Prior work with regard to susceptibility testing of dalbavancin has been valuable in development of a standardized methods and acknowledgement for this work is given to JMI Laboratories, Robert Rennie and Beth Goldstein.

REMARQUE: Se reporter aux documents du CLSI M7-A10 et M100-S25 et / ou ISO / FDIS 20776-1 pour tous les détails de la méthode de référence de microdilution de bouillon pour antibiogramme 2, 3, 4 Les méthodes de référence permettent options dans une partie de la. des procédures spécifiques à la préparation de l&#39;inoculum et panneau de MIC production pour atteindre le même résultat final. Le procédé détaillé ici se rapporte à un agent antimicrobien, dalbavancine, et certaines des étapes représentent une de plusieurs manières potentiellement le procédé de référence peut être fait. Mesures de sécurité appropriées (compatibles avec le niveau de biosécurité 2) devraient être utilisés 10. Le format de panneau MIC utilisé aux fins de la présente publication vidéo est montrée dans le tableau 1. 1. Conserver dalbavancine poudre <ol><li> Dès réception de diagnostic poudre de dalbavancine de qualité, conserver à -20 ° C dans un environnement desséché dans un congélateur non-dégivrant. Avant l&#39;utilisation, la poudre devrait équilibrer àatteindre la TA avant l&#39;ouverture. </li></ol> 2. Préparer des dilutions panneau MIC <ol><li> Préparer une solution stock pas supérieure à 1600 ng / ml de dalbavancine dans soignée DMSO (pur) dans des tubes en verre ou en plastique stériles, et d&#39;utiliser le même jour de préparation ou de conserver à -20 à -60 o C ou moins pour une utilisation future dans un congélateur non-dégivrant. Prendre en considération la puissance de dalbavancine comme prévu sur la documentation reçue avec la poudre, lors de la pesée de la poudre (voir l&#39;équation 1 par exemple 800 pg / ml préparation de la pâte). </li><li> Diluer le stock dilution semblable au régime comme il est indiqué dans la colonne 1 (&quot;de concentration de la source&quot;) dans le tableau 2 avec du DMSO pur dans des tubes en verre ou en plastique stériles. Utilisez une pipette pour mesurer diluant et une autre pipette pour ajouter le dalbavancine stock initial au premier tube. Pour chaque concentration dalbavancine boursier ultérieure utiliser une nouvelle pipette. </li><li> Préparer 100X finale concent du panneau de MICdilutions de rationnement (concentrations intermédiaires) avec du DMSO pur. Comme on le voit dans les colonnes 2-4 du tableau 2, mélanger des volumes appropriés de source et DMSO pour atteindre concentration intermédiaire souhaité (volumes à utiliser dépendra du nombre de panneaux de MIC à faire). </li><li> Préparer 0,004% P80: Préparer une solution de travail fraîchement stock de 2% P80 par addition de 0,1 ml à 4,9 ml P80 dH 2 O. Stériliser par passage à travers une solution de filtre de 0,22 micron et de l&#39;utilisation le jour même de la préparation. Préparer 0,004% P80 diluant en faisant une dilution 1: 500 de 2% P80 (par exemple, 0,3 ml de 2% de P80 149,7 ml de CAMHB). </li><li> Diluer davantage les concentrations intermédiaires préparés à l&#39;étape 2.2 1: 100 à cation ajusté Mueller Hinton Broth (CAMHB) additionné de 0,004% (v / v) de polysorbate-80 (P-80) P-80 et / ou LHB (pour les streptocoques) ajouté au double de la concentration finale car l&#39;addition de l&#39;inoculum (étape 4.3) se traduira par une dilution de 1: 2. Voir les colonnes 6 et 7 du tableau 2 </stRong&gt;. </li></ol> 3. Préparer panneaux MIC <ol><li> Distribuer 50 pi de chaque solution de dalbavancine préparé à l&#39;étape 2.3 dans les puits appropriés du panneau de MIC et inclure des médias seulement dans un puits (de contrôle de la croissance bien). Une pipette multi-canaux avec embouts stériles peut être utilisé pour cette étape. </li><li> Utilisez panneaux immédiatement ou sceller avec du film plastique, dans des sacs en plastique et le placer immédiatement dans un congélateur non-dégivrant à ≤-20 ° C (de préférence à ≤-60 ° C) jusqu&#39;à ce que nécessaire. Si les panneaux sont utilisés gelés, enlever les joints et placer des panneaux individuels sur la paillasse pendant 15-30 min (jusqu&#39;à ce que le contenu et sont décongelées) avant de procéder à l&#39;inoculation panneau. </li></ol> 4. Inoculer panneaux MIC, Effectuer Pureté et Colony Setup comte <ol><li> Sélectionnez plusieurs colonies bien isolées à partir d&#39;une gélose au sang 18-24 h ou autre plaque de gélose non sélective. Touchez le haut de chaque colonie avec une anse stérile ou un tampon et le transfert à 1-5 ml CAMHB ou saline jusqu&#39;à ce que la turbidité est équivalent à un standard McFarland 0,5. Évaluer la turbidité par comparaison visuelle de la 0,5 McFarland ou avec un appareil de mesure photométrique. </li><li> De 15 à 30 min de préparation, diluer l&#39;inoculum à 1: 100 dans CAMHB (100 ul dans 10 ml CAMHB). Pour la plupart des bactéries testées contre dalbavancine, à l&#39;exception de S. pneumoniae, cette dilution fournira une concentration de puits finale de 5 x 10 5 UFC / ml (fourchette acceptable est 2-8 x 10 5 UFC / ml). Pour S. pneumoniae, la concentration bactérienne basée sur la comparaison de la turbidité à un 0,5 McFarland est généralement beaucoup moins, donc, diluer l&#39;inoculum 1:25 (400 pi dans 10 ml CAMHB + 10% + LHB). </li><li> Dans les 15 min après la préparation de l&#39;inoculum, transférer 50 pi de l&#39;inoculum final dans chaque puits (à l&#39;exception du contrôle de la stérilité ainsi) du panneau MIC préparé à l&#39;étape 3. Une pipette multi-canal à l&#39;aide des conseils stériles peut être utilisé pour cette étape. </li><li> Effectuez une vérification de la puretépar le transfert et la diffusion d&#39;une aliquote de 1-10 ul de la commande de croissance positive et en utilisant une boucle stérile à une gélose non sélective (par exemple, gélose trypticase soja avec du sang de mouton à 5%). </li><li> Configuration comptage des colonies en supprimant 10 ul du contrôle de la croissance et avec une pipette à canal unique et pointe stérile et transfert à 10 ml de solution saline (1: 1000 dilution). Mélanger et transférer 100 pi avec une pipette à canal unique et pointe stérile pour un milieu approprié, non sélectif agar (par exemple, gélose trypticase soja avec du sang de mouton à 5%) et répartis sur toute la surface de la gélose avec une boucle stérile, en répétant deux fois dans des directions différentes pour assurer une distribution uniforme de l&#39;inoculum (dilution 1:10). </li></ol> 5. Les panneaux Incuber MIC, Colony comte et la pureté Plaques <ol><li> Sceller chaque panneau MIC ou une pile de pas plus de 4 panneaux dans un sac plastique, avec du ruban en plastique ou avec un couvercle en plastique hermétique avant l&#39;incubation. Sinon, placez vide panneau de MIC sur le top de pile de pas plus de 4 panneaux de MIC, placez une serviette en papier humide dans un récipient en plastique, panneaux lieu de MIC dans le récipient en plastique et fermer le récipient avec le couvercle. </li><li> Incuber panneaux MIC dans un incubateur de l&#39;air ambiant à 35 ° C ± 2 ° C pendant 16-20 heures (staphylocoques et les entérocoques) et 20-24 h (streptocoques) à 30 min de l&#39;inoculation. Incuber le comptage des colonies et plaques de pureté dans les mêmes conditions à l&#39;exception des streptocoques incuber dans un incubateur à CO2 à 5%. </li></ol> 6. Lisez le MIC et Colony Count plaques; Vérifiez Pureté Plate <ol><li> Lire la MIC comme la concentration la plus faible qui inhibe totalement la croissance bactérienne dans les puits comme détecté par l&#39;oeil nu. </li><li> Compter les colonies sur la plaque de comptage des colonies. Multiplier chaque colonie par facteur de dilution (1: 10 000) (par exemple, 50 colonies est équivalent à 5 x 10 5 CFU / ml). Une plage acceptable est de 20-80 colonies (2-8 x 10 5 UFC / ml) et est utilisé comme un Approdirectrice ximate. </li><li> Vérifiez plaque de pureté. Si toutes les colonies sont similaires aux colonies utilisés dans l&#39;étape 4.1, l&#39;inoculum peut être considéré comme pur. Si il ya d&#39;autres colonies présentes, puis il ya le potentiel pour un contaminant d&#39;être présent dans le panneau de MIC et le test doit être répété. </li></ol> 7. vérifier les résultats de contrôle de qualité. <ol><li> Reportez-vous au tableau 3 pour les gammes attendues de CLSI souches de contrôle de qualité. Signaler Seulement résultats de l&#39;essai isolats si les résultats MIC pour dalbavancine organisme (s) de contrôle de la qualité sont dans la fourchette attendue. </li><li> Si une CMI ≥0.25 pg / ml est obtenue pour tout S. clinique aureus isoler, répéter les tests dalbavancine MIC et / ou envoyer à un laboratoire de référence pour la vérification. </li></ol>

<ol>
	<li>Boucher, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Once-weekly+dalbavancin+versus+daily+conventional+therapy+for+skin+infection.">Once-weekly dalbavancin versus daily conventional therapy for skin infection.</a> The New England journal of medicine. 370, 2169-2179 (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> M07-A10. Methods for Dilution Antimicrobial Tests for Bacteria that Grow Aerobically.: Approved Standard. , (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> M100-S25. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-Fifth Informational Supplement. , (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+laboratory+testing+and+in+vitro+diagnostic+test+systems+--+Susceptibility+testing+of+infectious+agents+and+evaluation+of+performance+of+antimicrobial+susceptibility+test+devices+--+Part+1:+Reference+method+for+testing+the+in+vitro+activity+of+antimicrobial+agents+against+rapidly+growing+aerobic+bacteria+involved+in+infectious+diseases.">Clinical laboratory testing and in vitro diagnostic test systems -- Susceptibility testing of infectious agents and evaluation of performance of antimicrobial susceptibility test devices -- Part 1: Reference method for testing the in vitro activity of antimicrobial agents against rapidly growing aerobic bacteria involved in infectious diseases.</a> ISO/FDIS. 20776-1, (2006).</li><li>Jones, R. N., Farrell, D. J., Flamm, R. K., Sader, H. S., Dunne, M. W., Mendes, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surrogate+analysis+of+vancomycin+to+predict+susceptible+categorization+of+dalbavancin.">Surrogate analysis of vancomycin to predict susceptible categorization of dalbavancin.</a> Diagn Microbiol Infect Dis. , (2015).</li><li>Turnidge, J., Paterson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Setting+and+revising+antibacterial+susceptibility+breakpoints.">Setting and revising antibacterial susceptibility breakpoints.</a> Clinical microbiology reviews. 20, 391-408 (2007).</li><li>Rennie, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+broth+microdilution+antimicrobial+susceptibility+test+results+for+dalbavancin,+a+new+glycopeptide+agent.">Factors influencing broth microdilution antimicrobial susceptibility test results for dalbavancin, a new glycopeptide agent.</a> Journal of clinical microbiology. 45, 3151-3154 (2007).</li><li>Arhin, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+polysorbate+80+on+oritavancin+binding+to+plastic+surfaces:+implications+for+susceptibility+testing.">Effect of polysorbate 80 on oritavancin binding to plastic surfaces: implications for susceptibility testing.</a> Antimicrobial agents and chemotherapy. 52, 1597-1603 (2008).</li><li>Farrell, D. J., Mendes, R. E., Rhomberg, P. R., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+reference+broth+microdilution+method+for+testing+telavancin:+effect+on+MIC+results+and+correlation+with+other+testing+methodologies.">Revised reference broth microdilution method for testing telavancin: effect on MIC results and correlation with other testing methodologies.</a> Antimicrobial agents and chemotherapy. 58, 5547-5551 (2014).</li><li>Ribbon Panel, B. l. u. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+Safe+Work+Practices+in+Human+and+Animal+Medical+Diagnostic+Laboratories.">Guidelines for Safe Work Practices in Human and Animal Medical Diagnostic Laboratories.</a> MMWR Supplements. 61 (01), 1-101 (2012).</li><li>Anderegg, T. R., Biedenbach, D. J., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+quality+control+evaluations+for+susceptibility+testing+of+Dalbavancin+(BI397),+an+investigational+glycopeptide+with+potent+gram-positive+activity.">Initial quality control evaluations for susceptibility testing of Dalbavancin (BI397), an investigational glycopeptide with potent gram-positive activity.</a> Journal of clinical microbiology. 41, 2795-2796 (2003).</li><li>Koeth, L. M., Windau, A. R., Goldstein, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Broth+Microdilution+and+Agar+Dilution+Dalbavancin+and+Vancomycin+MIC+Results+for+42+Aerobic+Gram-positive+Bacteria.+Poster+132.">Comparison of Broth Microdilution and Agar Dilution Dalbavancin and Vancomycin MIC Results for 42 Aerobic Gram-positive Bacteria. Poster 132.</a> ASM. , (2012).</li><li>Fritsche, T. R., Rennie, R. P., Goldstein, B. P., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+dalbavancin+MIC+values+determined+by+Etest+(AB+BIODISK)+and+reference+dilution+methods+using+gram-positive+organisms.">Comparison of dalbavancin MIC values determined by Etest (AB BIODISK) and reference dilution methods using gram-positive organisms.</a> Journal of clinical microbiology. 44, 2988-2990 (2006).</li><li>Mushtaq, S., Warner, M., Johnson, A. P., Livermore, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+dalbavancin+against+staphylococci+and+streptococci,+assessed+by+BSAC+and+NCCLS+agar+dilution+methods.">Activity of dalbavancin against staphylococci and streptococci, assessed by BSAC and NCCLS agar dilution methods.</a> The Journal of antimicrobial chemotherapy. 54, 617-620 (2004).</li><li>Jones, R. N., Flamm, R. K., Sader, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveillance+of+dalbavancin+potency+and+spectrum+in+the+United+States+(2012).">Surveillance of dalbavancin potency and spectrum in the United States (2012).</a> Diagnostic microbiology and infectious disease. 76, 122-123 (2013).</li></ol>

Sandra McCurdy est un employé de Durata Therapeutics; Les spécialistes de laboratoire, Inc., employeur de Laura Koeth et Jeanna Fisher, a été contracté par Durata Therapeutics pour préparer le manuscrit. Frais de publication pour cet article ont été payés par les spécialistes de laboratoire, Inc.

Les détails de procédé suivantes sont présentées pour des considérations supplémentaires lors de la préparation pour le test dalbavancine MIC. La conception du panneau de MIC dépend du nombre d&#39;agents antimicrobiens à tester (par exemple., Dalbavancine seul ou de multiples agents) et les espèces de bactéries à tester. Les concentrations de dalbavancine devraient englober les points d&#39;arrêt d&#39;interprétation pour toutes les espèces bactériennes à tester et toute la gamme des dilutions attendues pour au moins une souche QC. La série de dilutions antimicrobien peut être organisé soit en lignes ou en colonnes en fonction du nombre d&#39;agents antimicrobiens et / ou des isolats / plaque et la méthode d&#39;inoculation. Le volume de poudre de dalbavancine et le bouillon doit être calculé pour assurer que des quantités optimales sont produits et des déchets est minime. Pour l&#39;exemple utilisé dans cette publication, les volumes sont basés sur la préparation de deux panneaux MIC. Cation ajusté bouillon de Mueller Hinton devrait être préparée et autoclavée selon l&#39;hommeles instructions et la stérilité des médias données par le fabricant vérifiées. MIC panneaux peuvent être fabriqués et utilisés le jour même de la préparation ou ils peuvent être testés avec les organismes de contrôle de qualité appropriés et les panneaux validées conservés congelés pour une utilisation future. Il est important d&#39;utiliser des techniques stériles pendant toute la procédure. Il n&#39;y a pas de critères stricts pour la vérification de la concentration de l&#39;inoculum avec le nombre de colonies. Les numérations des colonies peuvent être vérifiées pour chaque espèce initialement testé et / ou périodiquement à valider l&#39;étape de dilution effectuée à l&#39;étape 4.2. Il est important que la validité de la norme McFarland 0,5 est également vérifiée régulièrement avec E. ATCC 25922 coli en utilisant une procédure similaire à l&#39;étape 4.5. Si les résultats ne sont pas équivalents à 1-2 x 10 8 UFC / ml, une nouvelle norme McFarland 0,5 doit être obtenue. Si les comptes de colonies de puits de MIC sont en dehors de la plage acceptable (2-8 x 10 5 résultats UFC / ml et MIC pour l&#39;isolat (s) clinique varient d&#39;ee attendue distribution normale (par ex. de 0,03 à 0,12 ug / ml pour S. aureus) et / ou résultats de CMI pour isolat de contrôle de la qualité (s) sont à l&#39;extérieur des limites attendues, les tests de validation est nécessaire et la méthode de modification peut être justifiée. Il est suggéré qu&#39;un standard McFarland 0,5 validé est utilisé pour répéter le décompte (s) de la colonie et si les résultats sont à nouveau en dehors des résultats escomptés, la dilution de l&#39;inoculum comme effectuée à l&#39;étape 4.2 devrait être ajusté en conséquence et le MIC répété. Notez qu&#39;une vérification de la pureté est nécessaire même si un nombre de colonies est effectuée parce que la procédure de comptage des colonies utilise un volume dilué qui peuvent ne pas détecter nécessairement plus faibles concentrations d&#39;organismes contaminants. Pour un test MIC soit considéré comme valide, la croissance acceptable doit se produire dans le contrôle de la croissance ainsi. Pour la plupart des bactéries qui seront testés contre dalbavancine (ie., Les staphylocoques, les streptocoques et les entérocoques, la croissance seront considérés comme un bouton (typiquement&gt; 2 mm) et moins frequently, la croissance peut apparaître comme la turbidité dans le puits. Contrairement à certains agents antimicrobiens qui peuvent présenter de fuite effet que les concentrations augmentent, critères d&#39;dalbavancine sont généralement bien définis. Il existe divers dispositifs de visualisation destinés à faciliter la lecture des tests de microdilution, qui peuvent être utilisés pour lire des plaques contenant de dalbavancine tant qu&#39;il n&#39;y a pas de compromis dans la capacité de discerner la croissance dans les puits. Les étapes critiques dans le protocole sont liées aux parties de la procédure qui sont liés à la solubilité de la dalbavancine et addition de P80. Il est important que la concentration maximale de la dalbavancine utilisé est non supérieure à 1600 pg / ml, que le DMSO est utilisé comme solvant et que des concentrations intermédiaires sont préparés dans du DMSO avant d&#39;effectuer des dilutions en bouillon de sorte que la concentration finale de DMSO dans le MIC panneau puits ne dépasse pas 1%. Le DMSO est hygroscopique et par conséquent, l&#39;utilisation de bouteilles âgés de DMSO était une EXAMENions à l&#39;égard de la dalbavancine solubilité. Cependant, alors que d&#39;une petite étude de la DMO avec des souches de contrôle de qualité a montré que ce ne soit pas une variable importante (voir la section Résultats), il est recommandé d&#39;utiliser de nouvelles ou récemment ouverts bouteilles de DMSO. Il est également important que P80 est ajoutée au bouillon à l&#39;étape finale de préparation et de dilution de médicament est à une concentration finale de 0,002% dans la MIC bien. Le mode opératoire décrit ici utilise DMO préparation de panneaux de MIC en utilisant 50 pl / puits à la dalbavancine et P-80 concentrations de deux fois la concentration finale d&#39;inoculum et avec addition de 50 pl / puits de sorte que le volume final est / puits 100 ul. Cette méthode permet à un format de panneau MIC à être produite pour l&#39;essai de deux S. aureus et S. pneumoniae car le sang de cheval lysé peut être ajouté à l&#39;inoculum. D&#39;autres procédés pour la préparation de panneaux de MIC en utilisant 100 pl / puits avec addition d&#39;un maximum de 10 ul / puits sont décrits dans laProcédures CLSI et ISO. Le dalbavancine arrêt susceptible pour S. aureus est ≤0.12 pg / ml (FDA package insert). Comme cela est représenté sur la surveillance récent, la plupart des isolats sont inhibées par la dalbavancine à des niveaux de 0,06 ug / ml 15. Avec un point d&#39;arrêt sensibles à proximité de la MIC modale, toute variation de MIC en raison des différences de méthode peut influer sur les taux de susceptibilité. Parce que la procédure de la DMO pour dalbavancine comprend certaines mesures uniques (en particulier, l&#39;utilisation de DMSO dans la préparation de stock et des dilutions de médicaments intermédiaires et 0,002% P80 dans le MIC bien, il est impératif que la méthode est suivie à la lettre. Le S. aureus QC organisme (ATCC 29213) avec un très clair MIC de 0,06 pg / ml dalbavancine modale, a été un bon indicateur de la méthode variation et doit être utilisé systématiquement pour valider la méthode DMO. Si les résultats sont MIC avec la gamme de 0,03 à 0,12 attendu ug / ml, mais sont orientés soit à la basse ou HIGh côté de cette gamme, outre la validation de la méthode est justifiée. L&#39;addition de 0,002% P80 est recommandé pour tous les Gram positif pertinente organismes (staphylococcci, entérocoques et streptocoques). Cependant, il est à noter qu&#39;il a été démontré que lysée sang de cheval actes similaires à P-80 par rapport à son anti-liaison capacité et que l&#39;addition de P-80 à + CAMHB LHB n&#39;a aucun effet supplémentaire sur la dalbavancine streptocoques résultats de CMI. Il n&#39;y a actuellement aucune méthode de diffusion de disques pour les tests dalbavancine et en raison de la faible corrélation de la DMO et des résultats de AD, tests de sensibilité de dalbavancine en utilisant la méthode de AD est déconseillé 12, 14. La méthode la DMO doit être utilisé pour l&#39;évaluation future de dalbavancine susceptibilité et comme une norme d&#39;or pour le développement de tests de sensibilité aux antimicrobiens commerciales.

Dalbavancine est un lipoglycopeptidique semi-synthétique qui a été approuvé par la FDA mai 2014 pour le traitement des infections de la peau et des structures cutanées bactériennes aiguës causées par des organismes Gram-positifs 1. L&#39;objectif principal de cette méthode en détail dans un format vidéo est de fournir des orientations claires aux scientifiques de laboratoire clinique et de recherche pour les essais et la déclaration des résultats précis et reproductibles dalbavancine susceptibilité. La détermination d&#39;un agent antimicrobien MIC par des méthodes commerciales est systématiquement effectuée dans les laboratoires cliniques pour l&#39;évaluation in vitro de l&#39;activité d&#39;un agent contre les bactéries pathogènes. La méthode décrite ici est la méthode de microdilution de bouillon tel que recommandé par le CLSI et ISO 2,3,4. Depuis dalbavancine méthodes de susceptibilité commerciales ne sont pas actuellement disponibles (au moment de cette publication) et la diffusion du disque et les méthodes de dilution agar ne sont pas actuellement recommandé fou dalbavancine, méthodes bouillon de référence de dilution sont les options actuelles disponibles 12,14. Comme cette méthode de référence est pas un commercial et approuvé par la FDA méthode de diagnostic in vitro, les laboratoires cliniques aux Etats-Unis qui utilisent cette procédure pour les tests du patient doit se conformer à des exigences réglementaires pour un test développé en laboratoire (LDT). Il est prévu que l&#39;utilisation dalbavancine augmente, plus les laboratoires auront un besoin de tester ce composé. Tests vancomycine comme un substitut pour la détermination de la susceptibilité de S. dalbavancine aureus a été validé 5. Cependant, dalbavancine peut être actif contre la vancomycine S. intermédiaire aureus (VISA) et, par conséquent, les cliniciens peuvent demander les résultats dalbavancine MIC. En outre, les résultats de CMI pour d&#39;autres espèces bactériennes peuvent être demandés. Le point d&#39;arrêt sensible de la FDA pour la dalbavancine contre S. aureus a été établi à ≤0.12 pg / ml. FDA attribué seulement un suscepticatégorie ble en raison du manque de données sur les isolats résistants. La distribution de MIC normale chez type sauvage S. aureus est entre de 0,03 à 0,12 pg / ml, avec un micro modale claire de 0,06 pg / ml. Une légère variation dans les résultats de CMI en raison de la méthode de différence, en plus de la variation de la DMO inhérente de ± une dilution, pourrait avoir un impact significatif sur les taux de susceptibilité. 6 similaires à d&#39;autres agents lipoglycopeptidique, des tests de sensibilité de dalbavancine peut être difficile en raison solubilité et de la taille relativement importante de la molécule et ses propriétés de liaison 7,8,9. La méthode de référence BMD décrite ici comprend deux étapes spécifiques qui sont uniques aux agents insolubles et / ou des agents de lipoglycopeptidique: (1) l&#39;utilisation de DMSO pour la préparation de solutions d&#39;achat d&#39;actions et (2) plus de 0,002% de P-80 dans le panneau de MIC finale Des dilutions. L&#39;objectif de cette publication vidéo est de fournir la clarté à l&#39;dalbavancine méthode DMO et specifically concentrer sur ces étapes clés, pour assurer des résultats précis et reproductibles MIC.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dalbavancin</td>
			<td>Metrics, Inc.</td>
			<td>Greenville, NC</td>
			<td>BI-397</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vancomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>St. Louis, MO</td>
			<td>C5793</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cation Adjusted Mueller Hinton Broth</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>Sparks, MD</td>
			<td>212322</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysed horse blood</td>
			<td>Cleveland Scientific</td>
			<td>Bath, OH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dose-it peristaltic pump</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>Hudson, NH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-channel pipet (Viaflo II)</td>
			<td>Integra</td>
			<td>Hudson, NH</td>
			<td>4164</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 channel pipet (Matrix)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Waltham, MA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channelpPipets (Ovation 10 &#181;L - 100 &#181;L)</td>
			<td>VistaLab</td>
			<td>Brewster, NY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well microplate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>Monroe, NC</td>
			<td>650161</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL flat cap conical bottom centrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Waltham, MA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16x125mm disposable glass tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Waltham, MA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12x17mm snap cap, polystyrene tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Waltham, MA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 mL centrifuge tubes</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>Kaysville, UT</td>
			<td>C-3394-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent reservoirs</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>Hudson, NH</td>
			<td>4312</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable sterilelLoops (1 uL &#38; 10 uL)</td>
			<td>Biologix</td>
			<td>Lenexa, KA</td>
			<td>65-0001,65-0010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soy agar + 5% sheep blood</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>Sparks, MD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (ambient)</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (5% CO2)</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Waltham, MA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td></td>
			<td>52817</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab coats</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a reference broth microdilution method for dalbavancin in vitro susceptibility testing of bacteria that grow aerobically

Antibiogramme (AST) est effectué pour évaluer l&#39;activité in vitro des agents antimicrobiens contre diverses bactéries. Les résultats de l&#39;AST, qui sont exprimées en concentrations minimales inhibitrices (CMI) sont utilisés dans la recherche pour le développement antimicrobien et suivi du développement de la résistance et dans le cadre clinique pour des conseils de traitement antimicrobien. Dalbavancine est un agent antimicrobien lipoglycopeptidique semi-synthétique qui a été approuvé mai 2014 par la Food and Drug Administration (FDA) pour le traitement des infections de la peau et des structures cutanées bactériennes aiguës causées par des organismes Gram-positifs. L&#39;avantage de dalbavancine sur les thérapies anti-staphylocoques actuelles est sa longue demi-vie, ce qui permet un dosage une fois par semaine. Dalbavancine a une activité contre Staphylococcus aureus (y compris à la fois sensible à la méthicilline S. aureus [SASM] et résistant à la méthicilline S. aureus [SARM]), staphylocoques à coagulase négative, <em&gt; Streptococcus pneumoniae, groupe Streptococcus anginosus, β-hémolytique streptocoques et de la vancomycine entérocoques sensibles. Semblable à d&#39;autres agents de lipoglycopeptidique récents, optimisation des méthodes de test de sensibilité CLSI et le bouillon ISO comprend l&#39;utilisation de diméthylsulfoxyde (DMSO) comme solvant lors de la préparation des solutions d&#39;achat d&#39;actions et de polysorbate 80 (P80) pour soulager l&#39;adhésion de l&#39;agent au plastique. Avant les études cliniques et pendant le développement initial de la dalbavancine, des études de sensibilité sont effectués à l&#39;aide de P-80 et les résultats de CMI ont tendance à être 2-4 fois plus élevée et de même supérieur MIC résultats ont été obtenus avec la méthode de dilution de sensibilité agar. Dalbavancine a été inclus dans CLSI microdilution tables de méthodologie en 2005 et modifiée en 2006 afin de clarifier l&#39;utilisation de DMSO et P-80. Le microdilution de bouillon (DMO) de procédure illustrée ici est spécifique à dalbavancine et est en conformité avec les méthodes du CLSI et ISO, avec des détails et foc étape par étapenous sur les étapes critiques ajouté pour plus de clarté.

MIC méthodes standardisées sont nécessaires afin de suivre le développement de la résistance, un objectif important de divers programmes de surveillance antimicrobiens. Résultats dalbavancine MIC pour isolats collectés en Europe et aux USA en 2011-2013 étaient &lt;0,25 ng / ml pour 99,9% des S. aureus et 100% des streptocoques (tableau 4). Pour évaluer l&#39;importance de l&#39;utilisation de frais (scellé) DMSO, triple test des CMI dalbavancine de la DMO pour QC souches de S. ATCC 29213 aureus et E. faecalis ATCC 29212 et dupliquer les tests pour S. pneumoniae ATCC 49619 a été réalisée en utilisant (1) DMSO à partir ampoules scellées, (2) DMSO à partir d&#39;une bouteille de 1 L qui était au sein de la date d&#39;expiration et avait été utilisée précédemment pour 2 ans et (3) une aliquote de DMSO de la même 1 L bouteille (échantillon 2) qui a été autorisé à s&#39;asseoir dans un bêcher ouvert pendant 72 heures avant de les utiliser. Résultats de la MIC dalbavancine utilisant des panneaux fabriqués avec trois échantillons de DMSO étaient similaires et wans le QC gammes acceptables (tableau 5). La perte d&#39;activité de dalbavancine suite d&#39;une exposition de la solution d&#39;achat d&#39;actions au plastique et sans l&#39;ajout de P-80 a été bien documenté 7. Dans 2 des études supplémentaires, l&#39;addition de P-80 et les solutions mères initiales et intermédiaires (tableau 6) et l&#39;utilisation de tubes en verre ou en plastique pour la préparation des solutions initiales et intermédiaires sous licence (tableau 7) n&#39;a pas eu d&#39;effet sur les résultats dalbavancine MIC. Il y avait aussi pas d&#39;effet sur ​​les résultats de MIC dalbavancine quand polypropylène et le polystyrène plaques provenant de trois fabricants ont été utilisés (tableau 7). La présence de sang de cheval lysé dans les milieux de bouillon pour les essais de streptocoques a été démontré qu&#39;ils ont une activité de surfactant analogue, comparable à P-80 7, 8. La méthode de référence de la dalbavancine pour le streptocoque ne comprend à la fois cheval sang de P-80 et lysées ,Cependant, à la différence des staphylocoques et des entérocoques, des résultats dalbavancine MIC pour les streptocoques sont similaires (à +/- une dilution) avec et sans addition de P-80. Comme cela a été présenté précédemment et représenté sur la figure 1, la dalbavancine dilution de gélose (AD) CMI sont généralement 2-8 fois plus élevée par rapport à la référence de courant DMO 12, 13, 14. Contrairement DMO, l&#39;addition de 0,002% de P-80 ne affecter AD dalbavancine résulte MIC 12. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/53028/53028eq1.jpg" /> Équation 1: Exemple de dalbavancine Stock Solution Préparation étapes de préparation de 25 ml de 800 pg / ml de solution dalbavancine.. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53028/53028fig1.jpg" /> Figure 1. Comparaison des dalbavancine et vancomycine DMO à AD. Résultats de l&#39;étude qui a comparé dalbavancin et la vancomycine DMO et AD MIC résultats pour sélectionner les isolats bactériens Gram-positif. Moyenne (A) dalbavancine et (B) à la vancomycine microdilution en bouillon et gélose Dilution MIC résultats en ng / ml pour 15 Staphylococcus aureus, 8 à coagulase négative staphylocoques (SNC), 5 Enterococcus faecalis et 14 streptocoques (groupes A, B et C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53028/53028fig1highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 11 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> UN </td><td> DAL 0,002 </td><td> DAL 0,004 </td><td> DAL 0,008 </td><td> DAL 0,015 </td><td> Dal 0,03 </td><td> DAL; 0,06 </td><td> DAL 0,12 </td><td> DAL 0,25 </td><td> DAL 0,5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td> B </td><td> DAL 0,002 </td><td> DAL 0,004 </td><td> DAL 0,008 </td><td> DAL 0,015 </td><td> Dal 0,03 </td><td> DAL 0,06 </td><td> DAL 0,12 </td><td> DAL 0,25 </td><td> DAL 0,5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td> C </td><td> DAL 0,002 </td><td> DAL 0,004 </td><td> DAL 0,008 </td><td> DAL 0,015 </td><td> Dal 0,03 </td><td> DAL 0,06 </td><td> DAL0,12 </td><td> DAL 0,25 </td><td> DAL 0,5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td> RÉ </td><td> DAL 0,002 </td><td> DAL 0,004 </td><td> DAL 0,008 </td><td> DAL 0,015 </td><td> Dal 0,03 </td><td> DAL 0,06 </td><td> DAL 0,12 </td><td> DAL 0,25 </td><td> DAL 0,5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td> E </td><td> DAL 0,002 </td><td> DAL 0,004 </td><td> DAL 0,008 </td><td> DAL 0,015 </td><td> Dal 0,03 </td><td> DAL 0,06 </td><td> DAL 0,12 </td><td> DAL 0,25 </td&gt; <td> DAL 0,5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td> F </td><td> DAL 0,002 </td><td> DAL 0,004 </td><td> DAL 0,008 </td><td> DAL 0,015 </td><td> Dal 0,03 </td><td> DAL 0,06 </td><td> DAL 0,12 </td><td> DAL 0,25 </td><td> DAL 0,5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td> G </td><td> DAL 0,002 </td><td> DAL 0,004 </td><td> DAL 0,008 </td><td> DAL 0,015 </td><td> Dal 0,03 </td><td> DAL 0,06 </td><td> DAL 0,12 </td><td> DAL 0,25 </td><td> DAL 0.5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td> H </td><td> DAL 0,002 </td><td> DAL 0,004 </td><td> DAL 0,008 </td><td> DAL 0,015 </td><td> Dal 0,03 </td><td> DAL 0,06 </td><td> DAL 0,12 </td><td> DAL 0,25 </td><td> DAL 0,5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> DAL </td><td colspan="2"> Dalbavancine </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td&gt; </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="12"> Les concentrations sont exprimés en ng / ml après 50 pl / puits inoculation </td></tr></tbody></table> Tableau 1. MIC Plate Format. Le format de plaque à 96 puits, montrant l&#39;emplacement de dilutions de dalbavancine et puits de contrôle positif utilisé comme un exemple dans cette publication vidéo <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Conc Source. (ug / ml) </td><td> Source Volume (ml) </td><td> DMSO Volume (ml) </td><td> Intermédiaire Conc. dans du DMSO (ug / ml) </td><td> Volume intermédiaire Conc. (ml) </td><td> Volume CAMHB + 0,004% P80 * (ml) </td><td> 2X Conc. Après dilution 1: 100 dans CAMHB (ug / ml) </td><td> Conc final du groupe spécial. Après l&#39;inoculation (ug / ml) </td></tr><tr><td> 800 </td><td> 10 </td><td>10 </td><td> 400 </td><td> 0,02 </td><td> 1,98 </td><td> 4 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> 400 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td><td> 200 </td><td> 0,02 </td><td> 1,98 </td><td> 2 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 400 </td><td> 0,5 </td><td> 1.5 </td><td> 100 </td><td> 0,02 </td><td> 1,98 </td><td> 1 </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td> 400 </td><td> 0,5 </td><td> 3.5 </td><td> 50 </td><td> 0,02 </td><td> 1,98 </td><td> 0,5 </td><td> 0,25 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td><td> 25 </td><td> 0,02 </td><td> 1,98 </td><td> 0,25 </td><td> 0,125 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 0,5 </td><td> 1.5 </td><td> 12,5 </td><td> 0,02 </td><td> 1,98 </td><td> 0,125 </td><td> 0,06 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 0,5 </td><td> 3.5 </td><td> 6,25 </td><td> 0,02 </td><td> 1,98 </td><td> 0,06 </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td> 6,25 </td><td> 0,5 &lt;/ td&gt; <td> 0,5 </td><td> 3.13 </td><td> 0,02 </td><td> 1,98 </td><td> 0,03 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> 6,25 </td><td> 0,5 </td><td> 1.5 </td><td> 1.5 </td><td> 0,02 </td><td> 1,98 </td><td> 0,015 </td><td> 0,008 </td></tr><tr><td> 6,25 </td><td> 0,5 </td><td> 3.5 </td><td> 0,8 </td><td> 0,02 </td><td> 1,98 </td><td> 0,008 </td><td> 0,004 </td></tr><tr><td> 0,8 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td><td> 0,4 </td><td> 0,02 </td><td> 1,98 </td><td> 0,004 </td><td> 0,002 </td></tr><tr><td colspan="5"> Ce tableau a été modifié depuis CLSI M100-S25, Tableau 8B 3 </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 2. Schéma pour la préparation des dilutions d&#39;agents antimicrobiens insolubles dans l&#39;eau pour être utilisé dans un bouillon Testing dilutions sensibilité. Les volumes de dalbavancine solutions de travail et diluants pour la préparation de MIC finaledalbavancine solutions de 0,002 à 2 pg / ml. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> La souche de contrôle de qualité </td><td> Prévue dalbavancine MIC (pg / ml) </td></tr><tr><td> S. aureus ATCC 29213 </td><td> De 0,03 à 0,12 </td></tr><tr><td> E. faecalis ATCC 29212 </td><td> De 0,03 à 0,12 </td></tr><tr><td> S. pneumoniae ATCC 49619 </td><td> De 0,008 à 0,03 </td></tr></tbody></table> Tableau 3. Résultats attendus dalbavancine CMI pour les souches de contrôle de qualité 3, 11 CLSI résultats. De contrôle de qualité pour les souches proposées à tester avec des isolats cliniques afin de vérifier la méthodologie appropriée <img alt="Tableau 4" src="/files/ftp_upload/53028/53028table4.jpg" /> Tableau 4. Répartition des dalbavancine Résultats MIC (Nombre à chaque MIC) des Etats-Unis et européen 2011-2013 Surveillance d&#39;études 15. Résultats dalbavancine MIC d&#39;une étude publiée de récents isolats cliniques comme un indicateur de la dalbavancine actuel de l&#39;activité in vitro. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><colgroup></colgroup><tbody><tr><td rowspan="2"> Isoler # </td><td colspan="3"> Dalbavancine CMI (ug / ml) </td></tr><tr><td> DMSO 1 </td><td> DMSO 2 </td><td> DMSO 3 </td></tr><tr><td rowspan="3"> S. aureus ATCC 29213 </td><td> 0,12 </td><td> 0,06 </td><td> 0,06 </td></tr><tr><td> 0,12 </td><td> 0,06 </td><td> 0,06 </td></tr><tr><td> 0,06 </td><td> 0,06 </td><td> 0,06 </td></tr><tr><td rowspan="3"> E. faecalis ATCC 29212 </td><td> 0,06 </td><td> 0,06 </td><td> 0,06 </td></tr><tr><td> 0,06 </td><td> 0,06 </td><td> 0,06 </td></tr><tr><td> 0,06 </td><td> 0,06 </td><td> 0,06 </td></tr><tr><td rowspan="2"><em&gt; S. pneumoniae ATCC 49619 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> 0,03 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td colspan="4"> DMSO 1 = flamme Unopened scellé 10 ml ampoules </td></tr><tr><td colspan="2"> DMSO 2 = Foire ouvert bouteille 1L </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> DMSO 3 = Foire ouvert bouteille 1L - assis sur un banc dans le bécher à découvert pendant 72 heures </td></tr></tbody></table> Tableau 5. dalbavancine MIC Résultats (pg / ml) en utilisant DMSO Stock et Intermédiaire dilutions Préparation avec du DMSO à partir de 3 sources. Les résultats d&#39;une étude de MIC dalbavancine qui a comparé l&#39;effet de l&#39;utilisation de différents solvants de DMSO dans la préparation du dalbavancine stock et dilutions intermédiaires. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td rowspan="2"> Isoler Nombre </td><td rowspan="2"> Répliquer Nombre </td><td colspan="2"> Dalbavancine CMI (ug / ml) </td></tr><tr><td> Dalb w / P80 dans du DMSO </td><td> Dalb w / o P80 dans le DMSO </td></tr><tr><td rowspan="4"> S. aureus ATCC 29213 </td><td> 1 </td><td> 0,06 </td><td> 0,06 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 0,06 </td><td> 0,06 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 0,06 </td><td> 0,06 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 0,06 </td><td> 0,06 </td></tr><tr><td> S. aureus clinique DP80-002SA </td><td> 1 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td> S. aureus ATCC 700699 </td><td> 1 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td rowspan="4"> S. pneumoniae ATCC 49619 </td><td> 1 </td><td> 0,03 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 0,03 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 0,03 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 0,03 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td>S. pyogenes cliniques: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DP80-004PY </td><td> 1 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> DP80-005PY </td><td> 1 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td> DP80-006PY </td><td> 1 </td><td> 0,03 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> DP80-007PY </td><td> 1 </td><td> 0,06 </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td> DP80-008PY </td><td> 1 </td><td> 0,03 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> S. agalactiae clinique: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DP80-009AG </td><td> 1 </td><td> 0,06 </td><td> 0,12 </td></tr><tr><td> DP80-010AG </td><td> 1 </td><td> 0,06 </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td> DP80-011AG </td><td> 1 </td><td> 0,06 </td><td> 0,06 </td></tr><tr><td> DP80-012AG </td><td> 1 </td><td> 0,06 </td><td> 0,06 </td></tr><tr><td> S. dysgalactiae Clinical DP80-013DY </td><td> 1 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td> S. pneumoniae clinique: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DP80-014SP </td><td> 1 </td><td> 0,06 </td><td> 0,06 </td></tr><tr><td> DP80-015SP </td><td> 1 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td> DP80-016SP </td><td> 1 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td> DP80-017SP </td><td> 1 </td><td> 0,06 </td><td> 0,06 </td></tr></tbody></table> Tableau 6. Résultats dalbavancine MIC utilisant DMSO Stock et Intermédiaire dilutions Préparation avec et sans 0,002% P-80. Les résultats d&#39;une étude de MIC dalbavancine qui a comparé l&#39;effet de l&#39;ajout de 0,002% P-80 à dalbavancine stock et dilutions intermédiaires. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td rowspan="3"> Isoler </td><td rowspan="3"> Répliquer Nombre </td&gt; <td colspan="4" rowspan="2"> Stock dilution Tubes </td><td colspan="4"> Microplaque (plastique de type) </td></tr><tr><td rowspan="2"> Poly-propylène, Greiner </td><td colspan="3"> Polystyrène </td></tr><tr><td> Verre </td><td> Plastique </td><td> 1h plastique </td><td> 1h Plastique / Intermédiaire 1h </td><td> Greiner </td><td> Corning </td><td> Nunc </td></tr><tr><td rowspan="3"> S. aureus ATCC 29213 </td><td> 1 </td><td> 0,06 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0,06 </td><td> 0,03 </td><td> 0,06 </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0,06 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td rowspan="3"> E. faecalis ATCC 29212 </td><td&gt; 1 </td><td> 0,06 </td><td> 0,06 </td><td> 0,06 </td><td> 0,06 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0,06 </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 0,06 </td><td> 0,06 </td><td> 0,06 </td><td> 0,06 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0,06 </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 0,06 </td><td> 0,06 </td><td> 0,06 </td><td> 0,06 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0,06 </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td rowspan="2"> S. pneumoniae ATCC 49619 </td><td> 1 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td><td> 0,008 </td><td> 0,008 </td><td> 0,008 </td><td> 0,008 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td><td> 0,008 </td><td> 0,015 </td><td> 0,008 </td><td> 0,008 </td></tr><tr><td colspan="10"> Verre = Stock initial fait en bouteille de verre, utilisée immédiatement pour faire concentration intermédiaires dans des tubes en plastique, immédiatement utilisés pour faire des dilutions de bouillon. </td></tr><tr><td colspan="10"> Stock Plastique = initiale faite en tube de centrifugeuse en plastique, utilisé immédiatement pour faire concentrations intermédiaires dans des tubes en plastique, utilisés immédiatement pour faire des dilutions de bouillon. </td></tr><tr><td colspan="10"> 1 h plastique = Stock initial fait dans le tube de centrifugeuse en plastique, laisser reposer sur le banc pendant 1 heure puis utilisé pour fabriquer des concentrations intermédiaires dans des tubes en plastique, utilisés immédiatement pour faire concentrations dans le bouillon. </td></tr><tr><td colspan="10"> Plastique 1 h / Intermédiaire 1 hr = Stock initial fait dans le tube de centrifugeuse en plastique, laisser reposer sur le banc pendant 1 heure puis utilisé pour fabriquer des concentrations intermédiaires dans des tubes en plastique, laisser reposer sur le banc pendant 1 heure puis utilisé pour fabriquer des concentrations dans le bouillon. </td></tr></tbody></table> Tableau 7. Résultats dalbavancine MIC à l&#39;aide Stock dilutions Préparation en plastique et en verre Tubes et MIC types de plastique de la plaque. Résultats ofa dalbavancine étude MIC qui a comparé l&#39;effet de l&#39;utilisation de tubes de plastique ou de verre lors de la préparation des solutions mères et également l&#39;effet de l&#39;utilisation de différentes sources et les types de plastique pour des plaques de microtitrage.

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A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

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A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

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The rapid detection of antimicrobial resistance is important in the effort to control the increase in resistant Mycobacterium 
tuberculosis (Mtb). Antimicrobial susceptibility testing (AST) of Mtb has traditionally been performed by the agar method of proportion or by 
macrobroth testing on an instrument such as the BACTEC (Becton Dickinson, Sparks, MD), VersaTREK (TREK Diagnostics, Cleveland, OH) or BacT/ALERT (bioM&eacute;rieux, Hazelwood, MO). The agar proportion method, while considered the &#x201C;gold&#x201D; standard of AST, is labor intensive and requires calculation of resistance by performing colony counts on drug-containing agar as compared to drug-free agar. If there is &ge;1% growth on the drug-containing medium as compared to drug-free medium, the organism is considered resistant to that drug. The macrobroth methods require instrumentation and test break point ("critical") drug concentrations for the first line drugs (isoniazid, ethambutol, rifampin, and pyrazinamide). The method described here is commercially available in a 96 well microtiter plate format [MYCOTB (TREK Diagnostics)] and contains increasing concentrations of 12 antimicrobials used for treatment of tuberculosis including both first (isoniazid, rifampin, ethambutol) and second line drugs (amikacin, cycloserine, ethionamide, kanamycin, moxifloxacin, ofloxacin, para-aminosalicylic acid, rifabutin, and streptomycin). Pyrazinamide, a first line drug, is not included in the microtiter plate due to its need for acidic test conditions. Advantages of the microtiter system include both ease of set up and faster turn around time (14 days) compared with traditional agar proportion (21 days). In addition, the plate can be set up from inoculum prepared using either broth or solid medium. Since the microtiter plate format is new and since Mtb presents unique safety challenges in the laboratory, this protocol will describe how to safely setup, incubate and read the microtiter plate.

Antimicrobial susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis is challenging but critical for patient care. This microtiter plate format offers testing of 12 antimycobacterial drugs and provides minimum inhibitory concentration (MIC) values, which will aid in appropriate treatment.

Test de sensibilité aux antimicrobiens du complexe Mycobacterium tuberculosis des drogues de première et deuxième par dilution en bouillon dans un format microplaque

The rapid detection of antimicrobial resistance is important in the effort to control the increase in resistant Mycobacterium 
tuberculosis (Mtb). ...

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in the thymus proper vasculature formation and patterning is essential for thymocyte entry into the organ and mature T-cell exit to the periphery. The spatial arrangement of blood vessels in the thymus is dependent upon signals from the local microenvironment, namely thymic epithelial cells (TEC). Several recent reports suggest that disruption of these signals results in thymus blood vessel defects 1,2. Previous studies have described techniques used to label the neonatal and adult thymus vasculature 1,2. We demonstrate here a technique for labeling blood vessels in the embryonic thymus. This method combines the use of FITC-dextran or Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I (GSL 1 - isolectin B4) facial vein injections and CD31 antibody staining to identify thymus vascular structures and PDGFR-&beta; to label thymic perivascular mesenchyme 3-5. The option of using cryosections or vibratome sections is also provided. This protocol can be used to identify thymus vascular defects, which is critical for defining the roles of TEC-derived molecules in thymus blood vessel formation. As the method labels the entire vasculature, it can also be used to analyze the vascular networks in multiple organs and tissues throughout the embryo including skin and heart 6-10.

This article describes a method for labeling embryonic skin and thymus blood vessels.

Une méthode pour l&#39;étiquetage dans les vaisseaux sanguins souris embryonnaires

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional identification requires the sub-culture of signaled blood culture broth with identification available only after colonies on solid agar have matured. MALDI-TOF MS is a reliable, rapid method for identification of the majority of clinically relevant bacteria when applied to colonies on solid media. The application of MALDI-TOF MS directly to blood culture broth is an attractive approach as it has potential to accelerate species identification of bacteria and improve clinical management. However, an important problem to overcome is the pre-analysis removal of interfering resins, proteins and hemoglobin&#160;contained in blood culture specimens which, if not removed, interfere with the MS spectra and can result in insufficient or low discrimination identification scores. In addition it is necessary to concentrate bacteria to develop spectra of sufficient quality. The presented method describes the concentration, purification, and extraction of Gram negative bacteria allowing for the early identification of bacteria from a signaled blood culture broth.

The application of matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) directly to blood culture broth expedites the identification of bacteria. The presented method is a rapid and reliable method for identification of Gram negative bacteria directly from blood culture broth.

Identification rapide des bactéries à Gram négatif de sang Bouillon de culture à l&#39;aide MALDI-TOF spectrométrie de masse

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a rapid identification of the infectious agent to guide optimal antibiotic treatment. The analysis of Gram stains from positive blood culture can be rapidly conducted and already significantly impact the antibiotic regimen. However, the accurate identification of the infectious agent is still required to establish the optimal targeted treatment. We present here a simple and fast bacterial pellet preparation from a positive blood culture that can be used as a sample for several essential downstream applications such as identification by MALDI-TOF MS, antibiotic susceptibility testing (AST) by disc diffusion assay or automated AST systems and by automated PCR-based diagnostic testing. The performance of these different identification and AST systems applied directly on the blood culture bacterial pellets is very similar to the performance normally obtained from isolated colonies grown on agar plates. Compared to conventional approaches, the rapid acquisition of a bacterial pellet significantly reduces the time to report both identification and AST. Thus, following blood culture positivity, identification by MALDI-TOF can be reported within less than 1 hr whereas results of AST by automated AST systems or disc diffusion assays within 8 to 18 hr, respectively. Similarly, the results of a rapid PCR-based assay can be communicated to the clinicians less than 2 hr following the report of a bacteremia. Together, these results demonstrate that the rapid preparation of a blood culture bacterial pellet has a significant impact on the identification and AST turnaround time and thus on the successful outcome of patients suffering from bloodstream infections.

A rapid bacterial pellet preparation from a positive blood culture can be used as a sample for applications such as identification by MALDI-TOF, Gram staining, antibiotic susceptibility testing and PCR-based test. The results can be rapidly communicated to clinicians to improve the outcome of patients suffering from bloodstream infections.

Préparation d&#39;une hémoculture Pellet pour Rapid bactérienne identification et les tests de sensibilité aux antibiotiques

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

In Vitro désassemblage du virus grippal A capsides par Centrifugation Gradient

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

Mise en place d&#39;un programme d&#39;installation à haut débit pour le criblage de petites molécules qui modulent c-di-GMP Signalisation dans<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in the caseous cores of cavities and lesions is especially crucial because they harbor subpopulations of drug-tolerant bacteria also commonly referred to as persisters. Existing methods for the measurement of drug penetration in tuberculosis lesions involve costly and time-consuming in vivo pharmacokinetic studies coupled to bioanalytical or imaging techniques. The in vitro measurement of drug binding to caseum macromolecules was proposed as an alternative to such techniques since this binding hinders the passive diffusion of drug molecules through caseum. Rapid equilibrium dialysis is a fast and reliable system for performing plasma protein and tissue binding studies. In this protocol, we used a rapid equilibrium dialysis (RED) device to measure drug binding to homogenates of caseum that is excised from the lesions and cavities of tuberculosis-infected rabbits. The protocol also describes how to generate a surrogate matrix from lipid loaded THP-1 macrophages to use in place of caseum. This caseum/surrogate binding assay is an important tool in tuberculosis drug discovery and can be adapted to help study drug distribution in lesions or abscesses caused by other diseases.

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Here we describe a rapid equilibrium dialysis (RED) method to measure drug binding to caseum from pulmonary tuberculosis lesions and cavities. The protocol is also used with a foamy macrophage-derived matrix that is an effective surrogate to caseum.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensemble de liaison de caséine qui prédit la pénétration des drogues dans les lésions tuberculeuses

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

Basées sur la fluorescence neuraminidase Essai d&#39;inhibition pour évaluer la sensibilité des virus de la grippe à la neuraminidase Inhibiteur Classe de Antiviraux

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...