Name: Serie: Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney
Uploaded: 2015-10-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: 11.8K Aufrufe. Medical College of Wisconsin. Enzymatic microelectrode biosensors enable real-time measurements of extracellular cell signaling in biologically-relevant concentrations. The following protocols extend the applications of biosensors to the ex vivo and in vivo detection of ATP and H2O2 in the kidney.

Wir schätzen Sarissa Biomedical für ihre Arbeit bei der Entwicklung der in der vorliegenden Manuskript verwendeten Sensoren. Diese Forschung wurde von der National Heart, Lung unterstützt, and Blood Institute gewährt HL108880 (A. Staruschenko), HL 116264 (A. Cowley) und HL 122662 (A. Staruschenko und A. Cowley), ein Projekt des Medical College of finanziert Wisconsin Komitee Forschung Angelegenheiten # 9306830 (O. Palygin) und Vorschieben eines gesünderen Wisconsin Forschungs- und Ausbildungsprogramm # 9520217, und das Young Investigator Grants des National Kidney Foundation (O. Palygin).

Folgende Tierverfahren im Rahmen der NIH Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren eingehalten werden. Vorherige Genehmigung wurde von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) erhalten. HINWEIS: Lesen der Sensorherstellers soll während des Versuchs-Design und vor ihrer Verwendung erfolgen. Im Anschluss an diese Anweisungen werden optimale Ergebnisse zu erzielen, wenn Sie die Sensoren. 1. Sensorkalibrierung <ol><li> Frische Stammlösungen vor dem Beginn des Experiments. </li><li> Erstellen Puffer A enthaltend 10 mM NaPi-Puffer, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl 2 und 2 mM Glycerin. Den pH-Wert auf 7,4 unter Verwendung von NaOH. Bei 2-8 ° C. </li><li> Mit Hilfe eines Aktien ATP-Konzentration (100 mM) bei -20 ° C gelagert werden, erstellen Sie einen frischen 10 mM ATP Kalibrierungslösung durch Zugabe von 10 &amp; mgr; l Lager bis 90 &amp; mgr; l Puffer A </li><li> Rehydrieren die ATP-Sensor durch Anordnen seiner Spitze (2) in ter Rehydratisierung Kammer mit Puffer A für mindestens 10 min bei 2-8 ° C. HINWEIS: Nach Rehydratisierung sollten die Sensoren nicht der Luft für mehr als 20 Sekunden ausgesetzt werden, oder die Empfindlichkeit des Sensors verringert werden. Wenn Langzeitbelichtungen, um Luft zu erwarten sind, tauchen Sie den Sensor kurz in eine Lösung von Glycerin. Die Sensoren können für mehrere Experimente verwendet werden, aber diese müssen auf dem gleichen Tag wie Sensor Rehydratisierung auftreten. Die Sensoren können in der Rehydratisierung Kammer mit Puffer A bis zu 24 Stunden gelagert werden. </li><li> Schalten Sie den Dual-Channel-Potentiostaten (Abbildung 3) und starten Sie die Aufnahme-System-Software. </li><li> Eine Eichkammer mit 3 ml Puffer A Legen Sie die Referenz-Elektrode in die Eichkammer. Nehmen Sie jede Sensor aus der Rehydrierung Kammer, dann verbinden Sie es mit dem Manipulator und fügen diesen in die Kalibrierkammer Lösung. HINWEIS: Verwenden Sie eine Standard-Silikon beschichtete Petrischale als Kalibrierkammer. Führen Sie alle Kalibrierungen und studies in einem Faradayschen Käfig auf einem Hochleistungslabor Lufttisch um das Signalrauschen während der Amperometrie-Aufnahmen (Abbildung 4) zu reduzieren. Kalibrierungen werden am besten so nah an den Beginn der Datensammlung wie möglich durchgeführt. Für die in vivo-Anwendungen der optimale Zeitpunkt für die Kalibrierung ist bei der Tier Erholung nach der Operation Zeitraum. </li><li> Ex-vivo-Kalibrierung <ol><li> Zuführen Cyclovoltammetrie in der Kalibrierungskammer durch zyklisches die Sensoren von -500 mV bis +500 mV mit einer Geschwindigkeit von 100 mV / sec für 10 Zyklen. Dies die Empfindlichkeit der Sensoren erheblich verbessert. Siehe Figur 5 für die aus den 10 Zyklen beobachtet Spuren. </li><li> Polarisieren der Sensoren an +600 mV nach dem letzten Zyklus. Der Sensorstrom wird zu einer Asymptote zerfallen. Eine stetige Lektüre wird nach einem Minimum von 5 Minuten erreicht. Notieren Sie den Nullwert. </li></ol></li><li> In-vivo-Sensor-Kalibrierung <ol><li> Nicht die zyklische Voltammetrie auf die in vivo Senso auszuführenrs. Stattdessen polarisieren den Sensor in der Eichkammer 30 sec bis +500 mV. Setzen Sie dann die Potentiostaten auf 0 mV und lassen Sie den Sensorstrom zu einer Asymptote steigen. Der Sensorstrom ist mindestens 2 min auf Asymptote zu nehmen. Notieren Sie den Nullwert. </li></ol></li><li> Nacheinander hinzuzufügen Satz Mengen an ATP-Lösung in die Kammer, um eine Kalibrierungslinie umfasst eine gewünschte Erfassungsbereich zu erzeugen. Die ATP-Lösung erzeugt eine scharfe Spitze in dem Sensorsignal zunächst, gefolgt von einem Verfall wie der ATP diffundiert gleichmäßig in der Kammer. Nehmen Signalwerte, sobald der Signalpegel nach jedem ATP zusätzlich stabilisiert. 6A und 7 zeigen Spuren und schlug vor, ATP-Konzentrationen sowohl für ex vivo und in vivo Studien auf. HINWEIS: Es ist wichtig, um die Selektivität der Elektroden mit Hilfe Fängern der Analyten zu bestätigen. Die vorliegende Protokoll Apyrase, um die Spezifität des ATP-Sensor und Katalase für die H &lt;testensub&gt; 2 O 2 Signal (6B). Wenn Medikamente verabreicht werden sollen, sollten Messungen ihrer Reaktivität mit den Sensoren vor der Untersuchung bestimmt werden. </li><li> In 3 ul Apyrase aus einem Vorrat von 2 mg / ml (89 UN / mg), um die Spezifität des ATP-Sensor (der Strom, der durch ATP-Anwendung hergestellt werden, sollten zu dem Null-Niveau (Abbildung 7) reduzieren zu testen. </li><li> In 3 ul von Katalase aus einem Vorrat von 2 mg / ml (100 UN / mg), um die Spezifität der Null-Sensor (der Strom, der durch H 2 O 2 produziert Anwendung sollte auf den Nullwert zu reduzieren) zu testen. </li></ol> 2. Tierchirurgie für Sensor Studies <ol><li> Chirurgie für ex vivo <ol><li> Betäuben das Versuchstier mit Isofluran (5% Induktion, 1,5 bis 2,5% Wartung) / Klasse O 2 medizinische oder einer anderen zugelassenen Methode. 15 &#39;12 Tiere müssen ständig überwacht werden, um ein angemessenes Niveau der Anästhesie zu gewährleisten. StLage Atemfrequenz und toe Prise Reaktion verwendet werden, um angemessene Betäubung bestätigen. Hinweis: Euthanize das Tier nach anerkannten IACUC Protokolle. Bei Vollendung aller nicht überleben Verfahren euthanize tief narkotisierten Tieren durch Thorakotomie Induzieren Pneumothorax den humanen Tod des Tieres 12 zu gewährleisten. </li><li> Legen Sie die Ratte auf einem temperaturgesteuerten Operationstisch in Rückenlage. Und gleichzeitig eine angemessene Narkosetiefe, einen Mittellinienschnitt von ca. 5 cm im Einklang mit der linken Niere und setzen die distalen abdominalen Aorta. </li><li> Wickeln Sie ein Ligatur um die Zöliakie und mesenterica superior Arterien und der Bauchaorta oberhalb dieser Arterien, aber nicht unterbinden. Wickeln zwei Ligaturen um die Bauchaorta unterhalb der Nierenarterien. </li><li> Klemmen Sie die Bauchaorta oberhalb der Ligaturen. Binden Sie das untere Blattschraube. Katheterisierung der abdominalen Aorta mit Polyethylenschlauch (PE50). Sichern Sie den Katheter mit dem zweiten Aorta Ligatur. </li><li> Entfernen Sie die Klemme und ligieren die mesenterialen und Zöliakie Arterien. Perfusion der Niere bei 6 ml / min mit Hanks Balanced Salt Solution bei RT für 2-3 min, bis die Niere vollständig blanchiert. </li><li> Auszuschneiden der Niere und des Katheters verbundene Abschnitt der Aorta. Legen Sie die Niere in einen 3 ml Petrischale mit Bad-Lösung gefüllt. Hinweis: Experiment-Protokoll kann bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Die Badlösung enthält in mM: 145 NaCl, 4,5 KCl, 2 MgCl 2, 1 CaCl 2, 10 HEPES, pH 7,35 mit NaOH eingestellt. </li></ol></li><li> Chirurgie für In-vivo- <ol><li> Betäuben die Ratte mit zugelassenen IACUC Protokolle. Zur in vivo-Analyse betäuben die Ratten mit Ketamin (20 mg / kg im) und Inactin (50 mg / kg ip). Die Tiere müssen ständig überwacht werden, um eine angemessene Gabe von Betäubungsmitteln zu gewährleisten. Eine stabile Atemfrequenz und toe Prise Reaktion verwendet werden, um angemessene Betäubung bestätigen. </li><li> Nach entsprechender Anästhesietiefe zu erhaltened, legen Sie die Ratte in Rückenlage auf einer temperierten geerdeten Oberfläche auf dem Lufttisch entfernt. Sollte die Oberfläche vorgewärmt und bei 36 ° C gehalten werden. </li><li> Unter Beibehaltung richtige Narkosetiefe, stellen einen Mittellinienschnitt etwa 5 cm im Einklang mit der Niere. </li><li> Verwenden eines Fadens abgelenkt und verankern die kutanen und subkutanen Gewebe, so dass die gesamte Niere sichtbar ist. Legen Sie die Niere in einer Niere cup, alle Bewegungsartefakte zu minimieren. </li><li> Verwenden eine IV Infusion von 2% BSA 0,9% NaCl mit 1 ml / 100 g / h über die Jugularvene um das Blutvolumen aufrecht zu erhalten. Kanülieren beide Harnleiter zur Urinsammlung. Platz Krawatten um den mesenterica superior und Zöliakie Arterien und die distale Aorta für die Manipulation von renalen Perfusionsdruck (10A). </li><li> Wenn die Anwendung pharmakologischer Mittel ist während der in-vivo-Experimente benötigt wird Einführen eines interstitiellen Katheter empfohlen (10B </strong&gt;). </li></ol></li></ol> 3. Datenerfassung einrichten <ol><li> Öffnen Sie das Datenerfassungsprogramm und stellen Sie die Polarität sowohl für ex vivo und in vivo-Experimente an anodische Positive. Stellen Sie das Programm, um Daten als ASCII-Code zu speichern. </li><li> Positionieren Sie die Mikromanipulatoren zum schnellen Einsetzen der Sensoren in die Nieren. HINWEIS: Alternativ können Sie einen Dummy-Sonde mit dem Mikromanipulator angebracht, um zur Verwirklichung der gewünschten Anordnung von Sensoren. </li><li> Ex vivo Datenerfassungs- <ol><li> Perfusion der Niere mit Badlösung (ab 2.1.6) über den kanülierten Aorta bei einer konstanten Rate von 650 ul / min. Verwendung chirurgische Scheren, entfernen Sie vorsichtig die Nierenkapsel, die für Sensor Insertion erforderlich ist. </li><li> Sichern die Niere mit Gummibändern über die Niere umreift und mit Silikon beschichteten Schale mit Stiften befestigt. </li><li> Platzieren der Referenzelektrode in der Nähe der Niere in die Petrischale mit ihrer Spitze in Submersdie Pufferlösung. </li></ol></li><li> In-vivo-Datenerfassung <ol><li> Legen Sie die Niere in einer Niere Tasse. Je nach Belastung und Alter des Tieres mit einem Größe der Tasse, die die Niere locker hält. Abbildung 8 zeigt zwei Größen von Nierenschalen. Ähnliche Becher sind für verschiedene physiologische Ansätze auf der Analyse der Nierenfunktion fokussiert wie micropuncture etc 16 eingesetzt. Anmerkung: Die Position der Nieren Schale ist entscheidend, um die mechanischen Geräusche durch das Tier erzeugte Atem zu entfernen, aber nicht stören oder blockieren Nierenperfusion oder Urinflusses. </li><li> Lassen Sie 45 Minuten Erholungszeit, bevor die Datenerfassung. </li><li> Mit Hilfe eines 26-30G Nadel, machen Sie eine Einstichloch an der gewünschten Stelle und Tiefe des Sensors in der Niere. Tupfen Sie die Oberfläche Loch exsudiert Blut zu entfernen. Hinzufügen Glycerinlösung auf die Oberfläche der Niere. Dies wird die Nierenfläche vor dem Austrocknen während des Experiments zu verhindern. </li&gt; <li> Entfernen Sie den ersten Sensor von der Rehydrierung Kammer und befestigen Sie es an den Mikromanipulator. Schnell, innerhalb von 20 Sekunden, legen Sie die Elektrode in die frisch erstellten Loch in der Niere. Die Schritte 3,5-3,9 für das Null-Sensor. </li><li> Legen Sie die Referenzelektrode in die Niere, ca. 1 cm von der Sensoren. </li></ol></li><li> Einschalten des Potentiostaten und Aktivieren der Aufzeichnungsprogramm auf dem Computer, Fig. 9 zeigt die endgültige Konfiguration des ex vivo Nierendatenerfassung, Fig. 10 zeigt die endgültige Konfiguration des in vivo Nierendatenerfassung mit einem eingeführten Katheter. </li></ol> 4. Datenanalyse <ol><li> Importieren Sie die ASCII-Datendatei in Origin oder ähnliche Software. </li><li> Konzentration aktuelle Verhältnis <ol><li> Verwenden Sie die lineare Anpassung / extrapolieren-Funktion, um eine lineare Konzentration (x-Achse), um Strom zu bauen (y-Achse) Beziehung für die ATP oder H 2 </sub&gt; O 2 Kalibrierungspunkten (6 und 7). linearen Ausgleichsgeraden: y = mx + b </li></ol></li><li> Gleichzusetzen, um die aktuelle Konzentration </li><li> Subtrahieren der gemessenen Spuren des Nullsensor von denen der ATP-Sensor, um die tatsächliche durch intrazelluläres ATP erzeugten Strom zu erhalten. </li><li> Konvertieren Sie die ATP-Werte in pA durch Amperometrie an nM unter Verwendung des Kalibrierungsgleichung in 4.2.1 beschrieben. Bestimmen Sie die Konzentration des subtrahiert Datenspur des ATP-Sensor durch den Import jedes eingestellten Strom in den &quot;x&quot; -Wert und Auflösen nach y (die Konzentration des Analyten). </li><li> Genauso werden H 2 O 2 -Konzentration von seinem Kalibrierungsgleichung, wenn nötig. </li></ol>

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Sensoren für die Videoaufzeichnung dieser Handschrift wurden von Sarissa Biomedical Limited (Coventry, UK) zur Verfügung gestellt.

Die vorliegenden Protokolle wurden entwickelt, um eine verbesserte zeitliche und räumliche Auflösung der ATP bereitzustellen und H 2 O 2 Signalisierung für ex vivo isolierten, perfundierten und in vivo durchbluteten Niere. Die Differenzen zwischen den Protokollen und den hier verwendeten Sensoren liefern eine optimale Datenerfassung entweder für pharmakologische Mittel oder physiologische Studien. Protokolle bestehen aus 1) Sensorkalibrierung, 2) chirurgische Verfahren, 3) Datenerfassung...

Enzymatische Mikroelektroden-Biosensoren (auch als Sensoren in der vorliegenden Handschrift verwiesen wird) haben ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung dynamischer Signalprozesse in lebenden Zellen und Geweben. Die Sensoren liefern in biologisch relevanten Konzentrationen erhöhten zeitlichen und räumlichen Auflösung von Zellsignalmoleküle. Anstelle der Entnahme und Analyse extrazellulären Flüssigkeiten in Intervallen über einen langen Zeitraum angewendet, reagieren diese Sensoren so schnell ihre Enzyme reagieren mit dem Analyten, wodurch Echtzeitmessungen 1,2. Schnelle Erkennung von interstitiellen Konzentrationen von autokrinen und parakrinen Faktoren wie Purine oder Wasserstoffperoxid und die Dynamik ihrer Freisetzung kann verwendet werden, um ein Profil für die Wirkungen von Arzneimitteln in normalen und pathologischen Bedingungen 3 einzurichten. Derzeit haben die meisten Anwendungen mit Sensoren in der Hirngewebeschnitten und Zellkulturen 4-10 gewesen. Die in dieser Handschrift Ziel, ausführliche Protokollelegen die Mittel zur Echtzeit-Konzentrationen von Analyten in Voll Nieren genau zu messen. Die folgenden Protokolle wurden entwickelt, um interstitielle ATP und H 2 O 2 Signalisierung in den Nieren zu untersuchen. In der natürlichen Umgebung der Niere wird die extrazelluläre ATP schnell von endogenen ectonucleotidases in seine Derivate (ADP, AMP und Adenosin) abgebaut. Die hier verwendeten Sensoren sind sehr selektiv, um ATP über andere Purine oder ATP-Abbauprodukte 11. Dies bietet einen großen Vorteil, denn sie ermöglicht eine genaue Überwachung der konstanten und dynamischen Konzentrationen von ATP-Freisetzung und ihre Signalfunktion. Interstitielle ATP-Konzentration wird unter Verwendung der Kombination von zwei Mikroelektroden, eine ATP-Sensor und einem Null-Sensor gemessen. Die Null-Sensor in Kombination mit Katalase-Anwendungen in der Lage ist interstitiellen H erkennen 2 O 2 -Konzentrationen 12. Die folgenden Protokolle verwenden zwei verschiedene Designs sensors, die Eigenschaften optimal für die beiden ex vivo oder in vivo-Anwendungen haben. Beide Ausführungen beruhen auf dem sequentiellen katalytische Umsetzung von Glycerinkinase und Glycerin-3-phosphat-Oxidase in einer Sensorschicht enthalten enzymatische und wird durch die Anwesenheit von ATP angetrieben. In dem Satz von Sensoren in den ex-vivo-Studien verwendet werden, H 2 O 2, dem letzten enzymatischen Reaktionsproduktes durch Oxidation auf einer Platin / Iridium (Pt-Ir) Drahtelektrode detektiert. Sensoren für In-vivo-Studien sind stattdessen auf H auf einem Mediator beschichteten Goldelektrode durchbluteten Gewebes entwickelt auf der Basis 2 O 2 -Reduktion. In 1 ist ein Schema der beiden in dieser Handschrift beschriebenen Protokollen. Die Null-Sensor ist identisch mit dem entsprechenden ATP-Sensor, außer es die gebundenen Enzyme fehlen. Daher kann, zusätzlich zu der Erfassung des H 2 O 2 mit dem Enzym Katalase, die Null-Sensor mealeistet unspezifische Interferenzen. ATP-Konzentrationen werden durch Subtrahieren der Null erfaßt unspezifische Störungen und Hintergrund H 2 O 2 aus der ATP-Sensorsignal berechnet. Mehrere Sensoren sind ebenfalls im Handel erhältlich, um andere Analyte einschließlich Adenosin, ionosine, Hypoxanthin, Acetylcholin, Cholin, Glutamat, Glucose, Lactat, D-Serin für die ex vivo-Anwendungen oder Adenosin, ionosine und Hypoxanthin für in vivo zu detektieren, wenn in Kombination mit dem entsprechenden Null Sensors. Die Fähigkeit des Sensors zur Analyten genau zu erfassen, hängt von der korrekten Vor- und Nach- Kalibrierungen 13. Dies stellt sicher, dass die Analyse berücksichtigt die Drift der Sensorempfindlichkeit, die beim Einsatz in biologischen Geweben auftritt. Der Sensor enthält ein Depot von Glycerin, das als Reagens bei der Sensor enzymatischen Reaktionen verwendet wird. Wenn der Sensor nicht in Badlösungen mit Glycerin verwendet wird, wird er im Laufe der Zeit ausgewaschen. Kürzere rufnehmen Zeiten sind dann notwendig, um die Sensordrift zu minimieren. Zusätzlich Sensor Bewuchs durch endogene Proteasen und Proteinfragmente können die Empfindlichkeit der Sensoren 14 stark vermindert. Die vorliegende Manuskript stellt die Verwendung von Mikroelektroden enzymatische Biosensoren zur ex vivo und in vivo-Nieren Zubereitungen. Echtzeit-Analyt-Quantifizierung bietet beispiellose Detail der zellulären Signaltransduktion, die neue Einblicke in die Mechanismen von Nierenerkrankungen und pharmakologische Mittel zu offenbaren kann.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sensor Kit</td>
			<td>Sarissa Biomedical</td>
			<td>SBK-ATP-05-125</td>
			<td>The kit includes storage bottle, rehydration chamber, electrode leads, and reference electrodes.&#160; Also included with the kit is the user&#39;s choice of sensors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarissaprobe ATP Biosensor 125 &#956;m</td>
			<td>Sarissa Biomedical</td>
			<td>SBS-ATP-05-125</td>
			<td>store at 2-8 C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarissagold ATP Biosensor 50 &#956;m</td>
			<td>Sarissa Biomedical</td>
			<td>SGS-ATP-10-50</td>
			<td>store at 2-8 C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarissaprobe null sensor 125&#956;m</td>
			<td>Sarissa Biomedical</td>
			<td>SBS-NUL-20-125</td>
			<td>store at 2-8 C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarissagold null sensor 50 &#956;m</td>
			<td>Sarissa Biomedical</td>
			<td>SGS-NUL-10-50</td>
			<td>store at 2-8 C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarissaprobe ATP Manual</td>
			<td>Sarissa Biomedical</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf">http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage&#160;</td>
			<td>TMC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual channel potentiostat</td>
			<td>Digi-Ivy</td>
			<td>DY2021</td>
			<td>Type II Faraday cage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition program</td>
			<td>Digi-Ivy</td>
			<td>DY2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump</td>
			<td>Razel Scientific Instruments</td>
			<td>Model R99E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber optic illuminator</td>
			<td>Schott</td>
			<td>ACE 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MM-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>air table</td>
			<td>TMC</td>
			<td>63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane ventilator</td>
			<td>LEI Medical</td>
			<td>M2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 ml petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S3358OA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td></td>
			<td>26-30 gauge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Standard dissection pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>catheter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Polyethylene tubing (PE50)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>catheter tissue glue</td>
			<td>Vetbond</td>
			<td>1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>suture</td>
			<td>Look</td>
			<td>SP117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rubber bands</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any 2-4 mm wide rubber bands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicone</td>
			<td>Momentive</td>
			<td>RTV-615 Clear 1#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>clamp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18052-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>standard dissection kit</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kit should include scalpel and dissection sissors&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kidney Cup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Of own design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>standard chemicals</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6559-25UMO</td>
			<td>100 mM ATP solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrogen peroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apyrase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane</td>
			<td>Clipper</td>
			<td>10250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inactin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ketamine</td>
			<td>Clipper</td>
			<td>2010012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of enzymatic biosensors to quantify endogenous atp or h2o2 in the kidney

Enzymatische Mikro Biosensoren wurden weit verbreitet verwendet, um extrazelluläre Signalisierung in Echtzeit zu messen. Die meisten von ihr Einsatz zu Hirnschnitten und neuronalen Zellkulturen beschränkt. In jüngerer Zeit hat diese Technologie auf den ganzen Organen angewendet wurden. Fortschritte in der Sensordesign haben die Messung der Zellsignalisierung in durchbluteten Niere in vivo ermöglicht. Die vorliegenden Protokolle listen die erforderlichen Schritte, um ATP und H 2 O 2-Signalisierung in der Rattenniere Interstitium zu messen. Zwei separate Sensorkonstruktionen werden für die ex vivo und in vivo-Protokolle verwendet. Beide Sensortypen sind mit einer dünnen enzymatische Bioschicht auf einer Permselektivität Schicht überzogen, um schnell reagieren, empfindliche und selektive Biosensoren zu geben. Die Permselektivität Schicht schützt das Signal von den Interferenten in biologischem Gewebe, und die enzymatische Schicht die sequentielle katalytische Umsetzung von Glycerinkinase und Glycerin-3-phos nutztphosphat-Oxidase in Gegenwart von ATP, um H 2 O 2 zu produzieren. Der Satz von Sensoren für die Ex-vivo-Studien verwendet weiteren nachgewiesenen Analyten durch Oxidation von H 2 O 2 auf einer Platin / Iridium (Pt-Ir) Drahtelektrode. Die Sensoren für die in-vivo-Untersuchungen werden stattdessen auf die Reduktion von H 2 O 2 auf einen Mediator beschichteten Goldelektrode für bluteten Gewebe ausgelegt beruht. Endkonzentration Änderungen werden durch Echtzeit-Amperometrie gefolgt von Kalibrierung auf bekannte Konzentrationen des Analyten nachgewiesen. Zusätzlich kann die Spezifität des amperometrischen Signals durch den Zusatz von Enzymen wie Katalase und Apyrase, die unten H 2 O 2 und ATP entsprechend brechen zu bestätigen. Diese Sensoren stützen sich auch stark auf genaue Kalibrierungen vor und nach jedem Experiment. Die folgenden zwei Protokolle bauen das Studium der Echtzeit-Detektion von ATP und H 2O 2 in Nierengewebe, und kann weiter modifiziert werden, um die beschriebenen Verfahren zur Verwendung in anderen biologischen Präparaten oder ganzen Organen zu verlängern.

Das Design der enzymatischen Mikroelektroden-Biosensor ermöglicht die Echtzeit-Detektion von Analyten in ganzen Nieren. Die allgemeinen Versuchsplanung für die beiden ex vivo oder in vivo-Studien in 1 .Die verwendeten Sensoren veranschaulicht und die chirurgischen Verfahren davon ab, ob die Studie je ist ex vivo oder in vivo. Um reproduzierbare Ergebnisse, präzise vor und nach der Kalibrierung zu erhalten, sind kritisch. 6A zeigt eine</s...

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Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

Enzymatic microelectrode biosensors enable real-time measurements of extracellular cell signaling in biologically-relevant concentrations. The following protocols extend the applications of biosensors to the ex vivo and in vivo detection of ATP and H2O2 in the kidney.

Verwendung enzymatischer Biosensoren auf endogenes ATP oder H Quantifizieren<sub&gt; 2</sub&gt; O<sub&gt; 2</sub&gt; In der Niere

Enzymatic microelectrode biosensors have been widely used to measure extracellular signaling in real-time. Most of their use has been limited to brain ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

11.8K Aufrufe.  Medical College of Wisconsin. Enzymatic microelectrode biosensors enable real-time measurements of extracellular cell signaling in biologically-relevant concentrations. The following protocols extend the applications of biosensors to the ex vivo and in vivo detection of ATP and H2O2 in the kidney. 

Serie: Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect protease activity uses casein labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC) as the substrate.
Protease activity results in the cleavage of the FITC-labeled casein substrate into smaller fragments, which do not precipitate under acidic conditions. After incubation of the protease sample and substrate, the reaction is acidified with the addition of trichloroacetic acid (TCA). The mixture is then centrifuged with the undigested substrate forming a pellet and the smaller, acid soluble fragments remaining in solution. The supernatant is neutralized and the fluorescence of the FITC-labeled fragments is measured.
The described kit procedure detects the trypsin protease control at a concentration of approximately 0.5 &mu;g/ml (5 ng of trypsin added to the assay). This sensitivity can be increased with a longer incubation time, up to 24 hours. The assay is performed in microcentrifuge tubes and procedures are provided for fluorescence detection using either cuvettes or multiwell plates.

The Protease Fluorescent Detection Kit is designed for the measurement of protease activity using fluorometry. It is also suitable for detection of trace amounts of protease contamination. The method is based on the proteolytic hydroysis of a proprietary formulation of a FITC-labeled casein substrate.

Die Nutzung der Protease Fluorescent Detection Kit für Protease-Aktivität zu bestimmen

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

Forschung

Biologie

The use of SC1 (Pluripotin) to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and activation of the LIF/JAK/STAT3 pathway is not absolutely required to maintain the self-renewal state.2 The SC1 small molecule may be an economical alternative to LIF. SC1 functions through dual inhibition of Ras-GAP and ERK1.3 Illustration of its mechanism of action makes it a useful tool to study the fundamental molecular mechanism of self-renewal. Here we demonstrate the procedure for culturing mouse ES cells in the presence of SC1 and show that they are able to maintain self-renewal in the absence of LIF. Cells cultured with SC1 showed similar morphology compared to cells maintained with LIF. Both exhibited typical mouse ES morphology after five passages. Expression of typical pluripotency markers (Oct4, Sox2, Nanog, and SSEA1) was observed after five passages in the presence of SC1. Furthermore, SC1 caused no overt toxicity on mouse ES cells.

The use of SC1 Pluripotin to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

SC1 functions through dual inhibition of Ras- GAP and ERK1. We tested the function of SC1 in supporting mouse ES cell self-renewal in the absence of LIF and showed that SC1 is able to maintain self-renewal of mouse ES cell cultures.

Die Verwendung von SC1 (Pluripotin) zu MESC Self-Erneuerung in der Abwesenheit von LIF-Support

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

Präparation des Adult Zebrafisch Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

FRET-Mikroskopie zur Echtzeit-Überwachung der Signalisierung Events in lebenden Zellen mit unimolekularen Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated including macromolecular synthesis, metabolism and ultimately, commitment to the cell division cycle. The chemostat, a method of experimentally controlling cell growth rate, provides a powerful means of systematically studying how growth rate impacts cellular processes - including gene expression and metabolism - and the regulatory networks that control the rate of cell growth. When maintained for hundreds of generations chemostats can be used to study adaptive evolution of microbes in environmental conditions that limit cell growth. We describe the principle of chemostat cultures, demonstrate their operation and provide examples of their various applications. Following a period of disuse after their introduction in the middle of the twentieth century, the convergence of genome-scale methodologies with a renewed interest in the regulation of cell growth and the molecular basis of adaptive evolution is stimulating a renaissance in the use of chemostats in biological research.

Cell growth rate is a regulated process and a primary determinant of cell physiology. Continuous culturing using chemostats enables extrinsic control of cell growth rate by nutrient limitation facilitating the study of molecular networks that control cell growth and how those networks evolve to optimize cell growth.

Der Einsatz von Chemostate in Microbial Systems Biology

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

Analyse der Nephron Zusammensetzung und Funktion im erwachsenen Zebrafisch Nieren

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nephrotoxin Mikroinjektion in Zebrabärbling akuten Nierenschädigung zu Modell

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and biomedical sciences. This easy to follow protocol was developed for first year undergraduate pharmacy students and provides an entry-level introduction to enzyme reactions and analytical procedures for enzyme analysis. The enzyme of choice is lactase, as this represents an example of a commercially available enzyme relevant to human disease/pharmaceutical practice. Lactase is extracted from dietary supplement tablets, and assessed using a colorimetric assay based upon hydrolysis of an artificial substrate for lactase (ortho-nitrophenol-beta-D-galactopyranoside, ONPG). Release of ortho-nitrophenol following the hydrolytic cleavage of ONPG by lactase is measured by a change in absorbance at 420 nm, and the effect of the temperature on the enzymatic reaction is evaluated by carrying out the reaction on ice, at room temperature and at 37 &#176;C. More advanced analysis can be implemented using this protocol by assessing the enzyme activity under different conditions and using different reagents.

The enzymatic activity of lactase is essential for the catabolic processing of the disaccharide lactose. Here, the activity of lactase found in dietary supplements is assayed using a colorimetric assay. This provides students with an experimental platform for understanding the activity of lactase and enzyme kinetics.

Messung der Laktase enzymatische Aktivität in das Lehrlabor

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a prerequisite for studying the physiology of the isolated organ and for many innovative applications that may be possible in the future, including perfusion decellularization for kidney bioengineering or the administration of anti-rejection or genome-editing drugs in high doses to prime the kidney for transplantation. During the time of the perfusion, the kidney can be manipulated, renal function can be assessed, and various pharmaceuticals administered. After the procedure, the kidney can be transplanted or processed for molecular biology, biochemical analysis, or microscopy.
This paper describes the perfusate and the surgical technique needed for the ex vivo perfusion of mouse kidneys. Details of the perfusion apparatus are given and data are presented showing the viability of the kidney&#39;s preparation: renal blood flow, vascular resistance, and urine data as functional, transmission electron micrographs of different nephron segments as morphological readouts, and western blots of transport proteins of different nephron segments as molecular readout.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. The buffers and surgical technique are described in detail.

Die Maus isoliert perfundierten Nieren-Technik

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell imaging studies. Methods for detecting RNAs have expanded greatly since seminal studies linked site-specific mRNA localization to gene expression regulation. Dynamic mRNA processes can now be visualized via approaches that detect mRNAs, coupled with microscopy set-ups that are fast enough to capture the dynamic range of molecular behavior. The molecular beacon technology is a hybridization-based approach capable of direct detection of endogenous transcripts in living cells. Molecular beacons are hairpin-shaped, internally quenched, single-nucleotide discriminating nucleic acid probes, which fluoresce only upon hybridization to a unique target sequence. When coupled with advanced fluorescence microscopy and high-resolution imaging, they enable one to perform spatial and temporal tracking of intracellular movement of mRNAs. Although this technology is the only method capable of detecting endogenous transcripts, cell biologists have not yet fully embraced this technology due to difficulties in designing such probes for live cell imaging. A new software application, PinMol, allows for enhanced and rapid design of probes best suited to efficiently hybridize to mRNA target regions within a living cell. In addition, high-resolution, real-time image acquisition and current, open source image analysis software allow for a refined data output, leading to a finer evaluation of the complexity underlying the dynamic processes involved in the mRNA&#39;s life cycle.
Here we present a comprehensive protocol for designing and delivering molecular beacons into Drosophila melanogaster egg chambers. Direct and highly specific detection and visualization of endogenous maternal mRNAs is performed via spinning disc confocal microscopy. Imaging data is processed and analyzed using object detection and tracking in Icy software to obtain details about the dynamic movement of mRNAs, which are transported and localized to specialized regions within the oocyte.

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Here, we present a protocol for the visualization, detection, analysis and tracking of endogenous mRNA trafficking in live Drosophila melanogaster egg chamber using molecular beacons, spinning disc confocal microscopy, and open-source analysis software.

Visualisierung und Verfolgung endogenes mRNAs in Live Drosophila melanogaster Eierkammern

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...

Verwendung enzymatischer Biosensoren auf endogenes ATP oder H Quantifizieren

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