Name: use of enzymatic biosensors to quantify endogenous atp or h2o2 in the kidney
Uploaded: 2015-10-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney at JoVE.com

Apreciamos Sarissa Biomédica por su trabajo en el desarrollo de los sensores usados ​​en el presente manuscrito. Esta investigación fue apoyada por el Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre otorga HL108880 (A. Staruschenko), HL 116 264 (A. Cowley) y HL 122 662 (A. Staruschenko y A. Cowley), un proyecto financiado por el Colegio Médico de Comité de Asuntos de Investigación Wisconsin # 9306830 (O. Palygin) y al desarrollo de un Programa de Investigación y Educación Saludable Wisconsin # 9520217, y el joven investigador de subvención de la Fundación Nacional del Riñón (O. Palygin).

Los siguientes procedimientos con animales adheridos a la Guía del NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. La aprobación previa se obtuvo de el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC). NOTA: Revisión de las instrucciones del fabricante del sensor se debe hacer durante el diseño de experimento y antes de su uso. Siguiendo estas instrucciones producirá resultados óptimos al utilizar los sensores. 1. Calibración del sensor <ol><li> Prepare nuevas soluciones madre antes del inicio del experimento. </li><li> Crear Tampón A que contiene 10 mM de tampón NaPi, NaCl 100 mM, 1 mM de MgCl 2, y glicerol 2 mM. Ajustar el pH a 7,4 utilizando NaOH. Almacenar a 2-8 ° C. </li><li> Utilizando una concentración de solución madre de ATP (100 mM) se almacena a -20 ° C, crear una solución de calibración fresca 10 mM ATP mediante la adición de 10 l de stock a 90 l de tampón A. </li><li> Rehidratar el sensor de ATP mediante la colocación de la punta (Figura 2) en tél cámara de rehidratación que contiene tampón A por lo menos durante 10 minutos a 2-8 ° C. NOTA: Después de la rehidratación, los sensores no debe ser expuesto al aire durante más de 20 segundos o la sensibilidad del sensor puede ser reducida. Si se anticipan largas exposiciones al aire, sumergir el sensor brevemente en una solución de glicerol. Los sensores pueden ser utilizados para múltiples experimentos pero estos deben ocurrir en el mismo día como la rehidratación sensor. Los sensores pueden ser almacenados en la cámara de rehidratación con Tampón A para un máximo de 24 hr. </li><li> Encienda el potenciostato de doble canal (Figura 3) e iniciar el software del sistema de grabación. </li><li> Preparar una cámara de calibración con 3 ml de tampón A. colocar el electrodo de referencia en la cámara de calibración. Tome cada sensor de la cámara de rehidratación, a continuación, colóquelo en el manipulador y la inserta en la solución de cámara de calibración. NOTA: Utilice una silicona recubierto plato de petri estándar como una cámara de calibración. Llevar a cabo todas las calibraciones y studies en una jaula de Faraday en una mesa de aire de laboratorio de alto rendimiento para reducir el ruido de la señal durante las grabaciones amperometría (Figura 4). Las calibraciones se hacen mejor lo más cerca del inicio de la recolección de datos posible. Para aplicaciones en vivo el momento óptimo para la calibración es durante el período de recuperación después de la cirugía animal. </li><li> Ex vivo de calibración <ol><li> Realizar voltametría cíclica en la cámara de calibración en bicicleta a los sensores de -500 mV a 500 mV a una velocidad de 100 mV / s durante 10 ciclos. Esto mejora en gran medida la sensibilidad de los sensores. Consulte la Figura 5 para las huellas observadas a partir de los 10 ciclos. </li><li> Polarizar los sensores a 600 mV después del último ciclo. La corriente del sensor decaerá a una asíntota. Una lectura constante se logra después de un mínimo de 5 min. Registre la lectura de cero. </li></ol></li><li> En la calibración del sensor vivo <ol><li> No realice la voltametría cíclica en el in vivo sensors. En su lugar, polarizar el sensor en la cámara de calibración para 30 seg a 500 mV. A continuación, establezca el potenciostato a 0 mV y deje que el sensor de corriente a la altura de una asíntota. La corriente del sensor tomará por lo menos 2 minutos para asíntota. Registre la lectura de cero. </li></ol></li><li> Añadir consecutivamente cantidades fijas de solución de ATP en la cámara para producir una línea de calibración que abarca un rango de detección deseada. La solución ATP produce un pico agudo en la señal del sensor inicialmente, seguido por un decaimiento como difumina la ATP de manera uniforme en toda la cámara. Valores de la señal de registro una vez que el nivel de la señal se ha estabilizado después de cada adición de ATP. Figuras 6A y 7 muestran rastros y sugirió concentraciones de ATP, tanto ex vivo y los estudios in vivo, respectivamente. NOTA: Es importante para confirmar la selectividad de los electrodos mediante el uso de eliminadores de los analitos. El presente protocolo utilizado apirasa para poner a prueba la especificidad del sensor de ATP y catalasa para la H &lt;sub&gt; 2 O 2 de la señal (Figuras 6B). Si los medicamentos se administran, las mediciones de su reactividad con los sensores se deben determinar antes del estudio. </li><li> Añadir 3 l de apirasa de un stock de 2 mg / ml (89 UN / mg) para poner a prueba la especificidad del sensor de ATP (la corriente producida por la aplicación de ATP debe reducir hasta el nivel cero (Figura 7). </li><li> Añadir 3 l de catalasa de un stock de 2 mg / ml (100 UN / mg) para poner a prueba la especificidad del sensor nula (la corriente producida por H 2 O 2 aplicación debería reducir a la lectura de cero). </li></ol> 2. Cirugía Animal de Estudios de sensores <ol><li> Cirugía para la ex vivo <ol><li> Anestesiar el animal experimental con isoflurano (5% de inducción, de 1,5 a 2,5% de mantenimiento) / grado O médica 2 u otro método aprobado. 15 &#39;12 Los animales deben ser monitoreados continuamente para garantizar un nivel adecuado de anestesia. Sttasa de reacción y de los pies pizca respiratoria capaz se utilizan para confirmar la anestesia adecuada. Nota: La eutanasia del animal de acuerdo con los protocolos del IACUC aprobados. A la finalización de todos los procedimientos no-supervivencia eutanasia a animales profundamente anestesiados por toracotomía inducir neumotórax para asegurar la desaparición humanitario de los animales 12. </li><li> Coloque la rata en una mesa quirúrgica con control de temperatura en una posición supina. Mientras se mantiene una profundidad anestésica adecuada, hacer una incisión en la línea media de aproximadamente 5 cm en línea con el riñón izquierdo y exponer la aorta abdominal distal. </li><li> Envuelva una ligadura alrededor del celíaco y las arterias mesentérica superior y la aorta abdominal por encima de estas arterias pero no ligar. Envolver dos ligaduras alrededor de la aorta abdominal por debajo de las arterias renales. </li><li> Sujete la aorta abdominal por encima de las ligaduras. Ate la ligadura inferior. Cateterizar la aorta abdominal con tubo de polietileno (PE50). Asegure el catéter con la segunda ligadura aorta. </li><li> Retire la abrazadera y ligar las arterias mesentéricas y celíacos. Perfundir el riñón a 6 ml / min con Hanks Balanced Salt Solution a TA durante 2-3 min hasta que el riñón está completamente palideció. </li><li> Extirpar el riñón y el catéter, conectado porción de la aorta. Coloque el riñón en una placa de Petri de 3 ml lleno de solución del baño. Nota: protocolo de experimento se puede realizar a temperatura ambiente. La solución del baño contiene en mM: 145 NaCl, 4,5 KCl, 2 MgCl 2, 1 CaCl 2, 10 HEPES, pH ajustado con NaOH 7,35. </li></ol></li><li> Cirugía en in vivo <ol><li> Anestesiar la rata utilizando protocolos IACUC aprobados. Para el análisis in vivo anestesiar las ratas con ketamina (20 mg / kg IM) y inactina (50 mg / kg ip). Los animales deben ser controlados continuamente para garantizar un nivel adecuado de anestesia. Una reacción tasa y puntera pizca respiratoria estable se utiliza para confirmar la anestesia adecuada. </li><li> Después de la profundidad de anestesia adecuada es obtenered, coloque la rata en una posición supina sobre una superficie a tierra de temperatura controlada situado en la mesa de aire. La superficie debe ser precalentado y se mantiene a 36 ° C. </li><li> Mientras se mantiene la profundidad anestésica adecuada, hacer una incisión en la línea media de aproximadamente 5 cm en línea con el riñón. </li><li> Utilice una sutura para desviar y anclar el tejido cutáneo y subcutáneo de manera que todo el riñón es visible. Coloque el riñón en una taza de riñón para minimizar los artefactos de movimiento. </li><li> Utilice una infusión IV de 2% BSA: 0,9% de NaCl a 1 ml / 100 g / hr a través de la vena yugular para mantener el volumen de sangre. Canular ambos uréteres para la recolección de orina. Coloque los lazos alrededor de las arterias mesentéricas celíacas y superiores y la aorta distal para la manipulación de la presión de perfusión renal (Figuras 10A). </li><li> Si se requiere la aplicación de agentes farmacológicos durante los experimentos in vivo, la inserción de un catéter intersticial se recomienda (Figuras 10B </strong&gt;). </li></ol></li></ol> Configuración 3. Adquisición de Datos <ol><li> Abra el programa de adquisición de datos y establecer su polaridad tanto ex vivo e in vivo a anódica positiva. Ajuste el programa para guardar datos como código ASCII. </li><li> Coloque los micromanipuladores para la inserción rápida de los sensores en los riñones. NOTA: También puede utilizar una sonda ficticio unido al micromanipulador para ayudar a lograr la colocación deseada de sensores. </li><li> Adquisición de datos Ex vivo <ol><li> Perfundir el riñón con solución de baño (de 2.1.6) a través de la aorta canulado a una velocidad constante de 650 l / min. Con unas tijeras quirúrgicas, retire con cuidado la cápsula renal, la cual es necesaria para la inserción del sensor. </li><li> Asegurar el riñón con bandas de goma atadas sobre el riñón y unidos al plato recubierto de silicona con alfileres. </li><li> Coloque el electrodo de referencia cerca del riñón en la placa de Petri con su punta sumergida enla solución tampón. </li></ol></li><li> En la adquisición de datos in vivo <ol><li> Coloque el riñón en una taza de riñón. Dependiendo de la cepa y edad del animal utilizar un tamaño de copa que sostiene el riñón sin apretar. La Figura 8 muestra dos tamaños de copas de riñón. Tazas similares se utilizan para diferentes enfoques fisiológicos se centraron en el análisis de la función renal como micropunción etc 16. Nota: La posición de la copa renal es fundamental para eliminar el ruido mecánico producido por la respiración animal, pero no debe interferir con o bloquear la perfusión renal o el flujo de orina. </li><li> Permitir 45 minutos de tiempo de recuperación antes de realizar la recolección de datos. </li><li> Usando una aguja 26-30G, hacer un agujero de punción en el lugar deseado y la profundidad del sensor en el riñón. Seque el agujero superficie para eliminar la sangre exudada. Añadir solución de glicerol a la superficie del riñón. Esto evitará que la superficie de riñón se seque durante el experimento. </li&gt; <li> Retire el primer sensor de la cámara de la rehidratación y adjuntarlo a la micromanipulador. Rápidamente, dentro de los 20 segundos, inserte el electrodo en el agujero recién creado en el riñón. Repita los pasos 3,5 a 3,9 para el sensor nulo. </li><li> Insertar el electrodo de referencia en el riñón, aproximadamente 1 cm a partir de los sensores. </li></ol></li><li> Encienda la potenciostato y activar el programa de grabación en el equipo. La Figura 9 muestra la configuración final de la adquisición de datos de riñón ex vivo. La Figura 10 muestra la configuración final de la adquisición de datos de riñón in vivo con un catéter insertado. </li></ol> Análisis 4. Datos <ol><li> Importe el archivo de datos ASCII en origen o cualquier otro software similar. </li><li> Relación actual Concentración <ol><li> Utilice la función de ajuste / extrapolar lineal para construir una concentración lineal (eje x) a la corriente (eje y) la relación de la ATP o H 2 </sub&gt; O 2 puntos de calibración (Figuras 6 y 7). línea de ajuste lineal: y = mx + b </li></ol></li><li> Equiparar la corriente y la concentración </li><li> Restar las huellas medidos del sensor nula de los del sensor de ATP para obtener la corriente real producida por el ATP intracelular. </li><li> Convertir los valores de ATP en pA obtenidos por amperometría a nM usando la ecuación de calibración se detalla en 4.2.1. Determinar la concentración de la traza de datos resta del sensor de ATP mediante la importación de cada corriente ajustada en el valor de &quot;x&quot; y resolviendo para y (la concentración de analito). </li><li> Del mismo modo, el cálculo de H 2 O 2 concentración de su ecuación de calibración si es necesario. </li></ol>

<ol>
	<li>Palygin, O., Staruschenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+endogenous+substances+with+enzymatic+microelectrode+biosensors+in+the+kidney.">Detection of endogenous substances with enzymatic microelectrode biosensors in the kidney.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 305, 89-91 (2013).</li><li>Clark, L. C., Lyons, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrode+systems+for+continuous+monitoring+in+cardiovascular+surgery.">Electrode systems for continuous monitoring in cardiovascular surgery.</a> Ann N Y Acad Sci. 102, 29-45 (1962).</li><li>Haruyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-+and+nanobiotechnology+for+biosensing+cellular+responses.">Micro- and nanobiotechnology for biosensing cellular responses.</a> Adv Drug Deliv Rev. 55, 393-401 (2003).</li><li>Huckstepp, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+hemichannel-mediated+CO2-dependent+release+of+ATP+in+the+medulla+oblongata+contributes+to+central+respiratory+chemosensitivity.">Connexin hemichannel-mediated CO2-dependent release of ATP in the medulla oblongata contributes to central respiratory chemosensitivity.</a> J Physiol. 588, 3901-3920 (2010).</li><li>Lopatar, J., Dale, N., Frenguelli, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minor+contribution+of+ATP+P2+receptors+to+electrically-evoked+electrographic+seizure+activity+in+hippocampal+slices:+Evidence+from+purine+biosensors+and+P2+receptor+agonists+and+antagonists.">Minor contribution of ATP P2 receptors to electrically-evoked electrographic seizure activity in hippocampal slices: Evidence from purine biosensors and P2 receptor agonists and antagonists.</a> Neuropharmacology. 61, 25-34 (2011).</li><li>Avshalumov, M. V., Chen, B. T., Marshall, S. P., Pena, D. M., Rice, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate-dependent+inhibition+of+dopamine+release+in+striatum+is+mediated+by+a+new+diffusible+messenger,+H2O2.">Glutamate-dependent inhibition of dopamine release in striatum is mediated by a new diffusible messenger, H2O2.</a> J Neurosci. 23, 2744-2750 (2003).</li><li>Frenguelli, B. G., Wigmore, G., Llaudet, E., Dale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+mechanistic+dissociation+of+ATP+and+adenosine+release+during+ischaemia+in+the+mammalian+hippocampus.">Temporal and mechanistic dissociation of ATP and adenosine release during ischaemia in the mammalian hippocampus.</a> J. Neurochem. 101, 1400-1413 (2007).</li><li>Lalo, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocytosis+of+ATP+from+astrocytes+modulates+phasic+and+tonic+inhibition+in+the+neocortex.">Exocytosis of ATP from astrocytes modulates phasic and tonic inhibition in the neocortex.</a> PLoS Biol. 12, e1001747 (2014).</li><li>Heinrich, A., Ando, R. D., Turi, G., Rozsa, B., Sperlagh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K++depolarization+evokes+ATP,+adenosine+and+glutamate+release+from+glia+in+rat+hippocampus:+a+microelectrode+biosensor+study.">K+ depolarization evokes ATP, adenosine and glutamate release from glia in rat hippocampus: a microelectrode biosensor study.</a> Br.J Pharmacol. 167, 1003-1020 (2012).</li><li>Dale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+signaling+in+hypothalamic+tanycytes:+potential+roles+in+chemosensing.">Purinergic signaling in hypothalamic tanycytes: potential roles in chemosensing.</a> Semin Cell Dev Biol. 22, 237-244 (2011).</li><li>Gourine, A. V., Llaudet, E., Dale, N., Spyer, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release+of+ATP+in+the+ventral+medulla+during+hypoxia+in+rats:+role+in+hypoxic+ventilatory+response.">Release of ATP in the ventral medulla during hypoxia in rats: role in hypoxic ventilatory response.</a> J Neurosci. 25, 1211-1218 (2005).</li><li>Palygin, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+electrochemical+detection+of+ATP+and+H2O2+release+in+freshly+isolated+kidneys.">Real-time electrochemical detection of ATP and H2O2 release in freshly isolated kidneys.</a> Am J Physiol Renal Physiol. , (2013).</li><li>Thome-Duret, V., Gangnerau, M. N., Zhang, Y., Wilson, G. S., Reach, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+the+sensitivity+of+glucose+sensor+implanted+into+subcutaneous+tissue.">Modification of the sensitivity of glucose sensor implanted into subcutaneous tissue.</a> Diabetes Metab. 22, 174-178 (1996).</li><li>Wilson, G. S., Gifford, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensors+for+real-time+in+vivo+measurements.">Biosensors for real-time in vivo measurements.</a> Biosens. Bioelectron. 20, 2388-2403 (2005).</li><li>Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Channel+Analysis+of+TRPC+Channels+in+the+Podocytes+of+Freshly+Isolated+Glomeruli.">Single-Channel Analysis of TRPC Channels in the Podocytes of Freshly Isolated Glomeruli.</a> Methods Mol Biol. 998, 355-369 (2013).</li><li>Stockand, J. D., Vallon, V., Ortiz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+ex+vivo+analysis+of+tubule+function.">In vivo and ex vivo analysis of tubule function.</a> Compr Physiol. 2, 2495-2525 (2012).</li><li>Turner, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensors:+Fundamentals+and+applications+-+Historic+book+now+open+access.">Biosensors: Fundamentals and applications - Historic book now open access.</a> Biosens. Bioelectron. 65C, A1 (2014).</li><li>Kauffmann, J. M., Guilbault, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+electrode+biosensors:+theory+and+applications.">Enzyme electrode biosensors: theory and applications.</a> Methods Biochem Anal. 36, 63-113 (1992).</li><li>Barlett, P. N., Cooper, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+immobilization+of+enzymes+in+electropolymerized+films.">A review of the immobilization of enzymes in electropolymerized films.</a> J Electroanal Chem. 362, 1-12 (1993).</li><li>Kano, K., Morikage, K., Uno, B., Esaka, Y., Goto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+microelectrodes+for+choline+and+acetylcholine+and+their+applications.">Enzyme microelectrodes for choline and acetylcholine and their applications.</a> Anal Chim Acta. 299, 69-74 (1994).</li><li>Llaudet, E., Hatz, S., Droniou, M., Dale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrode+biosensor+for+real-time+measurement+of+ATP+in+biological+tissue.">Microelectrode biosensor for real-time measurement of ATP in biological tissue.</a> Anal Chem. 77, 3267-3273 (2005).</li><li>Llaudet, E., Botting, N. P., Crayston, J. A., Dale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-enzyme+microelectrode+sensor+for+detecting+purine+release+from+central+nervous+system.">A three-enzyme microelectrode sensor for detecting purine release from central nervous system.</a> Biosens Bioelectron. 18, 43-52 (2003).</li><li>Cosnier, S., Lepellec, A., Guidetti, B., Isabelle, R. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+biosensor+sensitivity+in+aqueous+and+organic+solvents+using+a+combination+of+poly(pyrrole-ammonium)+and+poly(pyrrole-lactobionamide)+films+as+host+matrices.">Enhancement of biosensor sensitivity in aqueous and organic solvents using a combination of poly(pyrrole-ammonium) and poly(pyrrole-lactobionamide) films as host matrices.</a> J Electroanal Chem. 449, 165-171 (1998).</li><li>Gourine, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+control+breathing+through+pH-dependent+release+of+ATP.">Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP.</a> Science. 329, 571-575 (2010).</li><li>Kluess, H. A., Stone, A. J., Evanson, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+overflow+in+skeletal+muscle+1A+arterioles.">ATP overflow in skeletal muscle 1A arterioles.</a> J. Physiol. 588, 3089-3100 (2010).</li><li>Nishiyama, A., Jackson, K. E., Majid, D. S., Rahman, M., Navar, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+interstitial+fluid+ATP+responses+to+arterial+pressure+and+tubuloglomerular+feedback+activation+during+calcium+channel+blockade.">Renal interstitial fluid ATP responses to arterial pressure and tubuloglomerular feedback activation during calcium channel blockade.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290, H772-H777 (2006).</li><li>Jin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+renal+perfusion+pressure+on+renal+medullary+hydrogen+peroxide+and+nitric+oxide+production.">Effects of renal perfusion pressure on renal medullary hydrogen peroxide and nitric oxide production.</a> Hypertension. 53, 1048-1053 (2009).</li><li>Khan, A. S., Michael, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+consequences+of+using+micro-electrodes+and+microdialysis+probes+in+the+brain.">Invasive consequences of using micro-electrodes and microdialysis probes in the brain.</a> Trends Anal. Chem. 22, 503-508 (2003).</li></ol>

Sensores para la grabación de vídeo de este manuscrito fueron proporcionados por Sarissa Biomédica Limited (Coventry, Reino Unido).

Los actuales protocolos fueron desarrollados para proporcionar una resolución temporal y espacial mejorada de ATP y H 2 O 2 de señalización para ex vivo aislados, perfundidos e in vivo riñones perfundidos sangre. Las diferencias entre los protocolos y los sensores utilizados aquí proporcionan la adquisición de datos óptima, ya sea para agentes farmacológicos o estudios fisiológicos. Los protocolos consisten en 1) la calibración del sensor, 2) procedimiento quirúrgico, 3) de config...

Biosensores microelectrodos enzimática (También denominada sensores en el presente manuscrito) han sido una herramienta valiosa para el estudio de procesos de señalización dinámica en las células y tejidos vivos. Los sensores proporcionan una mayor resolución temporal y espacial de las moléculas de señalización celular en concentraciones biológicamente relevantes. En lugar de toma de muestras y el análisis de los fluidos extracelulares tomadas a intervalos durante largos períodos de tiempo, estos sensores responden tan rápido como sus enzimas reaccionan con el analito, produciendo de ese modo mediciones en tiempo real 1,2. Detección rápida de las concentraciones intersticiales de factores autocrinos y paracrinos, como purinas o el peróxido de hidrógeno, y la dinámica de su liberación se puede utilizar para establecer un perfil de los efectos de las drogas en condiciones normales y patológicas 3. En la actualidad, la mayoría de las aplicaciones que utilizan sensores de haber estado en cortes de tejido del cerebro y cultivos celulares 4-10. Los protocolos detallados en este objetivo manuscrito aestablecer los medios para medir con precisión las concentraciones en tiempo real de analitos en los riñones enteros. Los siguientes protocolos se desarrollaron para estudiar ATP intersticial y H 2 O 2 de señalización en los riñones. En el entorno natural de los riñones, el ATP extracelular se cataboliza rápidamente por ectonucleotidasas endógenos en sus derivados (ADP, AMP y adenosina). Los sensores utilizados aquí son muy selectivos a la ATP sobre otras purinas o productos de degradación de ATP 11. Esto ofrece una gran ventaja, ya que permite la monitorización precisa de las concentraciones constantes y dinámicos de la liberación de ATP y su función de señalización. La concentración de ATP intersticial se mide usando la combinación de dos microelectrodos, un sensor de ATP y un sensor de Null. El sensor de Null en combinación con aplicaciones de catalasa es capaz de detectar intersticial H 2 O 2 concentraciones 12. Los siguientes protocolos utilizan dos diseños diferentes de sensors que tienen características óptimas para ya sea ex vivo o in vivo. aplicaciones Ambos diseños se basan en la reacción catalítica secuencial de glicerol quinasa y glicerol oxidasa-3-fosfato contenida en una capa enzimática del sensor y está impulsado por la presencia de ATP. En el conjunto de sensores utilizados en los estudios ex vivo, H 2 O 2, el producto final de reacción enzimática, se detecta por oxidación en un platino / iridio (Pt-Ir) electrodo de alambre. Sensores para estudios in vivo en cambio se basan en H 2 O 2 reducción en un electrodo de oro mediador recubierto diseñado para el tejido perfundido con sangre. Se muestra en la Figura 1 es un esquema de ambos protocolos descritos en este manuscrito. El sensor Null es idéntica a su sensor de ATP correspondiente, excepto que carece de las enzimas unidas. Por lo tanto, además de la detección de H 2 O 2 con la enzima catalasa, la mea sensor NullSures interferencias no específicas. Concentraciones de ATP se calculan restando el Null detecta interferencias no específicas y fondo H 2 O 2 de la señal del sensor de ATP. Varios sensores también están disponibles comercialmente para detectar otros analitos incluyendo adenosina, ionosine, hipoxantina, la acetilcolina, colina, glutamato, glucosa, lactato, D-serina para aplicaciones ex vivo o adenosina, ionosine, e hipoxantina para in vivo cuando se combina con el Null correspondiente sensor. La capacidad del sensor para detectar con precisión analitos depende de la pre adecuada y calibraciones posteriores 13. Esto asegura que el análisis representa la deriva en la sensibilidad del sensor que se produce durante el uso en los tejidos biológicos. El sensor tiene un depósito de glicerol que se utiliza como reactivo en las reacciones enzimáticas del sensor. Si el sensor no se utiliza en soluciones de baño que contiene glicerol, que se lave con el tiempo. Shorter rtiempos ecording son entonces necesarias para minimizar la deriva del sensor. Además del sensor de ensuciamiento por proteasas endógenas y los fragmentos de proteínas puede disminuir en gran medida la sensibilidad de los sensores 14. El presente manuscrito establece el uso de microelectrodos de biosensores enzimáticos para ex vivo e in vivo en forma de preparados de riñón. Cuantificación de analitos en tiempo real ofrece un detalle sin precedentes de la señalización celular que puede revelar nuevos conocimientos sobre los mecanismos de las enfermedades renales y agentes farmacológicos.

<table><tbody><tr><td>Sensor Kit</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SBK-ATP-05-125</td><td>The kit includes storage bottle, rehydration chamber, electrode leads, and reference electrodes.&amp;nbsp; Also included with the kit is the user&#039;s choice of sensors.</td></tr><tr><td>Sarissaprobe ATP Biosensor 125 &amp;mu;m</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SBS-ATP-05-125</td><td>store at 2-8 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C before use</td></tr><tr><td>Sarissagold ATP Biosensor 50 &amp;mu;m</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SGS-ATP-10-50</td><td>store at 2-8 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C before use</td></tr><tr><td>Sarissaprobe null sensor 125 &amp;mu;m</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SBS-NUL-20-125</td><td>store at 2-8 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C before use</td></tr><tr><td>Sarissagold null sensor 50 &amp;mu;m</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SGS-NUL-10-50</td><td>store at 2-8 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C before use</td></tr><tr><td>Sarissaprobe ATP Manual</td><td>Sarissa Biomedical</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf&quot;&gt;http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Faraday cage&amp;nbsp;</td><td>TMC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dual channel potentiostat</td><td>Digi-Ivy</td><td>DY2021</td><td>Type II Faraday cage</td></tr><tr><td>Data acquisition program</td><td>Digi-Ivy</td><td>DY2000</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion pump</td><td>Razel Scientific Instruments</td><td>Model R99E</td><td></td></tr><tr><td>Fiber optic illuminator</td><td>Schott</td><td>ACE 1</td><td></td></tr><tr><td>micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MM-3</td><td></td></tr><tr><td>micromanipulator magnetic stand</td><td>Narishige</td><td>GJ-8</td><td></td></tr><tr><td>air table</td><td>TMC</td><td>63-500</td><td></td></tr><tr><td>isoflurane ventilator</td><td>LEI Medical</td><td>M2000</td><td></td></tr><tr><td>3 ml petri dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>S3358OA</td><td></td></tr><tr><td>needle</td><td>Santa Cruz</td><td></td><td>26-30 G</td></tr><tr><td>pins</td><td></td><td></td><td>Standard dissection pins</td></tr><tr><td>catheter</td><td></td><td></td><td>Polyethylene tubing (PE50)</td></tr><tr><td>catheter tissue glue</td><td>Vetbond</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>suture</td><td>Look</td><td>SP117</td><td></td></tr><tr><td>rubber bands</td><td></td><td></td><td>any 2-4 mm wide rubber bands</td></tr><tr><td>silicone</td><td>Momentive</td><td>RTV-615 Clear 1#</td><td></td></tr><tr><td>clamp</td><td>Fine Science Tools</td><td>18052-03</td><td></td></tr><tr><td>standard dissection kit</td><td></td><td></td><td>Kit should include scalpel and dissection sissors&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Kidney Cup</td><td></td><td></td><td>Of own design</td></tr><tr><td>standard chemicals</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6559-25UMO</td><td>100 mM ATP solution</td></tr><tr><td>hydrogen peroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Apyrase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7646</td><td></td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>isoflurane</td><td>Clipper</td><td>10250</td><td></td></tr><tr><td>inactin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T133</td><td></td></tr><tr><td>ketamine</td><td>Clipper</td><td>2010012</td><td></td></tr><tr><td>Hanks Balanced Salt Solution&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14025092</td><td></td></tr></tbody></table>

use of enzymatic biosensors to quantify endogenous atp or h2o2 in the kidney

Biosensores enzimáticos de microelectrodos han sido ampliamente utilizados para medir la señalización extracelular en tiempo real. La mayor parte de su uso se ha limitado a secciones de cerebro y cultivos de células neuronales. Recientemente, esta tecnología se ha aplicado a los órganos enteros. Los avances en el diseño del sensor han hecho posible la medición de la señalización celular en vivo en los riñones perfundidos con sangre. Los actuales protocolos enumeran los pasos necesarios para medir el ATP y H 2 O 2 de señalización en el intersticio de riñón de rata. Dos diseños de sensores separados se utilizan para la ex vivo y en los protocolos in vivo. Ambos tipos de sensor se recubren con una capa biológica enzimática delgada en la parte superior de una capa de permeabilidad selectiva para dar respondieron rápido, biosensores sensibles y selectivos. La capa permselectividad protege la señal de los interferentes en el tejido biológico, y la capa enzimática utiliza la reacción catalítica secuencial de glicerol quinasa y glicerol-3-phosfosfato oxidasa en presencia de ATP para producir H 2 O 2. El conjunto de sensores utilizados para los estudios ex vivo detecta más analito mediante la oxidación de H 2 O 2 en un platino / iridio (Pt-Ir) electrodo de alambre. Los sensores para los estudios in vivo se basan en su lugar la reducción de H 2 O 2 en un electrodo de oro mediador recubierta diseñada para el tejido perfundido con sangre. Cambios concentración final son detectados por amperometría en tiempo real seguido de calibración para concentraciones conocidas de analito. Además, la especificidad de la señal amperométrica se puede confirmar mediante la adición de enzimas como la catalasa y la apirasa que descomponen H 2 O 2 y ATP correspondientemente. Estos sensores también se basan en gran medida en las calibraciones precisas antes y después de cada experimento. Los dos protocolos siguientes establecen el estudio de la detección en tiempo real de ATP y H 2O 2 en los tejidos renales, y puede ser modificado adicionalmente para extender el método descrito para su uso en otras preparaciones biológicas u órganos enteros.

El diseño del biosensor microelectrodo enzimática permite la detección en tiempo real de analitos en los riñones enteros. El diseño experimental general para ya sea ex vivo o in vivo estudios se ilustra en la Figura 1 .Los sensores utilizados y los procedimientos quirúrgicos difieren dependiendo de si el estudio es ex vivo o in vivo. Para obtener resultados reproducibles, pre precisa y calibraciones posteriores son críticos...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney at JoVE.com

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

Enzymatic microelectrode biosensors enable real-time measurements of extracellular cell signaling in biologically-relevant concentrations. The following protocols extend the applications of biosensors to the ex vivo and in vivo detection of ATP and H2O2 in the kidney.

El uso de biosensores para cuantificar enzimática endógena ATP o H<sub&gt; 2</sub&gt; O<sub&gt; 2</sub&gt; En el riñón

Enzymatic microelectrode biosensors have been widely used to measure extracellular signaling in real-time. Most of their use has been limited to brain ...

use-enzymatic-biosensors-to-quantify-endogenous-atp-or-h2o2

Research

JoVE Journal

Biology

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

11.9K vistas.  Medical College of Wisconsin. Enzymatic microelectrode biosensors enable real-time measurements of extracellular cell signaling in biologically-relevant concentrations. The following protocols extend the applications of biosensors to the ex vivo and in vivo detection of ATP and H2O2 in the kidney. 

Video: Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including destruction of the sample, introduction of potential artifacts, and a lack of specificity for the reactive species involved. Thus, there is a current need in the field of toxicology for non-destructive, sensitive, and specific methods that can be used to observe and quantify intracellular redox perturbations, more commonly referred to as oxidative stress. Here, we present a method for the use of two genetically-encoded fluorogenic sensors, roGFP2 and HyPer, to be used in live-cell imaging studies to observe xenobiotic-induced oxidative responses. roGFP2 equilibrates with the glutathione redox potential (EGSH), while HyPer directly detects hydrogen peroxide (H2O2). Both sensors can be expressed into various cell types via transfection or transduction, and can be targeted to specific cellular compartments. Most importantly, live-cell microscopy using these sensors offers high spatial and temporal resolution that is not possible using conventional methods. Changes in the fluorescence intensity monitored at 510 nm serves as the readout for both genetically-encoded fluorogenic sensors when sequentially excited by 404 nm and 488 nm light. This property makes both sensors ratiometric, eliminating common microscopy artifacts and correcting for differences in sensor expression between cells. This methodology can be applied across a variety of fluorometric platforms capable of exciting and collecting emissions at the prescribed wavelengths, making it suitable for use with confocal imaging systems, conventional wide-field microscopy, and plate readers. Both genetically-encoded fluorogenic sensors have been used in a variety of cell types and toxicological studies to monitor cellular EGSH and H2O2 generation in real-time. Outlined here is a standardized method that is widely adaptable across cell types and fluorometric platforms for the application of roGFP2 and HyPer in live-cell toxicological assessments of oxidative stress.

This manuscript describes the use of genetically-encoded fluorogenic reporters in an application of live-cell imaging for the examination of xenobiotic-induced oxidative stress. This experimental approach offers unparalleled spatiotemporal resolution, sensitivity, and specificity while avoiding many of the shortcomings of conventional methods used for the detection of toxicological oxidative stress.

Enfoques de evaluación de estrés oxidativo toxicológico mediante sensores codificados genéticamente fluorógenos la proyección de imagen

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells

Mitochondria have roles in many cellular processes, from energy metabolism and calcium homeostasis to control of cellular lifespan and programmed cell death. These processes affect and are affected by the redox status of and ATP production by mitochondria. Here, we describe the use of two ratiometric, genetically encoded biosensors that can detect mitochondrial redox state and ATP levels at subcellular resolution in living yeast cells. Mitochondrial redox state is measured using redox-sensitive Green Fluorescent Protein (roGFP) that is targeted to the mitochondrial matrix. Mito-roGFP contains cysteines at positions 147 and 204 of GFP, which undergo reversible and environment-dependent oxidation and reduction, which in turn alter the excitation spectrum of the protein. MitGO-ATeam is a F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) probe in which the &epsilon; subunit of the FoF1-ATP synthase is sandwiched between FRET donor and acceptor fluorescent proteins. Binding of ATP to the &epsilon; subunit results in conformation changes in the protein that bring the FRET donor and acceptor in close proximity and allow for fluorescence resonance energy transfer from the donor to acceptor.

We describe the use of two ratiometric, genetically encoded biosensors, which are based on GFP, to monitor mitochondrial redox state and ATP levels at subcellular resolution in living yeast cells.

Biosensores radiométricos que miden el estado redox mitocondrial y ATP en las células vivas de levadura

Mitochondria have roles in many cellular processes, from energy metabolism and calcium homeostasis to control of cellular lifespan and programmed cell ...

Bioingeniería

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would not occur spontaneously. These proteins are crucial for essentially all aspects of cellular life, including metabolism, cell division, responses to environmental changes and movement. The protocol presented here describes a nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-coupled ATPase assay that has been adapted to semi-high throughput screening of small molecule ATPase inhibitors. The assay has been applied to cardiac and skeletal muscle myosin II's, two actin-based molecular motor ATPases, as a proof of principle. The hydrolysis of ATP is coupled to the oxidation of NADH by enzymatic reactions in the assay. First, the ADP generated by the ATPase is regenerated to ATP by pyruvate kinase (PK). PK catalyzes the transition of phosphoenolpyruvate (PEP) to pyruvate in parallel. Subsequently, pyruvate is reduced to lactate by lactate dehydrogenase (LDH), which catalyzes the oxidation of NADH in parallel. Thus, the decrease in ATP concentration is directly correlated to the decrease in NADH concentration, which is followed by change to the intrinsic fluorescence of NADH. As long as PEP is available in the reaction system, the ADP concentration remains very low, avoiding inhibition of the ATPase enzyme by its own product. Moreover, the ATP concentration remains nearly constant, yielding linear time courses. The fluorescence is monitored continuously, which allows for easy estimation of the quality of data and helps to filter out potential artifacts (e.g., arising from compound precipitation or thermal changes).

A nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-coupled ATPase assay has been adapted to semihigh throughput screening of small molecule myosin inhibitors. This kinetic assay is run in a 384-well microplate format with total reaction volumes of only 20 &#181;L per well. The platform should be applicable to virtually any ADP producing enzyme.

Una adaptación de semi-alto rendimiento del ensayo ATPase acoplado a NADH para la detección de inhibidores de moléculas pequeñas

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Bioquímica

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and allostasis. Moreover, dysregulated protease activity drives pathogenesis and is a functional biomarker of diseases such as cancer; therefore, the ability to detect protease activity in vivo may provide clinically relevant information for biomedical diagnostics. The goal of this protocol is to create nanosensors that probe for protease activity in vivo by producing a quantifiable signal in urine. These protease nanosensors consist of two components: a nanoparticle and substrate. The nanoparticle functions to increase circulation half-life and substrate delivery to target disease sites. The substrate is a short peptide sequence (6-8 AA), which is designed to be specific to a target protease or group of proteases. The substrate is conjugated to the surface of the nanoparticle and is terminated by a reporter, such as a fluorescent marker, for detection. As dysregulated proteases cleave the peptide substrate, the reporter is filtered into urine for quantification as a biomarker of protease activity. Herein we describe construction of a nanosensor for matrix metalloproteinase 9 (MMP9), which is associated with tumor progression and metastasis, for detection of colorectal cancer in a mouse model.

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Proteases are tightly regulated enzymes involved in fundamental biological processes, and dysregulated protease activity drives progression of complex diseases such as cancer. This method&#39;s goal is to create nanosensors that measure protease activity in vivo by producing a cleavage signal that is detectable from host urine and discriminates disease.

Nanosensores para detectar actividad proteasa en Vivo para el diagnóstico no invasivo

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and ...

Metabolic Mapping: Quantitative Enzyme Cytochemistry and Histochemistry to Determine the Activity of Dehydrogenases in Cells and Tissues

Altered cellular metabolism is a hallmark of many diseases, including cancer, cardiovascular diseases and infection. The metabolic motor units of cells are enzymes and their activity is heavily regulated at many levels, including the transcriptional, mRNA stability, translational, post-translational and functional level. This complex regulation means that conventional quantitative or imaging assays, such as quantitative mRNA experiments, Western Blots and immunohistochemistry, yield incomplete information regarding the ultimate activity of enzymes, their function and/or their subcellular localization. Quantitative enzyme cytochemistry and histochemistry (i.e., metabolic mapping) show in-depth information on in situ enzymatic activity and its kinetics, function and subcellular localization in an almost true-to-nature situation.
We describe a protocol to detect the activity of dehydrogenases, which are enzymes that perform redox reactions to reduce cofactors such as NAD(P)+ and FAD. Cells and tissue sections are incubated in a medium that is specific for the enzymatic activity of one dehydrogenase. Subsequently, the dehydrogenase that is the subject of investigation performs its enzymatic activity in its subcellular site. In a chemical reaction with the reaction medium, this ultimately generates blue-colored formazan at the site of the dehydrogenase&#39;s activity. The formazan&#39;s absorbance is therefore a direct measure of the dehydrogenase&#39;s activity and can be quantified using monochromatic light microscopy and image analysis. The quantitative aspect of this protocol enables researchers to draw statistical conclusions from these assays.
Besides observational studies, this technique can be used for inhibition studies of specific enzymes. In this context, studies benefit from the true-to-nature advantages of metabolic mapping, giving in situ results that may be physiologically more relevant than in vitro enzyme inhibition studies. In all, metabolic mapping is an indispensable technique to study metabolism at the cellular or tissue level. The technique is easy to adopt, provides in-depth, comprehensive and integrated metabolic information and enables rapid quantitative analysis.

Here, we present a protocol that can be used to microscopically visualize and quantify activity of dehydrogenases in cells and tissues and its kinetics, function and subcellular localization.

Mapeo metabólico: Citoquímica enzimática cuantitativa y la histoquímica para determinar la actividad de Deshidrogenasas en células y tejidos

Altered cellular metabolism is a hallmark of many diseases, including cancer, cardiovascular diseases and infection. The metabolic motor units of cells ...

Inmunología e Infección

Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC regulates mitochondrial function and cellular energy status. Numerous reports demonstrated that the activation of PKC-a and PKC-&epsilon; improves mitochondrial function in the ischemic heart and mediates cardioprotection. In contrast, we have demonstrated that PKC-&alpha; and PKC-&epsilon; are involved in nephrotoxicant-induced mitochondrial dysfunction and cell death in kidney cells. Therefore, the goal of this study was to develop an in vitro model of renal cells maintaining active mitochondrial functions in which PKC isozymes could be selectively activated or inhibited to determine their role in regulation of oxidative phosphorylation and cell survival. Primary cultures of renal proximal tubular cells (RPTC) were cultured in improved conditions resulting in mitochondrial respiration and activity of mitochondrial enzymes similar to those in RPTC in vivo. Because traditional transfection techniques (Lipofectamine, electroporation) are inefficient in primary cultures and have adverse effects on mitochondrial function, PKC-&epsilon; mutant cDNAs were delivered to RPTC through adenoviral vectors. This approach results in transfection of over 90% cultured RPTC.
Here, we present methods for assessing the role of PKC-&epsilon; in: 1. regulation of mitochondrial morphology and functions associated with ATP synthesis, and 2. survival of RPTC in primary culture. PKC-&epsilon; is activated by overexpressing the constitutively active PKC-&epsilon; mutant. PKC-&epsilon; is inhibited by overexpressing the inactive mutant of PKC-&epsilon;. Mitochondrial function is assessed by examining respiration, integrity of the respiratory chain, activities of respiratory complexes and F0F1-ATPase, ATP production rate, and ATP content. Respiration is assessed in digitonin-permeabilized RPTC as state 3 (maximum respiration in the presence of excess substrates and ADP) and uncoupled respirations. Integrity of the respiratory chain is assessed by measuring activities of all four complexes of the respiratory chain in isolated mitochondria. Capacity of oxidative phosphorylation is evaluated by measuring the mitochondrial membrane potential, ATP production rate, and activity of F0F1-ATPase. Energy status of RPTC is assessed by determining the intracellular ATP content. Mitochondrial morphology in live cells is visualized using MitoTracker Red 580, a fluorescent dye that specifically accumulates in mitochondria, and live monolayers are examined under a fluorescent microscope. RPTC viability is assessed using annexin V/propidium iodide staining followed by flow cytometry to determine apoptosis and oncosis.
These methods allow for a selective activation/inhibition of individual PKC isozymes to assess their role in cellular functions in a variety of physiological and pathological conditions that can be reproduced in in vitro.

The effects of activation of protein kinase C (PKC) isozymes on mitochondrial functions associated with respiration and oxidative phosphorylation and on cell viability are described. The approach adapts adenoviral technique to selectively overexpress PKC isozymes in primary cell culture and a variety of assays to determine mitochondrial functions and energy status of the cell.

Evaluación de las funciones mitocondriales y la viabilidad celular renal de células que sobreexpresan la proteína quinasa C Isoenzimas

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC ...

Biología

Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization

Adenosine triphosphate-hydrolyzing enzymes, or ATPases, play a critical role in a diverse array of cellular functions. These dynamic proteins can generate energy for mechanical work, such as protein trafficking and degradation, solute transport, and cellular movements. The protocol described here is a basic assay for measuring the in vitro activity of purified ATPases for functional characterization. Proteins hydrolyze ATP in a reaction that results in inorganic phosphate release, and the amount of phosphate liberated is then quantitated using a colorimetric assay. This highly adaptable protocol can be adjusted to measure ATPase activity in kinetic or endpoint assays. A representative protocol is provided here based on the activity and requirements of EpsE, the AAA+ ATPase involved in Type II Secretion in the bacterium Vibrio cholerae. The amount of purified protein needed to measure activity, length of the assay and the timing and number of sampling intervals, buffer and salt composition, temperature, co-factors, stimulants (if any), etc. may vary from those described here, and thus some optimization may be necessary. This protocol provides a basic framework for characterizing ATPases and can be performed quickly and easily adjusted as necessary.

Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization

We describe a basic protocol for quantitating in vitro ATPase activity. This protocol can be optimized based on the level of activity and requirements for a given purified ATPase.

Medición<em&gt; In Vitro</em&gt; Actividad ATPasa para enzimática Caracterización

Adenosine triphosphate-hydrolyzing enzymes, or ATPases, play a critical role in a diverse array of cellular functions. These dynamic proteins can generate ...

Identification of the Source of Secreted Proteins in the Kidney by Brefeldin A Injection

Chronic kidney disease (CKD) is one of the top ten leading causes of death in the USA. Acute kidney injury (AKI), while often recoverable, predisposes patients to CKD later in life. Kidney epithelial cells have been identified as key signaling nodes in both AKI and CKD, whereby the cells can determine the course of the disease through the secretion of cytokines and other proteins. In CKD especially, several lines of evidence have demonstrated that maladaptively repaired tubular cells drive disease progression through the secretion of transforming growth factor-beta (TGF-&#946;), connective tissue growth factor (CTGF), and other profibrotic cytokines. However, identifying the source and the relative number of secreted proteins from different cell types in vivo remains challenging.
This paper describes a technique using brefeldin A (BFA) to prevent the secretion of cytokines, enabling the staining of cytokines in kidney tissue using standard immunofluorescent techniques. BFA inhibits endoplasmic reticulum (ER)-to-Golgi apparatus transport, which is necessary for the secretion of cytokines and other proteins. Injection of BFA 6 h before sacrifice leads to a build-up of TGF-&#946;, PDGF, and CTGF inside the proximal tubule cells (PTCs) in a mouse cisplatin model of AKI and TGF-&#946; in&#160;a mouse aristolochic acid (AA) model of CKD. Analysis revealed that BFA + cisplatin or BFA + AA increased TGF-&#946;-positive signal significantly compared to BFA + saline, cisplatin, or AA alone. These data suggest that BFA can be used to identify the cell type producing specific cytokines and quantify the relative amounts and/or different types of cytokines produced.

<meta charset="utf8"></head><body>Identificación de la fuente de proteínas secretadas en el riñón por la inyección de brefeldina A

Identifying the cell type responsible for secreting cytokines is necessary to understand the pathobiology of kidney disease. Here, we describe a method to quantitatively stain kidney tissue for cytokines produced by kidney epithelial or interstitial cells using brefeldin A, a secretion inhibitor, and cell-type-specific markers.

Identificación de la fuente de proteínas secretadas en el riñón por la inyección de brefeldina A

Chronic kidney disease (CKD) is one of the top ten leading causes of death in the USA. Acute kidney injury (AKI), while often recoverable, predisposes ...

Obtención de imágenes de peróxido mitocondrial en células de levadura vivas mediante mtHyper7

Imaging of mtHyPer7, a Ratiometric Biosensor for Mitochondrial Peroxide, in Living Yeast Cells

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, cancer, and normal aging. Here, an approach is described to assess mitochondrial function in living yeast cells at cellular and subcellular resolutions using a genetically encoded, minimally invasive, ratiometric biosensor. The biosensor, mitochondria-targeted HyPer7 (mtHyPer7), detects hydrogen peroxide (H2O2) in mitochondria. It consists of a mitochondrial signal sequence fused to a circularly permuted fluorescent protein and the H2O2-responsive domain of a bacterial OxyR protein. The biosensor is generated and integrated into the yeast genome using a CRISPR-Cas9 marker-free system, for&#160;more consistent expression compared to plasmid-borne constructs.
mtHyPer7 is quantitatively targeted to mitochondria, has no detectable effect on yeast growth rate or mitochondrial morphology, and provides a quantitative readout for mitochondrial H2O2 under normal growth conditions and upon exposure to oxidative stress. This protocol explains how to optimize imaging conditions using a spinning-disk confocal microscope system and perform quantitative analysis using freely available software. These tools make it possible to collect rich spatiotemporal information on mitochondria both within cells and among cells in a population. Moreover, the workflow described here can be used to validate other biosensors.

Autor destacado: Avance de la investigación mitocondrial - Biosensor mtHyper7 para análisis subcelular 

Hydrogen peroxide (H2O2) is both a source of oxidative damage and a signaling molecule. This protocol describes how to measure mitochondrial H2O2 using mitochondria-targeted HyPer7 (mtHyPer7), a genetically encoded ratiometric biosensor, in living yeast. It details how to optimize imaging conditions and perform quantitative cellular and subcellular analysis using freely available software.

Obtención de imágenes de mtHyPer7, un biosensor radiométrico para el peróxido mitocondrial, en células vivas de levadura

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, ...

El uso de biosensores para cuantificar enzimática endógena ATP o H

Resumen

Explorar más videos

Capítulos en este video

Enfoques de evaluación de estrés oxidativo toxicológico mediante sensores codificados genéticamente fluorógenos la proyección de imagen

Biosensores radiométricos que miden el estado redox mitocondrial y ATP en las células vivas de levadura

Una adaptación de semi-alto rendimiento del ensayo ATPase acoplado a NADH para la detección de inhibidores de moléculas pequeñas

Nanosensores para detectar actividad proteasa en Vivo para el diagnóstico no invasivo

Mapeo metabólico: Citoquímica enzimática cuantitativa y la histoquímica para determinar la actividad de Deshidrogenasas en células y tejidos

Evaluación de las funciones mitocondriales y la viabilidad celular renal de células que sobreexpresan la proteína quinasa C Isoenzimas

Medición

Identificación de la fuente de proteínas secretadas en el riñón por la inyección de brefeldina A

Identificación de la fuente de proteínas secretadas en el riñón por la inyección de brefeldina A

Obtención de imágenes de mtHyPer7, un biosensor radiométrico para el peróxido mitocondrial, en células vivas de levadura