Name: use of enzymatic biosensors to quantify endogenous atp or h2o2 in the kidney
Uploaded: 2015-10-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney at JoVE.com

私たちは、現在の原稿に使用されるセンサーの開発に自分の仕事のために必ずSarissaバイオメディカルを感謝しています。この研究は、国立心肺血液研究所HL 116264（A.カウリー）およびHL 122662（A. StaruschenkoとA.カウリー）、医科大学によって資金を供給プロジェクト、HL108880（A. Staruschenko）を付与することによってサポートされていましたウィスコンシン調査委員会の＃9306830（O. Palygin）と健康ウィスコンシン研究教育プログラム＃9520217を推進、国立腎臓財団の若手研究グラント（O. Palygin）。

実験動物の管理と使用に関するNI​​Hガイドに付着した以下の動物手順。事前承認は、施設内動物管理使用委員会（IACUC）から入手しました。 注：センサーメーカーの説明書のレビューは、実験の設計時およびそれらの使用前に行われるべきです。センサーを使用している場合、これらの命令に従うことで、最適な結果が得られます。 1.センサーのキャリブレーション<ol><li>実験の開始前に、新鮮なストック溶液を準備します。 </li><li> 10mMのNaPi緩衝液、100mMのNaCl、1mMのMgCl 2、2mMのグリセロールを含む緩衝液Aを作成します。 NaOHを用いてpHを7.4に調整します。 2〜8℃で保存してください。 </li><li> -20℃で保存株式ATP濃度（100 mm）を使用して、緩衝液Aの90μlに10μlの株式を追加することにより、新鮮な10 mMのATP校正ソリューションを作成</li><li>トンにその先端（ 図2）を配置することにより、ATPセンサーを再水和2〜8℃で少なくとも10分間、緩衝液Aを含む彼水分補給室。 注：再水和の後、センサは、以上20秒間空気に曝されるべきではないか、センサ感度が低下することがあります。空気に長時間露光が予想される場合は、グリセロールの溶液に簡単にセンサーを浸し。センサは、複数の実験のために使用することができるが、これらは、センサ水分補給と同じ日に行われなければなりません。センサは、最大24時間、緩衝液Aでの再水和チャンバ内に格納することができます。 </li><li>デュアルチャネルポテンショスタット（ 図3）をオンにし、記録システムソフトウェアを起動します。 </li><li>校正室に緩衝液Aプレイス3mlの基準電極との校正室を準備します。その後、マニピュレータに取り付け、キャリブレーションチャンバ溶液に挿入し、再水和室から各センサーを取ります。 注：校正​​室のような標準的なシリコンコーティングされたシャーレを使用します。すべてのキャリブレーションを実施し、ST電流測定の記録（ 図4）の間に信号ノイズを低減するために、高性能ラボ空気テーブルにファラデーケージ内udies。キャリブレーションは、最高の可能な限りのデータ収集の開始に近くで行われています。 インビボ用途のためのキャリブレーションのための最適な時間は、動物の手術後の回復期間の間にあります。 </li><li> ex vivoでのキャリブレーション<ol><li> 10サイクルのための100 mVの/秒の速度で500 mVのに-500 mVのからセンサーを循環させることにより、校正室でのサイクリックボルタンメトリーを実行します。これは非常に、センサの感度を向上させます。 10サイクルから見たトレースについては、図5を参照してください 。 </li><li>最後のサイクルの後に600 mVのにセンサーを分極。センサ電流は、漸近線に減衰します。安定した読み取りが5分の最小後に達成されます。ゼロ読書を記録します。 </li></ol></li><li> インビボセンサ較正で <ol><li> in vivoでの戦争にサイクリックボルタンメトリーを実行しないでくださいRS。代わりに、500 mVで30秒間の較正室にセンサを偏光。その後、0 mVのにポテンショスタットを設定し、センサ電流が漸近線に上昇することができます。センサ電流は漸近線に少なくとも2分かかります。ゼロ読書を記録します。 </li></ol></li><li>連続して所望の検出範囲を網羅する検量線を生成するためにチャンバー内にATP溶液のセット量を追加します。 ATP溶液は、ATPがチャンバ全体に均等に拡散するにつれて減衰が続く、最初にセンサ信号に鋭いピークを生成します。記録信号の値は、信号レベル一旦各ATPを添加した後、図6A及び図7のトレースを安定化し、それぞれ、 インビボ研究の両方エキソビボおよび内 ATP濃度を示唆しています。 注：これは、分析物の捕捉剤を使用することにより、電極の選択性を確認することが重要です。現在のプロトコルは&lt;HのためのATPセンサーとカタラーゼの特異性をテストするためにアピラーゼを使用しましたサブ&gt; 2 O 2信号（ 図6B）。薬物を投与する場合は、センサーとの反応性の測定は、試験の前に決定されるべきです。 </li><li> ATPセンサー（ゼロレベル（ 図7）に削減する必要があり、ATPのアプリケーションによって生成される電流の特異性をテストするために2 mg / mlの（89 UN / mg）をストックからアピラーゼの3μLを追加します。 </li><li>ヌルセンサー（H 2 O 2のアプリケーションによって生成される電流がゼロの読み取りに減らす必要があります）の特異性をテストするために2mg / mlの（100 UN / mg）をストックからカタラーゼの3μLを追加します。 </li></ol>センサーの研究2.動物の手術<ol><li> ex vivoでの手術<ol><li>イソフルラン（5％誘導、1.5〜2.5％のメンテナンス）/医療グレードのO 2または他の承認された方法で実験動物を麻酔。15 &#39;12動物は、継続的に、麻酔の適切なレベルを確保するために監視されなければなりません。セントできる呼吸数及びつま先ピンチ反応は、適切な麻酔を確認するために使用されます。 注：承認済みIACUCプロトコルに従って動物を安楽死させます。すべての非生存手続きの完了時に動物12の人道的な終焉を確実にするために開胸誘導気胸により深く麻酔をかけた動物を安楽死させます。 </li><li>仰臥位で温度制御手術台の上にラットを置きます。適切な麻酔深度を維持しながら、左腎臓に沿って約5cmの正中切開を行い、遠位腹部大動脈を露出させます。 </li><li>腹腔と上腸間膜動脈、およびこれらの動脈上の腹部大動脈の周りの合字をラップするが連結しないでください。腎動脈下の腹部大動脈約2合字を包みます。 </li><li>合字以上の腹部大動脈をクランプします。下の合字を接続します。ポリエチレン管（PE50）と腹部大動脈をカテーテルを挿入。二大動脈結紮でカテーテルを固定します。 </li><li>クランプを外し、腸間膜や腹腔動脈を結紮。腎臓が完全にブランチングされるまで2〜3分間室温でハンクス平衡塩溶液で6 ml /分で腎臓を灌流。 </li><li>大動脈の一部を接続腎臓およびカテーテルを、切り出します。浴溶液を充填した3ミリリットルのペトリ皿に腎臓を置きます。 注：実験プロトコルは、室温で行うことができます。 145のNaCl、4.5のKCl、2のMgCl 2、1のCaCl 2、10 HEPES、NaOHでpH調整7.35：浴溶液はmm含まれています。 </li></ol></li><li> in vivoでの手術<ol><li>承認されたIACUCプロトコルを用いてラットを麻酔。 in vivoでの分析のためにケタミン（20 mgの/ kgのIM）とinactin（50ミリグラム/ kg、腹腔内）でラットを麻酔。動物は、継続的に、麻酔の適切なレベルを確保するために監視されなければなりません。安定した呼吸数及びつま先ピンチ反応は、適切な麻酔を確認するために使用されます。 </li><li>適切な麻酔深度が得られた後edは、エアテーブルの上に配置された温度制御された接地面上に仰臥位にラットを配置します。表面は、予熱し36℃に維持されるべきです。 </li><li>適切な麻酔深度を維持しながら、正中切開腎臓に沿って約5cmを作ります。 </li><li>腎臓全体が表示されるように、皮膚や皮下組織を偏向し、固定するために縫合糸を使用してください。あらゆる動きアーチファクトを最小限にするために腎臓カップに腎臓を置きます。 </li><li>血液量を維持するために、頚静脈を介して1ミリリットル/ 100グラム/時で0.9％のNaCl：2％BSAのIV注入を使用します。尿採取のための両方の尿管にカニューレを挿入。上腸間膜や腹腔動脈と腎灌流圧（ 図10A）を操作するための遠位大動脈の周りに置きネクタイ。 </li><li>薬剤の適用は、in vivo実験中に必要とされる場合、間質カテーテルの挿入は、（ 図10Bに推奨されます</strong&gt;）。 </li></ol></li></ol> 3.データ集録のセットアップ<ol><li>データ収集プログラムを開き、両方のex vivoおよび陽極ポジティブにin vivo実験のためにその極性を設定します。 ASCIIコードなどのデータを保存するためのプログラムを設定します。 </li><li>腎臓へのセンサーの迅速な挿入のためのマイクロマニピュレーターを置きます。 注：別の方法として、センサーの所望の配置を達成するためにマイクロマニピュレータに取り付けられたダミープローブを使用しています。 </li><li> エクスビボデータ収集<ol><li> 650μL/ minの一定速度でカニューレを挿入し、大動脈を介して（2.1.6）から浴溶液で腎臓を灌流。手術用ハサミを使用して、慎重にセンサ挿入するために必要な腎臓カプセルを、削除してください。 </li><li>ゴムバンド腎臓の上に縛り付けとピンとシリコーンコートディッシュに付着して腎臓を固定します。 </li><li>に沈め、その先端とペトリ皿の中で腎臓に近い基準電極を配置緩衝溶液。 </li></ol></li><li> インビボでのデータ取得で <ol><li>腎臓カップに腎臓を置きます。動物の歪みや年齢に応じて緩やかに腎臓を保持しているカップのサイズを使用します。8に示す腎臓カップの2つのサイズを図 。同様のカップは、微小穿刺等16と腎臓機能の分析に焦点を当てた異なる生理学的なアプローチのために使用されます。 注意：腎臓カップの位置は、動物の呼吸によって生成された機械的ノイズを除去することが重要ですが、妨害または腎臓灌流または尿の流れを遮断しないようにしてください。 </li><li>データ収集を行う前に、回復時間の45分を許可します。 </li><li> 26-30G針を使用して、腎臓におけるセンサーの所望の位置と深さでパンク穴を作ります。滲出血液を除去するために表面の穴を吸い取ります。腎臓の表面にグリセロール溶液を加えます。これは、実験中に乾燥から腎臓表面を防ぐことができます。 </li&gt; <li>再水和室から第一のセンサを取り外し、マイクロマニピュレータに取り付けます。すぐに、20秒以内に、腎臓における新規に作成した穴に電極を挿入します。繰り返しヌルセンサーの3.5から3.9を繰り返します。 </li><li>センサからから約1cm、腎臓に参照電極を挿入します。 </li></ol></li><li>ポテンショスタットをオンにして、コンピューター上の記録プログラムを活性化させる。 図9は、ex vivoで腎臓データ収集の最終セットアップを示します。 図10は、挿入されたカテーテルを用いたインビボ腎臓データ収集の最終セットアップを示します。 </li></ol> 4.データ解析<ol><li>起源または他の同様のソフトウェアへのASCIIデータファイルをインポートします。 </li><li>集中現在の関係<ol><li>現在まで直線濃度（x軸 ）を構築するために、ATPまたはH 2（Y -軸）の関係を線形フィット/外挿機能を使用</suB&gt; O 2の較正点（ 図6および図7）。 線形適合ライン：Y = MX + B </li></ol></li><li>濃度への電流を同一視</li><li>細胞内ATPによって生成される実際の電流を得るためにATPセンサのものからヌルセンサの測定されたトレースを引きます。 </li><li> 4.2.1で詳述した較正式を用いてnmの電流測定により得られたpAの中のATP値に変換します。 「X」の値にそれぞれ調整電流をインポートするとy（分析物の濃度）を解くことにより、ATPセンサの減算データトレースの濃度を決定します。 </li><li>必要に応じて同様に、その検量線からH 2 O 2濃度を算出。 </li></ol>

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この原稿のビデオ録画のためのセンサは、必ずSarissaバイオメディカル・リミテッド（コベントリー、UK）により提供されました。

現在のプロトコルは、ATPの強化時間・空間分解能を提供するために開発したex vivoでの灌流、単離され、in vivoでの血液灌流腎臓用のH 2 O 2シグナリングが。プロトコルと、ここで使用されるセンサとの違いは、薬理学的薬剤または生理学的研究のいずれかに最適なデータ収集を提供します。プロトコルは、1）センサ較正、2）外科的処置、3）データ収集の設定、及...

（も、本原稿内のセンサとして参照）酵素微小電極のバイオセンサーは、生細胞や組織におけるダイナミックなシグナル伝達プロセスを研究するための貴重なツールとなっています。センサーは、生物学的に関連する濃度で、細胞シグナル伝達分子の時間的および空間分解能が向上してい。サンプリングと長期間にわたって間隔で採取した細胞外体液を分析する代わりに、これらのセンサは、高速、その酵素は、それによってリアルタイム測定1,2を製造 、分析物に反応するように反応します。高速プリンまたは過酸化水素のようなオートクリンおよびパラクリン因子の間質濃度の検出、及びそれらの放出の動力学は、正常および病的状態3における薬剤の効果のプロファイルを確立するために使用することができます。現在、センサを使用するアプリケーションの大部分は、脳組織切片および細胞培養物4-10にされています。この原稿を目的に詳細なプロトコル正確全体腎臓中の分析物のリアルタイムの濃度を測定する手段を確立します。 以下のプロトコルは、腎臓で間質ATP及びH 2 O 2シグナル伝達を研究するために開発されました。腎臓のネイティブ環境では、細胞外ATPは急速にその誘導体（ADP、AMPおよびアデノシン）に内因性ectonucleotidasesによって異化されます。ここで使用されるセンサは、他のプリンまたはATPの分解生成物11の上に、ATPに高度に選択的です。それはATP放出とそのシグナル伝達機能の定数と動的濃度の正確なモニタリングを可能にするので、これは大きな利点を提供しています。間質ATP濃度は、二つの微小電極、ATPセンサ及びヌルセンサーの組み合わせを使用して測定されます。カタラーゼのアプリケーションとの組み合わせでヌルのセンサは、間質H 2 O 2濃度12を検出することができます 。次のプロトコルは、戦争の二つの異なるデザインを使用しますエキソビボまたはインビボのいずれかのアプリケーションでのための最適な特性を持つRS。 両方の設計は、センサ酵素層中に含まれるグリセロールキナーゼとグリセロール-3-リン酸オキシダーゼの逐次触媒反応に基づいており、ATPの存在によって駆動されます。 ex vivoでの研究で使用されるセンサのセットでは、H 2 O 2、最終酵素反応生成物は、白金/イリジウム白金（Pt-IR）は、ワイヤ電極上の酸化によって検出されます。 in vivoでの研究のためのセンサーではなく、血液灌流組織のために設計されたメディエータコーティングされた金電極上に2 O 2還元 Hに基づいています。 図1に示す本原稿に記載され両方のプロトコルのスキームです。それが結合酵素を欠いている以外ヌルセンサーは、対応するATPセンサーと同じです。したがって、カタラーゼ酵素とH 2 O 2の検出に加えて、ヌルセンサMEAsures非特異的な干渉を。 ATP濃度は、ATPセンサ信号からの非特異的な干渉および背景H 2 O 2を検出したヌルを減算することによって計算されます。対応するヌルと対になったときに、いくつかのセンサは、アデノシン、ionosine、ヒポキサンチン、アセチルコリン、コリン、グルタミン酸、グルコース、乳酸、ex vivoでのアプリケーションまたはアデノシン、ionosine、およびin vivoのためのヒポキサンチンのためのD-セリンを含む他の検体を検出するために、市販されていますセンサー。 正確に検体を検出するためのセンサの能力は、適切な前後のキャリブレーション13に依存します。これは、分析は、生物学的組織での使用時に発生するセンサ感度のドリフトを占めていることを保証します。センサは、センサの酵素反応における試薬として使用されるグリセロールのデポを保持しています。センサはグリセロールを含む浴溶液中で使用されていない場合、それは時間をかけて洗います。短いRecording回次に、センサドリフトを最小化するために必要です。さらに、内因性プロテアーゼとタンパク質断片によって汚れセンサーが大きく、センサ14の感度を減少させることができます。 現在の原稿は 、ex vivo およびインビボ腎臓製剤中の酵素微小電極のバイオセンサーの使用を確立します。リアルタイムの分析物の定量化は、腎疾患や薬剤のメカニズムに新たな洞察を明らかにすることができる細胞内シグナル伝達の前例のない詳細を提供します。

<table><tbody><tr><td>Sensor Kit</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SBK-ATP-05-125</td><td>The kit includes storage bottle, rehydration chamber, electrode leads, and reference electrodes.&amp;nbsp; Also included with the kit is the user&#039;s choice of sensors.</td></tr><tr><td>Sarissaprobe ATP Biosensor 125 &amp;mu;m</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SBS-ATP-05-125</td><td>store at 2-8 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C before use</td></tr><tr><td>Sarissagold ATP Biosensor 50 &amp;mu;m</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SGS-ATP-10-50</td><td>store at 2-8 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C before use</td></tr><tr><td>Sarissaprobe null sensor 125 &amp;mu;m</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SBS-NUL-20-125</td><td>store at 2-8 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C before use</td></tr><tr><td>Sarissagold null sensor 50 &amp;mu;m</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SGS-NUL-10-50</td><td>store at 2-8 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C before use</td></tr><tr><td>Sarissaprobe ATP Manual</td><td>Sarissa Biomedical</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf&quot;&gt;http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Faraday cage&amp;nbsp;</td><td>TMC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dual channel potentiostat</td><td>Digi-Ivy</td><td>DY2021</td><td>Type II Faraday cage</td></tr><tr><td>Data acquisition program</td><td>Digi-Ivy</td><td>DY2000</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion pump</td><td>Razel Scientific Instruments</td><td>Model R99E</td><td></td></tr><tr><td>Fiber optic illuminator</td><td>Schott</td><td>ACE 1</td><td></td></tr><tr><td>micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MM-3</td><td></td></tr><tr><td>micromanipulator magnetic stand</td><td>Narishige</td><td>GJ-8</td><td></td></tr><tr><td>air table</td><td>TMC</td><td>63-500</td><td></td></tr><tr><td>isoflurane ventilator</td><td>LEI Medical</td><td>M2000</td><td></td></tr><tr><td>3 ml petri dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>S3358OA</td><td></td></tr><tr><td>needle</td><td>Santa Cruz</td><td></td><td>26-30 G</td></tr><tr><td>pins</td><td></td><td></td><td>Standard dissection pins</td></tr><tr><td>catheter</td><td></td><td></td><td>Polyethylene tubing (PE50)</td></tr><tr><td>catheter tissue glue</td><td>Vetbond</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>suture</td><td>Look</td><td>SP117</td><td></td></tr><tr><td>rubber bands</td><td></td><td></td><td>any 2-4 mm wide rubber bands</td></tr><tr><td>silicone</td><td>Momentive</td><td>RTV-615 Clear 1#</td><td></td></tr><tr><td>clamp</td><td>Fine Science Tools</td><td>18052-03</td><td></td></tr><tr><td>standard dissection kit</td><td></td><td></td><td>Kit should include scalpel and dissection sissors&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Kidney Cup</td><td></td><td></td><td>Of own design</td></tr><tr><td>standard chemicals</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6559-25UMO</td><td>100 mM ATP solution</td></tr><tr><td>hydrogen peroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Apyrase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7646</td><td></td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>isoflurane</td><td>Clipper</td><td>10250</td><td></td></tr><tr><td>inactin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T133</td><td></td></tr><tr><td>ketamine</td><td>Clipper</td><td>2010012</td><td></td></tr><tr><td>Hanks Balanced Salt Solution&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14025092</td><td></td></tr></tbody></table>

use of enzymatic biosensors to quantify endogenous atp or h2o2 in the kidney

酵素微小バイオセンサーは広くリアルタイムで細胞外シグナルを測定するために使用されてきました。それらの用途のほとんどは、脳切片および神経細胞培養物に限られていました。最近、この技術は、全体の臓器に適用されています。センサ設計の進歩は、血液灌流生体腎臓内での細胞のシグナル伝達の測定を可能にしました。現在のプロトコルは、ラット腎臓の間質におけるATP と H 2 O 2のシグナル伝達を測定するために必要な手順を示します。二つの別々のセンサ設計は、 エキソビボおよびインビボのプロトコールにおいて使用されます 。センサーの両方のタイプは、高速応答、高感度かつ選択的なバイオセンサーを与えるために選択透過性層の上に薄い酵素生物層で被覆されています。選択透過性膜は、生体組織内の干渉から信号を保護し、酵素層は、グリセロールキナーゼとグリセロール-3- PHOSの連続触媒反応を利用しATPの存在下で酸塩オキシダーゼはH 2 O 2を生成します。 ex vivoでの研究のために使用されるセンサのセットは、さらに、白金/イリジウム白金（Pt-IR）は、ワイヤ電極の上にH 2 O 2の酸化による分析物を検出しました。 in vivoでの研究のためのセンサーではなく、血液灌流組織のために設計されたメディエータコーティングされた金電極上のH 2 O 2の還元に基づいています。最終濃度の変化は、分析物の既知濃度のキャリブレーションに続いて、リアルタイムの電流測定により検出されます。また、電流測定信号の特異性は、それに対応し、H 2 O 2及びATPを分解し、そのようなカタラーゼやアピラーゼなどの酵素を添加することによって確認することができます。これらのセンサは、各実験の前と後の正確なキャリブレーションに大きく依存しています。次の2つのプロトコルは、ATPとH 2のリアルタイム検出の研究を確立します腎組織中のO 2は 、さらに他の生物学的製剤または全臓器での使用のために記載した方法を拡張するために改変することができます。

酵素微小電極のバイオセンサーの設計は、いずれかのエキソビボまたはインビボ研究の一般的実験計画を図1【選択を使用するセンサや外科的処置に示されている。全体の腎臓中の分析物のリアルタイム検出を可能にするかどうか調査によって異なりますエクスビボまたはインビボです 。 再現性のある結果、正確な前?...

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Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

Enzymatic microelectrode biosensors enable real-time measurements of extracellular cell signaling in biologically-relevant concentrations. The following protocols extend the applications of biosensors to the ex vivo and in vivo detection of ATP and H2O2 in the kidney.

酵素バイオセンサの使用は、内因性ATPまたはHを定量します<sub&gt; 2</sub&gt; O<sub&gt; 2</sub&gt;腎臓で

Enzymatic microelectrode biosensors have been widely used to measure extracellular signaling in real-time. Most of their use has been limited to brain ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

11.9K ビュー.  Medical College of Wisconsin. Enzymatic microelectrode biosensors enable real-time measurements of extracellular cell signaling in biologically-relevant concentrations. The following protocols extend the applications of biosensors to the ex vivo and in vivo detection of ATP and H2O2 in the kidney. 

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Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including destruction of the sample, introduction of potential artifacts, and a lack of specificity for the reactive species involved. Thus, there is a current need in the field of toxicology for non-destructive, sensitive, and specific methods that can be used to observe and quantify intracellular redox perturbations, more commonly referred to as oxidative stress. Here, we present a method for the use of two genetically-encoded fluorogenic sensors, roGFP2 and HyPer, to be used in live-cell imaging studies to observe xenobiotic-induced oxidative responses. roGFP2 equilibrates with the glutathione redox potential (EGSH), while HyPer directly detects hydrogen peroxide (H2O2). Both sensors can be expressed into various cell types via transfection or transduction, and can be targeted to specific cellular compartments. Most importantly, live-cell microscopy using these sensors offers high spatial and temporal resolution that is not possible using conventional methods. Changes in the fluorescence intensity monitored at 510 nm serves as the readout for both genetically-encoded fluorogenic sensors when sequentially excited by 404 nm and 488 nm light. This property makes both sensors ratiometric, eliminating common microscopy artifacts and correcting for differences in sensor expression between cells. This methodology can be applied across a variety of fluorometric platforms capable of exciting and collecting emissions at the prescribed wavelengths, making it suitable for use with confocal imaging systems, conventional wide-field microscopy, and plate readers. Both genetically-encoded fluorogenic sensors have been used in a variety of cell types and toxicological studies to monitor cellular EGSH and H2O2 generation in real-time. Outlined here is a standardized method that is widely adaptable across cell types and fluorometric platforms for the application of roGFP2 and HyPer in live-cell toxicological assessments of oxidative stress.

This manuscript describes the use of genetically-encoded fluorogenic reporters in an application of live-cell imaging for the examination of xenobiotic-induced oxidative stress. This experimental approach offers unparalleled spatiotemporal resolution, sensitivity, and specificity while avoiding many of the shortcomings of conventional methods used for the detection of toxicological oxidative stress.

遺伝子にコードされた蛍光センサーを用いた毒性酸化ストレスの評価へのアプローチをイメージング

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including ...

がん研究

Simultaneous Measurement of Superoxide/Hydrogen Peroxide and NADH Production by Flavin-containing Mitochondrial Dehydrogenases

It has been reported that mitochondria can contain up to 12 enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS). A majority of these sites include flavin-dependent respiratory complexes and dehydrogenases that produce a mixture of superoxide (O2&#9679;-) and hydrogen peroxide (H2O2). Accurate quantification of the ROS-producing potential of individual sites in isolated mitochondria can be challenging due to the presence of antioxidant defense systems&#160;and side reactions that also form O2&#9679;-/H2O2. Use&#160;of nonspecific inhibitors that can disrupt mitochondrial bioenergetics can also compromise measurements by altering&#160;ROS release from other sites of production. Here, we present an easy method for the simultaneous measurement of H2O2 release and nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) production by purified flavin-linked dehydrogenases. For our purposes here, we have used purified pyruvate dehydrogenase complex (PDHC) and &#945;-ketoglutarate dehydrogenase complex (KGDHC) of porcine heart origin as examples. This method allows for an accurate measure of native H2O2 release rates by individual sites of production by eliminating other potential sources of ROS and antioxidant systems. In addition, this method allows for a direct comparison of the relationship between H2O2 release and enzyme activity and the screening of the effectiveness and selectivity of inhibitors for ROS production. Overall, this approach can allow for the in-depth assessment of native rates of ROS release for individual enzymes prior to conducting more sophisticated experiments with isolated mitochondria or permeabilized muscle fiber.

Mitochondria contain several flavin-dependent enzymes that can produce reactive oxygen species (ROS). Monitoring ROS release from individual sites in mitochondria is challenging due to unwanted side reactions. We present an easy, inexpensive method for direct assessment of native rates for ROS release using purified flavoenzymes and microplate fluorometry.

活性酸素・過酸化水素とフラビン含有ミトコンドリア脱水素酵素による NADH 生産の同時測定

It has been reported that mitochondria can contain up to 12 enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS). A majority of these sites include ...

生化学

Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells

Mitochondria have roles in many cellular processes, from energy metabolism and calcium homeostasis to control of cellular lifespan and programmed cell death. These processes affect and are affected by the redox status of and ATP production by mitochondria. Here, we describe the use of two ratiometric, genetically encoded biosensors that can detect mitochondrial redox state and ATP levels at subcellular resolution in living yeast cells. Mitochondrial redox state is measured using redox-sensitive Green Fluorescent Protein (roGFP) that is targeted to the mitochondrial matrix. Mito-roGFP contains cysteines at positions 147 and 204 of GFP, which undergo reversible and environment-dependent oxidation and reduction, which in turn alter the excitation spectrum of the protein. MitGO-ATeam is a F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) probe in which the &epsilon; subunit of the FoF1-ATP synthase is sandwiched between FRET donor and acceptor fluorescent proteins. Binding of ATP to the &epsilon; subunit results in conformation changes in the protein that bring the FRET donor and acceptor in close proximity and allow for fluorescence resonance energy transfer from the donor to acceptor.

We describe the use of two ratiometric, genetically encoded biosensors, which are based on GFP, to monitor mitochondrial redox state and ATP levels at subcellular resolution in living yeast cells.

リビング酵母細胞におけるミトコンドリア酸化還元状態とATPを測定レシオメトリックバイオセンサー

Mitochondria have roles in many cellular processes, from energy metabolism and calcium homeostasis to control of cellular lifespan and programmed cell ...

生物工学

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would not occur spontaneously. These proteins are crucial for essentially all aspects of cellular life, including metabolism, cell division, responses to environmental changes and movement. The protocol presented here describes a nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-coupled ATPase assay that has been adapted to semi-high throughput screening of small molecule ATPase inhibitors. The assay has been applied to cardiac and skeletal muscle myosin II's, two actin-based molecular motor ATPases, as a proof of principle. The hydrolysis of ATP is coupled to the oxidation of NADH by enzymatic reactions in the assay. First, the ADP generated by the ATPase is regenerated to ATP by pyruvate kinase (PK). PK catalyzes the transition of phosphoenolpyruvate (PEP) to pyruvate in parallel. Subsequently, pyruvate is reduced to lactate by lactate dehydrogenase (LDH), which catalyzes the oxidation of NADH in parallel. Thus, the decrease in ATP concentration is directly correlated to the decrease in NADH concentration, which is followed by change to the intrinsic fluorescence of NADH. As long as PEP is available in the reaction system, the ADP concentration remains very low, avoiding inhibition of the ATPase enzyme by its own product. Moreover, the ATP concentration remains nearly constant, yielding linear time courses. The fluorescence is monitored continuously, which allows for easy estimation of the quality of data and helps to filter out potential artifacts (e.g., arising from compound precipitation or thermal changes).

A nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-coupled ATPase assay has been adapted to semihigh throughput screening of small molecule myosin inhibitors. This kinetic assay is run in a 384-well microplate format with total reaction volumes of only 20 &#181;L per well. The platform should be applicable to virtually any ADP producing enzyme.

低分子阻害剤スクリーニングのためのNADH結合ATPaseアッセイの半高スループット適応

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and allostasis. Moreover, dysregulated protease activity drives pathogenesis and is a functional biomarker of diseases such as cancer; therefore, the ability to detect protease activity in vivo may provide clinically relevant information for biomedical diagnostics. The goal of this protocol is to create nanosensors that probe for protease activity in vivo by producing a quantifiable signal in urine. These protease nanosensors consist of two components: a nanoparticle and substrate. The nanoparticle functions to increase circulation half-life and substrate delivery to target disease sites. The substrate is a short peptide sequence (6-8 AA), which is designed to be specific to a target protease or group of proteases. The substrate is conjugated to the surface of the nanoparticle and is terminated by a reporter, such as a fluorescent marker, for detection. As dysregulated proteases cleave the peptide substrate, the reporter is filtered into urine for quantification as a biomarker of protease activity. Herein we describe construction of a nanosensor for matrix metalloproteinase 9 (MMP9), which is associated with tumor progression and metastasis, for detection of colorectal cancer in a mouse model.

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Proteases are tightly regulated enzymes involved in fundamental biological processes, and dysregulated protease activity drives progression of complex diseases such as cancer. This method&#39;s goal is to create nanosensors that measure protease activity in vivo by producing a cleavage signal that is detectable from host urine and discriminates disease.

非侵襲的診断のプロテアーゼ活動In Vivo検出するナノセンサー

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and ...

Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC regulates mitochondrial function and cellular energy status. Numerous reports demonstrated that the activation of PKC-a and PKC-&epsilon; improves mitochondrial function in the ischemic heart and mediates cardioprotection. In contrast, we have demonstrated that PKC-&alpha; and PKC-&epsilon; are involved in nephrotoxicant-induced mitochondrial dysfunction and cell death in kidney cells. Therefore, the goal of this study was to develop an in vitro model of renal cells maintaining active mitochondrial functions in which PKC isozymes could be selectively activated or inhibited to determine their role in regulation of oxidative phosphorylation and cell survival. Primary cultures of renal proximal tubular cells (RPTC) were cultured in improved conditions resulting in mitochondrial respiration and activity of mitochondrial enzymes similar to those in RPTC in vivo. Because traditional transfection techniques (Lipofectamine, electroporation) are inefficient in primary cultures and have adverse effects on mitochondrial function, PKC-&epsilon; mutant cDNAs were delivered to RPTC through adenoviral vectors. This approach results in transfection of over 90% cultured RPTC.
Here, we present methods for assessing the role of PKC-&epsilon; in: 1. regulation of mitochondrial morphology and functions associated with ATP synthesis, and 2. survival of RPTC in primary culture. PKC-&epsilon; is activated by overexpressing the constitutively active PKC-&epsilon; mutant. PKC-&epsilon; is inhibited by overexpressing the inactive mutant of PKC-&epsilon;. Mitochondrial function is assessed by examining respiration, integrity of the respiratory chain, activities of respiratory complexes and F0F1-ATPase, ATP production rate, and ATP content. Respiration is assessed in digitonin-permeabilized RPTC as state 3 (maximum respiration in the presence of excess substrates and ADP) and uncoupled respirations. Integrity of the respiratory chain is assessed by measuring activities of all four complexes of the respiratory chain in isolated mitochondria. Capacity of oxidative phosphorylation is evaluated by measuring the mitochondrial membrane potential, ATP production rate, and activity of F0F1-ATPase. Energy status of RPTC is assessed by determining the intracellular ATP content. Mitochondrial morphology in live cells is visualized using MitoTracker Red 580, a fluorescent dye that specifically accumulates in mitochondria, and live monolayers are examined under a fluorescent microscope. RPTC viability is assessed using annexin V/propidium iodide staining followed by flow cytometry to determine apoptosis and oncosis.
These methods allow for a selective activation/inhibition of individual PKC isozymes to assess their role in cellular functions in a variety of physiological and pathological conditions that can be reproduced in in vitro.

The effects of activation of protein kinase C (PKC) isozymes on mitochondrial functions associated with respiration and oxidative phosphorylation and on cell viability are described. The approach adapts adenoviral technique to selectively overexpress PKC isozymes in primary cell culture and a variety of assays to determine mitochondrial functions and energy status of the cell.

腎細胞内のミトコンドリアの機能と細胞生存率の評価を過剰発現するプロテインキナーゼCアイソザイム

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC ...

生物学

A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive expression of families of related receptors, a broad range of related ligands and the difficulty of dealing with primary cultures of specialized endothelial cells. Here we describe a bioassay for the detection of ligands to the vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR-2), a key transducer of signals that promote angiogenesis and lymphangiogenesis. A cDNA encoding a fusion of the extracellular (ligand-binding) region of VEGFR-2 with the transmembrane and cytoplasmic regions of the erythropoietin receptor (EpoR) is expressed in the factor-dependent cell line Ba/F3. This cell line grows in the presence of interleukin-3 (IL-3) and withdrawal of this factor results in death of the cells within 24 hr. Expression of the VEGFR-2/EpoR receptor fusion provides an alternative mechanism to promote survival and potentially proliferation of stably transfected Ba/F3 cells in the presence of a ligand capable of binding and cross-linking the extracellular portion of the fusion protein (i.e., one that can cross-link the VEGFR-2 extracellular region). The assay can be performed in two ways: a semi-quantitative approach in which small volumes of ligand and cells permit a rapid result in 24 hr, and a quantitative approach involving surrogate markers of a viable cell number. The assay is relatively easy to perform, is highly responsive to known VEGFR-2 ligands and can accommodate extracellular inhibitors of VEGFR-2 signaling such as monoclonal antibodies to the receptor or ligands, and soluble ligand traps.

We describe a simple cell-based bioassay for detecting, quantifying and monitoring the activity of members of the vascular endothelial growth factor family of ligands. The assay uses chimeric receptors expressed in a factor-dependent cell line to provide a semi-quantitative or quantitative assessment of receptor binding and cross-linking by the ligand.

血管内皮増殖因子の評価のための簡易バイオアッセイ

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive ...

Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization

Adenosine triphosphate-hydrolyzing enzymes, or ATPases, play a critical role in a diverse array of cellular functions. These dynamic proteins can generate energy for mechanical work, such as protein trafficking and degradation, solute transport, and cellular movements. The protocol described here is a basic assay for measuring the in vitro activity of purified ATPases for functional characterization. Proteins hydrolyze ATP in a reaction that results in inorganic phosphate release, and the amount of phosphate liberated is then quantitated using a colorimetric assay. This highly adaptable protocol can be adjusted to measure ATPase activity in kinetic or endpoint assays. A representative protocol is provided here based on the activity and requirements of EpsE, the AAA+ ATPase involved in Type II Secretion in the bacterium Vibrio cholerae. The amount of purified protein needed to measure activity, length of the assay and the timing and number of sampling intervals, buffer and salt composition, temperature, co-factors, stimulants (if any), etc. may vary from those described here, and thus some optimization may be necessary. This protocol provides a basic framework for characterizing ATPases and can be performed quickly and easily adjusted as necessary.

Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization

We describe a basic protocol for quantitating in vitro ATPase activity. This protocol can be optimized based on the level of activity and requirements for a given purified ATPase.

計測<em&gt;インビトロ</em酵素特性評価のための&gt; ATPase活性

Adenosine triphosphate-hydrolyzing enzymes, or ATPases, play a critical role in a diverse array of cellular functions. These dynamic proteins can generate ...

Identification of the Source of Secreted Proteins in the Kidney by Brefeldin A Injection

Chronic kidney disease (CKD) is one of the top ten leading causes of death in the USA. Acute kidney injury (AKI), while often recoverable, predisposes patients to CKD later in life. Kidney epithelial cells have been identified as key signaling nodes in both AKI and CKD, whereby the cells can determine the course of the disease through the secretion of cytokines and other proteins. In CKD especially, several lines of evidence have demonstrated that maladaptively repaired tubular cells drive disease progression through the secretion of transforming growth factor-beta (TGF-&#946;), connective tissue growth factor (CTGF), and other profibrotic cytokines. However, identifying the source and the relative number of secreted proteins from different cell types in vivo remains challenging.
This paper describes a technique using brefeldin A (BFA) to prevent the secretion of cytokines, enabling the staining of cytokines in kidney tissue using standard immunofluorescent techniques. BFA inhibits endoplasmic reticulum (ER)-to-Golgi apparatus transport, which is necessary for the secretion of cytokines and other proteins. Injection of BFA 6 h before sacrifice leads to a build-up of TGF-&#946;, PDGF, and CTGF inside the proximal tubule cells (PTCs) in a mouse cisplatin model of AKI and TGF-&#946; in&#160;a mouse aristolochic acid (AA) model of CKD. Analysis revealed that BFA + cisplatin or BFA + AA increased TGF-&#946;-positive signal significantly compared to BFA + saline, cisplatin, or AA alone. These data suggest that BFA can be used to identify the cell type producing specific cytokines and quantify the relative amounts and/or different types of cytokines produced.

Identifying the cell type responsible for secreting cytokines is necessary to understand the pathobiology of kidney disease. Here, we describe a method to quantitatively stain kidney tissue for cytokines produced by kidney epithelial or interstitial cells using brefeldin A, a secretion inhibitor, and cell-type-specific markers.

Chronic kidney disease (CKD) is one of the top ten leading causes of death in the USA. Acute kidney injury (AKI), while often recoverable, predisposes ...

mtHyper7を用いた生酵母細胞における過酸化ミトコンドリアのイメージング

Imaging of mtHyPer7, a Ratiometric Biosensor for Mitochondrial Peroxide, in Living Yeast Cells

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, cancer, and normal aging. Here, an approach is described to assess mitochondrial function in living yeast cells at cellular and subcellular resolutions using a genetically encoded, minimally invasive, ratiometric biosensor. The biosensor, mitochondria-targeted HyPer7 (mtHyPer7), detects hydrogen peroxide (H2O2) in mitochondria. It consists of a mitochondrial signal sequence fused to a circularly permuted fluorescent protein and the H2O2-responsive domain of a bacterial OxyR protein. The biosensor is generated and integrated into the yeast genome using a CRISPR-Cas9 marker-free system, for&#160;more consistent expression compared to plasmid-borne constructs.
mtHyPer7 is quantitatively targeted to mitochondria, has no detectable effect on yeast growth rate or mitochondrial morphology, and provides a quantitative readout for mitochondrial H2O2 under normal growth conditions and upon exposure to oxidative stress. This protocol explains how to optimize imaging conditions using a spinning-disk confocal microscope system and perform quantitative analysis using freely available software. These tools make it possible to collect rich spatiotemporal information on mitochondria both within cells and among cells in a population. Moreover, the workflow described here can be used to validate other biosensors.

著者スポットライト:ミトコンドリア研究の進歩 - 細胞内解析のためのmtHyper7バイオセンサー 

Hydrogen peroxide (H2O2) is both a source of oxidative damage and a signaling molecule. This protocol describes how to measure mitochondrial H2O2 using mitochondria-targeted HyPer7 (mtHyPer7), a genetically encoded ratiometric biosensor, in living yeast. It details how to optimize imaging conditions and perform quantitative cellular and subcellular analysis using freely available software.

生きた酵母細胞におけるミトコンドリア過酸化物のレシオメトリックバイオセンサーmtHyPer7のイメージング

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, ...

酵素バイオセンサの使用は、内因性ATPまたはHを定量します

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