אנו מעריכים את סריסה ביו-רפואיים לעבודתם בפיתוח החיישנים המשמשים בכתב היד הנוכחית. מחקר זה נתמך על ידי הלאומי ללב, ריאות ודם מכון מעניק HL108880 (א Staruschenko), HL 116,264 (א קאולי) וHL 122,662 (א Staruschenko וא קאולי), פרויקט ממומן על ידי בית הספר לרפואה של הוועדה לענייני המחקר ויסקונסין # 9306830 (א &#39;Palygin) וקידום # בריא ויסקונסין תכנית המחקר וחינוך 9,520,217, והחוקר הצעיר גרנט של הקרן הלאומית לכליות (א&#39; Palygin).

נהלי החיה הבאים דבקו במדריך NIH לטיפול ושימוש בחי מעבדה. אישור מראש התקבל מהוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC). הערה: סקירה של הוראות יצרן החיישן צריכה להיעשות בשלבי תכנון הניסוי ולפני השימוש בם. ההנחיות באות יפיק תוצאות אופטימליות בעת שימוש בחיישנים. 1. חיישן כיול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרונות מניות טריים לפני תחילת הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור מאגר המכיל 10 מ&quot;מ חיץ NaPi, 100 מ&quot;מ NaCl, 1 מ&quot;מ MgCl 2, ו -2 גליצרול מ&quot;מ. התאם את ה- pH 7.4 באמצעות NaOH. אחסן ב 2-8 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בריכוז ATP המניות (100 מ&quot;מ) מאוחסן ב -20 ° C, ליצור פתרון כיול טרי 10 מ&quot;מ ATP על ידי הוספת מניית 10 μl 90 μl של א &#39;המאגר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רעננות חיישן ה- ATP על ידי הצבת קצהו (איור 2) לtהוא תא להחזרת נוזלים המכיל מאגר לפחות 10 דקות ב 2-8 מעלות צלזיוס. הערה: לאחר התייבשות, לא צריכה להיות חשוף לאוויר החיישנים ליותר מ -20 שניות או רגישות החיישן עשויה להיות מופחתת. אם חשיפות ארוכות לאוויר צפויים, לטבול את החיישן בקצרה לפתרון של גליצרול. החיישנים יכולים לשמש לניסויים מרובים אך אלה חייבים להתרחש באותו היום כמו התייבשות חיישן. ניתן לאחסן את החיישנים בתא להחזרת נוזלים עם הצפת עד 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את potentiostat הערוץ הכפול (איור 3) ולהפעיל את תוכנת מערכת הקלטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תא כיול עם 3 מיליליטר של חיץ א מקום האלקטרודה ההתייחסות לתא הכיול. קח כל חיישן מהתא להחזרת נוזלים, אז לצרף אותו למניפולטור ולהכניס אותו לתוך תא פתרון כיול. הערה: השתמש בצלחת פטרי סיליקון המצופה סטנדרטית כתא כיול. לבצע את כל הכיולים ורחudies בכלוב פאראדיי על שולחן אוויר מעבדה ביצועים גבוהים כדי להפחית את רעש האות במהלך הקלטות amperometry (איור 4). כיולים נעשים הטובים ביותר קרובים לתחילת איסוף הנתונים ככל האפשר. עבור יישומים בvivo הזמן האופטימלי לכיול הוא בתקופת ההתאוששות שלאחר ניתוח בבעלי החיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Vivo לשעבר כיול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע voltammetry המחזורית בתא הכיול ידי רכיבה על אופני החיישנים מ-500 mV ל+500 mV בשיעור של 100 mV / sec במשך 10 מחזורים. זה משפר באופן משמעותי את הרגישות של החיישנים. ראה איור 5 לעקבות שנצפו מ10 המחזורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקטב החיישנים לmV 600 אחרי המחזור האחרון. החיישן הנוכחי ידעכו לאסימפטוטה. קריאה יציבה מושגת לאחר מינימום של 5 דקות. רשום את הקריאה אפס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכיול חיישן vivo <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל תבצעו את voltammetry המחזורית בin vivo הצרRS. במקום זאת, לקטב את החיישן בתא הכיול במשך 30 שניות ל+500 mV. לאחר מכן קבע את potentiostat ל0 mV ולאפשר הנוכחי החיישן לעלות לאסימפטוטה. החיישן הנוכחי ייקח לפחות 2 דקות לאסימפטוטה. רשום את הקריאה אפס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברציפות להוסיף כמויות סט של פתרון ה- ATP לתא לייצר קו כיול מקיף טווח גילוי רצוי. פתרון ה- ATP מייצר שיא חד באות החיישן בתחילה, ואחריו ריקבון כATP מפזר באופן אחיד בכל התא. ערכי אות שיא פעם אחת את רמת האות התייצב לאחר כל הוספת ATP. 6A דמויות ועקבות 7 תכנית והציעו ריכוזי ה- ATP לשני vivo לשעבר ובמחקרי vivo, בהתאמה. הערה: חשוב כדי לאשר את הסלקטיביות של אלקטרודות באמצעות אוכלי נבלות של analytes. הפרוטוקול הנוכחי משמש apyrase כדי לבדוק את הספציפיות של חיישן ה- ATP וcatalase לH &lt;תת&gt; 2 O 2 אות (6B דמויות). אם תרופות הן להינתן, מדידות של תגובתיות שלהם עם החיישנים צריכים להיקבע לפני המחקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 μl של apyrase ממלאי של 2 מ&quot;ג / מיליליטר (89 האו&quot;ם / מ&quot;ג) כדי לבדוק ספציפי של חיישן ה- ATP (הנוכחי מיוצר על ידי יישום ה- ATP צריך להפחית לרמת אפס (איור 7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 μl של catalase ממלאי של 2mg / מיליליטר (100 האו&quot;ם / מ&quot;ג) כדי לבדוק את הספציפיות של חיישן null (הנוכחיות מיוצר על ידי H 2 O 2 יישום צריך להפחית לקריאת אפס). </li></ol> 2. ניתוח בעלי חיים לחיישן לימודים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח לvivo לשעבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את החיה הניסיונית עם isoflurane (אינדוקציה 5%, 1.5 עד 2.5% אחזקה) / O כיתה רפואי 2 או שיטה שאושרה עוד. 15 &#39;12 בעלי חיים חייבים להיות במעקב רציף על מנת להבטיח רמה נאותה של הרדמה. רחובתגובת קמצוץ שיעור ובוהן נשימה מסוגלת משמשות כדי לאשר הרדמה מתאימה. הערה: להרדים בעלי החיים על פי פרוטוקולים שאושרו IACUC. בסיום כל ההליכים שאינם ההישרדות להרדים בעלי חיים עמוקים מורדמים על ידי פתיחת בית החזה וגורם pneumothorax כדי להבטיח את מותו האנושי של בעלי החיים 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החולדה על שולחן ניתוחים בטמפרטורה מבוקרת במצב שכיבה. תוך שמירה על עומק הרדמה מתאים, לעשות חתך קו האמצע של כ 5 סנטימטרים בקו אחד עם הכליה השמאלית ולחשוף את אב העורקים בבטן דיסטלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעטוף מייתר סביב צליאק ועורקי mesenteric מעולים, ואב העורקים בבטן מעל העורקים האלה, אבל לא לקשור. לעטוף שני חיבורי אותיות סביב אב העורקים בבטן מתחת לעורקי הכליה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד את אב העורקים בבטן מעל חיבורי האותיות. לקשור את המייתר נמוך יותר. קטטר אב העורקים בבטן עם צינורות פוליאתילן (PE50). Secure את הקטטר עם מייתר אב העורקים השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המהדק ולקשור את עורקי mesenteric וצליאק. Perfuse הכליות בשעת 6 מיליליטר / דקה עם הנקס מאוזן תמיסת מלח על RT במשך 2-3 דקות, עד שהכליה החווירה לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלו הכליות וקטטר, מחוברים חלק של אב העורקים. מניחים את הכליות ל3 מיליליטר צלחת פטרי מלא פתרון אמבטיה. הערה: פרוטוקול ניסוי יכול להתבצע על RT. פתרון האמבטיה מכיל במ&quot;מ: 145 NaCl, 4.5 KCl, 2 MgCl 2, 1 CaCl 2, 10 HEPES, pH 7.35 מותאמים עם NaOH. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח לin vivo <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכברוש תוך שימוש בפרוטוקולי IACUC אושר. לניתוח בvivo להרדים חולדות עם קטמין (20 מ&quot;ג / קילוגרם IM) וinactin (50 מ&quot;ג / IP קילוגרם). בעלי חיים חייבים להיות במעקב רציף על מנת להבטיח רמה נאותה של הרדמה. תגובת קמצוץ שיעור ובוהן נשימה יציבה משמשות כדי לאשר הרדמה מתאימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר עומק הרדמה נכון הוא לקבלאד, מניח את החולדה במצב שכיבה על משטח מוארק טמפרטורה מבוקרת ממוקם על שולחן האוויר. המשטח צריך להיות שחומם מראש ונשמר על 36 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוך שמירה על עומק הרדמה מתאים, לעשות חתך קו האמצע כ 5 סנטימטרים בקו אחד עם הכליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתפר להסיט ולעגן את רקמת עור ותת עורי, כך שכל הכליה היא גלויה. מניחים את הכליות בכוס כליות כדי למזער את חפצי תנועה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בעירוי של BSA 2%: 0.9% NaCl ב 1 מיליליטר / 100 שעות / g דרך וריד הצוואר לשמור נפח דם. Cannulate שני השופכנים לאיסוף שתן. קשרי מקום סביב עורקי mesenteric וצליאק מעולים וaortal דיסטלי למניפולציה של לחץ פרפוזיה (10A דמויות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם היישום של סוכנים תרופתיים נדרש במהלך ניסויי in vivo, החדרת קטטר ביניים מומלצת (10 ב איורים </strong&gt;). </li></ol></li></ol> התקנת 3. רכישת נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תכנית רכישת נתונים ולהגדיר הקוטביות שלה לשני vivo לשעבר ובניסויי vivo לאנודית חיובית. הגדר את התכנית כדי לשמור את הנתונים כקוד ASCII. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את micromanipulators להחדרה מהירה של החיישנים לכליות. הערה: לחלופין, להשתמש בבדיקת דמה שצורפה לmicromanipulator כדי לעזור להשיג את המיקום הרצוי של חיישנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Vivo לשעבר רכישת נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse הכליות עם פתרון אמבטיה (מ2.1.6) דרך אב העורקים cannulated בקצב קבוע של 650 μl / דקה. בעזרת מספריים כירורגיות, להסיר בזהירות את הקפסולה הכליות, אשר הכרחית להחדרת חיישן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אבטח את הכליות עם גומיות קשורות על הכליות ומחוברות לצלחת מצופה סיליקון עם סיכות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את האלקטרודה ההתייחסות קרובה לכליה בצלחת פטרי עם הקצה שלה שקוע בפתרון החיץ. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברכישת נתונים vivo <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הכליות בכוס כליות. בהתאם לזן וגיל של החיה להשתמש בגודל של כוס שמחזיקה את הכליות באופן רופף. איור 8 מראה שני גדלים של כוסות כליות. כוסות דומות משמשות לגישות פיסיולוגיות שונות המתמקדות בניתוח של תפקוד כליות כגון micropuncture וכו &#39;16. הערה: המיקום של כוס הכליות הוא קריטי כדי להסיר את הרעש המכני המיוצר על ידי הנשימה של בעלי החיים, אבל לא צריך להפריע או לחסום זלוף כליות או זרימת שתן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר 45 דקות של זמן התאוששות לפני ביצוע איסוף נתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מחט 26-30G, לעשות חור לנקב במיקום והעומק הרצויים של החיישן בכליות. למחוק את חור פני השטח כדי להסיר דם הקרין. להוסיף פתרון גליצרול אל פני השטח של הכליה. זה ימנע את פני השטח בכליות מהתייבשות במהלך הניסוי. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את החיישן הראשון מהתא להחזרת נוזלים ולצרף אותו לmicromanipulator. במהירות, תוך 20 שניות, להכניס את האלקטרודה לתוך החור הטרי שנוצר בכליות. חזור על שלבים 3.5-3.9 לחיישן null. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את האלקטרודה ההתייחסות לכליות, כ 1 סנטימטר מהחיישנים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את potentiostat ולהפעיל את תכנית ההקלטה במחשב. איור 9 מציג את ההגדרה הסופית של vivo לשעבר רכישת נתונים הכליות. איור 10 מראה את ההתקנה הסופית של in vivo רכישת נתונים כליות עם קטטר שהוכנס. </li></ol> ניתוח נתונים 4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבא את קובץ נתוני ASCII למקור או כל תוכנה דומה אחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביחס נוכחית ריכוז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בפונקציה מתאימה / לחיץ ליניארי לבנות ריכוז ליניארי (ציר ה- X) למערכת יחסים הנוכחית (y -axis) ל- ATP או H 2 </sub&gt; נקודות O 2 כיול (איורים 6 ו -7). קו ליניארי בכושר: = MX + b y </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשוות הנוכחי לריכוז </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפחית את העקבות המדודות של חיישן null מאלה של חיישן ה- ATP להשיג הנוכחי בפועל מיוצר על ידי ATP תאיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמיר את ערכי ה- ATP ברשות הפלסטינית מתקבלים על ידי amperometry לננומטר באמצעות משוואת הכיול מפורטת ב4.2.1. קבע את הריכוז של עקבות נתונים מופחתים של חיישן ה- ATP על ידי יבוא כל נוכחית מותאמת לערך &quot;x&quot; ופתרון לy (ריכוז אנליטי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן דומה, לחשב H 2 O 2 ריכוז מהמשוואה כיולה במידת צורך. </li></ol>

<ol>
	<li>Palygin, O., Staruschenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+endogenous+substances+with+enzymatic+microelectrode+biosensors+in+the+kidney.">Detection of endogenous substances with enzymatic microelectrode biosensors in the kidney.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 305, 89-91 (2013).</li><li>Clark, L. C., Lyons, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrode+systems+for+continuous+monitoring+in+cardiovascular+surgery.">Electrode systems for continuous monitoring in cardiovascular surgery.</a> Ann N Y Acad Sci. 102, 29-45 (1962).</li><li>Haruyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-+and+nanobiotechnology+for+biosensing+cellular+responses.">Micro- and nanobiotechnology for biosensing cellular responses.</a> Adv Drug Deliv Rev. 55, 393-401 (2003).</li><li>Huckstepp, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+hemichannel-mediated+CO2-dependent+release+of+ATP+in+the+medulla+oblongata+contributes+to+central+respiratory+chemosensitivity.">Connexin hemichannel-mediated CO2-dependent release of ATP in the medulla oblongata contributes to central respiratory chemosensitivity.</a> J Physiol. 588, 3901-3920 (2010).</li><li>Lopatar, J., Dale, N., Frenguelli, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minor+contribution+of+ATP+P2+receptors+to+electrically-evoked+electrographic+seizure+activity+in+hippocampal+slices:+Evidence+from+purine+biosensors+and+P2+receptor+agonists+and+antagonists.">Minor contribution of ATP P2 receptors to electrically-evoked electrographic seizure activity in hippocampal slices: Evidence from purine biosensors and P2 receptor agonists and antagonists.</a> Neuropharmacology. 61, 25-34 (2011).</li><li>Avshalumov, M. V., Chen, B. T., Marshall, S. P., Pena, D. M., Rice, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate-dependent+inhibition+of+dopamine+release+in+striatum+is+mediated+by+a+new+diffusible+messenger,+H2O2.">Glutamate-dependent inhibition of dopamine release in striatum is mediated by a new diffusible messenger, H2O2.</a> J Neurosci. 23, 2744-2750 (2003).</li><li>Frenguelli, B. G., Wigmore, G., Llaudet, E., Dale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+mechanistic+dissociation+of+ATP+and+adenosine+release+during+ischaemia+in+the+mammalian+hippocampus.">Temporal and mechanistic dissociation of ATP and adenosine release during ischaemia in the mammalian hippocampus.</a> J. Neurochem. 101, 1400-1413 (2007).</li><li>Lalo, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocytosis+of+ATP+from+astrocytes+modulates+phasic+and+tonic+inhibition+in+the+neocortex.">Exocytosis of ATP from astrocytes modulates phasic and tonic inhibition in the neocortex.</a> PLoS Biol. 12, e1001747 (2014).</li><li>Heinrich, A., Ando, R. D., Turi, G., Rozsa, B., Sperlagh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K++depolarization+evokes+ATP,+adenosine+and+glutamate+release+from+glia+in+rat+hippocampus:+a+microelectrode+biosensor+study.">K+ depolarization evokes ATP, adenosine and glutamate release from glia in rat hippocampus: a microelectrode biosensor study.</a> Br.J Pharmacol. 167, 1003-1020 (2012).</li><li>Dale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+signaling+in+hypothalamic+tanycytes:+potential+roles+in+chemosensing.">Purinergic signaling in hypothalamic tanycytes: potential roles in chemosensing.</a> Semin Cell Dev Biol. 22, 237-244 (2011).</li><li>Gourine, A. V., Llaudet, E., Dale, N., Spyer, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release+of+ATP+in+the+ventral+medulla+during+hypoxia+in+rats:+role+in+hypoxic+ventilatory+response.">Release of ATP in the ventral medulla during hypoxia in rats: role in hypoxic ventilatory response.</a> J Neurosci. 25, 1211-1218 (2005).</li><li>Palygin, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+electrochemical+detection+of+ATP+and+H2O2+release+in+freshly+isolated+kidneys.">Real-time electrochemical detection of ATP and H2O2 release in freshly isolated kidneys.</a> Am J Physiol Renal Physiol. , (2013).</li><li>Thome-Duret, V., Gangnerau, M. N., Zhang, Y., Wilson, G. S., Reach, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+the+sensitivity+of+glucose+sensor+implanted+into+subcutaneous+tissue.">Modification of the sensitivity of glucose sensor implanted into subcutaneous tissue.</a> Diabetes Metab. 22, 174-178 (1996).</li><li>Wilson, G. S., Gifford, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensors+for+real-time+in+vivo+measurements.">Biosensors for real-time in vivo measurements.</a> Biosens. Bioelectron. 20, 2388-2403 (2005).</li><li>Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Channel+Analysis+of+TRPC+Channels+in+the+Podocytes+of+Freshly+Isolated+Glomeruli.">Single-Channel Analysis of TRPC Channels in the Podocytes of Freshly Isolated Glomeruli.</a> Methods Mol Biol. 998, 355-369 (2013).</li><li>Stockand, J. D., Vallon, V., Ortiz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+ex+vivo+analysis+of+tubule+function.">In vivo and ex vivo analysis of tubule function.</a> Compr Physiol. 2, 2495-2525 (2012).</li><li>Turner, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensors:+Fundamentals+and+applications+-+Historic+book+now+open+access.">Biosensors: Fundamentals and applications - Historic book now open access.</a> Biosens. Bioelectron. 65C, A1 (2014).</li><li>Kauffmann, J. M., Guilbault, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+electrode+biosensors:+theory+and+applications.">Enzyme electrode biosensors: theory and applications.</a> Methods Biochem Anal. 36, 63-113 (1992).</li><li>Barlett, P. N., Cooper, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+immobilization+of+enzymes+in+electropolymerized+films.">A review of the immobilization of enzymes in electropolymerized films.</a> J Electroanal Chem. 362, 1-12 (1993).</li><li>Kano, K., Morikage, K., Uno, B., Esaka, Y., Goto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+microelectrodes+for+choline+and+acetylcholine+and+their+applications.">Enzyme microelectrodes for choline and acetylcholine and their applications.</a> Anal Chim Acta. 299, 69-74 (1994).</li><li>Llaudet, E., Hatz, S., Droniou, M., Dale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrode+biosensor+for+real-time+measurement+of+ATP+in+biological+tissue.">Microelectrode biosensor for real-time measurement of ATP in biological tissue.</a> Anal Chem. 77, 3267-3273 (2005).</li><li>Llaudet, E., Botting, N. P., Crayston, J. A., Dale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-enzyme+microelectrode+sensor+for+detecting+purine+release+from+central+nervous+system.">A three-enzyme microelectrode sensor for detecting purine release from central nervous system.</a> Biosens Bioelectron. 18, 43-52 (2003).</li><li>Cosnier, S., Lepellec, A., Guidetti, B., Isabelle, R. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+biosensor+sensitivity+in+aqueous+and+organic+solvents+using+a+combination+of+poly(pyrrole-ammonium)+and+poly(pyrrole-lactobionamide)+films+as+host+matrices.">Enhancement of biosensor sensitivity in aqueous and organic solvents using a combination of poly(pyrrole-ammonium) and poly(pyrrole-lactobionamide) films as host matrices.</a> J Electroanal Chem. 449, 165-171 (1998).</li><li>Gourine, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+control+breathing+through+pH-dependent+release+of+ATP.">Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP.</a> Science. 329, 571-575 (2010).</li><li>Kluess, H. A., Stone, A. J., Evanson, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+overflow+in+skeletal+muscle+1A+arterioles.">ATP overflow in skeletal muscle 1A arterioles.</a> J. Physiol. 588, 3089-3100 (2010).</li><li>Nishiyama, A., Jackson, K. E., Majid, D. S., Rahman, M., Navar, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+interstitial+fluid+ATP+responses+to+arterial+pressure+and+tubuloglomerular+feedback+activation+during+calcium+channel+blockade.">Renal interstitial fluid ATP responses to arterial pressure and tubuloglomerular feedback activation during calcium channel blockade.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290, H772-H777 (2006).</li><li>Jin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+renal+perfusion+pressure+on+renal+medullary+hydrogen+peroxide+and+nitric+oxide+production.">Effects of renal perfusion pressure on renal medullary hydrogen peroxide and nitric oxide production.</a> Hypertension. 53, 1048-1053 (2009).</li><li>Khan, A. S., Michael, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+consequences+of+using+micro-electrodes+and+microdialysis+probes+in+the+brain.">Invasive consequences of using micro-electrodes and microdialysis probes in the brain.</a> Trends Anal. Chem. 22, 503-508 (2003).</li></ol>

חיישנים להקלטת וידאו של כתב היד הזה נמסרו על ידי סריסה ביו-רפואי מוגבל (קובנטרי, בריטניה).

הפרוטוקולים הנוכחיים פותחו כדי לספק רזולוציה של זמן ומרחב משופר של ה- ATP ו- 2 O 2 H איתות לכליות-perfused דם מבודדים vivo לשעבר, perfused וin vivo. ההבדלים בין הפרוטוקולים והחיישנים המשמשים כאן לספק נתונים רכישה אופטימלית לשני סוכנים תרופתיים או מחקרים פיסיולוגיים. הפרוטוקולים מורכבים של 1 כיול) חיישן, 2) הליך כירורגי, 3) התקנת רכישת נתונים, ו -4) ניתוח נתונים. הם מאפשרים מדידות בזמן אמת של analytes לתנאי ניסוי רבים. זה יוביל לתובנות גדולות יותר למחל כליה והפיתוח של טיפולים תרופתיים יעילים יותר. כאן השתמשנו בחיישנים לנתח ATP ו- H 2 O 2. עם זאת, חיישנים לחומרים אחרים זמינים גם וניתן להשתמש בו. הפרוטוקולים שתוארו כאן יושמו ללמוד ATP ו- H 2 O 2 בכליות חולדה, אבל באותו methoד יכול בקלות להיות מותאם ליישום בעכברים. לפיכך, גישה זו יש פוטנציאל גדול בהתחשב בשפע של מודלים של מכרסמים גנטיים. העיצוב הבסיסי של חיישני microelectrode האנזימטית פותח בשנתי ה -1960 על ידי קלארק וליון 2. בעקבות הפיתוח הראשוני של חיישנים, התקדמות שנעשתה בשני העיצוב 17-19 ויישומי 20. Llaudet et al. 21,22 פיתח את עיצוב עיקרון חיישני ATP משמשים בפרוטוקולים הנוכחיים תוך שימוש בשיטות מet al Cosneir. 23 לציפוי האנזים. חיישנים אלה זיהו איתות ATP במספר התהליכים פיסיולוגיים כוללים שחרור ATP מהאסטרוציטים מוח 8, הסדרת נשימת 4,24, ורגולצית עורקיק שריר שלד 25. לאחרונה הפרוטוקול לשעבר vivo נעשה שימוש כדי למדוד איתות ATP בכליות 12. המטרה שלי כתב היד הזהים כדי לספק כיוונים יעילים ותובנות לזיהוי של חומרים אנדוגניים כגון ATP בכליות. יש חיישני microelectrode אנזימתי יתרונות רבים על פני אמצעים קיימים למדידת analytes in vivo. עם זאת, יש להשתמש באמצעי זהירות מיוחדת לגישה זו כמו לכל שיטה חדשה אחרת. אימות עם גישה הוקמה מספקת אמון בנתונים המתקבלים. לדוגמא, מדידות microdialysis נעשו כפי שתוארו לעיל 26,27. לא נצפה הבדל משמעותי בין ריכוזי השיא נקבעו על ידי החיישנים ואלו שהושגו מדגימות הדיאליזה 12. ההגבלה של microdialysis היא שזה רק מודד רמות מצב היציב של אנליטי. ככזה, ההערכה של שינויים דינמיים באיתות תא ניתן להשיג עם השימוש בחיישני microelectrode האנזימטית בלבד. מפרטי manufactory של זמני תגובת חיישן שונים בין החיישןסוגים. Ex vivo חיישנים יש זמן תגובה של 5-10 שניות ובחיישני vivo של 30-35 שניות לעליית אות 10-90%. עקבות הכיול (האיורים 6 ו -7) להדגים את הרזולוציה של בנוסף אנליטי / הסרת הזמן. עבור שתי גישות החיישן וmicrodialysis, השימוש באנזימים ספציפיים כדי לחסום את האות המיוצרת על ידי analytes נדרש כדי להבטיח סגוליות. יש הפרוטוקולים תיארו מספר אתגרים. כמו בכל החדרת חיישן לרקמה, נזק לרקמות מתרחשת. זה יכול להפעיל מסלולי איתות אשר עשוי להשפיע על המדידות 28. כדי למזער את הנזק לתאים, חיישנים דקים יותר יהיו צורך. עם זאת, קשה לחדור הקפסולה הכליות עם החיישנים כך מחטים המשמשות לייצור חור כניסה קטן. חיישנים דקים נוטים יותר לכופף ולשבש ציפוים על כניסה. חיישנים בקוטר גדולים יותר הם יותר עמיד וכיפוף resultaנזק NT להם ציפוי. איור 3 מראה חיישן דק ועבה. בנוסף להתנגדות של החיישן העבה לכיפוף, שהם מכילים שכבה עבה של ציפוי, מתן הגנה מוגברת לשכבה האנזימטית. החשש של נזק לרקמות שנגרמו על ידי שימוש בחיישנים עבים היה הרבה פחות בכליות מאשר שזה יהיה ברקמת המוח. עומק ההחדרה מקורב ומיקום סופי צריך להיות מאומת לאחר מדידות בכליות הושלמו. הערכה בין שכבות קורטקס ומדולה באמצעות אורך קצה החיישן כמדריך הכנסה ודי כקצה החיישן הוא 0.5 מ&quot;מ וקליפת הכליה היא 2-3 מ&quot;מ עובי. עכירות של החיישן גם מתרחשת בקצב גדול יותר בדם, ובכך להגביל את השימוש בחיישן ארוך בפרוטוקולי vivo לניסוי אחד. פעמים הקלטה של ​​1 עד 1 שעה וחצי הביאו רק להיסחף חיישן קטן. הקריטריונים העיקריים בהערכת ביצועי החיישן המופחת היא הרגישות הנמוכהלאנליטי בתהליך הכיול. רעש חשמלי מוגבר וחוסר יציבות של הבסיס הנוכחי יכולים גם להצביע על כך שקצה החיישן פגום. למדידות מדויקות של ה- ATP, שני החיישנים (ATP וריק) צריכים להיות מאפייני רעש ויציבות דומים לחיסור נוסף של האות. אחרת, אחד מהחיישנים צריך להיות מוחלף. לרעש וזיהוי של ריכוזים קטנים של אנליטי נמוכים, השימוש בחיישנים חדשים עבור כל חיה שהציע. כמה צעדים חיוניים לתוצאות ניסוי מוצלחות. החיישנים הם מאוד שבירים וצריכים להיות מטופל בזהירות כדי למנוע נזק לקצה החיישן. כמו כן, לאחר התייבשות, לא צריכים להיות חשופים החיישנים לאוויר במשך יותר מ -20 שניות. הקלטות רעש נמוכות נדרשות לזיהוי המוצלח של אותות ביולוגיים ברקמות. לשם כך, נדרש שולחן המעבדה אוויר ביצועים גבוהים והארקה חשמל תקינה. בתוספת סכומים של dur אנליטי מדויקיםing צעדי הכיול הוא הכרחי לקביעת ריכוז מדויקת בניסויים. השגת סליקה טובה של הכליות בניתוחי כליות vivo לשעבר יגרום הקלטות מוצלחות. השימוש באנזימי apyrase וcatalase בכיולים ובניסויים מאפשרים ההערכה של רגישות ספציפי חיישן ומאשר את המדידות. פרוטוקולים אלה מספקים מאוד משופרים פירוט של איתות תאית בכליות. הרגישות המשופרת והפתרון זמני שניתנה על ידי החיישנים יכולים לאפשר לנו לפתור את השינויים בATP איתות במצבי מחלה והבאים מניפולציה תרופתית שהיו בלתי ניתן לגילוי בעבר. פרוטוקול in vivo הוא גם מתאים למחקרים פיסיולוגיים מורכבים תוך vivo לשעבר הוא אופטימלי ללימוד יישומים תרופתיים בכליות. העיצוב של חיישן in vivo משמש כאן מאפשר התנגדות חסרת תקדים נגד הפרעות בblאוד-perfused רקמה. יחדיו, חיישנים אלה מציעים כמות גדולה של יישומים שקודם לכן לא היו אפשריים עם פרוטוקולים וטכניקות קיימים.

חיישני microelectrode האנזימטית (גם בהפניה כמו חיישנים בכתב היד הנוכחית) היו כלי רב ערך ללימוד תהליכי איתות דינמיים בתאים חיים ורקמות. החיישנים יספקו גדלו רזולוציה של זמן ומרחב של מולקולות איתות תא בריכוזים רלוונטיים מבחינה ביולוגית. במקום דגימה וניתוח נוזלים תאיים נלקחו במרווחים על פני תקופות זמן ארוכות, חיישנים אלה מגיבים מהר ככל האנזימים שלהם מגיבים לאנליטי, ובכך לייצר מדידות בזמן אמת 1,2. זיהוי מהיר של ריכוזי ביניים של גורמי autocrine ואוטוקריני, כמו purines או מי חמצן, ואת הדינמיקה של שחרורם ניתן להשתמש כדי להקים פרופיל להשפעות של תרופות בתנאים נורמלים ופתולוגיים 3. נכון לעכשיו, רוב היישומים באמצעות חיישנים היו בחתכי רקמת מוח ותרביות תאים 4-10. הפרוטוקולים מפורטים במטרת כתב היד הזה ללהקים את האמצעים כדי למדוד במדויק ריכוזים של analytes בכל כליות בזמן אמת. הפרוטוקולים הבאים פותחו ללמוד ATP ביניים ו- H 2 O 2 איתות בכליות. בסביבה המקורית של הכליות, ATP התאי catabolized במהירות על ידי ectonucleotidases אנדוגני לנגזרותיו (ADP, AMP ואדנוזין). החיישנים המשמשים כאן הם מאוד סלקטיבית לATP על purines אחרת או מוצרים פגומים ATP 11. זו מציעה יתרון גדול שכן היא מאפשרת ניטור מדויק של ריכוזים קבועים ודינמיים של שחרור ATP ותפקוד האיתות שלה. ריכוז ה- ATP ביניים נמדד באמצעות שילוב של שני microelectrodes, חיישן ה- ATP וחיישן ריק. חיישן ריק בשילוב עם יישומי catalase הוא מסוגל לזהות H ביניים 2 O 2 ריכוזים 12. הפרוטוקולים הבאים משתמשים בשני עיצובים שונים של הצרRS שיש להן מאפיינים אופטימליים לשני vivo לשעבר או ביישומי vivo. שני העיצובים מבוססים על התגובה קטליטי רציפה של קינאז גליצרול ומונואמין גליצרול-3-פוספט הכלול בשכבה האנזימטית חיישן ומונע על ידי הנוכחות של ה- ATP. בסט של חיישנים המשמשים במחקרי vivo לשעבר, H 2 O 2, מוצר התגובה האנזימטית הסופי, הוא זוהה על ידי חמצון על פלטינה / אירידיום אלקטרודה חוט (PT-עיר). חיישנים ללימודים בvivo מבוססים במקום על H 2 O 2 הפחתה באלקטרודה זהב מתווך מצופה מיועדת לרקמה-perfused דם. שמוצגת באיור 1 היא ערכה של שני הפרוטוקולים שתוארו בכתב היד הזה. חיישן ריק זהה לחיישן ה- ATP המקביל שלה חוץ מזה שחסר את האנזימים מחויבים. לכן, בנוסף לגילוי של H 2 O 2 עם אנזים catalase, מאה שהחיישן ריקsures הפרעות ספציפיות. ריכוזי ATP מחושבים על ידי הפחתת ריק זוהה הפרעות ספציפיות וH רקע 2 O 2 מאות חיישן ה- ATP. כמה חיישנים גם זמינים מסחרי כדי לזהות analytes האחר כוללים אדנוזין, ionosine, hypoxanthine, אצטילכולין, כולין, גלוטמט, גלוקוז, חומצת החלב, ד-סרין ליישומי vivo לשעבר או אדנוזין, ionosine, וhypoxanthine לin vivo כאשר יחד עם ריק המקביל חיישן. היכולת של החיישן לזיהוי מדויק analytes תלויה בטרום הנכון וכיולים שלאחר 13. זה מבטיח שהניתוח מהווה להיסחף ברגישות חיישן המתרחש במהלך שימוש ברקמות ביולוגיות. החיישן מחזיק מחסן של גליצרול המשמש כמגיב בתגובות אנזימטיות החיישן. אם החיישן לא נעשה שימוש בפתרונות אמבטיה המכילים גליצרול, זה יהיה לשטוף החוצה לאורך זמן. r הקצרפעמים ecording אז הם הכרחיים כדי למזער להיסחף החיישן. בנוסף חיישן עכירות על ידי פרוטאזות אנדוגני ושברי חלבון יכול להפחית את הרגישות של החיישנים 14 מאוד. כתב היד הנוכחית קובעת את השימוש בחיישני microelectrode האנזימטית לvivo לשעבר ובהכנות כליות vivo. כימות אנליטי בזמן אמת מספקת פירוט חסר תקדים של איתות תאית שעשויות לחשוף תובנות רומן לתוך המנגנונים של מחלות כליה וסוכנים תרופתיים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sensor Kit</td>
			<td>Sarissa Biomedical</td>
			<td>SBK-ATP-05-125</td>
			<td>The kit includes storage bottle, rehydration chamber, electrode leads, and reference electrodes.&#160; Also included with the kit is the user&#39;s choice of sensors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarissaprobe ATP Biosensor 125 &#956;m</td>
			<td>Sarissa Biomedical</td>
			<td>SBS-ATP-05-125</td>
			<td>store at 2-8 C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarissagold ATP Biosensor 50 &#956;m</td>
			<td>Sarissa Biomedical</td>
			<td>SGS-ATP-10-50</td>
			<td>store at 2-8 C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarissaprobe null sensor 125&#956;m</td>
			<td>Sarissa Biomedical</td>
			<td>SBS-NUL-20-125</td>
			<td>store at 2-8 C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarissagold null sensor 50 &#956;m</td>
			<td>Sarissa Biomedical</td>
			<td>SGS-NUL-10-50</td>
			<td>store at 2-8 C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarissaprobe ATP Manual</td>
			<td>Sarissa Biomedical</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf">http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage&#160;</td>
			<td>TMC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual channel potentiostat</td>
			<td>Digi-Ivy</td>
			<td>DY2021</td>
			<td>Type II Faraday cage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition program</td>
			<td>Digi-Ivy</td>
			<td>DY2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump</td>
			<td>Razel Scientific Instruments</td>
			<td>Model R99E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber optic illuminator</td>
			<td>Schott</td>
			<td>ACE 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MM-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>air table</td>
			<td>TMC</td>
			<td>63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane ventilator</td>
			<td>LEI Medical</td>
			<td>M2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 ml petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S3358OA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td></td>
			<td>26-30 gauge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Standard dissection pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>catheter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Polyethylene tubing (PE50)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>catheter tissue glue</td>
			<td>Vetbond</td>
			<td>1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>suture</td>
			<td>Look</td>
			<td>SP117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rubber bands</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any 2-4 mm wide rubber bands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicone</td>
			<td>Momentive</td>
			<td>RTV-615 Clear 1#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>clamp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18052-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>standard dissection kit</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kit should include scalpel and dissection sissors&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kidney Cup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Of own design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>standard chemicals</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6559-25UMO</td>
			<td>100 mM ATP solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrogen peroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apyrase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane</td>
			<td>Clipper</td>
			<td>10250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inactin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ketamine</td>
			<td>Clipper</td>
			<td>2010012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of enzymatic biosensors to quantify endogenous atp or h2o2 in the kidney

חיישני microelectrode אנזימתי היו בשימוש נרחב כדי למדוד איתות תאית בזמן אמת. רוב השימוש בם הוגבל לפרוסות מוח ותרביות תאים עצביות. לאחרונה, טכנולוגיה זו הוחל על כל האיברים. התקדמות בתכנון חיישן שהתאפשרה המדידה של איתות תא בכליות vivo-perfused דם. הפרוטוקולים הנוכחיים רשימת הצעדים הדרושים כדי למדוד 2 O 2 איתות ATP ו- H בinterstitium כליות חולדה. שני עיצובי חיישן נפרדים המשמשים לvivo לשעבר ובפרוטוקולי vivo. שני סוגים של חיישן מצופים בbiolayer האנזימטית דק על גבי שכבת permselectivity לתת חיישנים מהירים להגיב, רגישים וסלקטיבית. שכבת permselectivity מגנה על האות מinterferents ברקמות ביולוגיות, והשכבה האנזימטית מנצלת את תגובת קטליטי רציפה של קינאז גליצרול וגליצרול-3-phosמונואמין phate בנוכחות ATP לייצר H 2 O 2. הסט של חיישנים המשמשים למחקרי vivo לשעבר זוהה נוסף אנליטי על ידי חמצון של H 2 O 2 בפלטינה / אירידיום אלקטרודה חוט (PT-עיר). החיישנים למחקרי in vivo מבוססים במקום על ההפחתה של H 2 O 2 באלקטרודה זהב מתווך מצופה מיועדת לרקמה-perfused דם. שינויי ריכוז סופיים מזוהים על ידי amperometry בזמן אמת ואחרי כיול לריכוזים ידועים של אנליטי. בנוסף, את הספציפיות של אות אמפרומטריים יכולות להיות מאושרות על ידי התוספת של אנזימים כגון catalase וapyrase כי לשבור H 2 O 2 ו- ATP בהתאמה. חיישנים אלה גם מסתמכים במידה רבה על כיולים מדויקים לפני ואחרי כל ניסוי. שני הפרוטוקולים הבאים להקים המחקר של זיהוי של ה- ATP ו- H 2 בזמן אמתO 2 ברקמות כליה, ויכול להיות שונה נוסף להאריך את השיטה המתוארת לשימוש בתכשירים ביולוגיים אחרים או כל איברים.

העיצוב של biosensor microelectrode האנזימטית מאפשר זיהוי של analytes בכל כליות בזמן אמת. עיצוב הניסוי הכללי לאו vivo לשעבר או במחקרי vivo מודגם באיור 1 חיישני .the משמשים והניתוחים שונים בהתאם אם המחקר הוא vivo לשעבר או in vivo. כדי להשיג תוצאות לשחזור, מראש מדויק וכיולי פוסט הם קריטי. איור 6 א מציג עקבות נציג של האות ראתה מחיישן ה- ATP vivo לשעבר בכיולים. שים לב שהמהירות apyrase בוטל אות ATP. היה לי catalase אין כל השפעה על אות ה- ATP ומדגים את ייחודה לH 2 O 2 הוא יוצר (איור 6). הליך הכיול מייצר ליניארי בכושר שמשמש לחישוב השינויים הדינמיים של ה- ATP (איור 6 א, פנל מימין). בviכיול חיישן VO מייצר עקבות דומות לזה של חיישן vivo לשעבר. עם זאת, חיישן זה מזהה מצמצם במקום זרמי חמצוני וככזה הנוכחיות מיוצר הוא שלילי. כיול של חיישנים אלה גם מייצר ליניארי בכושר במגוון 0.3-80 מיקרומטר (איור 7 א פנל ימני). הספציפיות של חיישן in vivo לATP על פני מוצרים אחרים פורין מוצגת באיור 7. הגישה המתוארת כאן מאפשרת לנו למדוד את שני הרמות בסיסיות של חומרים אנדוגניים ושינויים חריפים בתגובה לעירוי תרופה 12. מוצג באיור 11 הם אנג השני-induced שינויי ריכוז אנדוגני ביניים של H 2 O 2 בחולדות מלח עמיד ומלח-רגיש. בניסויים אלה, כליות מבודדות טרי מספראג Dawley (SD) או דאל חולדות מלח רגיש (SS) היו perfused עם 1 מיקרומטר אנג השני תחת זרם בלתי פוסק למינרית (650 μl / min). כshoWN באיור 11, אנג השני גורם לשחרור החריף של H 2 O 2 בכליות משני SD וחולדות SS. עם זאת, משרעת המרבית של כל תגובה היה גבוה באופן משמעותי בחולדות SS, במיוחד כאשר החיות הואכלו בדיאטה מלח גבוה 12. מוצג באיור 12 הוא יישום נציג של החיישנים in vivo. העירוי של catalase (5 מיקרוגרם / מיליליטר) החוסם לחלוטין את אות H 2 O 2 זוהתה על ידי biosensor. ניסויים אלה ממחישים את השימוש בחיישנים האנזימטית ספציפיים בשילוב עם טכניקת אמפרומטריים לזיהוי של רמות בסיס של חומרים אנדוגניים ומדידות של שחרורם בזמן אמת בתגובה להתערבות תרופתית. יישומים נוספים של גישה זו כדי ללמוד את התפקיד של איתות purinergic ומי חמצן ישפרו את הידע שלנו והבנה של פתולוגיות כליות כמו יתר לחץ דם מלח-רגיש, שור כליותלחץ idative ומחלת כליות כרונית. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53059/53059fig1.jpg" /> סכמטי באיור 1. של הפרוטוקולים. כיול עם אנליטי של עניין ובדיקה הספציפי שלו נעשה מייד לפני תחילת הניסויים. פרוטוקול in vivo צריך להיות בעקבות ניסויים פיסיולוגיים מורכבים וvivo לשעבר ליישומים תרופתיים. כיול ניסוי הודעה צריך להיעשות ונלקח בחשבון בעת ניתוח הנתונים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53059/53059fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53059/53059fig2.jpg" /> איור 2. אנזימתי microelectrode החיישן. שני<html> גדלי חיישן משמשים ליישומי vivo לשעבר מוצגים, 50 מיקרומטר ו -125 מיקרומטר קטרים. כל חוט חיישן משתרע לתוך צינור נימים להתחבר למחבר סוף הזהב (לא מוצג). הבלעה מראה קצה חיישן מצופה באנזימים לגילוי ה- ATP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53059/53059fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53059/53059fig3.jpg" /> איור 3. הערוץ הכפול potentiostat. ערוצי potentiostat כותרת CH1 וCH2. 1) CH1 חיבור חיישן ה- ATP ו- 2) CH2 קשרי ריק חיישן חיבור 3) החשמליים מצמידים את האלקטרודה ההתייחסות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53059/53059fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <html> התחת = &quot;jove_content&quot; FO: לשמור-together.within עמודים = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53059/53059fig4.jpg" /> איור 4. התקנת חיישן. רכישת הנתונים מתבצעת בכלוב פאראדיי כדי להפחית את הרעש חשמלי ועל מעבדה שולחן בעל ביצועים גבוהים למשטח עבודה ללא רעידות. 1) שולחן ניתוחים בטמפרטורה מבוקרת משמש כדי לשמור על טמפרטורת גוף של בעלי חיים בניסויים פיסיולוגיים 2) micromanipulators מצורפים למתאמי הרכבה מגנטיים למיקום גמיש של החיישנים במהלך ניסוי 3) מקור אור נחוץ לניתוחים והחדרת חיישן 4 potentiostat) הכפול ערוץ 5) בעל לחיישנים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53059/53059fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> p_upload / 53,059 / 53059fig5.jpg &quot;/&gt; איור 5. Voltammetry המחזורי. למחקרים vivo לשעבר, voltammetry המחזורית החיישן נערך במשך 10 מחזורים בין -0.5 ו -0.5 V לפני פרוטוקול הכיול. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53059/53059fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/53059/53059fig6.jpg" /> איור 6. Amperometry כיול עבור Ex Vivo. () כיול משתמש בתוספת של ריכוזי ה- ATP ידועים לפתרון האמבטיה. מתאים ערכי אמפרומטריים נרשמו ברמת אסימפטוטה (זכר שחור). הזרמים שהושגו ליצור משוואת כיול. למשל מוצג בלוח השמאלי. העקבות האדומות היא curreNT של חיישן ריק שרק מגיב לתוספת של H 2 O 2. חיישן ריק (ב) מכויל עם התוספת של H 2 O 2 ידוע ריכוזים (חצים אדומים) לפתרון האמבטיה וAsymptotes ערכי אמפרומטריים נרשמים (חיצים שחורים דקים). תוספת של catalase לפתרון האמבטיה (חץ שחור עבה) תוצאות בריקבון הנוכחי מהיר. הפנל הימני מראה את משוואת כיול חיישן ריק. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53059/53059fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/53059/53059fig7.jpg" /> איור 7. Amperometry כיול ל;. In vivo כיול in vivo אלקטרודות מבוצע באופן דומה לזה מפורט במחקרי vivo לשעבר מלבד תגובות הפחתה לגרום הפוכה נוכחית (קוטביות). (א) התוספת של ריכוזי ה- ATP ידועים מייצרת נוכחית אמפרומטריים על חיישן ה- ATP (זכר השחור) אבל אין כל השפעה על חיישן ריק (זכר אדום). תוספת של apyrase מכבה הנוכחית של חיישן ה- ATP. (ב) הספציפי של חיישן ה- ATP אושר על ידי התוספת של 10 מיקרומטר של סוכנים שונים purinergic (UTP, UDP ואדנוזין). יישומים נוספים של ה- ATP מספקים נוכחית אמפרומטריים לזיהוי יציב. (ג) Microphotograph של חיישני in vivo מבוססים על האלקטרודה זהב מתווך מצופה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53059/53059fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של figu זה</a>מחדש. <img alt="איור 8" src="/files/ftp_upload/53059/53059fig8.jpg" /> איור 8. כוסות כליות. במחקרי in vivo, כליות מתקיימות עדיין משתמשת בכוסות כליות הנירוסטה לראות. שני גדלים של כוסות משמשים כדי להתאים וריאציה גודל כליות. כוסות אלה מפחיתים את חפצי התנועה שנוצרים על ידי הנשימה של החיה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53059/53059fig8large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 9" src="/files/ftp_upload/53059/53059fig9.jpg" /> כליות מבודדות וperfused איור 9. Ex Vivo. הכליות המבודדות ממוקמת לתוך צלחת 1) פטרי מצופה סי עבהתחתון licone לסיכת החדרה 2) עורק הכליה הוא cannulated ומחובר למשאבת מזרק לזלוף הקבוע במהלך ניסוי 3) חיישן ה- ATP, 4) וחיישן ריק מוכנסים לתוך הכליות 5) האלקטרודה ההתייחסות ממוקמת באזור הכליות השקועים לפתרון האמבטיה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53059/53059fig9large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 10" src="/files/ftp_upload/53059/53059fig10.jpg" /> איור 10. בכליות perfused Vivo דם. () הכליה השמאלית חשופה והניחה בכוס כליות, הכליה הימנית נותר בשלמותה בתוך בעלי החיים. שני החיישנים מוכנסים לתוך הכליות. BSA: NaCl הוא החדיר דרך וריד הצוואר צינתור כדי לנטרל את אובדן הנוזלים גרם בy דוגמא הגדולה חתך קו אמצע (B) של ניסוי in vivo עם קטטר ביניים מושתל עבור יישומים תרופתיים ישירים 1) הכליות מוחזקות על ידי כוס כליות 2 חיישן) ATP 3) חיישן ריק ו -4) אלקטרודה התייחסות מוכנסת לתוך שטח הגחון של 5) קטטר הכליות הושתל בכליות ומחובר למשאבת peristaltic לאינפוזיות התרופתית מינרית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53059/53059fig10large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 11" src="/files/ftp_upload/53059/53059fig11.jpg" /> איור 11. אקס ניתוח Vivo של H 2 </<html> תת&gt; O 2 בכליות. זלוף אנג השני גורם H 2 O 2 שחרור בקליפת הכליה חולדה. (א) שינויים בזמן אמת של הממוצע 2 O 2 ריכוז H (פסים אפורים להראות שגיאה סטנדרטית) מהסכום כולל של N = 8 יישומים (4 כליות מ4 חולדות שונות). ברים בחלק העליון מייצגים יישום אנג השני. H המקסימלי (B) 2 O 2 ערכי המשרעת ריכוז במהלך זלוף אנג השני לספראג Dawley (SD) וחולדות דאל מלח רגיש (SS) האכילו דיאטות מלח נמוכות וגבוהות, בהתאמה. * - P &lt;0.05 לעומת חולדות SD. הדמות מותאמת התייחסות 12 באישור. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53059/53059fig11large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> /files/ftp_upload/53059/53059fig12.jpg &quot;/&gt; איור 12. בניתוח vivo של H 2 O 2. דוגמא להערכת in vivo של H 2 O 2 ביניים ריכוז בלשד של עכברוש SS קבל תזונה מלח נמוכה (כפי שמוצג באיור 10 ב). יישום ביניים של catalase באמצעות צנתר מושתל למרווח 5 דקות מיוצר מצור של אות H 2 O 2 בלשד הכליה מוחלט. הפחתה של catalase, מכישלון בזרימת דם כליות, הביאה להתאוששות חלקית של האות, שנחסמה שוב על ידי יישום נוסף catalase (10 דקות). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53059/53059fig12large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney at JoVE.com

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

Enzymatic microelectrode biosensors enable real-time measurements of extracellular cell signaling in biologically-relevant concentrations. The following protocols extend the applications of biosensors to the ex vivo and in vivo detection of ATP and H2O2 in the kidney.

שימוש באנזימתי Biosensors לכמת אנדוגני ATP או H<sub&gt; 2</sub&gt; O<sub&gt; 2</sub&gt; בכליות

Enzymatic microelectrode biosensors have been widely used to measure extracellular signaling in real-time. Most of their use has been limited to brain ...

use-enzymatic-biosensors-to-quantify-endogenous-atp-or-h2o2

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

11.8K Views.  Medical College of Wisconsin. Enzymatic microelectrode biosensors enable real-time measurements of extracellular cell signaling in biologically-relevant concentrations. The following protocols extend the applications of biosensors to the ex vivo and in vivo detection of ATP and H2O2 in the kidney. 

Video: Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

The use of SC1 (Pluripotin) to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and activation of the LIF/JAK/STAT3 pathway is not absolutely required to maintain the self-renewal state.2 The SC1 small molecule may be an economical alternative to LIF. SC1 functions through dual inhibition of Ras-GAP and ERK1.3 Illustration of its mechanism of action makes it a useful tool to study the fundamental molecular mechanism of self-renewal. Here we demonstrate the procedure for culturing mouse ES cells in the presence of SC1 and show that they are able to maintain self-renewal in the absence of LIF. Cells cultured with SC1 showed similar morphology compared to cells maintained with LIF. Both exhibited typical mouse ES morphology after five passages. Expression of typical pluripotency markers (Oct4, Sox2, Nanog, and SSEA1) was observed after five passages in the presence of SC1. Furthermore, SC1 caused no overt toxicity on mouse ES cells.

The use of SC1 Pluripotin to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

SC1 functions through dual inhibition of Ras- GAP and ERK1. We tested the function of SC1 in supporting mouse ES cell self-renewal in the absence of LIF and showed that SC1 is able to maintain self-renewal of mouse ES cell cultures.

השימוש sc1 (Pluripotin) לתמיכה המסקלין עצמית חידוש בהעדר LIF

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

סריג מיקרוסקופי לניטור בזמן אמת של אירועי איתות בתאים חיים באמצעות Biosensors Unimolecular

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated including macromolecular synthesis, metabolism and ultimately, commitment to the cell division cycle. The chemostat, a method of experimentally controlling cell growth rate, provides a powerful means of systematically studying how growth rate impacts cellular processes - including gene expression and metabolism - and the regulatory networks that control the rate of cell growth. When maintained for hundreds of generations chemostats can be used to study adaptive evolution of microbes in environmental conditions that limit cell growth. We describe the principle of chemostat cultures, demonstrate their operation and provide examples of their various applications. Following a period of disuse after their introduction in the middle of the twentieth century, the convergence of genome-scale methodologies with a renewed interest in the regulation of cell growth and the molecular basis of adaptive evolution is stimulating a renaissance in the use of chemostats in biological research.

Cell growth rate is a regulated process and a primary determinant of cell physiology. Continuous culturing using chemostats enables extrinsic control of cell growth rate by nutrient limitation facilitating the study of molecular networks that control cell growth and how those networks evolve to optimize cell growth.

השימוש בChemostats בביולוגיה מיקרוביאלית מערכות

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nephrotoxin Microinjection דג הזברה למודל אי-ספיקת כליות חריפה

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and biomedical sciences. This easy to follow protocol was developed for first year undergraduate pharmacy students and provides an entry-level introduction to enzyme reactions and analytical procedures for enzyme analysis. The enzyme of choice is lactase, as this represents an example of a commercially available enzyme relevant to human disease/pharmaceutical practice. Lactase is extracted from dietary supplement tablets, and assessed using a colorimetric assay based upon hydrolysis of an artificial substrate for lactase (ortho-nitrophenol-beta-D-galactopyranoside, ONPG). Release of ortho-nitrophenol following the hydrolytic cleavage of ONPG by lactase is measured by a change in absorbance at 420 nm, and the effect of the temperature on the enzymatic reaction is evaluated by carrying out the reaction on ice, at room temperature and at 37 &#176;C. More advanced analysis can be implemented using this protocol by assessing the enzyme activity under different conditions and using different reagents.

The enzymatic activity of lactase is essential for the catabolic processing of the disaccharide lactose. Here, the activity of lactase found in dietary supplements is assayed using a colorimetric assay. This provides students with an experimental platform for understanding the activity of lactase and enzyme kinetics.

מדידת פעילות אנזימטי לקטאז במעבדת ההוראה

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a prerequisite for studying the physiology of the isolated organ and for many innovative applications that may be possible in the future, including perfusion decellularization for kidney bioengineering or the administration of anti-rejection or genome-editing drugs in high doses to prime the kidney for transplantation. During the time of the perfusion, the kidney can be manipulated, renal function can be assessed, and various pharmaceuticals administered. After the procedure, the kidney can be transplanted or processed for molecular biology, biochemical analysis, or microscopy.
This paper describes the perfusate and the surgical technique needed for the ex vivo perfusion of mouse kidneys. Details of the perfusion apparatus are given and data are presented showing the viability of the kidney&#39;s preparation: renal blood flow, vascular resistance, and urine data as functional, transmission electron micrographs of different nephron segments as morphological readouts, and western blots of transport proteins of different nephron segments as molecular readout.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. The buffers and surgical technique are described in detail.

טכניקת כלית עכבר המבודדת perfused

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful in cases of attenuated, oligo- or mono-symptomatic forms of CF usually diagnosed later in life, and of CF-related disorders such as congenital bilateral absence of vas deferens, idiopathic chronic pancreatitis, allergic bronchopulmonary aspergillosis, and bronchiectasis. In both clinical and preclinical settings, the test has been used as a biomarker to quantify responses to targeted therapeutic strategies for CF. Adapting the test to a mouse is challenging and can entail an associated mortality. This paper describes the adequate depth of anesthesia required to maintain a nasal catheter in situ for continuous perfusion. It lists measures to avoid broncho-aspiration of solutions perfused in the nose. It also describes the animal care at the end of the test, including administration of a combination of antidotes of the anesthetic drugs, leading to rapidly reversing the anesthesia with full recovery of the animals. Representative data obtained from a CF and a wild-type mouse show that the test discriminates between CF and non-CF. Altogether, the protocol described here allows reliable measurements of the functional status of trans-epithelial chloride and sodium transporters in spontaneously breathing mice, as well as multiple tests in the same animal while reducing test-related mortality.

Here, we present a protocol to measure nasal potential difference in mice. The test quantifies the function of transmembrane ion transporters such as the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator and the epithelial sodium channel. It is valuable to evaluate the efficacy of novel therapies for cystic fibrosis.

האף הפרש הפוטנציאלים לכמת תחבורה טרנס-אפיתל יון בעכברים

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell imaging studies. Methods for detecting RNAs have expanded greatly since seminal studies linked site-specific mRNA localization to gene expression regulation. Dynamic mRNA processes can now be visualized via approaches that detect mRNAs, coupled with microscopy set-ups that are fast enough to capture the dynamic range of molecular behavior. The molecular beacon technology is a hybridization-based approach capable of direct detection of endogenous transcripts in living cells. Molecular beacons are hairpin-shaped, internally quenched, single-nucleotide discriminating nucleic acid probes, which fluoresce only upon hybridization to a unique target sequence. When coupled with advanced fluorescence microscopy and high-resolution imaging, they enable one to perform spatial and temporal tracking of intracellular movement of mRNAs. Although this technology is the only method capable of detecting endogenous transcripts, cell biologists have not yet fully embraced this technology due to difficulties in designing such probes for live cell imaging. A new software application, PinMol, allows for enhanced and rapid design of probes best suited to efficiently hybridize to mRNA target regions within a living cell. In addition, high-resolution, real-time image acquisition and current, open source image analysis software allow for a refined data output, leading to a finer evaluation of the complexity underlying the dynamic processes involved in the mRNA&#39;s life cycle.
Here we present a comprehensive protocol for designing and delivering molecular beacons into Drosophila melanogaster egg chambers. Direct and highly specific detection and visualization of endogenous maternal mRNAs is performed via spinning disc confocal microscopy. Imaging data is processed and analyzed using object detection and tracking in Icy software to obtain details about the dynamic movement of mRNAs, which are transported and localized to specialized regions within the oocyte.

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Here, we present a protocol for the visualization, detection, analysis and tracking of endogenous mRNA trafficking in live Drosophila melanogaster egg chamber using molecular beacons, spinning disc confocal microscopy, and open-source analysis software.

חזותי ומעקב אחר mRNAs בשידור חי דרוזוסופילה מלאנוגסטר צ'יימברס

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires careful and in-depth analyses and quantification to capture as much information about the underlying events as possible. Spatial, temporal and intensity parameters intrinsic to Ca2+ signals such as frequency, duration, propagation, velocity and amplitude may provide some biological information required for intracellular signalling. High-resolution Ca2+ imaging typically results in the acquisition of large data files that are time consuming to process in terms of translating the imaging information into quantifiable data, and this process can be susceptible to human error and bias. Analysis of Ca2+ signals from cells in situ typically relies on simple intensity measurements from arbitrarily selected regions of interest (ROI) within a field of view (FOV). This approach ignores much of the important signaling information contained in the FOV. Thus, in order to maximize recovery of information from such high-resolution recordings obtained with Ca2+dyes or optogenetic Ca2+ imaging, appropriate spatial and temporal analysis of the Ca2+ signals is required. The protocols outlined in this paper will describe how a high volume of data can be obtained from Ca2+ imaging recordings to facilitate more complete analysis and quantification of Ca2+ signals recorded from cells using a combination of spatiotemporal map (STM)-based analysis and particle-based analysis. The protocols also describe how different patterns of Ca2+ signaling observed in different cell populations in situ can be analyzed appropriately. For illustration, the method will examine Ca2+ signaling in a specialized population of cells in the small intestine, interstitial cells of Cajal (ICC), using GECIs.

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Genetically encoded Ca2+ indicators (GECIs) have radically changed how in situ Ca2+ imaging is performed. To maximize data recovery from such recordings, appropriate analysis of Ca2+ signals is required. The protocols in this paper facilitate the quantification of Ca2+ signals recorded in situ using spatiotemporal mapping and particle-based analysis.

יישומים של מיפוי-עתיים, טכניקות ניתוח חלקיקים לכמת Ca תאיים2 + איתות בחיי עיר

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires ...

The Use of the Patch-Clamp Technique to Study the Thermogenic Capacity of Mitochondria

Mitochondrial thermogenesis (also known as mitochondrial uncoupling) is one of the most promising targets for increasing energy expenditure to combat metabolic syndrome. Thermogenic tissues such as brown and beige fats develop highly specialized mitochondria for heat production. Mitochondria of other tissues, which primarily produce ATP, also convert up to 25% of the total mitochondrial energy production into heat and can, therefore, have a considerable impact on the physiology of the whole body. Mitochondrial thermogenesis is not only essential for maintaining the body temperature, but also prevents diet-induced obesity and reduces the production of reactive oxygen species (ROS) to protect cells from oxidative damage. Since mitochondrial thermogenesis is a key regulator of cellular metabolism, a mechanistic understanding of this fundamental process will help in the development of therapeutic strategies to combat many pathologies associated with mitochondrial dysfunction. Importantly, the precise molecular mechanisms that control acute activation of thermogenesis in mitochondria are poorly defined. This lack of information is largely due to a dearth of methods for the direct measurement of uncoupling proteins. The recent development of patch-clamp methodology applied to mitochondria enabled, for the first time, the direct study of the phenomenon at the origin of mitochondrial thermogenesis, H+ leak through the IMM, and the first biophysical characterization of mitochondrial transporters responsible for it, the uncoupling protein 1 (UCP1), specific of brown and beige fats, and the ADP/ATP transporter (AAC) for all other tissues. This unique approach will provide new insights into the mechanisms that control H+ leak and mitochondrial thermogenesis and how they can be targeted to combat metabolic syndrome. This paper describes the patch-clamp methodology applied to mitochondria to study their thermogenic capacity by directly measuring H+ currents through the IMM.

This method article details the main steps in measuring H+ leak across the inner mitochondrial membrane with the patch-clamp technique, a new approach to study the thermogenic capacity of mitochondria.

השימוש בטכניקת המהדק טלאי כדי לחקור את היכולת התרמוגנית של המיטוכונדריה

Mitochondrial thermogenesis (also known as mitochondrial uncoupling) is one of the most promising targets for increasing energy expenditure to combat ...