אנו מעריכים את סריסה ביו-רפואיים לעבודתם בפיתוח החיישנים המשמשים בכתב היד הנוכחית. מחקר זה נתמך על ידי הלאומי ללב, ריאות ודם מכון מעניק HL108880 (א Staruschenko), HL 116,264 (א קאולי) וHL 122,662 (א Staruschenko וא קאולי), פרויקט ממומן על ידי בית הספר לרפואה של הוועדה לענייני המחקר ויסקונסין # 9306830 (א &#39;Palygin) וקידום # בריא ויסקונסין תכנית המחקר וחינוך 9,520,217, והחוקר הצעיר גרנט של הקרן הלאומית לכליות (א&#39; Palygin).

נהלי החיה הבאים דבקו במדריך NIH לטיפול ושימוש בחי מעבדה. אישור מראש התקבל מהוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC). הערה: סקירה של הוראות יצרן החיישן צריכה להיעשות בשלבי תכנון הניסוי ולפני השימוש בם. ההנחיות באות יפיק תוצאות אופטימליות בעת שימוש בחיישנים. 1. חיישן כיול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרונות מניות טריים לפני תחילת הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור מאגר המכיל 10 מ&quot;מ חיץ NaPi, 100 מ&quot;מ NaCl, 1 מ&quot;מ MgCl 2, ו -2 גליצרול מ&quot;מ. התאם את ה- pH 7.4 באמצעות NaOH. אחסן ב 2-8 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בריכוז ATP המניות (100 מ&quot;מ) מאוחסן ב -20 ° C, ליצור פתרון כיול טרי 10 מ&quot;מ ATP על ידי הוספת מניית 10 μl 90 μl של א &#39;המאגר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רעננות חיישן ה- ATP על ידי הצבת קצהו (איור 2) לtהוא תא להחזרת נוזלים המכיל מאגר לפחות 10 דקות ב 2-8 מעלות צלזיוס. הערה: לאחר התייבשות, לא צריכה להיות חשוף לאוויר החיישנים ליותר מ -20 שניות או רגישות החיישן עשויה להיות מופחתת. אם חשיפות ארוכות לאוויר צפויים, לטבול את החיישן בקצרה לפתרון של גליצרול. החיישנים יכולים לשמש לניסויים מרובים אך אלה חייבים להתרחש באותו היום כמו התייבשות חיישן. ניתן לאחסן את החיישנים בתא להחזרת נוזלים עם הצפת עד 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את potentiostat הערוץ הכפול (איור 3) ולהפעיל את תוכנת מערכת הקלטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תא כיול עם 3 מיליליטר של חיץ א מקום האלקטרודה ההתייחסות לתא הכיול. קח כל חיישן מהתא להחזרת נוזלים, אז לצרף אותו למניפולטור ולהכניס אותו לתוך תא פתרון כיול. הערה: השתמש בצלחת פטרי סיליקון המצופה סטנדרטית כתא כיול. לבצע את כל הכיולים ורחudies בכלוב פאראדיי על שולחן אוויר מעבדה ביצועים גבוהים כדי להפחית את רעש האות במהלך הקלטות amperometry (איור 4). כיולים נעשים הטובים ביותר קרובים לתחילת איסוף הנתונים ככל האפשר. עבור יישומים בvivo הזמן האופטימלי לכיול הוא בתקופת ההתאוששות שלאחר ניתוח בבעלי החיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Vivo לשעבר כיול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע voltammetry המחזורית בתא הכיול ידי רכיבה על אופני החיישנים מ-500 mV ל+500 mV בשיעור של 100 mV / sec במשך 10 מחזורים. זה משפר באופן משמעותי את הרגישות של החיישנים. ראה איור 5 לעקבות שנצפו מ10 המחזורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקטב החיישנים לmV 600 אחרי המחזור האחרון. החיישן הנוכחי ידעכו לאסימפטוטה. קריאה יציבה מושגת לאחר מינימום של 5 דקות. רשום את הקריאה אפס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכיול חיישן vivo <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל תבצעו את voltammetry המחזורית בin vivo הצרRS. במקום זאת, לקטב את החיישן בתא הכיול במשך 30 שניות ל+500 mV. לאחר מכן קבע את potentiostat ל0 mV ולאפשר הנוכחי החיישן לעלות לאסימפטוטה. החיישן הנוכחי ייקח לפחות 2 דקות לאסימפטוטה. רשום את הקריאה אפס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברציפות להוסיף כמויות סט של פתרון ה- ATP לתא לייצר קו כיול מקיף טווח גילוי רצוי. פתרון ה- ATP מייצר שיא חד באות החיישן בתחילה, ואחריו ריקבון כATP מפזר באופן אחיד בכל התא. ערכי אות שיא פעם אחת את רמת האות התייצב לאחר כל הוספת ATP. 6A דמויות ועקבות 7 תכנית והציעו ריכוזי ה- ATP לשני vivo לשעבר ובמחקרי vivo, בהתאמה. הערה: חשוב כדי לאשר את הסלקטיביות של אלקטרודות באמצעות אוכלי נבלות של analytes. הפרוטוקול הנוכחי משמש apyrase כדי לבדוק את הספציפיות של חיישן ה- ATP וcatalase לH &lt;תת&gt; 2 O 2 אות (6B דמויות). אם תרופות הן להינתן, מדידות של תגובתיות שלהם עם החיישנים צריכים להיקבע לפני המחקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 μl של apyrase ממלאי של 2 מ&quot;ג / מיליליטר (89 האו&quot;ם / מ&quot;ג) כדי לבדוק ספציפי של חיישן ה- ATP (הנוכחי מיוצר על ידי יישום ה- ATP צריך להפחית לרמת אפס (איור 7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 μl של catalase ממלאי של 2mg / מיליליטר (100 האו&quot;ם / מ&quot;ג) כדי לבדוק את הספציפיות של חיישן null (הנוכחיות מיוצר על ידי H 2 O 2 יישום צריך להפחית לקריאת אפס). </li></ol> 2. ניתוח בעלי חיים לחיישן לימודים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח לvivo לשעבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את החיה הניסיונית עם isoflurane (אינדוקציה 5%, 1.5 עד 2.5% אחזקה) / O כיתה רפואי 2 או שיטה שאושרה עוד. 15 &#39;12 בעלי חיים חייבים להיות במעקב רציף על מנת להבטיח רמה נאותה של הרדמה. רחובתגובת קמצוץ שיעור ובוהן נשימה מסוגלת משמשות כדי לאשר הרדמה מתאימה. הערה: להרדים בעלי החיים על פי פרוטוקולים שאושרו IACUC. בסיום כל ההליכים שאינם ההישרדות להרדים בעלי חיים עמוקים מורדמים על ידי פתיחת בית החזה וגורם pneumothorax כדי להבטיח את מותו האנושי של בעלי החיים 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החולדה על שולחן ניתוחים בטמפרטורה מבוקרת במצב שכיבה. תוך שמירה על עומק הרדמה מתאים, לעשות חתך קו האמצע של כ 5 סנטימטרים בקו אחד עם הכליה השמאלית ולחשוף את אב העורקים בבטן דיסטלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעטוף מייתר סביב צליאק ועורקי mesenteric מעולים, ואב העורקים בבטן מעל העורקים האלה, אבל לא לקשור. לעטוף שני חיבורי אותיות סביב אב העורקים בבטן מתחת לעורקי הכליה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד את אב העורקים בבטן מעל חיבורי האותיות. לקשור את המייתר נמוך יותר. קטטר אב העורקים בבטן עם צינורות פוליאתילן (PE50). Secure את הקטטר עם מייתר אב העורקים השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המהדק ולקשור את עורקי mesenteric וצליאק. Perfuse הכליות בשעת 6 מיליליטר / דקה עם הנקס מאוזן תמיסת מלח על RT במשך 2-3 דקות, עד שהכליה החווירה לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלו הכליות וקטטר, מחוברים חלק של אב העורקים. מניחים את הכליות ל3 מיליליטר צלחת פטרי מלא פתרון אמבטיה. הערה: פרוטוקול ניסוי יכול להתבצע על RT. פתרון האמבטיה מכיל במ&quot;מ: 145 NaCl, 4.5 KCl, 2 MgCl 2, 1 CaCl 2, 10 HEPES, pH 7.35 מותאמים עם NaOH. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח לin vivo <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכברוש תוך שימוש בפרוטוקולי IACUC אושר. לניתוח בvivo להרדים חולדות עם קטמין (20 מ&quot;ג / קילוגרם IM) וinactin (50 מ&quot;ג / IP קילוגרם). בעלי חיים חייבים להיות במעקב רציף על מנת להבטיח רמה נאותה של הרדמה. תגובת קמצוץ שיעור ובוהן נשימה יציבה משמשות כדי לאשר הרדמה מתאימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר עומק הרדמה נכון הוא לקבלאד, מניח את החולדה במצב שכיבה על משטח מוארק טמפרטורה מבוקרת ממוקם על שולחן האוויר. המשטח צריך להיות שחומם מראש ונשמר על 36 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוך שמירה על עומק הרדמה מתאים, לעשות חתך קו האמצע כ 5 סנטימטרים בקו אחד עם הכליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתפר להסיט ולעגן את רקמת עור ותת עורי, כך שכל הכליה היא גלויה. מניחים את הכליות בכוס כליות כדי למזער את חפצי תנועה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בעירוי של BSA 2%: 0.9% NaCl ב 1 מיליליטר / 100 שעות / g דרך וריד הצוואר לשמור נפח דם. Cannulate שני השופכנים לאיסוף שתן. קשרי מקום סביב עורקי mesenteric וצליאק מעולים וaortal דיסטלי למניפולציה של לחץ פרפוזיה (10A דמויות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם היישום של סוכנים תרופתיים נדרש במהלך ניסויי in vivo, החדרת קטטר ביניים מומלצת (10 ב איורים </strong&gt;). </li></ol></li></ol> התקנת 3. רכישת נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תכנית רכישת נתונים ולהגדיר הקוטביות שלה לשני vivo לשעבר ובניסויי vivo לאנודית חיובית. הגדר את התכנית כדי לשמור את הנתונים כקוד ASCII. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את micromanipulators להחדרה מהירה של החיישנים לכליות. הערה: לחלופין, להשתמש בבדיקת דמה שצורפה לmicromanipulator כדי לעזור להשיג את המיקום הרצוי של חיישנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Vivo לשעבר רכישת נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse הכליות עם פתרון אמבטיה (מ2.1.6) דרך אב העורקים cannulated בקצב קבוע של 650 μl / דקה. בעזרת מספריים כירורגיות, להסיר בזהירות את הקפסולה הכליות, אשר הכרחית להחדרת חיישן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אבטח את הכליות עם גומיות קשורות על הכליות ומחוברות לצלחת מצופה סיליקון עם סיכות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את האלקטרודה ההתייחסות קרובה לכליה בצלחת פטרי עם הקצה שלה שקוע בפתרון החיץ. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברכישת נתונים vivo <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הכליות בכוס כליות. בהתאם לזן וגיל של החיה להשתמש בגודל של כוס שמחזיקה את הכליות באופן רופף. איור 8 מראה שני גדלים של כוסות כליות. כוסות דומות משמשות לגישות פיסיולוגיות שונות המתמקדות בניתוח של תפקוד כליות כגון micropuncture וכו &#39;16. הערה: המיקום של כוס הכליות הוא קריטי כדי להסיר את הרעש המכני המיוצר על ידי הנשימה של בעלי החיים, אבל לא צריך להפריע או לחסום זלוף כליות או זרימת שתן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר 45 דקות של זמן התאוששות לפני ביצוע איסוף נתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מחט 26-30G, לעשות חור לנקב במיקום והעומק הרצויים של החיישן בכליות. למחוק את חור פני השטח כדי להסיר דם הקרין. להוסיף פתרון גליצרול אל פני השטח של הכליה. זה ימנע את פני השטח בכליות מהתייבשות במהלך הניסוי. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את החיישן הראשון מהתא להחזרת נוזלים ולצרף אותו לmicromanipulator. במהירות, תוך 20 שניות, להכניס את האלקטרודה לתוך החור הטרי שנוצר בכליות. חזור על שלבים 3.5-3.9 לחיישן null. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את האלקטרודה ההתייחסות לכליות, כ 1 סנטימטר מהחיישנים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את potentiostat ולהפעיל את תכנית ההקלטה במחשב. איור 9 מציג את ההגדרה הסופית של vivo לשעבר רכישת נתונים הכליות. איור 10 מראה את ההתקנה הסופית של in vivo רכישת נתונים כליות עם קטטר שהוכנס. </li></ol> ניתוח נתונים 4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבא את קובץ נתוני ASCII למקור או כל תוכנה דומה אחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביחס נוכחית ריכוז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בפונקציה מתאימה / לחיץ ליניארי לבנות ריכוז ליניארי (ציר ה- X) למערכת יחסים הנוכחית (y -axis) ל- ATP או H 2 </sub&gt; נקודות O 2 כיול (איורים 6 ו -7). קו ליניארי בכושר: = MX + b y </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשוות הנוכחי לריכוז </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפחית את העקבות המדודות של חיישן null מאלה של חיישן ה- ATP להשיג הנוכחי בפועל מיוצר על ידי ATP תאיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמיר את ערכי ה- ATP ברשות הפלסטינית מתקבלים על ידי amperometry לננומטר באמצעות משוואת הכיול מפורטת ב4.2.1. קבע את הריכוז של עקבות נתונים מופחתים של חיישן ה- ATP על ידי יבוא כל נוכחית מותאמת לערך &quot;x&quot; ופתרון לy (ריכוז אנליטי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן דומה, לחשב H 2 O 2 ריכוז מהמשוואה כיולה במידת צורך. </li></ol>

<ol>
	<li>Palygin, O., Staruschenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+endogenous+substances+with+enzymatic+microelectrode+biosensors+in+the+kidney.">Detection of endogenous substances with enzymatic microelectrode biosensors in the kidney.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 305, 89-91 (2013).</li><li>Clark, L. C., Lyons, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrode+systems+for+continuous+monitoring+in+cardiovascular+surgery.">Electrode systems for continuous monitoring in cardiovascular surgery.</a> Ann N Y Acad Sci. 102, 29-45 (1962).</li><li>Haruyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-+and+nanobiotechnology+for+biosensing+cellular+responses.">Micro- and nanobiotechnology for biosensing cellular responses.</a> Adv Drug Deliv Rev. 55, 393-401 (2003).</li><li>Huckstepp, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+hemichannel-mediated+CO2-dependent+release+of+ATP+in+the+medulla+oblongata+contributes+to+central+respiratory+chemosensitivity.">Connexin hemichannel-mediated CO2-dependent release of ATP in the medulla oblongata contributes to central respiratory chemosensitivity.</a> J Physiol. 588, 3901-3920 (2010).</li><li>Lopatar, J., Dale, N., Frenguelli, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minor+contribution+of+ATP+P2+receptors+to+electrically-evoked+electrographic+seizure+activity+in+hippocampal+slices:+Evidence+from+purine+biosensors+and+P2+receptor+agonists+and+antagonists.">Minor contribution of ATP P2 receptors to electrically-evoked electrographic seizure activity in hippocampal slices: Evidence from purine biosensors and P2 receptor agonists and antagonists.</a> Neuropharmacology. 61, 25-34 (2011).</li><li>Avshalumov, M. V., Chen, B. T., Marshall, S. P., Pena, D. M., Rice, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate-dependent+inhibition+of+dopamine+release+in+striatum+is+mediated+by+a+new+diffusible+messenger,+H2O2.">Glutamate-dependent inhibition of dopamine release in striatum is mediated by a new diffusible messenger, H2O2.</a> J Neurosci. 23, 2744-2750 (2003).</li><li>Frenguelli, B. G., Wigmore, G., Llaudet, E., Dale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+mechanistic+dissociation+of+ATP+and+adenosine+release+during+ischaemia+in+the+mammalian+hippocampus.">Temporal and mechanistic dissociation of ATP and adenosine release during ischaemia in the mammalian hippocampus.</a> J. Neurochem. 101, 1400-1413 (2007).</li><li>Lalo, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocytosis+of+ATP+from+astrocytes+modulates+phasic+and+tonic+inhibition+in+the+neocortex.">Exocytosis of ATP from astrocytes modulates phasic and tonic inhibition in the neocortex.</a> PLoS Biol. 12, e1001747 (2014).</li><li>Heinrich, A., Ando, R. D., Turi, G., Rozsa, B., Sperlagh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K++depolarization+evokes+ATP,+adenosine+and+glutamate+release+from+glia+in+rat+hippocampus:+a+microelectrode+biosensor+study.">K+ depolarization evokes ATP, adenosine and glutamate release from glia in rat hippocampus: a microelectrode biosensor study.</a> Br.J Pharmacol. 167, 1003-1020 (2012).</li><li>Dale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+signaling+in+hypothalamic+tanycytes:+potential+roles+in+chemosensing.">Purinergic signaling in hypothalamic tanycytes: potential roles in chemosensing.</a> Semin Cell Dev Biol. 22, 237-244 (2011).</li><li>Gourine, A. V., Llaudet, E., Dale, N., Spyer, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release+of+ATP+in+the+ventral+medulla+during+hypoxia+in+rats:+role+in+hypoxic+ventilatory+response.">Release of ATP in the ventral medulla during hypoxia in rats: role in hypoxic ventilatory response.</a> J Neurosci. 25, 1211-1218 (2005).</li><li>Palygin, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+electrochemical+detection+of+ATP+and+H2O2+release+in+freshly+isolated+kidneys.">Real-time electrochemical detection of ATP and H2O2 release in freshly isolated kidneys.</a> Am J Physiol Renal Physiol. , (2013).</li><li>Thome-Duret, V., Gangnerau, M. N., Zhang, Y., Wilson, G. S., Reach, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+the+sensitivity+of+glucose+sensor+implanted+into+subcutaneous+tissue.">Modification of the sensitivity of glucose sensor implanted into subcutaneous tissue.</a> Diabetes Metab. 22, 174-178 (1996).</li><li>Wilson, G. S., Gifford, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensors+for+real-time+in+vivo+measurements.">Biosensors for real-time in vivo measurements.</a> Biosens. Bioelectron. 20, 2388-2403 (2005).</li><li>Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Channel+Analysis+of+TRPC+Channels+in+the+Podocytes+of+Freshly+Isolated+Glomeruli.">Single-Channel Analysis of TRPC Channels in the Podocytes of Freshly Isolated Glomeruli.</a> Methods Mol Biol. 998, 355-369 (2013).</li><li>Stockand, J. D., Vallon, V., Ortiz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+ex+vivo+analysis+of+tubule+function.">In vivo and ex vivo analysis of tubule function.</a> Compr Physiol. 2, 2495-2525 (2012).</li><li>Turner, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensors:+Fundamentals+and+applications+-+Historic+book+now+open+access.">Biosensors: Fundamentals and applications - Historic book now open access.</a> Biosens. Bioelectron. 65C, A1 (2014).</li><li>Kauffmann, J. M., Guilbault, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+electrode+biosensors:+theory+and+applications.">Enzyme electrode biosensors: theory and applications.</a> Methods Biochem Anal. 36, 63-113 (1992).</li><li>Barlett, P. N., Cooper, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+immobilization+of+enzymes+in+electropolymerized+films.">A review of the immobilization of enzymes in electropolymerized films.</a> J Electroanal Chem. 362, 1-12 (1993).</li><li>Kano, K., Morikage, K., Uno, B., Esaka, Y., Goto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+microelectrodes+for+choline+and+acetylcholine+and+their+applications.">Enzyme microelectrodes for choline and acetylcholine and their applications.</a> Anal Chim Acta. 299, 69-74 (1994).</li><li>Llaudet, E., Hatz, S., Droniou, M., Dale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrode+biosensor+for+real-time+measurement+of+ATP+in+biological+tissue.">Microelectrode biosensor for real-time measurement of ATP in biological tissue.</a> Anal Chem. 77, 3267-3273 (2005).</li><li>Llaudet, E., Botting, N. P., Crayston, J. A., Dale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-enzyme+microelectrode+sensor+for+detecting+purine+release+from+central+nervous+system.">A three-enzyme microelectrode sensor for detecting purine release from central nervous system.</a> Biosens Bioelectron. 18, 43-52 (2003).</li><li>Cosnier, S., Lepellec, A., Guidetti, B., Isabelle, R. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+biosensor+sensitivity+in+aqueous+and+organic+solvents+using+a+combination+of+poly(pyrrole-ammonium)+and+poly(pyrrole-lactobionamide)+films+as+host+matrices.">Enhancement of biosensor sensitivity in aqueous and organic solvents using a combination of poly(pyrrole-ammonium) and poly(pyrrole-lactobionamide) films as host matrices.</a> J Electroanal Chem. 449, 165-171 (1998).</li><li>Gourine, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+control+breathing+through+pH-dependent+release+of+ATP.">Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP.</a> Science. 329, 571-575 (2010).</li><li>Kluess, H. A., Stone, A. J., Evanson, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+overflow+in+skeletal+muscle+1A+arterioles.">ATP overflow in skeletal muscle 1A arterioles.</a> J. Physiol. 588, 3089-3100 (2010).</li><li>Nishiyama, A., Jackson, K. E., Majid, D. S., Rahman, M., Navar, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+interstitial+fluid+ATP+responses+to+arterial+pressure+and+tubuloglomerular+feedback+activation+during+calcium+channel+blockade.">Renal interstitial fluid ATP responses to arterial pressure and tubuloglomerular feedback activation during calcium channel blockade.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290, H772-H777 (2006).</li><li>Jin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+renal+perfusion+pressure+on+renal+medullary+hydrogen+peroxide+and+nitric+oxide+production.">Effects of renal perfusion pressure on renal medullary hydrogen peroxide and nitric oxide production.</a> Hypertension. 53, 1048-1053 (2009).</li><li>Khan, A. S., Michael, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+consequences+of+using+micro-electrodes+and+microdialysis+probes+in+the+brain.">Invasive consequences of using micro-electrodes and microdialysis probes in the brain.</a> Trends Anal. Chem. 22, 503-508 (2003).</li></ol>

חיישנים להקלטת וידאו של כתב היד הזה נמסרו על ידי סריסה ביו-רפואי מוגבל (קובנטרי, בריטניה).

הפרוטוקולים הנוכחיים פותחו כדי לספק רזולוציה של זמן ומרחב משופר של ה- ATP ו- 2 O 2 H איתות לכליות-perfused דם מבודדים vivo לשעבר, perfused וin vivo. ההבדלים בין הפרוטוקולים והחיישנים המשמשים כאן לספק נתונים רכישה אופטימלית לשני סוכנים תרופתיים או מחקרים פיסיולוגיים. הפרוטוקולים מורכבים של 1 כיול) חיישן, 2) הליך כירורגי, 3) התקנת רכישת נתונים, ו -4) ניתוח נתונים. הם מאפשרים מדידות בזמן אמת של analytes לתנאי ניסוי רבים. זה יוביל לתובנות גדולות יותר למחל כליה והפיתוח של טיפולים תרופתיים יעילים יותר. כאן השתמשנו בחיישנים לנתח ATP ו- H 2 O 2. עם זאת, חיישנים לחומרים אחרים זמינים גם וניתן להשתמש בו. הפרוטוקולים שתוארו כאן יושמו ללמוד ATP ו- H 2 O 2 בכליות חולדה, אבל באותו methoד יכול בקלות להיות מותאם ליישום בעכברים. לפיכך, גישה זו יש פוטנציאל גדול בהתחשב בשפע של מודלים של מכרסמים גנטיים. העיצוב הבסיסי של חיישני microelectrode האנזימטית פותח בשנתי ה -1960 על ידי קלארק וליון 2. בעקבות הפיתוח הראשוני של חיישנים, התקדמות שנעשתה בשני העיצוב 17-19 ויישומי 20. Llaudet et al. 21,22 פיתח את עיצוב עיקרון חיישני ATP משמשים בפרוטוקולים הנוכחיים תוך שימוש בשיטות מet al Cosneir. 23 לציפוי האנזים. חיישנים אלה זיהו איתות ATP במספר התהליכים פיסיולוגיים כוללים שחרור ATP מהאסטרוציטים מוח 8, הסדרת נשימת 4,24, ורגולצית עורקיק שריר שלד 25. לאחרונה הפרוטוקול לשעבר vivo נעשה שימוש כדי למדוד איתות ATP בכליות 12. המטרה שלי כתב היד הזהים כדי לספק כיוונים יעילים ותובנות לזיהוי של חומרים אנדוגניים כגון ATP בכליות. יש חיישני microelectrode אנזימתי יתרונות רבים על פני אמצעים קיימים למדידת analytes in vivo. עם זאת, יש להשתמש באמצעי זהירות מיוחדת לגישה זו כמו לכל שיטה חדשה אחרת. אימות עם גישה הוקמה מספקת אמון בנתונים המתקבלים. לדוגמא, מדידות microdialysis נעשו כפי שתוארו לעיל 26,27. לא נצפה הבדל משמעותי בין ריכוזי השיא נקבעו על ידי החיישנים ואלו שהושגו מדגימות הדיאליזה 12. ההגבלה של microdialysis היא שזה רק מודד רמות מצב היציב של אנליטי. ככזה, ההערכה של שינויים דינמיים באיתות תא ניתן להשיג עם השימוש בחיישני microelectrode האנזימטית בלבד. מפרטי manufactory של זמני תגובת חיישן שונים בין החיישןסוגים. Ex vivo חיישנים יש זמן תגובה של 5-10 שניות ובחיישני vivo של 30-35 שניות לעליית אות 10-90%. עקבות הכיול (האיורים 6 ו -7) להדגים את הרזולוציה של בנוסף אנליטי / הסרת הזמן. עבור שתי גישות החיישן וmicrodialysis, השימוש באנזימים ספציפיים כדי לחסום את האות המיוצרת על ידי analytes נדרש כדי להבטיח סגוליות. יש הפרוטוקולים תיארו מספר אתגרים. כמו בכל החדרת חיישן לרקמה, נזק לרקמות מתרחשת. זה יכול להפעיל מסלולי איתות אשר עשוי להשפיע על המדידות 28. כדי למזער את הנזק לתאים, חיישנים דקים יותר יהיו צורך. עם זאת, קשה לחדור הקפסולה הכליות עם החיישנים כך מחטים המשמשות לייצור חור כניסה קטן. חיישנים דקים נוטים יותר לכופף ולשבש ציפוים על כניסה. חיישנים בקוטר גדולים יותר הם יותר עמיד וכיפוף resultaנזק NT להם ציפוי. איור 3 מראה חיישן דק ועבה. בנוסף להתנגדות של החיישן העבה לכיפוף, שהם מכילים שכבה עבה של ציפוי, מתן הגנה מוגברת לשכבה האנזימטית. החשש של נזק לרקמות שנגרמו על ידי שימוש בחיישנים עבים היה הרבה פחות בכליות מאשר שזה יהיה ברקמת המוח. עומק ההחדרה מקורב ומיקום סופי צריך להיות מאומת לאחר מדידות בכליות הושלמו. הערכה בין שכבות קורטקס ומדולה באמצעות אורך קצה החיישן כמדריך הכנסה ודי כקצה החיישן הוא 0.5 מ&quot;מ וקליפת הכליה היא 2-3 מ&quot;מ עובי. עכירות של החיישן גם מתרחשת בקצב גדול יותר בדם, ובכך להגביל את השימוש בחיישן ארוך בפרוטוקולי vivo לניסוי אחד. פעמים הקלטה של ​​1 עד 1 שעה וחצי הביאו רק להיסחף חיישן קטן. הקריטריונים העיקריים בהערכת ביצועי החיישן המופחת היא הרגישות הנמוכהלאנליטי בתהליך הכיול. רעש חשמלי מוגבר וחוסר יציבות של הבסיס הנוכחי יכולים גם להצביע על כך שקצה החיישן פגום. למדידות מדויקות של ה- ATP, שני החיישנים (ATP וריק) צריכים להיות מאפייני רעש ויציבות דומים לחיסור נוסף של האות. אחרת, אחד מהחיישנים צריך להיות מוחלף. לרעש וזיהוי של ריכוזים קטנים של אנליטי נמוכים, השימוש בחיישנים חדשים עבור כל חיה שהציע. כמה צעדים חיוניים לתוצאות ניסוי מוצלחות. החיישנים הם מאוד שבירים וצריכים להיות מטופל בזהירות כדי למנוע נזק לקצה החיישן. כמו כן, לאחר התייבשות, לא צריכים להיות חשופים החיישנים לאוויר במשך יותר מ -20 שניות. הקלטות רעש נמוכות נדרשות לזיהוי המוצלח של אותות ביולוגיים ברקמות. לשם כך, נדרש שולחן המעבדה אוויר ביצועים גבוהים והארקה חשמל תקינה. בתוספת סכומים של dur אנליטי מדויקיםing צעדי הכיול הוא הכרחי לקביעת ריכוז מדויקת בניסויים. השגת סליקה טובה של הכליות בניתוחי כליות vivo לשעבר יגרום הקלטות מוצלחות. השימוש באנזימי apyrase וcatalase בכיולים ובניסויים מאפשרים ההערכה של רגישות ספציפי חיישן ומאשר את המדידות. פרוטוקולים אלה מספקים מאוד משופרים פירוט של איתות תאית בכליות. הרגישות המשופרת והפתרון זמני שניתנה על ידי החיישנים יכולים לאפשר לנו לפתור את השינויים בATP איתות במצבי מחלה והבאים מניפולציה תרופתית שהיו בלתי ניתן לגילוי בעבר. פרוטוקול in vivo הוא גם מתאים למחקרים פיסיולוגיים מורכבים תוך vivo לשעבר הוא אופטימלי ללימוד יישומים תרופתיים בכליות. העיצוב של חיישן in vivo משמש כאן מאפשר התנגדות חסרת תקדים נגד הפרעות בblאוד-perfused רקמה. יחדיו, חיישנים אלה מציעים כמות גדולה של יישומים שקודם לכן לא היו אפשריים עם פרוטוקולים וטכניקות קיימים.

חיישני microelectrode האנזימטית (גם בהפניה כמו חיישנים בכתב היד הנוכחית) היו כלי רב ערך ללימוד תהליכי איתות דינמיים בתאים חיים ורקמות. החיישנים יספקו גדלו רזולוציה של זמן ומרחב של מולקולות איתות תא בריכוזים רלוונטיים מבחינה ביולוגית. במקום דגימה וניתוח נוזלים תאיים נלקחו במרווחים על פני תקופות זמן ארוכות, חיישנים אלה מגיבים מהר ככל האנזימים שלהם מגיבים לאנליטי, ובכך לייצר מדידות בזמן אמת 1,2. זיהוי מהיר של ריכוזי ביניים של גורמי autocrine ואוטוקריני, כמו purines או מי חמצן, ואת הדינמיקה של שחרורם ניתן להשתמש כדי להקים פרופיל להשפעות של תרופות בתנאים נורמלים ופתולוגיים 3. נכון לעכשיו, רוב היישומים באמצעות חיישנים היו בחתכי רקמת מוח ותרביות תאים 4-10. הפרוטוקולים מפורטים במטרת כתב היד הזה ללהקים את האמצעים כדי למדוד במדויק ריכוזים של analytes בכל כליות בזמן אמת. הפרוטוקולים הבאים פותחו ללמוד ATP ביניים ו- H 2 O 2 איתות בכליות. בסביבה המקורית של הכליות, ATP התאי catabolized במהירות על ידי ectonucleotidases אנדוגני לנגזרותיו (ADP, AMP ואדנוזין). החיישנים המשמשים כאן הם מאוד סלקטיבית לATP על purines אחרת או מוצרים פגומים ATP 11. זו מציעה יתרון גדול שכן היא מאפשרת ניטור מדויק של ריכוזים קבועים ודינמיים של שחרור ATP ותפקוד האיתות שלה. ריכוז ה- ATP ביניים נמדד באמצעות שילוב של שני microelectrodes, חיישן ה- ATP וחיישן ריק. חיישן ריק בשילוב עם יישומי catalase הוא מסוגל לזהות H ביניים 2 O 2 ריכוזים 12. הפרוטוקולים הבאים משתמשים בשני עיצובים שונים של הצרRS שיש להן מאפיינים אופטימליים לשני vivo לשעבר או ביישומי vivo. שני העיצובים מבוססים על התגובה קטליטי רציפה של קינאז גליצרול ומונואמין גליצרול-3-פוספט הכלול בשכבה האנזימטית חיישן ומונע על ידי הנוכחות של ה- ATP. בסט של חיישנים המשמשים במחקרי vivo לשעבר, H 2 O 2, מוצר התגובה האנזימטית הסופי, הוא זוהה על ידי חמצון על פלטינה / אירידיום אלקטרודה חוט (PT-עיר). חיישנים ללימודים בvivo מבוססים במקום על H 2 O 2 הפחתה באלקטרודה זהב מתווך מצופה מיועדת לרקמה-perfused דם. שמוצגת באיור 1 היא ערכה של שני הפרוטוקולים שתוארו בכתב היד הזה. חיישן ריק זהה לחיישן ה- ATP המקביל שלה חוץ מזה שחסר את האנזימים מחויבים. לכן, בנוסף לגילוי של H 2 O 2 עם אנזים catalase, מאה שהחיישן ריקsures הפרעות ספציפיות. ריכוזי ATP מחושבים על ידי הפחתת ריק זוהה הפרעות ספציפיות וH רקע 2 O 2 מאות חיישן ה- ATP. כמה חיישנים גם זמינים מסחרי כדי לזהות analytes האחר כוללים אדנוזין, ionosine, hypoxanthine, אצטילכולין, כולין, גלוטמט, גלוקוז, חומצת החלב, ד-סרין ליישומי vivo לשעבר או אדנוזין, ionosine, וhypoxanthine לin vivo כאשר יחד עם ריק המקביל חיישן. היכולת של החיישן לזיהוי מדויק analytes תלויה בטרום הנכון וכיולים שלאחר 13. זה מבטיח שהניתוח מהווה להיסחף ברגישות חיישן המתרחש במהלך שימוש ברקמות ביולוגיות. החיישן מחזיק מחסן של גליצרול המשמש כמגיב בתגובות אנזימטיות החיישן. אם החיישן לא נעשה שימוש בפתרונות אמבטיה המכילים גליצרול, זה יהיה לשטוף החוצה לאורך זמן. r הקצרפעמים ecording אז הם הכרחיים כדי למזער להיסחף החיישן. בנוסף חיישן עכירות על ידי פרוטאזות אנדוגני ושברי חלבון יכול להפחית את הרגישות של החיישנים 14 מאוד. כתב היד הנוכחית קובעת את השימוש בחיישני microelectrode האנזימטית לvivo לשעבר ובהכנות כליות vivo. כימות אנליטי בזמן אמת מספקת פירוט חסר תקדים של איתות תאית שעשויות לחשוף תובנות רומן לתוך המנגנונים של מחלות כליה וסוכנים תרופתיים.

<table><tbody><tr><td>Sensor Kit</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SBK-ATP-05-125</td><td>The kit includes storage bottle, rehydration chamber, electrode leads, and reference electrodes.&amp;nbsp; Also included with the kit is the user&#039;s choice of sensors.</td></tr><tr><td>Sarissaprobe ATP Biosensor 125 &amp;mu;m</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SBS-ATP-05-125</td><td>store at 2-8 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C before use</td></tr><tr><td>Sarissagold ATP Biosensor 50 &amp;mu;m</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SGS-ATP-10-50</td><td>store at 2-8 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C before use</td></tr><tr><td>Sarissaprobe null sensor 125 &amp;mu;m</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SBS-NUL-20-125</td><td>store at 2-8 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C before use</td></tr><tr><td>Sarissagold null sensor 50 &amp;mu;m</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SGS-NUL-10-50</td><td>store at 2-8 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C before use</td></tr><tr><td>Sarissaprobe ATP Manual</td><td>Sarissa Biomedical</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf&quot;&gt;http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Faraday cage&amp;nbsp;</td><td>TMC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dual channel potentiostat</td><td>Digi-Ivy</td><td>DY2021</td><td>Type II Faraday cage</td></tr><tr><td>Data acquisition program</td><td>Digi-Ivy</td><td>DY2000</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion pump</td><td>Razel Scientific Instruments</td><td>Model R99E</td><td></td></tr><tr><td>Fiber optic illuminator</td><td>Schott</td><td>ACE 1</td><td></td></tr><tr><td>micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MM-3</td><td></td></tr><tr><td>micromanipulator magnetic stand</td><td>Narishige</td><td>GJ-8</td><td></td></tr><tr><td>air table</td><td>TMC</td><td>63-500</td><td></td></tr><tr><td>isoflurane ventilator</td><td>LEI Medical</td><td>M2000</td><td></td></tr><tr><td>3 ml petri dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>S3358OA</td><td></td></tr><tr><td>needle</td><td>Santa Cruz</td><td></td><td>26-30 G</td></tr><tr><td>pins</td><td></td><td></td><td>Standard dissection pins</td></tr><tr><td>catheter</td><td></td><td></td><td>Polyethylene tubing (PE50)</td></tr><tr><td>catheter tissue glue</td><td>Vetbond</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>suture</td><td>Look</td><td>SP117</td><td></td></tr><tr><td>rubber bands</td><td></td><td></td><td>any 2-4 mm wide rubber bands</td></tr><tr><td>silicone</td><td>Momentive</td><td>RTV-615 Clear 1#</td><td></td></tr><tr><td>clamp</td><td>Fine Science Tools</td><td>18052-03</td><td></td></tr><tr><td>standard dissection kit</td><td></td><td></td><td>Kit should include scalpel and dissection sissors&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Kidney Cup</td><td></td><td></td><td>Of own design</td></tr><tr><td>standard chemicals</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6559-25UMO</td><td>100 mM ATP solution</td></tr><tr><td>hydrogen peroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Apyrase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7646</td><td></td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>isoflurane</td><td>Clipper</td><td>10250</td><td></td></tr><tr><td>inactin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T133</td><td></td></tr><tr><td>ketamine</td><td>Clipper</td><td>2010012</td><td></td></tr><tr><td>Hanks Balanced Salt Solution&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14025092</td><td></td></tr></tbody></table>

use of enzymatic biosensors to quantify endogenous atp or h2o2 in the kidney

חיישני microelectrode אנזימתי היו בשימוש נרחב כדי למדוד איתות תאית בזמן אמת. רוב השימוש בם הוגבל לפרוסות מוח ותרביות תאים עצביות. לאחרונה, טכנולוגיה זו הוחל על כל האיברים. התקדמות בתכנון חיישן שהתאפשרה המדידה של איתות תא בכליות vivo-perfused דם. הפרוטוקולים הנוכחיים רשימת הצעדים הדרושים כדי למדוד 2 O 2 איתות ATP ו- H בinterstitium כליות חולדה. שני עיצובי חיישן נפרדים המשמשים לvivo לשעבר ובפרוטוקולי vivo. שני סוגים של חיישן מצופים בbiolayer האנזימטית דק על גבי שכבת permselectivity לתת חיישנים מהירים להגיב, רגישים וסלקטיבית. שכבת permselectivity מגנה על האות מinterferents ברקמות ביולוגיות, והשכבה האנזימטית מנצלת את תגובת קטליטי רציפה של קינאז גליצרול וגליצרול-3-phosמונואמין phate בנוכחות ATP לייצר H 2 O 2. הסט של חיישנים המשמשים למחקרי vivo לשעבר זוהה נוסף אנליטי על ידי חמצון של H 2 O 2 בפלטינה / אירידיום אלקטרודה חוט (PT-עיר). החיישנים למחקרי in vivo מבוססים במקום על ההפחתה של H 2 O 2 באלקטרודה זהב מתווך מצופה מיועדת לרקמה-perfused דם. שינויי ריכוז סופיים מזוהים על ידי amperometry בזמן אמת ואחרי כיול לריכוזים ידועים של אנליטי. בנוסף, את הספציפיות של אות אמפרומטריים יכולות להיות מאושרות על ידי התוספת של אנזימים כגון catalase וapyrase כי לשבור H 2 O 2 ו- ATP בהתאמה. חיישנים אלה גם מסתמכים במידה רבה על כיולים מדויקים לפני ואחרי כל ניסוי. שני הפרוטוקולים הבאים להקים המחקר של זיהוי של ה- ATP ו- H 2 בזמן אמתO 2 ברקמות כליה, ויכול להיות שונה נוסף להאריך את השיטה המתוארת לשימוש בתכשירים ביולוגיים אחרים או כל איברים.

העיצוב של biosensor microelectrode האנזימטית מאפשר זיהוי של analytes בכל כליות בזמן אמת. עיצוב הניסוי הכללי לאו vivo לשעבר או במחקרי vivo מודגם באיור 1 חיישני .the משמשים והניתוחים שונים בהתאם אם המחקר הוא vivo לשעבר או in vivo. כדי להשיג תוצאות לשחזור, מראש מדויק וכיולי פוסט הם קריטי. איור 6 א מציג עקבות נציג של האות ראתה מחיישן ה- ATP vivo לשעבר בכיולים. שים לב שהמהירות apyrase בוטל אות ATP. היה לי catalase אין כל השפעה על אות ה- ATP ומדגים את ייחודה לH 2 O 2 הוא יוצר (איור 6). הליך הכיול מייצר ליניארי בכושר שמשמש לחישוב השינויים הדינמיים של ה- ATP (איור 6 א, פנל מימין). בviכיול חיישן VO מייצר עקבות דומות לזה של חיישן vivo לשעבר. עם זאת, חיישן זה מזהה מצמצם במקום זרמי חמצוני וככזה הנוכחיות מיוצר הוא שלילי. כיול של חיישנים אלה גם מייצר ליניארי בכושר במגוון 0.3-80 מיקרומטר (איור 7 א פנל ימני). הספציפיות של חיישן in vivo לATP על פני מוצרים אחרים פורין מוצגת באיור 7. הגישה המתוארת כאן מאפשרת לנו למדוד את שני הרמות בסיסיות של חומרים אנדוגניים ושינויים חריפים בתגובה לעירוי תרופה 12. מוצג באיור 11 הם אנג השני-induced שינויי ריכוז אנדוגני ביניים של H 2 O 2 בחולדות מלח עמיד ומלח-רגיש. בניסויים אלה, כליות מבודדות טרי מספראג Dawley (SD) או דאל חולדות מלח רגיש (SS) היו perfused עם 1 מיקרומטר אנג השני תחת זרם בלתי פוסק למינרית (650 μl / min). כshoWN באיור 11, אנג השני גורם לשחרור החריף של H 2 O 2 בכליות משני SD וחולדות SS. עם זאת, משרעת המרבית של כל תגובה היה גבוה באופן משמעותי בחולדות SS, במיוחד כאשר החיות הואכלו בדיאטה מלח גבוה 12. מוצג באיור 12 הוא יישום נציג של החיישנים in vivo. העירוי של catalase (5 מיקרוגרם / מיליליטר) החוסם לחלוטין את אות H 2 O 2 זוהתה על ידי biosensor. ניסויים אלה ממחישים את השימוש בחיישנים האנזימטית ספציפיים בשילוב עם טכניקת אמפרומטריים לזיהוי של רמות בסיס של חומרים אנדוגניים ומדידות של שחרורם בזמן אמת בתגובה להתערבות תרופתית. יישומים נוספים של גישה זו כדי ללמוד את התפקיד של איתות purinergic ומי חמצן ישפרו את הידע שלנו והבנה של פתולוגיות כליות כמו יתר לחץ דם מלח-רגיש, שור כליותלחץ idative ומחלת כליות כרונית. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53059/53059fig1.jpg" /> סכמטי באיור 1. של הפרוטוקולים. כיול עם אנליטי של עניין ובדיקה הספציפי שלו נעשה מייד לפני תחילת הניסויים. פרוטוקול in vivo צריך להיות בעקבות ניסויים פיסיולוגיים מורכבים וvivo לשעבר ליישומים תרופתיים. כיול ניסוי הודעה צריך להיעשות ונלקח בחשבון בעת ניתוח הנתונים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53059/53059fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53059/53059fig2.jpg" /> איור 2. אנזימתי microelectrode החיישן. שני<html> גדלי חיישן משמשים ליישומי vivo לשעבר מוצגים, 50 מיקרומטר ו -125 מיקרומטר קטרים. כל חוט חיישן משתרע לתוך צינור נימים להתחבר למחבר סוף הזהב (לא מוצג). הבלעה מראה קצה חיישן מצופה באנזימים לגילוי ה- ATP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53059/53059fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53059/53059fig3.jpg" /> איור 3. הערוץ הכפול potentiostat. ערוצי potentiostat כותרת CH1 וCH2. 1) CH1 חיבור חיישן ה- ATP ו- 2) CH2 קשרי ריק חיישן חיבור 3) החשמליים מצמידים את האלקטרודה ההתייחסות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53059/53059fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <html> התחת = &quot;jove_content&quot; FO: לשמור-together.within עמודים = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53059/53059fig4.jpg" /> איור 4. התקנת חיישן. רכישת הנתונים מתבצעת בכלוב פאראדיי כדי להפחית את הרעש חשמלי ועל מעבדה שולחן בעל ביצועים גבוהים למשטח עבודה ללא רעידות. 1) שולחן ניתוחים בטמפרטורה מבוקרת משמש כדי לשמור על טמפרטורת גוף של בעלי חיים בניסויים פיסיולוגיים 2) micromanipulators מצורפים למתאמי הרכבה מגנטיים למיקום גמיש של החיישנים במהלך ניסוי 3) מקור אור נחוץ לניתוחים והחדרת חיישן 4 potentiostat) הכפול ערוץ 5) בעל לחיישנים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53059/53059fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> p_upload / 53,059 / 53059fig5.jpg &quot;/&gt; איור 5. Voltammetry המחזורי. למחקרים vivo לשעבר, voltammetry המחזורית החיישן נערך במשך 10 מחזורים בין -0.5 ו -0.5 V לפני פרוטוקול הכיול. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53059/53059fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/53059/53059fig6.jpg" /> איור 6. Amperometry כיול עבור Ex Vivo. () כיול משתמש בתוספת של ריכוזי ה- ATP ידועים לפתרון האמבטיה. מתאים ערכי אמפרומטריים נרשמו ברמת אסימפטוטה (זכר שחור). הזרמים שהושגו ליצור משוואת כיול. למשל מוצג בלוח השמאלי. העקבות האדומות היא curreNT של חיישן ריק שרק מגיב לתוספת של H 2 O 2. חיישן ריק (ב) מכויל עם התוספת של H 2 O 2 ידוע ריכוזים (חצים אדומים) לפתרון האמבטיה וAsymptotes ערכי אמפרומטריים נרשמים (חיצים שחורים דקים). תוספת של catalase לפתרון האמבטיה (חץ שחור עבה) תוצאות בריקבון הנוכחי מהיר. הפנל הימני מראה את משוואת כיול חיישן ריק. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53059/53059fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/53059/53059fig7.jpg" /> איור 7. Amperometry כיול ל;. In vivo כיול in vivo אלקטרודות מבוצע באופן דומה לזה מפורט במחקרי vivo לשעבר מלבד תגובות הפחתה לגרום הפוכה נוכחית (קוטביות). (א) התוספת של ריכוזי ה- ATP ידועים מייצרת נוכחית אמפרומטריים על חיישן ה- ATP (זכר השחור) אבל אין כל השפעה על חיישן ריק (זכר אדום). תוספת של apyrase מכבה הנוכחית של חיישן ה- ATP. (ב) הספציפי של חיישן ה- ATP אושר על ידי התוספת של 10 מיקרומטר של סוכנים שונים purinergic (UTP, UDP ואדנוזין). יישומים נוספים של ה- ATP מספקים נוכחית אמפרומטריים לזיהוי יציב. (ג) Microphotograph של חיישני in vivo מבוססים על האלקטרודה זהב מתווך מצופה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53059/53059fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של figu זה</a>מחדש. <img alt="איור 8" src="/files/ftp_upload/53059/53059fig8.jpg" /> איור 8. כוסות כליות. במחקרי in vivo, כליות מתקיימות עדיין משתמשת בכוסות כליות הנירוסטה לראות. שני גדלים של כוסות משמשים כדי להתאים וריאציה גודל כליות. כוסות אלה מפחיתים את חפצי התנועה שנוצרים על ידי הנשימה של החיה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53059/53059fig8large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 9" src="/files/ftp_upload/53059/53059fig9.jpg" /> כליות מבודדות וperfused איור 9. Ex Vivo. הכליות המבודדות ממוקמת לתוך צלחת 1) פטרי מצופה סי עבהתחתון licone לסיכת החדרה 2) עורק הכליה הוא cannulated ומחובר למשאבת מזרק לזלוף הקבוע במהלך ניסוי 3) חיישן ה- ATP, 4) וחיישן ריק מוכנסים לתוך הכליות 5) האלקטרודה ההתייחסות ממוקמת באזור הכליות השקועים לפתרון האמבטיה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53059/53059fig9large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 10" src="/files/ftp_upload/53059/53059fig10.jpg" /> איור 10. בכליות perfused Vivo דם. () הכליה השמאלית חשופה והניחה בכוס כליות, הכליה הימנית נותר בשלמותה בתוך בעלי החיים. שני החיישנים מוכנסים לתוך הכליות. BSA: NaCl הוא החדיר דרך וריד הצוואר צינתור כדי לנטרל את אובדן הנוזלים גרם בy דוגמא הגדולה חתך קו אמצע (B) של ניסוי in vivo עם קטטר ביניים מושתל עבור יישומים תרופתיים ישירים 1) הכליות מוחזקות על ידי כוס כליות 2 חיישן) ATP 3) חיישן ריק ו -4) אלקטרודה התייחסות מוכנסת לתוך שטח הגחון של 5) קטטר הכליות הושתל בכליות ומחובר למשאבת peristaltic לאינפוזיות התרופתית מינרית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53059/53059fig10large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 11" src="/files/ftp_upload/53059/53059fig11.jpg" /> איור 11. אקס ניתוח Vivo של H 2 </<html> תת&gt; O 2 בכליות. זלוף אנג השני גורם H 2 O 2 שחרור בקליפת הכליה חולדה. (א) שינויים בזמן אמת של הממוצע 2 O 2 ריכוז H (פסים אפורים להראות שגיאה סטנדרטית) מהסכום כולל של N = 8 יישומים (4 כליות מ4 חולדות שונות). ברים בחלק העליון מייצגים יישום אנג השני. H המקסימלי (B) 2 O 2 ערכי המשרעת ריכוז במהלך זלוף אנג השני לספראג Dawley (SD) וחולדות דאל מלח רגיש (SS) האכילו דיאטות מלח נמוכות וגבוהות, בהתאמה. * - P &lt;0.05 לעומת חולדות SD. הדמות מותאמת התייחסות 12 באישור. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53059/53059fig11large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> /files/ftp_upload/53059/53059fig12.jpg &quot;/&gt; איור 12. בניתוח vivo של H 2 O 2. דוגמא להערכת in vivo של H 2 O 2 ביניים ריכוז בלשד של עכברוש SS קבל תזונה מלח נמוכה (כפי שמוצג באיור 10 ב). יישום ביניים של catalase באמצעות צנתר מושתל למרווח 5 דקות מיוצר מצור של אות H 2 O 2 בלשד הכליה מוחלט. הפחתה של catalase, מכישלון בזרימת דם כליות, הביאה להתאוששות חלקית של האות, שנחסמה שוב על ידי יישום נוסף catalase (10 דקות). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53059/53059fig12large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney at JoVE.com

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

Enzymatic microelectrode biosensors enable real-time measurements of extracellular cell signaling in biologically-relevant concentrations. The following protocols extend the applications of biosensors to the ex vivo and in vivo detection of ATP and H2O2 in the kidney.

שימוש באנזימתי Biosensors לכמת אנדוגני ATP או H<sub&gt; 2</sub&gt; O<sub&gt; 2</sub&gt; בכליות

Enzymatic microelectrode biosensors have been widely used to measure extracellular signaling in real-time. Most of their use has been limited to brain ...

use-enzymatic-biosensors-to-quantify-endogenous-atp-or-h2o2

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

11.9K Views.  Medical College of Wisconsin. Enzymatic microelectrode biosensors enable real-time measurements of extracellular cell signaling in biologically-relevant concentrations. The following protocols extend the applications of biosensors to the ex vivo and in vivo detection of ATP and H2O2 in the kidney. 

Video: Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including destruction of the sample, introduction of potential artifacts, and a lack of specificity for the reactive species involved. Thus, there is a current need in the field of toxicology for non-destructive, sensitive, and specific methods that can be used to observe and quantify intracellular redox perturbations, more commonly referred to as oxidative stress. Here, we present a method for the use of two genetically-encoded fluorogenic sensors, roGFP2 and HyPer, to be used in live-cell imaging studies to observe xenobiotic-induced oxidative responses. roGFP2 equilibrates with the glutathione redox potential (EGSH), while HyPer directly detects hydrogen peroxide (H2O2). Both sensors can be expressed into various cell types via transfection or transduction, and can be targeted to specific cellular compartments. Most importantly, live-cell microscopy using these sensors offers high spatial and temporal resolution that is not possible using conventional methods. Changes in the fluorescence intensity monitored at 510 nm serves as the readout for both genetically-encoded fluorogenic sensors when sequentially excited by 404 nm and 488 nm light. This property makes both sensors ratiometric, eliminating common microscopy artifacts and correcting for differences in sensor expression between cells. This methodology can be applied across a variety of fluorometric platforms capable of exciting and collecting emissions at the prescribed wavelengths, making it suitable for use with confocal imaging systems, conventional wide-field microscopy, and plate readers. Both genetically-encoded fluorogenic sensors have been used in a variety of cell types and toxicological studies to monitor cellular EGSH and H2O2 generation in real-time. Outlined here is a standardized method that is widely adaptable across cell types and fluorometric platforms for the application of roGFP2 and HyPer in live-cell toxicological assessments of oxidative stress.

This manuscript describes the use of genetically-encoded fluorogenic reporters in an application of live-cell imaging for the examination of xenobiotic-induced oxidative stress. This experimental approach offers unparalleled spatiotemporal resolution, sensitivity, and specificity while avoiding many of the shortcomings of conventional methods used for the detection of toxicological oxidative stress.

הדמיה גישות הערכות של רעילות לחץ חימצוני באמצעות חיישנים Fluorogenic מקודד גנטית

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including ...

Cancer Research

Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells

Mitochondria have roles in many cellular processes, from energy metabolism and calcium homeostasis to control of cellular lifespan and programmed cell death. These processes affect and are affected by the redox status of and ATP production by mitochondria. Here, we describe the use of two ratiometric, genetically encoded biosensors that can detect mitochondrial redox state and ATP levels at subcellular resolution in living yeast cells. Mitochondrial redox state is measured using redox-sensitive Green Fluorescent Protein (roGFP) that is targeted to the mitochondrial matrix. Mito-roGFP contains cysteines at positions 147 and 204 of GFP, which undergo reversible and environment-dependent oxidation and reduction, which in turn alter the excitation spectrum of the protein. MitGO-ATeam is a F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) probe in which the &epsilon; subunit of the FoF1-ATP synthase is sandwiched between FRET donor and acceptor fluorescent proteins. Binding of ATP to the &epsilon; subunit results in conformation changes in the protein that bring the FRET donor and acceptor in close proximity and allow for fluorescence resonance energy transfer from the donor to acceptor.

We describe the use of two ratiometric, genetically encoded biosensors, which are based on GFP, to monitor mitochondrial redox state and ATP levels at subcellular resolution in living yeast cells.

Biosensors רציומטרי שלמדוד את מצב חיזור מיטוכונדריאלי וה-ATP בתאי שמרי חיים

Mitochondria have roles in many cellular processes, from energy metabolism and calcium homeostasis to control of cellular lifespan and programmed cell ...

Bioengineering

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would not occur spontaneously. These proteins are crucial for essentially all aspects of cellular life, including metabolism, cell division, responses to environmental changes and movement. The protocol presented here describes a nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-coupled ATPase assay that has been adapted to semi-high throughput screening of small molecule ATPase inhibitors. The assay has been applied to cardiac and skeletal muscle myosin II's, two actin-based molecular motor ATPases, as a proof of principle. The hydrolysis of ATP is coupled to the oxidation of NADH by enzymatic reactions in the assay. First, the ADP generated by the ATPase is regenerated to ATP by pyruvate kinase (PK). PK catalyzes the transition of phosphoenolpyruvate (PEP) to pyruvate in parallel. Subsequently, pyruvate is reduced to lactate by lactate dehydrogenase (LDH), which catalyzes the oxidation of NADH in parallel. Thus, the decrease in ATP concentration is directly correlated to the decrease in NADH concentration, which is followed by change to the intrinsic fluorescence of NADH. As long as PEP is available in the reaction system, the ADP concentration remains very low, avoiding inhibition of the ATPase enzyme by its own product. Moreover, the ATP concentration remains nearly constant, yielding linear time courses. The fluorescence is monitored continuously, which allows for easy estimation of the quality of data and helps to filter out potential artifacts (e.g., arising from compound precipitation or thermal changes).

A nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-coupled ATPase assay has been adapted to semihigh throughput screening of small molecule myosin inhibitors. This kinetic assay is run in a 384-well microplate format with total reaction volumes of only 20 &#181;L per well. The platform should be applicable to virtually any ADP producing enzyme.

הסתגלות למחצה בתפוקה גבוהה של מעכבי הנדח ביחד לסינון מולקולה קטנה

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Biochemistry

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and allostasis. Moreover, dysregulated protease activity drives pathogenesis and is a functional biomarker of diseases such as cancer; therefore, the ability to detect protease activity in vivo may provide clinically relevant information for biomedical diagnostics. The goal of this protocol is to create nanosensors that probe for protease activity in vivo by producing a quantifiable signal in urine. These protease nanosensors consist of two components: a nanoparticle and substrate. The nanoparticle functions to increase circulation half-life and substrate delivery to target disease sites. The substrate is a short peptide sequence (6-8 AA), which is designed to be specific to a target protease or group of proteases. The substrate is conjugated to the surface of the nanoparticle and is terminated by a reporter, such as a fluorescent marker, for detection. As dysregulated proteases cleave the peptide substrate, the reporter is filtered into urine for quantification as a biomarker of protease activity. Herein we describe construction of a nanosensor for matrix metalloproteinase 9 (MMP9), which is associated with tumor progression and metastasis, for detection of colorectal cancer in a mouse model.

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Proteases are tightly regulated enzymes involved in fundamental biological processes, and dysregulated protease activity drives progression of complex diseases such as cancer. This method&#39;s goal is to create nanosensors that measure protease activity in vivo by producing a cleavage signal that is detectable from host urine and discriminates disease.

Nanosensors כדי לאתר פרוטאז פעילות In Vivo אבחון לא פולשנית

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and ...

Metabolic Mapping: Quantitative Enzyme Cytochemistry and Histochemistry to Determine the Activity of Dehydrogenases in Cells and Tissues

Altered cellular metabolism is a hallmark of many diseases, including cancer, cardiovascular diseases and infection. The metabolic motor units of cells are enzymes and their activity is heavily regulated at many levels, including the transcriptional, mRNA stability, translational, post-translational and functional level. This complex regulation means that conventional quantitative or imaging assays, such as quantitative mRNA experiments, Western Blots and immunohistochemistry, yield incomplete information regarding the ultimate activity of enzymes, their function and/or their subcellular localization. Quantitative enzyme cytochemistry and histochemistry (i.e., metabolic mapping) show in-depth information on in situ enzymatic activity and its kinetics, function and subcellular localization in an almost true-to-nature situation.
We describe a protocol to detect the activity of dehydrogenases, which are enzymes that perform redox reactions to reduce cofactors such as NAD(P)+ and FAD. Cells and tissue sections are incubated in a medium that is specific for the enzymatic activity of one dehydrogenase. Subsequently, the dehydrogenase that is the subject of investigation performs its enzymatic activity in its subcellular site. In a chemical reaction with the reaction medium, this ultimately generates blue-colored formazan at the site of the dehydrogenase&#39;s activity. The formazan&#39;s absorbance is therefore a direct measure of the dehydrogenase&#39;s activity and can be quantified using monochromatic light microscopy and image analysis. The quantitative aspect of this protocol enables researchers to draw statistical conclusions from these assays.
Besides observational studies, this technique can be used for inhibition studies of specific enzymes. In this context, studies benefit from the true-to-nature advantages of metabolic mapping, giving in situ results that may be physiologically more relevant than in vitro enzyme inhibition studies. In all, metabolic mapping is an indispensable technique to study metabolism at the cellular or tissue level. The technique is easy to adopt, provides in-depth, comprehensive and integrated metabolic information and enables rapid quantitative analysis.

Here, we present a protocol that can be used to microscopically visualize and quantify activity of dehydrogenases in cells and tissues and its kinetics, function and subcellular localization.

מיפוי מטבולית: אנזים כמותית Cytochemistry ו להסטולוגיה כדי לקבוע את הפעילות של Dehydrogenases של תאים ורקמות

Altered cellular metabolism is a hallmark of many diseases, including cancer, cardiovascular diseases and infection. The metabolic motor units of cells ...

Immunology and Infection

Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC regulates mitochondrial function and cellular energy status. Numerous reports demonstrated that the activation of PKC-a and PKC-&epsilon; improves mitochondrial function in the ischemic heart and mediates cardioprotection. In contrast, we have demonstrated that PKC-&alpha; and PKC-&epsilon; are involved in nephrotoxicant-induced mitochondrial dysfunction and cell death in kidney cells. Therefore, the goal of this study was to develop an in vitro model of renal cells maintaining active mitochondrial functions in which PKC isozymes could be selectively activated or inhibited to determine their role in regulation of oxidative phosphorylation and cell survival. Primary cultures of renal proximal tubular cells (RPTC) were cultured in improved conditions resulting in mitochondrial respiration and activity of mitochondrial enzymes similar to those in RPTC in vivo. Because traditional transfection techniques (Lipofectamine, electroporation) are inefficient in primary cultures and have adverse effects on mitochondrial function, PKC-&epsilon; mutant cDNAs were delivered to RPTC through adenoviral vectors. This approach results in transfection of over 90% cultured RPTC.
Here, we present methods for assessing the role of PKC-&epsilon; in: 1. regulation of mitochondrial morphology and functions associated with ATP synthesis, and 2. survival of RPTC in primary culture. PKC-&epsilon; is activated by overexpressing the constitutively active PKC-&epsilon; mutant. PKC-&epsilon; is inhibited by overexpressing the inactive mutant of PKC-&epsilon;. Mitochondrial function is assessed by examining respiration, integrity of the respiratory chain, activities of respiratory complexes and F0F1-ATPase, ATP production rate, and ATP content. Respiration is assessed in digitonin-permeabilized RPTC as state 3 (maximum respiration in the presence of excess substrates and ADP) and uncoupled respirations. Integrity of the respiratory chain is assessed by measuring activities of all four complexes of the respiratory chain in isolated mitochondria. Capacity of oxidative phosphorylation is evaluated by measuring the mitochondrial membrane potential, ATP production rate, and activity of F0F1-ATPase. Energy status of RPTC is assessed by determining the intracellular ATP content. Mitochondrial morphology in live cells is visualized using MitoTracker Red 580, a fluorescent dye that specifically accumulates in mitochondria, and live monolayers are examined under a fluorescent microscope. RPTC viability is assessed using annexin V/propidium iodide staining followed by flow cytometry to determine apoptosis and oncosis.
These methods allow for a selective activation/inhibition of individual PKC isozymes to assess their role in cellular functions in a variety of physiological and pathological conditions that can be reproduced in in vitro.

The effects of activation of protein kinase C (PKC) isozymes on mitochondrial functions associated with respiration and oxidative phosphorylation and on cell viability are described. The approach adapts adenoviral technique to selectively overexpress PKC isozymes in primary cell culture and a variety of assays to determine mitochondrial functions and energy status of the cell.

הערכה של פונקציות מיטוכונדריאלי וכדאיויות תא בתאי כלית overexpressing חלבון קינאז C Isozymes

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC ...

Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization

Adenosine triphosphate-hydrolyzing enzymes, or ATPases, play a critical role in a diverse array of cellular functions. These dynamic proteins can generate energy for mechanical work, such as protein trafficking and degradation, solute transport, and cellular movements. The protocol described here is a basic assay for measuring the in vitro activity of purified ATPases for functional characterization. Proteins hydrolyze ATP in a reaction that results in inorganic phosphate release, and the amount of phosphate liberated is then quantitated using a colorimetric assay. This highly adaptable protocol can be adjusted to measure ATPase activity in kinetic or endpoint assays. A representative protocol is provided here based on the activity and requirements of EpsE, the AAA+ ATPase involved in Type II Secretion in the bacterium Vibrio cholerae. The amount of purified protein needed to measure activity, length of the assay and the timing and number of sampling intervals, buffer and salt composition, temperature, co-factors, stimulants (if any), etc. may vary from those described here, and thus some optimization may be necessary. This protocol provides a basic framework for characterizing ATPases and can be performed quickly and easily adjusted as necessary.

Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization

We describe a basic protocol for quantitating in vitro ATPase activity. This protocol can be optimized based on the level of activity and requirements for a given purified ATPase.

מדידה<em&gt; במבחנה</em&gt; פעילות ATPase עבור אנזימתי אפיון

Adenosine triphosphate-hydrolyzing enzymes, or ATPases, play a critical role in a diverse array of cellular functions. These dynamic proteins can generate ...

Identification of the Source of Secreted Proteins in the Kidney by Brefeldin A Injection

Chronic kidney disease (CKD) is one of the top ten leading causes of death in the USA. Acute kidney injury (AKI), while often recoverable, predisposes patients to CKD later in life. Kidney epithelial cells have been identified as key signaling nodes in both AKI and CKD, whereby the cells can determine the course of the disease through the secretion of cytokines and other proteins. In CKD especially, several lines of evidence have demonstrated that maladaptively repaired tubular cells drive disease progression through the secretion of transforming growth factor-beta (TGF-&#946;), connective tissue growth factor (CTGF), and other profibrotic cytokines. However, identifying the source and the relative number of secreted proteins from different cell types in vivo remains challenging.
This paper describes a technique using brefeldin A (BFA) to prevent the secretion of cytokines, enabling the staining of cytokines in kidney tissue using standard immunofluorescent techniques. BFA inhibits endoplasmic reticulum (ER)-to-Golgi apparatus transport, which is necessary for the secretion of cytokines and other proteins. Injection of BFA 6 h before sacrifice leads to a build-up of TGF-&#946;, PDGF, and CTGF inside the proximal tubule cells (PTCs) in a mouse cisplatin model of AKI and TGF-&#946; in&#160;a mouse aristolochic acid (AA) model of CKD. Analysis revealed that BFA + cisplatin or BFA + AA increased TGF-&#946;-positive signal significantly compared to BFA + saline, cisplatin, or AA alone. These data suggest that BFA can be used to identify the cell type producing specific cytokines and quantify the relative amounts and/or different types of cytokines produced.

<meta charset="utf8"></head><body>זיהוי מקור החלבונים המופרשים בכליה על ידי הזרקת ברפלדין A

Identifying the cell type responsible for secreting cytokines is necessary to understand the pathobiology of kidney disease. Here, we describe a method to quantitatively stain kidney tissue for cytokines produced by kidney epithelial or interstitial cells using brefeldin A, a secretion inhibitor, and cell-type-specific markers.

זיהוי מקור החלבונים המופרשים בכליה על ידי הזרקת ברפלדין A

Chronic kidney disease (CKD) is one of the top ten leading causes of death in the USA. Acute kidney injury (AKI), while often recoverable, predisposes ...

הדמיה של מי חמצן מיטוכונדריאליים בתאי שמרים חיים באמצעות mtHyper7

Imaging of mtHyPer7, a Ratiometric Biosensor for Mitochondrial Peroxide, in Living Yeast Cells

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, cancer, and normal aging. Here, an approach is described to assess mitochondrial function in living yeast cells at cellular and subcellular resolutions using a genetically encoded, minimally invasive, ratiometric biosensor. The biosensor, mitochondria-targeted HyPer7 (mtHyPer7), detects hydrogen peroxide (H2O2) in mitochondria. It consists of a mitochondrial signal sequence fused to a circularly permuted fluorescent protein and the H2O2-responsive domain of a bacterial OxyR protein. The biosensor is generated and integrated into the yeast genome using a CRISPR-Cas9 marker-free system, for&#160;more consistent expression compared to plasmid-borne constructs.
mtHyPer7 is quantitatively targeted to mitochondria, has no detectable effect on yeast growth rate or mitochondrial morphology, and provides a quantitative readout for mitochondrial H2O2 under normal growth conditions and upon exposure to oxidative stress. This protocol explains how to optimize imaging conditions using a spinning-disk confocal microscope system and perform quantitative analysis using freely available software. These tools make it possible to collect rich spatiotemporal information on mitochondria both within cells and among cells in a population. Moreover, the workflow described here can be used to validate other biosensors.

מחבר זרקור: קידום מחקר מיטוכונדריאלי - mtHyper7 Biosensor לאנליזה תת-תאית 

Hydrogen peroxide (H2O2) is both a source of oxidative damage and a signaling molecule. This protocol describes how to measure mitochondrial H2O2 using mitochondria-targeted HyPer7 (mtHyPer7), a genetically encoded ratiometric biosensor, in living yeast. It details how to optimize imaging conditions and perform quantitative cellular and subcellular analysis using freely available software.

הדמיה של mtHyPer7, ביוסנסור רציומטרי למי חמצן מיטוכונדריאליים, בתאי שמרים חיים

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, ...

שימוש באנזימתי Biosensors לכמת אנדוגני ATP או H

Summary

Explore More Videos

הדמיה גישות הערכות של רעילות לחץ חימצוני באמצעות חיישנים Fluorogenic מקודד גנטית

Biosensors רציומטרי שלמדוד את מצב חיזור מיטוכונדריאלי וה-ATP בתאי שמרי חיים

הסתגלות למחצה בתפוקה גבוהה של מעכבי הנדח ביחד לסינון מולקולה קטנה

Nanosensors כדי לאתר פרוטאז פעילות In Vivo אבחון לא פולשנית

מיפוי מטבולית: אנזים כמותית Cytochemistry ו להסטולוגיה כדי לקבוע את הפעילות של Dehydrogenases של תאים ורקמות

הערכה של פונקציות מיטוכונדריאלי וכדאיויות תא בתאי כלית overexpressing חלבון קינאז C Isozymes

מדידה

זיהוי מקור החלבונים המופרשים בכליה על ידי הזרקת ברפלדין A

זיהוי מקור החלבונים המופרשים בכליה על ידי הזרקת ברפלדין A

הדמיה של mtHyPer7, ביוסנסור רציומטרי למי חמצן מיטוכונדריאליים, בתאי שמרים חיים