testing. The performance of these different identification and AST systems applied directly on the blood culture bacterial pellets is very similar to the performance normally obtained from isolated colonies grown on agar plates. Compared to conventional approaches, the rapid acquisition of a bacterial pellet significantly reduces the time to report both identification and AST. Thus, following blood culture positivity, identification by MALDI-TOF can be reported within less than 1 hr whereas results of AST by automated AST systems or disc diffusion assays within 8 to 18 hr, respectively. Similarly, the results of a rapid PCR-based assay can be communicated to the clinicians less than 2 hr following the report of a bacteremia. Together, these results demonstrate that the rapid preparation of a blood culture bacterial pellet has a significant impact on the identification and AST turnaround time and thus on the successful outcome of patients suffering from bloodstream infections.

A rapid bacterial pellet preparation from a positive blood culture can be used as a sample for applications such as identification by MALDI-TOF, Gram staining, antibiotic susceptibility testing and PCR-based test. The results can be rapidly communicated to clinicians to improve the outcome of patients suffering from bloodstream infections.

Preparação de uma Cultura Pellet sangue para rápida identificação bacteriana e Antibiótico Teste à Susceptibilidade

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

Visualization of the Charcoal Agar Resazurin Assay for Semi-quantitative, Medium-throughput Enumeration of Mycobacteria

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the etiological agent of TB, is refractory to rapid and lasting chemotherapy due to the presence of bacilli exhibiting phenotypic drug resistance. The charcoal agar resazurin assay (CARA) was developed as a tool to characterize active molecules discovered by high-throughput screening campaigns against replicating and non-replicating M. tuberculosis. Inclusion of activated charcoal in bacteriologic agar medium helps mitigate the impact of compound carry-over, and eliminates the requirement to pre-dilute cells prior to spotting on CARA microplates. After a 7-10 day incubation period at 37 &#176;C, the reduction of resazurin by mycobacterial microcolonies growing on the surface of CARA microplate wells permits semi-quantitative assessment of bacterial numbers via fluorometry. The CARA detects approximately a 2-3 log10 difference in bacterial numbers and predicts a minimal bactericidal concentration leading to &#8805;99% bacterial kill (MBC&#8805;99). The CARA helps determine whether a molecule is active on bacilli that are replicating, non-replicating, or both. Pilot experiments using the CARA facilitate the identification of which concentration of test agent and time of compound exposure require further evaluation by colony forming unit (CFU) assays. In addition, the CARA can predict if replicating actives are bactericidal or bacteriostatic.

The charcoal agar resazurin assay (CARA) is a semi-quantitative, medium-throughput method to assess activity of test agents against mycobacteria that are replicating, non-replicating, or both. The CARA permits rapid evaluation of time- and concentration-dependent activity and identifies parameters to pursue by colony forming unit (CFU) assays.

Visualização do carvão Agar resazurina Ensaio para a semi-quantitativa, médio rendimento enumeração de micobactérias

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the ...

Antimicrobial Synergy Testing by the Inkjet Printer-assisted Automated Checkerboard Array and the Manual Time-kill Method

As rates of multidrug-resistant (MDR) pathogens continue to rise, outpacing the development of new antimicrobials, novel approaches to treatment of MDR bacteria are increasingly becoming a necessity. One such approach is combination therapy, in which two or more antibiotics are used together to treat an infection against which one or both of the drugs may be ineffective alone. When two drugs, in combination, exert a greater than additive effect, they are considered synergistic. In vitro investigation of synergistic activity is an important first step in evaluating the possible efficacy of drug combinations. Two main in vitro synergy testing methods have been developed: the checkerboard array and the time-kill study. In this paper, we present an automated checkerboard array method that makes use of inkjet printing technology to increase the efficiency and accuracy of this technique, as well as a standard manual time-kill synergy method. The automated checkerboard array can serve as a high-throughput screening assay, while the manual time-kill study provides additional, complementary data on synergistic activity and killing.
The checkerboard array is a modification of standard minimum inhibitory concentration (MIC) testing, in which bacteria are incubated with antibiotics at different concentration combinations and evaluated for growth inhibition after overnight incubation. Manual performance of the checkerboard array requires a laborious and error-prone series of calculations and dilutions. In the automated method presented here, the calculation and dispensing of required antibiotic stock solution volumes are automated through the use of inkjet printer technology. In the time-kill synergy assay, bacteria are incubated with the antibiotics of interest, both together and individually, and sampled at intervals over the course of 24 h for quantitative culture. The results can determine whether a combination is synergistic and whether it is bactericidal, and provide data on inhibition and killing of bacteria over time.

Antimicrobial synergy testing is used to evaluate the effect of two or more antibiotics used in combination and is typically performed by one of two methods: the checkerboard array or the time-kill assay. Here, we present an automated, inkjet printer-assisted checkerboard array synergy technique and a classic time-kill synergy study.

Antimicrobiana sinergia testes pela impressora jato de tinta-assistida matriz Checkerboard automatizado e o método Manual de tempo-kill

As rates of multidrug-resistant (MDR) pathogens continue to rise, outpacing the development of new antimicrobials, novel approaches to treatment of MDR ...

Deferred Growth Inhibition Assay to Quantify the Effect of Bacteria-derived Antimicrobials on Competition

Competitive exclusion can occur in microbial communities when, for example, an inhibitor-producing strain outcompetes its competitor for an essential nutrient or produces antimicrobial compounds that its competitor is not resistant to. Here we describe a deferred growth inhibition assay, a method for assessing the ability of one bacterium to inhibit the growth of another through the production of antimicrobial compounds or through competition for nutrients. This technique has been used to investigate the correlation of nasal isolates with the exclusion of particular species from a community. This technique can also be used to screen for lantibiotic producers or potentially novel antimicrobials. The assay is performed by first culturing the test inhibitor-producing strain overnight on an agar plate, then spraying over the test competitor strain and incubating again. After incubation, the extent of inhibition can be measured quantitatively, through the size of the zone of clearing around the inhibitor-producing strain, and qualitatively, by assessing the clarity of the inhibition zone. Here we present the protocol for the deferred inhibition assay, describe ways to minimize variation between experiments, and define a clarity scale that can be used to qualitatively assess the degree of inhibition.

The deferred growth inhibition assay can be used to assess the competition effect by one bacterial isolate on another. Inhibition is quantified by measuring the zone of clearing around the inhibitor-producing isolate, or qualitatively assessed by determining the visible extent of inhibition.

Crescimento diferido Ensaio de Inibição para quantificar o efeito de antimicrobianos bactérias derivadas de concorrência

Competitive exclusion can occur in microbial communities when, for example, an inhibitor-producing strain outcompetes its competitor for an essential ...

Biologia

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

Fungal infections have become an important medical condition in the last decades, but the number of available antifungal drugs is limited. In this scenario, the search for new antifungal drugs is necessary. The protocol reported here details a method to screen peptides for their antifungal properties. It is based on the broth microdilution susceptibility test from the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 guidelines with modifications to suit the research of antimicrobial peptides as potential new antifungals. This protocol describes a functional assay to evaluate the activity of antifungal compounds and may be easily modified to suit any particular class of molecules under investigation. Since the assays are performed in 96-well plates using small volumes, a large-scale screening can be completed in a short amount of time, especially if carried out in an automation setting. This procedure illustrates how a standardized and adjustable clinical protocol can help the bench-work pursuit of new molecules to improve the therapy of fungal diseases.

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

An easy and adaptable broth microdilution method for screening antifungal compounds and extracts.

Como caldo em Vitro rastreio: um método fácil e rápido para detectar novos compostos antifúngicos

Fungal infections have become an important medical condition in the last decades, but the number of available antifungal drugs is limited. In this ...

Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Stimulated Raman Scattering Imaging of Deuterium Incorporation in a Single Bacterium

To slow and prevent the spread of antimicrobial resistant infections, rapid antimicrobial susceptibility testing (AST) is in urgent need to &#65279;quantitatively determine the &#65279;antimicrobial effects on pathogens. &#65279;It typically takes days to complete the AST by conventional methods based on the long-time culture, and they do not work directly for clinical samples. Here, we report a rapid AST &#65279;method enabled by stimulated Raman scattering (SRS) imaging of deuterium oxide (D2O) metabolic incorporation. Metabolic incorporation of D2O into biomass and the metabolic activity inhibition upon exposure to antibiotics at the single bacterium level are monitored by SRS imaging. The&#65279; single-cell metabolism inactivation concentration (SC-MIC) of bacteria upon exposure to antibiotics can be obtained after a total of 2.5 h of sample preparation and detection. Furthermore, this rapid AST method is directly applicable to bacterial samples in complex biological environments, such as urine or whole blood. SRS metabolic imaging of deuterium incorporation is transformative for rapid single-cell phenotypic AST in the clinic.

This protocol presents rapid antimicrobial susceptibility testing (AST) assay within 2.5 h by single-cell-stimulated Raman scattering imaging of D2O metabolism. This method applies to bacteria in the urine or whole blood environment, which is transformative for rapid single-cell phenotypic AST in the clinic.

Teste Rápido de Suscetibilidade a Antimicrobianos por Imagem de Dispersão Raman Estimulada da Incorporação de Deutério em uma Única Bactéria

To slow and prevent the spread of antimicrobial resistant infections, rapid antimicrobial susceptibility testing (AST) is in urgent need to ...

An In Vitro Broth Microdilution Assay for the Screening of Antifungal Compounds

Source: de-Souza-Silva, C. M., et al. <a href="https://app.jove.com/v/57127">Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates an in vitro assay to screen antifungal compounds using a broth microdilution assay. Test compounds are serially diluted in a microtiter plate and incubated with a fungal inoculum. Post-incubation, the plate is examined for wells without visible fungal growth to assess the antifungal potential of the test compounds and their minimum inhibitory concentration (MIC).

Um ensaio de microdiluição em caldo in vitro para a triagem de compostos antifúngicos

1. Solutions and Media

	Prepare 2X Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium, phosphate-buffered saline (PBS), Sabouraud dextrose broth, and ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Imunologia

Imunodiagnóstico

In Vitro and In Vivo Models

Evaluating the Effectiveness of a Test Compound against Mycobacteria in Broth

Source: Zheng, X., et al. <a href="https://app.jove.com/v/55273">System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis.</a> J. Vis. Exp. (2017)
This video demonstrates an in-broth assay to determine antibiotic efficacy against Mycobacterium tuberculosis. The bacterial culture is incubated with different concentrations of a bactericidal antibiotic. The bactericidal efficacy is measured by assessing the presence of viable bacteria using a resazurin assay.

Avaliando a eficácia de um composto de teste contra micobactérias em caldo

1. Bacterial Strain and Growth Medium

	Make albumin dextrose and salt stock solution (ADS) by solubilizing 25 g of bovine serum albumin, 10.0 g of ...

Um método de microdiluição em caldo de referência para Dalbavancin

Resumo

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