Biz bu yazıda kullanılan sensörlerin geliştirilmesi onların çalışmaları için Sarissa Biyomedikal teşekkür ederiz. Bu araştırma Ulusal Kalp, Akciğer tarafından desteklenen ve Kan Enstitüsü HL108880 (A. Staruschenko) verir, HL 116.264 (A. Cowley) ve HL 122.662 (A. Staruschenko ve A. Cowley), Tıp Koleji tarafından finanse edilen bir proje Wisconsin Araştırma İşleri Komisyonu # 9306830 (O. Palygin) ve Sağlıklı Wisconsin Araştırma ve Eğitim Programı # 9520217 ilerlemek ve Ulusal Böbrek Vakfı Genç Araştırmacı Grant (O. Palygin).

Laboratuvar Hayvanları Bakımı ve Kullanımı NIH Kılavuzu&#39;na uyulması aşağıdaki hayvan prosedürleri. Ön onay Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) elde edilmiştir. NOT: Sensör üreticisi talimatları Deneme tasarımı ve önce kendi kullanımına sırasında yapılmalıdır. Sensörler kullanırken bu talimatları sonrasında optimal sonuçlar üretecektir. 1. Sensör Kalibrasyonu <ol><li> Deneyin başlamasından önce taze stok çözümleri hazırlayın. </li><li> 10 mM NaPi tamponu, 100 mM NaCI, 1 mM MgCI2, ve 2 mM gliserol içeren tampon A oluşturur. NaOH kullanılarak 7.4&#39;e pH ayarlayın. 2-8 ° C&#39;de saklayın. </li><li> -20 ° C&#39;de saklandı stok ATP konsantrasyonu (100 mM) kullanılarak, Tampon A, 90 ul 10 ul stok eklenerek taze 10 mM ATP çözeltisi oluşturmak kalibrasyon </li><li> T içine ucu (Şekil 2) koyarak ATP sensörü rehydrate2-8 ° C&#39;de en az 10 dakika süre ile tampon A içeren da rehidrasyon odası. Not: rehidrasyon sonra, sensörler fazla 20 saniye boyunca havaya maruz kalmamalıdır veya sensör hassasiyeti azaltılabilir. Havaya uzun pozlama beklenen ise, bir gliserol çözeltisi içine kısa bir süre sensörü daldırma. Sensörler birden deneyler için kullanılabilir ancak bu sensör rehidrasyon ile aynı günde gerçekleşmelidir. Sensörler 24 saat için tampon A ile rehidrasyon odası içinde saklanabilir. </li><li> Çift kanallı potentiyostat (Şekil 3) açın ve kayıt sistemi yazılımını başlatmak. </li><li> Tampon A. Place 3 ml kalibrasyon odasına referans elektrodu ile bir kalibrasyon odasını hazırlayın. Daha sonra, rehidrasyon odasından her sensörü alın manipülatör ekleyin ve kalibrasyon odası çözüm içine yerleştirin. NOT: Bir kalibrasyon odası gibi standart silikon kaplı petri kullanın. Tüm kalibrasyonları ve st yürütmekyüksek performanslı laboratuar hava masaya bir Faraday kafesi içinde udies amperometri kayıtları (Şekil 4) sırasında sinyal gürültüsünü azaltmak için. Kalibrasyon mümkün olan en iyi şekilde veri toplama başlangıç ​​yakın yapılır. In vivo uygulamalar için kalibrasyon için en uygun zaman hayvan ameliyat sonrası iyileşme döneminde olduğunu. </li><li> Ex vivo kalibrasyon <ol><li> 10 döngü için 100 mV / sn bir hızda 500 mV -500 mV ile sensörler devirli kalibrasyon odası içinde voltametri gerçekleştirin. Bu büyük ölçüde sensör duyarlılığını arttırır. 10 döngüleri gözlenen izleri Şekil 5&#39;e bakınız. </li><li> Son döngüden sonra 600 mV sensörleri polarize. Sensör akımı bir asimptotuna bozulacaktır. Sabit bir okuma 5 dakikalık bir minimum sonra elde edilir. Sıfır okuma kaydedin. </li></ol></li><li> In vivo sensör kalibrasyonu <ol><li> In vivo senso üzerinde voltametri yapmayınrs. Bunun yerine, mV ila +500 30 saniye için kalibrasyon odasında sensörü polarize. Sonra 0 mV potansiyostatı ayarlamak ve sensör akımı bir asimptotuna yükselmesine izin verin. Sensör akımı asimptotuna en az 2 dakika sürecektir. Sıfır okuma kaydedin. </li></ol></li><li> Ardışık istenen algılama aralığı kapsayan bir kalibrasyon hattı üretmek için odasına ATP çözeltisi set miktarda ekleyebilirsiniz. ATP odasına boyunca eşit dağılır olarak ATP çözüm çürüme tarafından takip başlangıçta sensör sinyali keskin bir tepe üretir. Tutanak sinyal değerleri sinyal seviyesi bir kez. Her ATP ilavesinden sonra Şekil 6A ve 7 izlerini stabilize ve sırasıyla vivo çalışmalar hem ex vivo ve ATP konsantrasyonlarını önerdi. NOT: Bu Analitlerin temizleyiciler kullanılarak elektrotların seçiciliğini onaylamak için önemlidir. Mevcut protokol H &lt;ATP sensör ve katalaz özgünlüğünü test etmek için kullanılır apirazsub&gt; 2 O 2 sinyali (Şekil 6B). Ilaçların tatbik edilecek ise, sensör ile reaktiviteleri ölçümleri çalışma öncesi belirlenmelidir. </li><li> ATP sensörü (sıfır seviyesinin (Şekil 7) azaltmalıdır ATP uygulama tarafından üretilen akım spesifıkliğini test etmede 2 mg / ml (89 BM / mg) olan bir stok apiraz 3 ul ekle. </li><li> (2 O 2 uygulama sıfır okuma azaltmak gerekir H tarafından üretilen akım) null sensörü özgünlüğünü test etmek için 2mg / ml stok (100 UN / mg) katalaz 3 ul ekleyin. </li></ol> Sensör Araştırmalar 2. Hayvan Cerrahisi <ol><li> Ex vivo Cerrahisi <ol><li> Izofluran (% 5 indüksiyon,% 1.5 2.5 bakım) / tıbbi sınıf O 2 ya da başka bir onaylanmış yöntemle deneysel hayvan anestezisi. 12 Hayvanlar sürekli olarak anestezi yeterli düzeyde sağlanması için izlenmesi gerekir 15 &#39;. Stmümkün solunum hızı ve ayak tutam tepki uygun anestezi onaylamak için kullanılır. Onaylı IACUC protokollerine göre hayvan Euthanize: Not. Tüm hayatta olmayan prosedürlerin tamamlanmasıyla hayvanın 12 insani ölümünü sağlamak için pnömotoraks uyaran torakotomi ile derinden anestezi hayvanlar euthanize. </li><li> Sırtüstü pozisyonda sıcaklık kontrollü cerrahi masaya sıçan yerleştirin. Uygun bir anestezi derinliği muhafaza edilirken, sol böbrek doğrultusunda yaklaşık 5 sm bir orta hat kesi yapmak ve merkezden uzak karın aortu maruz kalmaktadır. </li><li> Çölyak ve superior mezenterik arterler ve bu arterlerin üzerinde abdominal aorta etrafında bitişik harfleri sarın ama Arter yok. Renal arterlerin altında abdominal aorta etrafında iki bitişik harfler sarın. </li><li> Bitişik harfler üzerinde abdominal aorta Kelepçe. Alt bitişik harfleri bağlayın. Polietilen boru (PE50) ile abdominal aorta kateter. İkinci aort ligature ile kateter sabitleyin. </li><li> Kelepçesini çıkartın ve mezenterik ve çölyak arterler Arter. Böbrek tamamen beyazlatılmış kadar 2-3 dakika süresince oda sıcaklığında Hanks Dengelenmiş Tuz Çözeltisi ile 6 ml / dk böbrek serpmek. </li><li> Aort kısmını bağlı böbrek ve kateter, tüketim. Banyo çözeltisi ile dolu bir 3 mi Petri kabı içine böbrek yerleştirin. Not: Deney protokolü, oda sıcaklığında gerçekleştirilebilir. 145 NaCl, 4.5 KCl, 2 MgCl2, 1 CaCl2, 10 HEPES, pH NaOH ile ayarlanmış 7,35: banyo çözeltisi mM içerir. </li></ol></li><li> In vivo cerrahi <ol><li> Onaylı IACUC protokolleri kullanarak sıçan anestezisi. In vivo analiz için ketamin sıçanlar (20 mg / kg im), Inactin (50 mg / kg ip) anestezi. Hayvanlar sürekli olarak anestezi yeterli düzeyde sağlanması için izlenmesi gerekir. Kararlı bir solunum hızı ve ayak tutam tepki uygun anestezi onaylamak için kullanılır. </li><li> Uygun anestezi derinliği elde sonraed, hava tablo üzerinde bulunan sıcaklık kontrollü bir topraklanmış bir yüzey üzerine sırt üstü yatırıldı sıçan yerleştirin. Yüzey önceden ısıtılmış ve 36 ° C &#39;de muhafaza edilmesi gerekir. </li><li> Uygun anestezi derinliği korurken, böbrek doğrultusunda ensizyon yaklaşık 5 cm olun. </li><li> Saptırmak ve tüm böbrek görünür şekilde deri ve deri altı doku demirlemek bir sütür kullanın. Herhangi bir hareket eserler en aza indirmek için bir böbrek fincan böbrek yerleştirin. </li><li> Kan hacmi muhafaza etmek için, jugularis damarından 1 ml / 100 g / saatlik bir% 0.9 NaCl,% 2 BSA, bir IV infüzyonu kullanın. İdrar toplama hem üreterler cannulate. Yer superior mezenterik ve çölyak arterler etrafında bağlar ve böbrek perfüzyon basıncı (Şekil 10A) manipülasyonu için uzak aortal. </li><li> Farmakolojik ajanların uygulanması in vivo deneyler sırasında gerekli ise, bir geçiş kateter yerleştirilmesi (Şekil 10B önerilir </strong&gt;). </li></ol></li></ol> 3. Veri Toplama Ayarları <ol><li> Veri toplama programını açın ve her iki ex vivo ve Anodik Pozitif in vivo deneylerde kendi polarite ayarlayın. ASCII kodu olarak verileri kaydetmek için programı ayarlayabilirsiniz. </li><li> Böbreklerin sensörler hızlı yerleştirilmesi için mikromanipülatörler yerleştirin. NOT: Alternatif olarak, sensörlerin istenen yerleşim ulaşmanıza yardımcı olmak için mikromanipülatör bağlı bir kukla prob kullanın. </li><li> Ex vivo veri toplama <ol><li> / Dakika 650 ul sabit bir oranda kanül yoluyla aort (2.1.6) banyo çözeltisi ile böbrek serpmek. Cerrahi makas kullanarak dikkatlice sensör yerleştirilmesi için gerekli olan böbrek kapsülü, kaldırın. </li><li> Lastik bantlar böbrek üzerinde sarılı ve iğnelerle silikon kaplı çanak bağlı olan böbrek sabitleyin. </li><li> Ucu batık ile petri böbrek yakın referans elektrot yerleştirintampon çözeltisi. </li></ol></li><li> In vivo veri toplama <ol><li> Bir böbrek fincan böbrek yerleştirin. Hayvanın soyu ve yaşına bağlı olarak. Gevşek böbreği tutan bardak bir boyutunu kullanmak 8 görünen programları böbrek bardak iki boyutları Şekil. Benzer bardak gibi micropuncture vs 16 böbrek işlevinin analiz odaklı farklı fizyolojik yaklaşımlar kullanılmaktadır. Böbrek fincan pozisyon hayvan nefes tarafından üretilen mekanik gürültü çıkarmak için çok önemlidir, ancak müdahale veya böbrek perfüzyon veya idrar akışını engellemeyin olmalıdır: Not. </li><li> Veri toplama gerçekleştirmeden önce iyileşme süresi 45 dakika bekleyin. </li><li> Bir 26-30G iğne kullanarak, böbrek sensörün istenen konuma ve derinlikte bir delik delme. Dönen kanı temizlemek için yüzey delik kurulayın. Böbrek yüzeyine bir gliserol çözeltisini ekleyin. Bu deney sırasında kurumasını böbrek yüzeyini önleyecektir. </li&gt; <li> Rehidrasyon odasından, ilk sensörünü çıkarın ve mikromanipülatör eklemek. Çabuk, 20 saniye içinde, böbrekte taze oluşturulan deliğe elektrot yerleştirin. Yineleyin boş sensör için 3,5-3,9 adımları. </li><li> Sensörlerden gelen gelen böbrek içine yaklaşık 1 cm referans elektrot yerleştirin. </li></ol></li><li> Potentiyostat açın ve bilgisayara kayıt programı etkinleştirin. 9 ex vivo böbrek veri toplama son kurulumunu göstermektedir. 10 eklenen bir kateter ile in vivo böbrek veri toplama son kurulumunu göstermektedir. </li></ol> 4. Veri Analizi <ol><li> Menşe veya başka bir benzer yazılım içine ASCII veri dosyasını içe aktarın. </li><li> Konsantrasyon geçerli ilişki <ol><li> Geçerli bir lineer konsantrasyon (x- ekseni) oluşturmak için ATP veya H 2 (y -Axis) ilişki lineer uyum / tahmin etmek işlevini kullanın </sub&gt; O 2 kalibrasyon noktası (Şekil 6 ve 7). doğrusal fit satır: y = mx + b </li></ol></li><li> Konsantrasyona akımı Equate </li><li> Hücre içi ATP tarafından üretilen gerçek akımı elde etmek için ATP sensörünün olanlardan boş sensörünün ölçülen izleri çıkarın. </li><li> 4.2.1 detaylı kalibrasyon denklem kullanılarak nM&#39;ye amperometri ile elde edilen pA ATP değerleri dönüştürür. &quot;X&quot; değeri her bir düzeltilmiş akımı ithal ve y (analitin konsantrasyonu) için çözerek ATP sensörünün çıkarılır veri izi konsantrasyonunu belirlemek. </li><li> Gerekirse Benzer şekilde, kalibrasyon denklemi H 2 O 2 konsantrasyonu hesaplayın. </li></ol>

<ol>
	<li>Palygin, O., Staruschenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+endogenous+substances+with+enzymatic+microelectrode+biosensors+in+the+kidney.">Detection of endogenous substances with enzymatic microelectrode biosensors in the kidney.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 305, 89-91 (2013).</li><li>Clark, L. C., Lyons, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrode+systems+for+continuous+monitoring+in+cardiovascular+surgery.">Electrode systems for continuous monitoring in cardiovascular surgery.</a> Ann N Y Acad Sci. 102, 29-45 (1962).</li><li>Haruyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-+and+nanobiotechnology+for+biosensing+cellular+responses.">Micro- and nanobiotechnology for biosensing cellular responses.</a> Adv Drug Deliv Rev. 55, 393-401 (2003).</li><li>Huckstepp, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+hemichannel-mediated+CO2-dependent+release+of+ATP+in+the+medulla+oblongata+contributes+to+central+respiratory+chemosensitivity.">Connexin hemichannel-mediated CO2-dependent release of ATP in the medulla oblongata contributes to central respiratory chemosensitivity.</a> J Physiol. 588, 3901-3920 (2010).</li><li>Lopatar, J., Dale, N., Frenguelli, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minor+contribution+of+ATP+P2+receptors+to+electrically-evoked+electrographic+seizure+activity+in+hippocampal+slices:+Evidence+from+purine+biosensors+and+P2+receptor+agonists+and+antagonists.">Minor contribution of ATP P2 receptors to electrically-evoked electrographic seizure activity in hippocampal slices: Evidence from purine biosensors and P2 receptor agonists and antagonists.</a> Neuropharmacology. 61, 25-34 (2011).</li><li>Avshalumov, M. V., Chen, B. T., Marshall, S. P., Pena, D. M., Rice, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate-dependent+inhibition+of+dopamine+release+in+striatum+is+mediated+by+a+new+diffusible+messenger,+H2O2.">Glutamate-dependent inhibition of dopamine release in striatum is mediated by a new diffusible messenger, H2O2.</a> J Neurosci. 23, 2744-2750 (2003).</li><li>Frenguelli, B. G., Wigmore, G., Llaudet, E., Dale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+mechanistic+dissociation+of+ATP+and+adenosine+release+during+ischaemia+in+the+mammalian+hippocampus.">Temporal and mechanistic dissociation of ATP and adenosine release during ischaemia in the mammalian hippocampus.</a> J. Neurochem. 101, 1400-1413 (2007).</li><li>Lalo, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocytosis+of+ATP+from+astrocytes+modulates+phasic+and+tonic+inhibition+in+the+neocortex.">Exocytosis of ATP from astrocytes modulates phasic and tonic inhibition in the neocortex.</a> PLoS Biol. 12, e1001747 (2014).</li><li>Heinrich, A., Ando, R. D., Turi, G., Rozsa, B., Sperlagh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K++depolarization+evokes+ATP,+adenosine+and+glutamate+release+from+glia+in+rat+hippocampus:+a+microelectrode+biosensor+study.">K+ depolarization evokes ATP, adenosine and glutamate release from glia in rat hippocampus: a microelectrode biosensor study.</a> Br.J Pharmacol. 167, 1003-1020 (2012).</li><li>Dale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+signaling+in+hypothalamic+tanycytes:+potential+roles+in+chemosensing.">Purinergic signaling in hypothalamic tanycytes: potential roles in chemosensing.</a> Semin Cell Dev Biol. 22, 237-244 (2011).</li><li>Gourine, A. V., Llaudet, E., Dale, N., Spyer, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release+of+ATP+in+the+ventral+medulla+during+hypoxia+in+rats:+role+in+hypoxic+ventilatory+response.">Release of ATP in the ventral medulla during hypoxia in rats: role in hypoxic ventilatory response.</a> J Neurosci. 25, 1211-1218 (2005).</li><li>Palygin, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+electrochemical+detection+of+ATP+and+H2O2+release+in+freshly+isolated+kidneys.">Real-time electrochemical detection of ATP and H2O2 release in freshly isolated kidneys.</a> Am J Physiol Renal Physiol. , (2013).</li><li>Thome-Duret, V., Gangnerau, M. N., Zhang, Y., Wilson, G. S., Reach, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+the+sensitivity+of+glucose+sensor+implanted+into+subcutaneous+tissue.">Modification of the sensitivity of glucose sensor implanted into subcutaneous tissue.</a> Diabetes Metab. 22, 174-178 (1996).</li><li>Wilson, G. S., Gifford, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensors+for+real-time+in+vivo+measurements.">Biosensors for real-time in vivo measurements.</a> Biosens. Bioelectron. 20, 2388-2403 (2005).</li><li>Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Channel+Analysis+of+TRPC+Channels+in+the+Podocytes+of+Freshly+Isolated+Glomeruli.">Single-Channel Analysis of TRPC Channels in the Podocytes of Freshly Isolated Glomeruli.</a> Methods Mol Biol. 998, 355-369 (2013).</li><li>Stockand, J. D., Vallon, V., Ortiz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+ex+vivo+analysis+of+tubule+function.">In vivo and ex vivo analysis of tubule function.</a> Compr Physiol. 2, 2495-2525 (2012).</li><li>Turner, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensors:+Fundamentals+and+applications+-+Historic+book+now+open+access.">Biosensors: Fundamentals and applications - Historic book now open access.</a> Biosens. Bioelectron. 65C, A1 (2014).</li><li>Kauffmann, J. M., Guilbault, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+electrode+biosensors:+theory+and+applications.">Enzyme electrode biosensors: theory and applications.</a> Methods Biochem Anal. 36, 63-113 (1992).</li><li>Barlett, P. N., Cooper, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+immobilization+of+enzymes+in+electropolymerized+films.">A review of the immobilization of enzymes in electropolymerized films.</a> J Electroanal Chem. 362, 1-12 (1993).</li><li>Kano, K., Morikage, K., Uno, B., Esaka, Y., Goto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+microelectrodes+for+choline+and+acetylcholine+and+their+applications.">Enzyme microelectrodes for choline and acetylcholine and their applications.</a> Anal Chim Acta. 299, 69-74 (1994).</li><li>Llaudet, E., Hatz, S., Droniou, M., Dale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrode+biosensor+for+real-time+measurement+of+ATP+in+biological+tissue.">Microelectrode biosensor for real-time measurement of ATP in biological tissue.</a> Anal Chem. 77, 3267-3273 (2005).</li><li>Llaudet, E., Botting, N. P., Crayston, J. A., Dale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-enzyme+microelectrode+sensor+for+detecting+purine+release+from+central+nervous+system.">A three-enzyme microelectrode sensor for detecting purine release from central nervous system.</a> Biosens Bioelectron. 18, 43-52 (2003).</li><li>Cosnier, S., Lepellec, A., Guidetti, B., Isabelle, R. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+biosensor+sensitivity+in+aqueous+and+organic+solvents+using+a+combination+of+poly(pyrrole-ammonium)+and+poly(pyrrole-lactobionamide)+films+as+host+matrices.">Enhancement of biosensor sensitivity in aqueous and organic solvents using a combination of poly(pyrrole-ammonium) and poly(pyrrole-lactobionamide) films as host matrices.</a> J Electroanal Chem. 449, 165-171 (1998).</li><li>Gourine, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+control+breathing+through+pH-dependent+release+of+ATP.">Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP.</a> Science. 329, 571-575 (2010).</li><li>Kluess, H. A., Stone, A. J., Evanson, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+overflow+in+skeletal+muscle+1A+arterioles.">ATP overflow in skeletal muscle 1A arterioles.</a> J. Physiol. 588, 3089-3100 (2010).</li><li>Nishiyama, A., Jackson, K. E., Majid, D. S., Rahman, M., Navar, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+interstitial+fluid+ATP+responses+to+arterial+pressure+and+tubuloglomerular+feedback+activation+during+calcium+channel+blockade.">Renal interstitial fluid ATP responses to arterial pressure and tubuloglomerular feedback activation during calcium channel blockade.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290, H772-H777 (2006).</li><li>Jin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+renal+perfusion+pressure+on+renal+medullary+hydrogen+peroxide+and+nitric+oxide+production.">Effects of renal perfusion pressure on renal medullary hydrogen peroxide and nitric oxide production.</a> Hypertension. 53, 1048-1053 (2009).</li><li>Khan, A. S., Michael, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+consequences+of+using+micro-electrodes+and+microdialysis+probes+in+the+brain.">Invasive consequences of using micro-electrodes and microdialysis probes in the brain.</a> Trends Anal. Chem. 22, 503-508 (2003).</li></ol>

Bu yazının video kaydı için Sensörler Sarissa Biyomedikal Limited (Coventry, İngiltere) tarafından sağlandı.

Mevcut protokoller ATP gelişmiş zamansal ve uzaysal çözünürlüğü sağlamak için geliştirilmiştir ve ex vivo perfüze izole ve in vivo kan perfüze böbrekler için H 2 O 2 sinyal. Protokolleri ve burada kullanılan sensörler arasındaki farklar farmakolojik ajanlar ve fizyolojik çalışmalar biri için uygun veri toplama sağlar. Protokoller 1) sensör kalibrasyonu, 2) cerrahi prosedür, 3) veri toplama kurulumu ve 4) veri analizi oluşmaktadır. Onlar çok deneysel koşullar i?...

(Aynı zamanda mevcut el yazması sensörleri olarak başvurulan) Enzimatik mikroelektrot biyosensör hücre ve dokuları, canlı, dinamik sinyal süreçleri incelemek için değerli bir araç olmuştur. Sensörler biyolojik ilgili konsantrasyonlarda hücre sinyal molekülleri zamansal ve uzaysal çözünürlüğü artmış sağlarlar. Bunun yerine örnekleme ve uzun süre boyunca aralıklarla alınan hücre dışı sıvıların analiz enzimleri analit tepki olarak, bu sensörler, böylece gerçek zamanlı ölçümleri 1,2 üreten, hızlı yanıt verir. Pürin ya da hidrojen peroksit ve bunların serbest bırakılması dinamikleri gibi otokrin ve parakrin faktörler, interstisyel konsantrasyonları hızlı tespiti, normal ve patolojik koşullarda 3 ilaçların etkileri için bir profil oluşturmak için de kullanılabilir. Şu anda, sensörler kullanılarak uygulamalar çoğunluğu beyin dokusu dilimleri ve hücre kültürlerinde 4-10 olmuştur. Bu yazının amacı ayrıntılı protokollerdoğru bütün böbreklerde analitlerin gerçek zamanlı konsantrasyonlarını ölçmek için araçlar kurar. Aşağıdaki protokoller interstisyel ATP ve H böbrekte 2 O 2 sinyal incelemek için geliştirilmiştir. Böbreğin yerli ortamında, hücre dışı ATP hızla türevleri (ADP, AMP ve adenozin) içine endojen ectonucleotidases tarafından katabolize edilir. Burada kullanılan sensör diğer pürin ATP bozunma ürünleri üzerinde 11 ATP&#39;ye son derece seçicidirler. ATP serbest bırakılması ve sinyal fonksiyonu sürekli ve dinamik konsantrasyonlarının doğru izlenmesini sağlayan bu büyük bir avantaj sunuyor. İnterstisyel ATP konsantrasyonu iki Mikroelektronlar kombinasyonu, bir ATP sensörü ve null sensörü kullanılarak ölçülür. Katalaz uygulamaları ile birlikte boş sensör interstisyel H 2 O 2 konsantrasyonu 12 tespit edebiliyor. Aşağıdaki protokoller senso iki farklı tasarımlar kullanınYa ex vivo veya in vivo uygulamalarda optimum özelliklere sahip rs. Her iki tasarım bir sensör enzimatik katmanın içerdiği gliserol kinaz ve gliserol-3-fosfat oksidaz sıralı katalitik reaksiyon dayanır ve ATP mevcudiyetinde tarafından tahrik edilir. Ex vivo çalışmalarda kullanılan sensörlerin grubu, H2O 2, son enzimatik reaksiyon ürünü olarak bir platin / iridyum (Pt-Ir) telidir ilgili oksidasyonu ile tespit edilir. In vivo çalışmalar için sensörler yerine, kan ile perfüze doku için tasarlanmış bir mediatör kaplı altın elektrot üzerinde 2 O 2 redüksiyon H dayanmaktadır. Bu yazıda anlatılan her iki protokol şeması Şekil 1&#39;de gösterilmektedir. Bu bağlanmış enzimler yoksun hariç boş sensör karşılık gelen ATP sensörü ile aynıdır. Bu nedenle, katalaz enzimi ile H2O 2 saptanmasına ek olarak, sıfır sensör meaSures nonspesifik müdahaleler. ATP konsantrasyonları Boş nonspesifik müdahaleler ve ATP sensörü sinyali arka plan H 2 O 2 algılandı çıkarılmasıyla hesaplanır. Çeşitli sensörleri ayrıca karşılık gelen Null ile eşleştirilmiş in vivo adenozin ionosine, hipoksantin, asetilkolin, kolin, glutamat, glikoz, laktat, ex vivo uygulamalar ya da adenozin ionosine d-serin ve hipoksantin gibi diğer analitler tespit etmek için ticari olarak temin edilebilir sensörü. Doğru analitlerin tespit sensörün yeteneği düzgün öncesi ve sonrası kalibrasyon 13 bağlıdır. Bu analiz, biyolojik dokularda kullanım sırasında meydana sensör hassasiyeti sürüklenme hesapları sağlar. Sensör sensör enzimatik reaksiyonlarda reaktif madde olarak kullanılan bir gliserol depo tutar. Sensör gliserol içeren banyo çözümlerinde kullanılan değilse, zamanla yıkayın olacaktır. Shorter rayıt kez o zaman sensör kayması en aza indirmek için gereklidir. Ayrıca büyük sensörlerin 14 duyarlılığını azaltabilir endojen proteazlar ve protein parçaları ile kirlenme sensör. Mevcut elyazması ex vivo ve in vivo böbrek hazırlıklarında enzimatik mikroelektrot biyosensörler kullanımını kurar. Gerçek zamanlı analit ölçümü böbrek hastalıkları ve farmakolojik ajanların mekanizmalarına yeni bakış açıları ortaya çıkarabilir hücresel sinyal görülmemiş ayrıntı sağlar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sensor Kit</td>
			<td>Sarissa Biomedical</td>
			<td>SBK-ATP-05-125</td>
			<td>The kit includes storage bottle, rehydration chamber, electrode leads, and reference electrodes.&#160; Also included with the kit is the user&#39;s choice of sensors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarissaprobe ATP Biosensor 125 &#956;m</td>
			<td>Sarissa Biomedical</td>
			<td>SBS-ATP-05-125</td>
			<td>store at 2-8 C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarissagold ATP Biosensor 50 &#956;m</td>
			<td>Sarissa Biomedical</td>
			<td>SGS-ATP-10-50</td>
			<td>store at 2-8 C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarissaprobe null sensor 125&#956;m</td>
			<td>Sarissa Biomedical</td>
			<td>SBS-NUL-20-125</td>
			<td>store at 2-8 C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarissagold null sensor 50 &#956;m</td>
			<td>Sarissa Biomedical</td>
			<td>SGS-NUL-10-50</td>
			<td>store at 2-8 C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarissaprobe ATP Manual</td>
			<td>Sarissa Biomedical</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf">http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage&#160;</td>
			<td>TMC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual channel potentiostat</td>
			<td>Digi-Ivy</td>
			<td>DY2021</td>
			<td>Type II Faraday cage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition program</td>
			<td>Digi-Ivy</td>
			<td>DY2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump</td>
			<td>Razel Scientific Instruments</td>
			<td>Model R99E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber optic illuminator</td>
			<td>Schott</td>
			<td>ACE 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MM-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>air table</td>
			<td>TMC</td>
			<td>63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane ventilator</td>
			<td>LEI Medical</td>
			<td>M2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 ml petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S3358OA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td></td>
			<td>26-30 gauge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Standard dissection pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>catheter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Polyethylene tubing (PE50)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>catheter tissue glue</td>
			<td>Vetbond</td>
			<td>1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>suture</td>
			<td>Look</td>
			<td>SP117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rubber bands</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any 2-4 mm wide rubber bands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicone</td>
			<td>Momentive</td>
			<td>RTV-615 Clear 1#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>clamp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18052-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>standard dissection kit</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kit should include scalpel and dissection sissors&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kidney Cup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Of own design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>standard chemicals</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6559-25UMO</td>
			<td>100 mM ATP solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrogen peroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apyrase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane</td>
			<td>Clipper</td>
			<td>10250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inactin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ketamine</td>
			<td>Clipper</td>
			<td>2010012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of enzymatic biosensors to quantify endogenous atp or h2o2 in the kidney

Enzimatik mikroelektrot biyosensörler yaygın gerçek zamanlı olarak hücre dışı sinyal ölçmek için kullanılmıştır. Bunların kullanımı çoğu Beyin dilimleri ve nöronal hücre kültürleri ile sınırlı olmuştur. Son zamanlarda, bu teknoloji, bütün organlara uygulanmıştır. Sensör tasarımı gelişmeler kan ile perfüze vivo böbreklerde hücre sinyallemesinin ölçüm mümkün kılmıştır. Mevcut protokoller sıçan böbrek interstisyumda ATP ve H 2 O 2 sinyalizasyon ölçmek için gereken adımları listeler. İki ayrı bir sensör tasarımları ex vivo ve in vivo protokoller kullanılır. Sensörün Her iki tür de hızlı bir yanıt, duyarlı ve seçici biyosensörler vermek üzere bir seçici geçirgenliğe tabakanın üzerine ince bir enzimatik biolayer ile kaplanır. Seçici geçirgenliğe tabakası biyolojik dokuda interferents sinyal korur ve enzimatik tabakanın gliserol kinaz ve gliserol-3-Phos sıralı katalitik reaksiyon kullanırATP varlığında phate oksidaz H2O 2 üretmek. Ex vivo çalışmalar için kullanılan sensörler grubu ayrıca bir platin / iridyum (Pt-Ir) telidir ilgili H2O 2 oksidasyonu ile analiti tespit edildi. In vivo çalışmalar için sensörler yerine, kan ile perfüze doku için tasarlanmış bir mediatör kaplı altın elektrot üzerinde H2O 2 indirgenmesi dayanmaktadır. Nihai konsantrasyon değişiklikleri analit bilinen konsantrasyonlarına kalibrasyon ardından gerçek zamanlı amperometri ile tespit edilir. Buna ek olarak, amperometrik sinyalin spesifıkliği O 2 ve ATP buna H2 parçalayan örneğin katalaz gibi enzimler ve apiraz ilavesiyle kontrol edilebilir. Bu sensörler ayrıca önce ve her bir deney sonrasında doğru kalibrasyon temeline dayanmaktadır. Aşağıdaki iki protokol ATP ve H2 Gerçek zamanlı saptama çalışma oluşturulmasıBöbrek dokularında O 2, ve daha fazla başka biyolojik karışımların veya bütün organlarda kullanım için tarif edilen yöntem genişletmek için değiştirilebilir.

Enzimatik mikroelektrot biyosensör tasarımı bütün böbreklerde analitlerin gerçek zamanlı algılanmasını sağlar. Her iki ex vivo veya in vivo çalışmalar genel deney tasarımı kullanılan Şekil 1 hayranlarıyla sensörleri gösterilmiştir ve cerrahi işlemler çalışmaya bağlı olarak farklılık ex vivo veya in vivo olduğu. Tekrarlanabilir sonuçlar, doğru öncesi ve sonrası kalibrasyon elde etmek olan kritik. ...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney at JoVE.com

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

Enzymatic microelectrode biosensors enable real-time measurements of extracellular cell signaling in biologically-relevant concentrations. The following protocols extend the applications of biosensors to the ex vivo and in vivo detection of ATP and H2O2 in the kidney.

Enzimatik Biyosensörlerin Kullanımı Endojen ATP veya H belirlememize<sub&gt; 2</sub&gt; O<sub&gt; 2</sub&gt; Böbrek

Enzymatic microelectrode biosensors have been widely used to measure extracellular signaling in real-time. Most of their use has been limited to brain ...

use-enzymatic-biosensors-to-quantify-endogenous-atp-or-h2o2

Research

JoVE Journal

Biology

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

11.8K Görüntüleme.  Medical College of Wisconsin. Enzymatic microelectrode biosensors enable real-time measurements of extracellular cell signaling in biologically-relevant concentrations. The following protocols extend the applications of biosensors to the ex vivo and in vivo detection of ATP and H2O2 in the kidney. 

Video: Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

The use of SC1 (Pluripotin) to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and activation of the LIF/JAK/STAT3 pathway is not absolutely required to maintain the self-renewal state.2 The SC1 small molecule may be an economical alternative to LIF. SC1 functions through dual inhibition of Ras-GAP and ERK1.3 Illustration of its mechanism of action makes it a useful tool to study the fundamental molecular mechanism of self-renewal. Here we demonstrate the procedure for culturing mouse ES cells in the presence of SC1 and show that they are able to maintain self-renewal in the absence of LIF. Cells cultured with SC1 showed similar morphology compared to cells maintained with LIF. Both exhibited typical mouse ES morphology after five passages. Expression of typical pluripotency markers (Oct4, Sox2, Nanog, and SSEA1) was observed after five passages in the presence of SC1. Furthermore, SC1 caused no overt toxicity on mouse ES cells.

The use of SC1 Pluripotin to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

SC1 functions through dual inhibition of Ras- GAP and ERK1. We tested the function of SC1 in supporting mouse ES cell self-renewal in the absence of LIF and showed that SC1 is able to maintain self-renewal of mouse ES cell cultures.

Kendini yenileme LIF Yokluğunda Mesc Destek SC1 (Pluripotin) kullanımı

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and ...

Biyoloji

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

Yetişkin Zebra balığı Böbrek diseksiyonu

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

Unimoleküler Biyosensörler kullanma Canlı Hücreler Olaylar Sinyal gerçek zamanlı izlenmesi için Mikroskopi FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated including macromolecular synthesis, metabolism and ultimately, commitment to the cell division cycle. The chemostat, a method of experimentally controlling cell growth rate, provides a powerful means of systematically studying how growth rate impacts cellular processes - including gene expression and metabolism - and the regulatory networks that control the rate of cell growth. When maintained for hundreds of generations chemostats can be used to study adaptive evolution of microbes in environmental conditions that limit cell growth. We describe the principle of chemostat cultures, demonstrate their operation and provide examples of their various applications. Following a period of disuse after their introduction in the middle of the twentieth century, the convergence of genome-scale methodologies with a renewed interest in the regulation of cell growth and the molecular basis of adaptive evolution is stimulating a renaissance in the use of chemostats in biological research.

Cell growth rate is a regulated process and a primary determinant of cell physiology. Continuous culturing using chemostats enables extrinsic control of cell growth rate by nutrient limitation facilitating the study of molecular networks that control cell growth and how those networks evolve to optimize cell growth.

Mikrobiyal Systems Biyoloji Chemostats Kullanımı

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Zebra balığı Nephrotoxin Mikroenjeksiyon Akut Böbrek Yaralanması Model

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and biomedical sciences. This easy to follow protocol was developed for first year undergraduate pharmacy students and provides an entry-level introduction to enzyme reactions and analytical procedures for enzyme analysis. The enzyme of choice is lactase, as this represents an example of a commercially available enzyme relevant to human disease/pharmaceutical practice. Lactase is extracted from dietary supplement tablets, and assessed using a colorimetric assay based upon hydrolysis of an artificial substrate for lactase (ortho-nitrophenol-beta-D-galactopyranoside, ONPG). Release of ortho-nitrophenol following the hydrolytic cleavage of ONPG by lactase is measured by a change in absorbance at 420 nm, and the effect of the temperature on the enzymatic reaction is evaluated by carrying out the reaction on ice, at room temperature and at 37 &#176;C. More advanced analysis can be implemented using this protocol by assessing the enzyme activity under different conditions and using different reagents.

The enzymatic activity of lactase is essential for the catabolic processing of the disaccharide lactose. Here, the activity of lactase found in dietary supplements is assayed using a colorimetric assay. This provides students with an experimental platform for understanding the activity of lactase and enzyme kinetics.

Laktaz enzim etkinliğin ölçülmesi öğretim laboratuarında

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a prerequisite for studying the physiology of the isolated organ and for many innovative applications that may be possible in the future, including perfusion decellularization for kidney bioengineering or the administration of anti-rejection or genome-editing drugs in high doses to prime the kidney for transplantation. During the time of the perfusion, the kidney can be manipulated, renal function can be assessed, and various pharmaceuticals administered. After the procedure, the kidney can be transplanted or processed for molecular biology, biochemical analysis, or microscopy.
This paper describes the perfusate and the surgical technique needed for the ex vivo perfusion of mouse kidneys. Details of the perfusion apparatus are given and data are presented showing the viability of the kidney&#39;s preparation: renal blood flow, vascular resistance, and urine data as functional, transmission electron micrographs of different nephron segments as morphological readouts, and western blots of transport proteins of different nephron segments as molecular readout.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. The buffers and surgical technique are described in detail.

Fare İzole perfüze Böbrek Tekniği

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell imaging studies. Methods for detecting RNAs have expanded greatly since seminal studies linked site-specific mRNA localization to gene expression regulation. Dynamic mRNA processes can now be visualized via approaches that detect mRNAs, coupled with microscopy set-ups that are fast enough to capture the dynamic range of molecular behavior. The molecular beacon technology is a hybridization-based approach capable of direct detection of endogenous transcripts in living cells. Molecular beacons are hairpin-shaped, internally quenched, single-nucleotide discriminating nucleic acid probes, which fluoresce only upon hybridization to a unique target sequence. When coupled with advanced fluorescence microscopy and high-resolution imaging, they enable one to perform spatial and temporal tracking of intracellular movement of mRNAs. Although this technology is the only method capable of detecting endogenous transcripts, cell biologists have not yet fully embraced this technology due to difficulties in designing such probes for live cell imaging. A new software application, PinMol, allows for enhanced and rapid design of probes best suited to efficiently hybridize to mRNA target regions within a living cell. In addition, high-resolution, real-time image acquisition and current, open source image analysis software allow for a refined data output, leading to a finer evaluation of the complexity underlying the dynamic processes involved in the mRNA&#39;s life cycle.
Here we present a comprehensive protocol for designing and delivering molecular beacons into Drosophila melanogaster egg chambers. Direct and highly specific detection and visualization of endogenous maternal mRNAs is performed via spinning disc confocal microscopy. Imaging data is processed and analyzed using object detection and tracking in Icy software to obtain details about the dynamic movement of mRNAs, which are transported and localized to specialized regions within the oocyte.

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Here, we present a protocol for the visualization, detection, analysis and tracking of endogenous mRNA trafficking in live Drosophila melanogaster egg chamber using molecular beacons, spinning disc confocal microscopy, and open-source analysis software.

Canlı Drosophila melanogaster yumurta Chambers Içinde endojen mrnas görselleştirme ve izleme

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires careful and in-depth analyses and quantification to capture as much information about the underlying events as possible. Spatial, temporal and intensity parameters intrinsic to Ca2+ signals such as frequency, duration, propagation, velocity and amplitude may provide some biological information required for intracellular signalling. High-resolution Ca2+ imaging typically results in the acquisition of large data files that are time consuming to process in terms of translating the imaging information into quantifiable data, and this process can be susceptible to human error and bias. Analysis of Ca2+ signals from cells in situ typically relies on simple intensity measurements from arbitrarily selected regions of interest (ROI) within a field of view (FOV). This approach ignores much of the important signaling information contained in the FOV. Thus, in order to maximize recovery of information from such high-resolution recordings obtained with Ca2+dyes or optogenetic Ca2+ imaging, appropriate spatial and temporal analysis of the Ca2+ signals is required. The protocols outlined in this paper will describe how a high volume of data can be obtained from Ca2+ imaging recordings to facilitate more complete analysis and quantification of Ca2+ signals recorded from cells using a combination of spatiotemporal map (STM)-based analysis and particle-based analysis. The protocols also describe how different patterns of Ca2+ signaling observed in different cell populations in situ can be analyzed appropriately. For illustration, the method will examine Ca2+ signaling in a specialized population of cells in the small intestine, interstitial cells of Cajal (ICC), using GECIs.

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Genetically encoded Ca2+ indicators (GECIs) have radically changed how in situ Ca2+ imaging is performed. To maximize data recovery from such recordings, appropriate analysis of Ca2+ signals is required. The protocols in this paper facilitate the quantification of Ca2+ signals recorded in situ using spatiotemporal mapping and particle-based analysis.

Kendisinin geçici eşleme ve parçacık analiz teknikleri intrasellüler Ca sinyal2 + in Situ ölçmek için uygulamaları

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires ...

The Use of the Patch-Clamp Technique to Study the Thermogenic Capacity of Mitochondria

Mitochondrial thermogenesis (also known as mitochondrial uncoupling) is one of the most promising targets for increasing energy expenditure to combat metabolic syndrome. Thermogenic tissues such as brown and beige fats develop highly specialized mitochondria for heat production. Mitochondria of other tissues, which primarily produce ATP, also convert up to 25% of the total mitochondrial energy production into heat and can, therefore, have a considerable impact on the physiology of the whole body. Mitochondrial thermogenesis is not only essential for maintaining the body temperature, but also prevents diet-induced obesity and reduces the production of reactive oxygen species (ROS) to protect cells from oxidative damage. Since mitochondrial thermogenesis is a key regulator of cellular metabolism, a mechanistic understanding of this fundamental process will help in the development of therapeutic strategies to combat many pathologies associated with mitochondrial dysfunction. Importantly, the precise molecular mechanisms that control acute activation of thermogenesis in mitochondria are poorly defined. This lack of information is largely due to a dearth of methods for the direct measurement of uncoupling proteins. The recent development of patch-clamp methodology applied to mitochondria enabled, for the first time, the direct study of the phenomenon at the origin of mitochondrial thermogenesis, H+ leak through the IMM, and the first biophysical characterization of mitochondrial transporters responsible for it, the uncoupling protein 1 (UCP1), specific of brown and beige fats, and the ADP/ATP transporter (AAC) for all other tissues. This unique approach will provide new insights into the mechanisms that control H+ leak and mitochondrial thermogenesis and how they can be targeted to combat metabolic syndrome. This paper describes the patch-clamp methodology applied to mitochondria to study their thermogenic capacity by directly measuring H+ currents through the IMM.

This method article details the main steps in measuring H+ leak across the inner mitochondrial membrane with the patch-clamp technique, a new approach to study the thermogenic capacity of mitochondria.

Mitokondrinin Termojenik Kapasitesini İncelemek için Yama-Kelepçe Tekniğinin Kullanımı

Mitochondrial thermogenesis (also known as mitochondrial uncoupling) is one of the most promising targets for increasing energy expenditure to combat ...

Methods Article

Enzimatik Biyosensörlerin Kullanımı Endojen ATP veya H belirlememize