Name: Video: Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers
Uploaded: 2015-10-31T14:00:00
Duration: 20 min

MA fue apoyado por una beca de Schrödinger del Fondo austríaco Ciencia (FWF, J3086-B11) y gracias al Max-Planck-Sociedad para el apoyo financiero y administrativo. GS fue apoyado por el Fondo de Ciencia y Tecnología de Viena (WWTF, LS13-030). JH fue apoyado por el Fondo de Ciencia y Tecnología de Viena (WWTF, LS14-031).

1. Generación y funcionalización de planar SLBS <ol><li> La mezcla de los lípidos <ol><li> Para llegar a una DGS NTA-Ni / 90% composición lipídica POPC 10% se disuelven 45 mg de POPC y 6,9 mg DGS NTA-Ni en cloroformo en un matraz de 250 ml de fondo redondo. Mantenga el volumen de baja cloroformo (sólo varios ml) se evapore en el siguiente paso. Para una DGS NTA-Ni / 99% composición de lípidos POPC 1% utilizar 49,5 mg y 0,69 mg POPC DGS NTA-Ni. </li><li> Eliminar el cloroformo utilizando un evaporador rotatorio lentamente - un aumento por encima de la temperatura ambiente no es necesario. Alternativamente, soplar fuera dentro de una campana química en una corriente de gas inerte tal como nitrógeno o argón. Mientras se hace girar constantemente este matraz para permitir la igualdad de deposición del lípido secado en la mitad inferior del matraz de fondo redondo. </li><li> Una vez que se evaporó la mayor parte del cloroformo, adjuntar el matraz para aspirar O / N para eliminar el cloroformo cuantitativamente. NOTA: Este paso es fundamental para evitar la contaminaciónde proteínas y células con cloroformo tóxico en las etapas posteriores y para asegurar la fluidez de la bicapa lipídica. </li></ol></li><li> Generación de pequeñas vesículas unilaminares (SUV) de lípidos secos NOTA: pequeñas vesículas unilaminares (SUVs) son entre 20 nm y 100 nm de diámetro y se pueden producir fácilmente por tratamiento con ultrasonidos de baño. Extrusión de lípidos, un método alternativo, puede dar lugar a SUVs y, dependiendo del tamaño de poro del filtro aplicado para la extrusión, también vesículas unilamelares grandes (LUV), que son 100 nm a 1000 nm de tamaño. Sin embargo, todo terrenos son los más adecuados para la formación de SLBS. <ol><li> SUVs través de ultrasonidos de baño (que se muestran en el video): <ol><li> Desgasifique PBS. Suspender la mezcla de lípidos seca con los 250 ml matraz de fondo redondo de 10 ml desgasificado PBS. </li><li> Llenar el matraz con gas inerte tal como nitrógeno o argón, cerrarlo con un tapón y sellar el matraz con cinta de autoclave. </li><li> Coloque el frasco cerrado en un baño de ultrasonido y sonicar el lípido suspensión unt 120 a 170 W hasta que se ha vuelto clara. Esto toma entre 30 y 60 min. </li><li> Monitorear el progreso de la vesícula formación espectro-fotometría: derivarse que la absorción de la emulsión sin diluir en comparación con PBS se mantiene constante a 234 nm (como un indicador aproximado de la concentración de lípidos) todavía debe bajar de manera significativa a 550 nm (debido a una menor dispersión de la luz a través de partículas más grandes). </li><li> Para sedimentar las vesículas unilamelares no pesados, que interfieren con la formación de un SLB contigua, sedimentar la suspensión de vesículas por centrifugación, a 150.000 xg durante 1 hora a 25 ° C y luego durante 8 horas a 288.000 xg, 4 ° C. </li><li> Filtrar el sobrenadante a través de un filtro de jeringa con un diámetro de poro de 0,2 micras. </li><li> Medir la DO a 234 nm y 550 nm para controlar la claridad de la preparación de vesículas y la cantidad de lípidos izquierda. </li><li> Guarde las vesículas a 4 ° C en atmósfera de argón o nitrógeno. Opcionalmente, utilice suspensión de vesículas bicapa para la preparación depor muchos meses. </li></ol></li><li> SUVs mediante extrusión de lípidos: <ol><li> En resumen, pasar la suspensión de lípidos varias veces a través de un filtro con un tamaño de poro de 0,1 micras. Independientemente del método de fabricación, centrifugar la suspensión de vesículas dos veces (1H, 150,000g, 25 ° C; a continuación, 8H, 4 ° C, 288.000 g) para sedimentar las vesículas no unilamelares que son más pesados. NOTA: Cuando se almacena a 4 ° C bajo gas inerte, las vesículas se pueden utilizar para la preparación bicapa durante varios meses. </li></ol></li></ol></li><li> Formación de un SLB y cargar con la proteína <ol><li> Tratar 24 x 50 mm # 1.5 portaobjetos de vidrio con una mezcla 3: 1 de ácido sulfúrico concentrado y peróxido de hidrógeno al 30% durante 30 min. NOTA: Debido a la naturaleza agresiva de la mezcla tome un cuidado especial, es decir, llevar una bata de laboratorio y gafas de seguridad como se muestra en el video! </li><li> Enjuagar los portaobjetos de vidrio bajo una corriente de ddH2O fuera de una botella con atomizador. Colóquelos en un soporte de teflón y déjelos secardurante 10 a 30 min. </li><li> Retire la placa de vidrio inferior de 8 o 16 cámaras así, llenar el fondo con pegamento epoxi y coloque cuidadosamente un portaobjetos de vidrio limpio y seco en el fondo de la cámara de cola cubierta. Deje que el pegamento se endurezca durante aproximadamente 10 min. Retire el exceso de pegamento de la parte inferior. NOTA: un sello hermético entre el portaobjetos de vidrio y la cámara también se puede lograr fácilmente con el uso de un de dos componentes dental pasta de modelar de silicona, que se endurece dentro de 10 a 30 min. Este sello no es tan firme como el pegamento epoxi, pero resiste la tensión física regular. Después del experimento se puede retirar fácilmente de la cámara, que luego es reutilizable en futuros experimentos. </li><li> Pipetear 120 l (60μl) de una suspensión de lípidos veces 10 diluida PBS-en cada pocillo de un niño de 8 (16) - así cámara (preparado como se ha descrito anteriormente) y dejar que la forma bicapa durante 20 min. Enjuagar cuidadosamente la bicapa dos veces con 15 ml de PBS. Una vez se ha formado la bicapa, siempre debe estar sumergida en tampón y nunca se expone al aire. </li&gt; <li> Llene cada pocillo hasta el final con PBS, luego despegar 330μl (cámara de 8 pocillos) o 165μl (cámara de 16 pocillos). Hay 350μl (175μl) dejó en el pozo. Añadir 50 l (25 l) de cóctel que contiene proteínas etiquetadas-His diluido en PBS a cada pocillo (400 o 200 l final) y se incuba a TA durante 60 min en la oscuridad. La densidad de proteína de la superficie se puede ajustar mediante la variación de la concentración de proteína durante esta etapa de incubación. </li><li> Enjuague cada pocillo dos veces con 15 ml de PBS. NOTA: Por lo general, SLBS se debe utilizar en los experimentos de no más de 6 horas después de su carga con la proteína. Durante este periodo, la recuperación después de photobleaching fluoróforo permanece hasta el 95% y sin pérdida de la proteína asociada a la bicapa se puede detectar. La densidad de la proteína debe ser determinado antes del experimento (véase a continuación). </li><li> Paso opcional: Para probar la unión no específica de la proteína de la DGS NTA-Ni que contiene SLB, lavar el SLB una vez con PBS que contiene imidazol 300 mM. El PROproteína debe salir por completo. </li></ol></li></ol> 2. Microscopio de instalación <ol><li> Para la construcción de un sistema de microscopía capaz de detectar la fluorescencia de fluorocromos individuales consulte las recomendaciones indicadas en la introducción. </li></ol> 3. Mediciones Eléctricas NOTA: Los fluoróforos pueden ser fácilmente saturados con el exceso de luz de excitación. Esto acelera fotoblanqueo sin mayor ganancia en emisión y debe evitarse tanto. Para optimizar la iluminación de la muestra la densidad de potencia de excitación debe ser medido directamente en el espécimen. Tales mediciones pueden también servir como una referencia para futuros experimentos. Además, conociendo la relación entre la potencia de entrada y de salida de láser es útil al evaluar donde la luz se pierde en el sistema de imágenes. <ol><li> Mover el haz de excitación a la posición vertical para que salga el objetivo en un ángulo de 90 °. </li><li> Coloque la cabeza del medidor de potencia en la parte superior of la viga y medir la potencia del haz (= P). Documentar el resultado. </li><li> Utilizando el periscopio, gire el haz en la posición TIRF y la imagen de una bicapa fluorescente homogéneo intacta. Para evitar la decoloración y la saturación de la señal CCD lugar una densidad neutra (ND) del filtro con una densidad óptica (DO) de 2 a 3 en la trayectoria de la luz de excitación. <ol><li> Mida las cuentas integradas de todo el campo iluminado (= I total). Además, medir el tamaño de la zona iluminada (= A total). Medir las cuentas integradas (= I Center) del punto central de máxima iluminación, así como el tamaño del punto (= a centro). </li></ol></li><li> Mida la señal de fondo por píxel (= B) o bien fuera de la zona iluminada o sin iluminación de la muestra. </li><li> Reste la señal de fondo a partir de los resultados medidos en 3.). Para ello, multiplicando el número de píxeles de la zona en cuestión (área entera iluminada o punto central) con el fondocuentas por píxel. (= I Total - A .B totales y yo Center - Un centro .B). </li><li> Divida el integrado y corrección de fondo de la señal del punto central de la señal integrada y fondo con corrección de todo el campo de la iluminación. NOTA: El resultado indica la fracción de la potencia total situado dentro del punto central (= (centro I - Un centro .B) / (I Total - A .B total)). Multiplicación de este resultado con el P potencia medida en 2.) resultados en el poder de la luz que ilumina el punto central. </li><li> Determine el tamaño de la mancha Un centro en μm². Por esta dividir el tamaño de píxel cámara en micras por el aumento del objetivo, toma la plaza del resultado como μm² por píxel. <ol><li> Alternativamente medir el tamaño de píxel dentro de la imagen con el uso de una diapositiva micrómetro colocado en el microscopio y tomar el cuadrado de la zona de resultado como por píxel. Multiply este valor por el número de píxeles situados dentro del punto central para llegar a la zona de punto iluminado. </li></ol></li><li> Dividir la potencia P que ilumina el punto central por el tamaño del punto central de un centro, μm² para calcular la intensidad de iluminación por 2 micras. Un ejemplo se da en la figura 6. </li><li> Valores de densidad de potencia medidos en la iluminación no TIRF suelen ser inferiores a los presentes en la iluminación TIRF 13, que también depende del ángulo exacto en el que la luz láser está totalmente reflejada. Para llegar a densidades de potencia presentes bajo iluminación TIRF, imagen calibrada perlas fluorescentes de diámetro 0.1μm tanto en no TIRF y TIRF. La relación de intensidades de fluorescencia del grano medido en TIRF y el modo no TIRF asciende a el factor de conversión C, que permite la conversión de los valores de densidad de potencia medidos en los efectivos bajo iluminación TIRF (ecuación 1). Densidad de poder </em&gt; TIRF = C • densidad de potencia no TIRF (ecuación 1) con C = intensidad del grano T IRF intensidad / perlas no TIRF </li></ol> 4. Densidad Las mediciones <ol><li> Determinar la señal media de los fluoróforos individuales situados en una bicapa. Moléculas MHC bicapa unida cargadas con péptidos fluorescentes son ideales para este propósito ya que la proteína: etiqueta estequiometría es exactamente una. Si lejía necesaria todas las etiquetas de la bicapa en el campo de visión y dejar que la fluorescencia se recuperan de visualizar fluoróforos individuales. <ol><li> Graba imágenes en rápida sucesión (por ejemplo, se aplican una adquisición de streaming de protocolo) y supervisar las moléculas individuales de movilidad en varios marcos. Para obtener más información consulte la Figura 7. </li></ol></li><li&gt; Marque el punto central de la iluminación dentro de la bicapa como retorno de la inversión. Medir el ROI, la variación en densidad de potencia de iluminación (que es proporcional a la intensidad de fluorescencia) debe ser idealmente menos de 15%. <ol><li> Determinar sola molécula y fluorescencia mayor sólo dentro de este retorno de la inversión. Integrar la señal de un retorno de la inversión, que es lo suficientemente grande como para capturar el 99% o más de la función de dispersión de punto del único emisor. Cuando se emplea una cámara con un tamaño de píxel de 16-20 de micras (indicado en las especificaciones de la cámara del fabricante), un objetivo con un aumento de 100 veces y una abertura numérica igual o mayor que 1,45, tome una región de 7 por 7 píxeles con el pico de intensidad situado en el centro de la plaza. </li><li> Para determinar la señal de fondo, integrar los cargos de un cuadrado de 7 por 7 pixel vecino, que no contiene una señal de fluorescencia. Reste el fondo de la señal de moléculas individuales para determinar el valor corregido para una sola molécula de flúorescencia. Seleccionar sólo las señales, que son todavía visibles en el siguiente cuadro. </li></ol></li><li> Repita el paso 4.2 cincuenta a varios cientos de veces. Un promedio de la señal de fondo con corrección. Si lo desea, trazar valores de intensidad de una sola molécula como un histograma. Opcional: tomar ventaja de un plugin adecuado de paquetes de software de código abierto (por ejemplo ImageJ) o procesar los datos utilizando un software comercial (por ejemplo Metamorph, Molecular Devices). Los usuarios experimentados pueden escribir su propio programa de análisis en Matlab o paquetes de software similares. </li><li> Coloque un filtro de densidad neutra de 2 o más alto en el camino de excitación y tomar imágenes de una bicapa fluorescente que contiene proteínas marcadas con el mismo fluoróforo. Anote la intensidad media de píxeles dentro de la misma ROI utilizado para mediciones de la intensidad de una sola molécula. Registre el tiempo de exposición de las medidas de fluorescencia a granel. Mida el mismo lugar sin iluminación para la sustracción de fondo. </li><li> Para determinar la densidad de proteína dentro de la bicapa, multiplicar la intensidad de píxel media de fluorescencia mayor fondo corregida determinada en la etapa 4 por el número de píxeles por cuadrado micras (por ejemplo, 41.5), por 100 (si se emplea un filtro ND con una DO de 2) o 1.000 (si un ND se utilizó filtro con un diámetro exterior de 3) y el tiempo de exposición utilizada en el paso 2 y se divide por la media de la señal única molécula determinada en el paso 3, el tiempo de exposición utilizada en el paso 2 y el número de fluoróforos por proteína. </li></ol> 5. Prueba de la integridad de la bicapa <ol><li> Preparar una bicapa fluorescente y colocarlo en la platina del microscopio como se describe anteriormente. </li><li> Ajuste el enfoque y tome la imagen de la bicapa en modo TIRF. Aplicar un corto pero intenso pulso de blanqueador en modo no TIRF para la ablación de la fluorescencia en un pequeño retorno de la inversión en forma de disco. </li><li> Tome una imagen de la bicapa en el modo de baja intensidad TIRF inmediatamente después del blanqueo y luego cada cinco a diez segundos para controlar la velocidad de recuperación de fluorescencia. </li><li> Move a un área diferente de la bicapa y siga los pasos 2 y 3. Tome otra imagen en el modo de TIRF baja intensidad 5 min después del impulso de lejía. Determinar la intensidad he puesto blanqueador en el área de lejía y lo comparo con la intensidad antes de blanquear I 0 al comienzo del experimento (sin blanqueo debería haber ocurrido) para calcular la fracción inmóvil (SI) de la siguiente manera: Fracción inmóvil IF (%) = (I 0 - Puedo publicar lejía) / (I 0 - fondo) x 100, con el fondo = intensidad medida en el retorno de la inversión sin luz de excitación aplicada El IF debe ser inferior a 10% (idealmente menos de 5%). </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen ningún interés financiero en competencia.

Microscopía sola molécula ofrece la oportunidad única de estudiar el comportamiento de las proteínas dentro de su entorno celular nativo. La imagen molecular se convierte, por tanto, cada vez más atractivo a una amplia comunidad científica, sin embargo, muchos científicos de la vida todavía se esconden de la inversión inicial en tecnología y experiencia. El principal beneficio que surge de montaje de la propia sistema de imágenes es que se puede ajustar fácilmente a las necesidades específicas de cualquier persona. Como se sugiere en este documento una TIRF no haz de excitación se puede implementar fácilmente, además de una trayectoria de la luz TIRF existente, si se desea la foto-blanqueamiento rápido y definido (o-activación) de fluoróforos y ligandos, por ejemplo, cuando se realiza FRAP o ligando experimentos uncaging 14 . La introducción de un divisor de haz de emisión permite la grabación simultánea de al menos dos y en algunos casos hasta cuatro canales fluorescentes. La lista de extensiones es, en esencia, sólo limitado porla propia imaginación. Por ejemplo, la implementación de una rueda de filtros de emisión motorizado en la vía de emisión permite el cambio rápido entre hasta diez canales fluorescentes diferentes. Cuando se combinan dos motorizados ruedas de filtros de emisión (cada una equipada con ranuras 10 de filtro) en la serie, hasta 18 canales fluorescentes puede ser leída. Formación de imágenes basada en TIRF se puede complementar con mediciones de la movilización del calcio y la interferencia Reflexión Microscopy (IRM) después de la integración de un camino de excitación de la lámpara de Xenón o Mercurio. IRM es el método de elección para visualizar el grado en el cual las células se unen a la superficie de cristal o un SLB y por lo tanto pueden proporcionar información crítica al interpretar los datos de imagen basados ​​en TIRF. El establecimiento de un haz de excitación se abrieron con el uso de un sencillo espejo dicroico y un láser de 405 nm adicional de la realización de la microscopía permite la localización de fotoactivación (PALM) o estocástico microscopía óptica de reconstrucción (STORM), es decir, dos superresolutmetodologías de iones con una precisión de posición por debajo del límite de difracción de la luz visible 15,16. Sin embargo, el éxito experimental no sólo es una cuestión de hardware adecuado. Para sacar el máximo provecho de las imágenes basadas en TIRF de ruido reducido, las células deben hacer contacto a una superficie de una manera que no impone restricciones sobre la superficie de la célula o que interfiera con la fisiología de la membrana plasmática. SLBS funcionalizado con proteínas adecuadas para la adhesión celular están excediendo muy adecuado para este propósito porque todos los ligandos incrustados-SLB son lateralmente móvil y ajustar su posición lateral dentro de la bicapa en respuesta al receptor de la dinámica de unión y la segregación. Para fabricar SLBS de una manera reproducible, lo mejor es comenzar con los SUV de gran pureza. Como se describe aquí, es por lo tanto crítico para eliminar vesículas multilamelares, que también se producen durante la sonicación, en dos etapas de ultracentrifugación como éstos interfere con la formación de SLBS contiguas que ofrecen alta fluidez. SLBS de forma de alta calidad sólo en superficies de vidrio limpio. Una vez portaobjetos de vidrio limpio se debe utilizar inmediatamente o almacenar en vacío. Es importante destacar que SLBS nunca deben ser expuestos al aire ya que esto daría lugar a su interrupción. Lavado SLB implica, como se muestra, tampón de enjuague con el uso de una pipeta serológica, ya que esto no es sólo un procedimiento de salvar pero también de ahorro de tiempo. Durante la cosecha y purificación de proteínas SLB-residentes el uso de detergentes debe ser evitado. Esto es porque detergente reducirá significativamente la movilidad de proteínas incluso cuando están presentes en cantidades traza. Para evitar la necesidad de detergente todos juntos, se recomienda la expresión soluble de ligandos etiqueta equipado polihistidina secretada en células de mamíferos o insectos. Si se requiere el replegamiento de cuerpos de inclusión de E. coli, la precaución debe aplicarse para eliminar detergentes efectivamente de los cuerpos de inclusión antes de su desempleo y replegamiento. Una importante ventaja de emplear SLBS resultados de su naturaleza modular y reconstituyente, que permite diseccionar específicamente el papel de una interacción receptor-ligando dado para la activación celular y la adhesión celular. En este sentido, es importante mencionar que DGS NTA-Ni debe estar presente en 10% dentro de la SLB con el fin de evitar que las proteínas que compiten por los sitios de unión NTA-NI. Cuando se emplea SLBS que albergan sólo el 1% o 2% DGS NTA-Ni, una reducción en la asociación de las especies proteicas un determinado marcada con polihistidina se puede notar, especialmente cuando se co-incubación de cantidades crecientes de una segunda especie de proteína-polihistidina etiquetado (inédito observación). Este fenómeno no se observa cuando se trabaja con SLBS ofrecen el 10% DGS NTA-Ni. Aunque nunca hemos observado la unión no específica de cualquier proteína-polihistidina etiquetado probado para SLBS contienen DGS NTA-Ni, esta posibilidad debe ser probado en la introducción de una proteína, por primera vez,Para ello se recomienda el uso de SLBS carentes de DGS NTA-Ni (la proteína no debe obligar). En segundo lugar, cuando se utiliza un SLB contiene DGS NTA-Ni, la proteína debe salir por completo después de lavar la SLB con PBS que contenía imidazol 300 mM. Otra ventaja significativa de emplear SLBS es que las interacciones transitorias y eventos de señalización pueden ser monitoreados con resolución mejorada 17-19 de espacio-temporal. Esto es al menos en parte debido a un proceso de unión tridimensional se reduce esencialmente a dos dimensiones de imagen, especialmente cuando se graba en el modo de TIRF ruido atenuado. El uso de SLBS es compatible con la detección de señales sola molécula, un requisito previo para la microscopía foto activadas localización (PALM) o estocástico microscopía óptica de reconstrucción (STORM), es decir, la microscopía de super-resolución con una resolución por debajo del límite de difracción 15,16. Estas modalidades especiales de imagen permiten sola molécula Förster Resonancia Energía Traexperimentos nsfer diseñados para visualizar las interacciones individuales proteína-proteína en un entorno sináptica 20. Este enfoque se explica en considerable detalle en una publicación JoVe denominado 21 &quot;Medición de la unión usando un ensayo de FRET a base de microscopía de TCR-pMHC&quot;. Al interpretar los experimentos basados ​​en SLB uno siempre debe tener en cuenta que no todas las propiedades de una membrana plasmática de una célula viva se caracterizan por SLBS, y que algunas de las cualidades que faltan pueden afectar la fisiología bajo investigación. Después de todo, las proteínas incrustadas-SLB están difundiendo libremente y no organizados en microdominios de membrana como la mayoría de sus homólogos celulares son 5,6,22. Hojas de membrana de plasma inmovilizada derivadas de células adherentes, que conservan la arquitectura membrana plasmática de las células vivas en cierto grado, se han empleado con éxito para estudiar la captación de antígenos de membrana embebido por los linfocitos B 23. Sin embargo, incluso talesmembranas no interactúan con un citoesqueleto muy dinámico y cuentan con ninguna flexibilidad, ya que se apoyan en una superficie de vidrio rígido. En vista de estas discrepancias existe una clara necesidad de SLBS ingeniería, que ofrecen medios para compartimentar las proteínas de una manera definida y que se apoyan en superficies de flexibilidad ajustable o por superficies que cambian su rigidez en respuesta a pulsos de luz aplicados localmente.

La comprensión de los mecanismos por los que las proteínas de membrana cumplen su función celular a menudo puede ser una tarea difícil, porque sus modos de acción se definen a menudo por las interacciones de afinidad baja, que son difíciles de detectar y evaluar mediante metodologías bioquímicas convencionales. Las proteínas de membrana pueden además ser altamente enriquecido en dominios específicos de membrana 5,6 o formar estructuras de orden superior dinámicos, que pueden, en principio, alterar su actividad biológica 7. Tanto sola molécula de microscopía de fluorescencia láser asistida no invasiva se ha convertido en la metodología de elección para estudiar el comportamiento de proteínas en entornos celulares complejos. Esto es especialmente cierto para los procesos bioquímicos que tienen lugar en la membrana plasmática, ya que pueden, en principio, ser controlados en el modo de reducción de ruido reflexión interna total (TIRF). Aquí iluminación de la muestra se restringe a una rebanada de hasta 200 nm-delgada en las proximidades de un vaso surface, lo que resulta en una pérdida significativa en el fondo celular y, debido a las características de la luz de excitación evanescente, también en un aumento sustancial en la intensidad de señal de fluorescencia 8,9. Ambos aspectos son importantes cuando se pretende para alta resolución posicional y temporal en la detección de moléculas individuales. Planar SLBS no sólo son compatibles con la microscopía TIRF. Cuando funcionalizado con ligandos adecuados que también proporcionan acceso directo al estudio de la dinámica molecular de reconocimiento célula-célula a medida que ocurren en las células inmunes u otras células. También pueden ser simplemente utilizadas para posicionar células móviles y por lo demás no adherentes lo suficientemente cerca para el portaobjetos de vidrio de modo que tales células se pueden obtener imágenes en la iluminación TIRF, que es altamente deseable cuando los experimentos de conducción que implican seguimiento molécula simple o simple superresolución a base de molécula. Con este fin proteínas tienen que ser cargado en un SLB altamente móvil. Una ventaja inherente de la li utilizado<html> Los PID son que no hay unión no específica de proteínas en absoluto. Por otra parte, SLBS pueden considerarse como líquidos de dos dimensiones con una capacidad inherente de curarse a sí mismos; irregularidades en el soporte de vidrio se compensan hasta un cierto grado. Un protocolo paso a paso se proporciona para generar bicapas altamente móviles encargadas de proteínas de interés. La formación de SLBS planas se describe, que contienen 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC) como el ingrediente principal (de 90-99%) y el sintético y funcionalizado de lípidos de 1,2-dioleoyl- sn -glicero-3 - {[N (5-amino-1-carboxipentil) iminodiacético ácido] succinil} sal de níquel (DGS NTA-Ni) en baja abundancia (1-10%). POPC lleva un ácido graso saturado y un ácido graso monoinsaturado y forma bicapas lipídicas de alta fluidez incluso a RT. DGS NTA-Ni se une con su grupo de cabeza a las colas de poli-histidina y sirve como anclaje para proteínas etiquetadas-poli-histidina de elección (Figura 1). &quot;&gt; Es importante destacar que el hardware microscopía debe incluir un número de periféricos que se describen a continuación. Con la información proporcionada y algunos conocimientos básicos de la óptica y la física láser, cualquier biólogo debe ser capaz de construir una sola configuración de imágenes molécula. Excitación de la muestra debe ser idealmente realizado en un microscopio invertido en el modo de reflexión interna total (TIRF) como este régimen reduce la luz espuria y el fondo excesivo resultante de otra forma de celular autofluorescencia 9. Para ello, un objetivo especial TIRF capaz (ver más abajo) y se necesitan iluminación láser. Algunos experimentos requieren tiempos de iluminación dentro del rango de milisegundos y operado en una sucesión rápida. Para ahorrar tiempo de iluminación o para evitar el blanqueo innecesario causado por iluminación repetitivo a menudo es útil para dividir la luz emitida en dos o más canales espectrales. Esto permite una lectura simultánea de dos o más perfiles de emisión, que pueden convertirse en un factor significativo cuando CONDUCting experimentos que implican transferencia de energía de resonancia Förster (FRET). Aquí la emisión resultó de un impulso de luz de excitación solo se puede grabar tanto del donante FRET y FRET aceptora (como la emisión sensibilizada). La cámara debería capturar suficientes fotones con suficientemente bajo fondo para visualizar fluoróforos individuales durante el tiempo de iluminación. Aplicaciones informáticas tendrá que estar preparado para la tarea de sincronizar cierre de excitación y de adquisición de imágenes. Una visión global se da a continuación y en la Figura 2: Objetivo a TIRF capaz: Para la iluminación TIRF basada en el objetivo de la apertura numérica (NA) del objetivo debe ser igual o mayor que 1,4 utilizando portaobjetos de vidrio estándar (n = 1,515) 9. La ampliación puede oscilar entre 60x a 150x. El objetivo debe ser corregida cromáticamente para permitir confocalidad cuando la formación de imágenes diferentes fluoróforos. Láseres: El número de lase disponiblesOpciones R ha aumentado significativamente en los últimos años. Modernos láseres de onda continua de diodos electrónicamente modulables son rentables y pueden funcionar con frecuencia y velocidad sin precedentes. Más caros láseres de iones de gas sobresalen en la calidad del haz láser, pero requieren de obturación externo (véase más adelante) y, a menudo extensa (agua) de refrigeración. Persianas de Excitación: moduladores acústico-ópticos (OMA) permiten cierre rápido en rápida sucesión 10. Para apretado cerrando la combinación de un AOM con los obturadores mecánicos se recomienda. De esta manera extensa calentamiento de la OMA debido a la exposición de luz continua se evita y la luz se escape de la OMA en el fuera de posición se anula. Las lentes se utilizan para ampliar haces de láser y para enfocar ellos sobre el plano focal posterior del objetivo. De esta manera, la luz de excitación sale del objetivo como un haz paralelo (Figura 3), que se requiere para la iluminación de TIRFla muestra. Moviendo el punto focal dentro del plano focal posterior desde el centro a la periferia del objetivo va a cambiar el ángulo en el que el haz sale del objetivo, pero no la ubicación del punto de láser en la muestra (Figura 3), que es una función de la geometría de haz global. Iluminación TIRF sobreviene en un ángulo crítico, que se puede ajustar utilizando un conjunto de espejos que funcionan como un periscopio para traducir el punto focal del láser dentro del plano focal del objetivo. Las lentes deben ser corregidas cromáticamente y se pueden utilizar en un conjunto de dos o tres lentes. Un sistema de tres lente consiste en dos lentes que actúan como un telescopio para ensanchar el haz de láser (y por lo tanto el punto de iluminación en la muestra) y una tercera lente para enfocar el haz ensanchada en el plano focal posterior del objetivo (Figura 4). Ambas funciones (telescopio y de enfoque) también se puede lograr por una combinación de sólo dos lentes (véase la figura 4). Espejos debe ser de al menos el 95% reflectante para evitar la pérdida de la luz láser. Para cada ajuste del haz de un conjunto de dos espejos se aplica normalmente como tal disposición es suficiente para ajustar con precisión cualquier ángulo y la posición de un rayo láser. Superposiciones dicroicos reflejan y transmiten la luz de diferentes longitudes de onda específicas y se utilizan para superponer o dividir los haces de dos láseres. Filtros Polychroic son más complejos que los filtros dicroicos y son necesarias para reflejar la luz de excitación de entrada y salida de transmitir luz de emisión de la muestra. Se colocan en el cubo de filtro entre el objetivo y la lente del tubo del microscopio. Limpie los filtros: Dependiendo del tipo de employe láser d láser limpiar los filtros con un ancho de banda de transmisión estrecha debe ser colocado en el haz de láser justo después de que sale del láser. Filtros Notchestán diseñados para absorber con eficacia la luz láser con un ancho de banda estrecha y transmitir toda otra luz. Se colocan dentro de la trayectoria de emisiones para filtrar cualquier luz de excitación láser espuria. Sin embargo, filtros de corte funcionan sólo a 0 ° de ángulo de entrada. Si la anchura de banda del filtro de corte es muy fuerte, los diferentes ángulos entrantes no pueden reflejarse más. El bloqueo de la luz láser láser colimado no se ve afectada, pero la luz retrodispersada no puede ser obstaculizada de manera eficiente de llegar a la cámara. Ruedas de filtros motorizados equipados con ruedas de filtros adecuados se pueden colocar fácilmente en la vía de excitación y de emisión y permiten conmutación simple entre diferentes intensidades de luz (cuando está equipado con filtros ND) o canales fluorescentes (cuando se coloca delante de una lámpara de arco de xenón o de mercurio para radiométrica imágenes de calcio o delante de la cámara para seleccionar el fluoróforo emisor de luz). 50:50 cubo divisor de haz cun ser utilizado para dividir rayos láser en dos trayectorias de rayos de excitación separados y también para combinarlos en frente del periscopio. Divisor de haz (camino de emisión): Para la adquisición rápida de imágenes sin necesidad de cambios de filtro físico, el haz de emisión se divide en un canal azul-cambiado y desplazada al rojo. En principio, divisores de haz pueden ser construidos mediante el empleo de una cuña dicroico o un conjunto de espejos y un espejo dicroico para separar el haz de emisión de una manera dependiente de la longitud de onda. Se necesitan dos filtros de emisión para limpiar los canales emitidos. Filtro espacial: filtrado espacial del haz de excitación es a veces necesaria para eliminar los rayos de luz no paralelos emitidos por rayos láser de baja calidad. Un filtro espacial consiste en un telescopio de dos lentes con un pequeño agujero de alfiler colocado exactamente en el punto focal de ambas lentes. Esta luz espuria manera resultante de las porciones no paralelos del haz de láser se bloquea de manera eficiente. Such condiciones se deben cumplir al establecer la microscopía basada en TIRF. Aumentos filtrado espacial con poros más pequeños, que son más difíciles de colocar en el punto focal, y con distancias focales más pequeñas de la primera lente. Para reducir los efectos causados ​​por aberraciones de la lente es ventajoso emplear en lugar de simples lentes de alta calidad y objetivos de microscopio infinito-corregida con bajo aumento (10x o 20x). Periscopio: Una configuración periscopio es necesario traducir el rayo láser enfocado en el plano focal del objetivo, un requisito previo para la imagen TIRF. Puede ser fácilmente construido a partir de dos espejos de dos pulgadas, una etapa de traslación para ajustar el primer espejo y un poste para posicionar el segundo espejo para reflejar la ensanchado y centrado haz de excitación en el microscopio (Figura 5). Cámara: Back-iluminado Electron-Multiplicación de dispositivos de carga acoplada (EMCCD) se utilizan rutinariamente parala grabación de señales sola molécula. Esto es debido a su alta eficiencia cuántica (hasta 95%), alta velocidad de adquisición (hasta 30 MHz) y comparativamente bajo nivel de ruido. Enfriamiento hasta -80 ° C reduce el ruido térmico y con el apoyo de una serie de cámaras EMCCD actualmente disponibles. Una limitación de la tecnología es que EMCCD ruido de la cámara aumenta linealmente con la tanto la ganancia de la cámara y la señal que está siendo capturado. Este no es el caso con las cámaras científicas CMOS (sCMOS), que son significativamente menos caros y operan debido a la arquitectura especial del chip sCMOS también mucho más rápido que las cámaras EMCCD. Sin embargo, un problema asociado con la tecnología CMOS es que la adquisición de imágenes todavía carece de un cierto grado de una lectura cuantitativa en un solo nivel molécula, debido a que cada pixel cuenta con diferente sensibilidad de detección. En principio esto se puede compensar a través de la normalización pixel, pero este procedimiento no es en absoluto triviales 11. Es por eso que todavía dudamos en volverfelicitar cámaras sCMOS para microscopía sola molécula, pero en vista de la rápida evolución de esta tecnología, cámaras sCMOS pronto podría convertirse en la cámara de elección. Slow cámaras cámaras CCD de escaneo de evitar el ruido y píxeles de varianza relacionados amplificación todos juntos y soportan velocidades de adquisición más rápidos si se pueden operar en un modo denominado &#39;cinético&#39;. En este modo todo el chip de la cámara a excepción de una región de interés (ROI) está enmascarado, que hace que sea posible emplear el propio chip como un dispositivo de almacenamiento. Tras el retorno de la inversión se expone por primera vez, los cargos resultantes se desplazaron a la zona enmascarada de la línea de píxeles de chips por línea de píxeles, donde la imagen está protegida de mayor exposición a la luz. Una vez que el desplazamiento de todas las líneas de la ROI en la región enmascarada se ha completado (en el rango sub-milisegundos), el propio ROI está listo para la próxima exposición. Este ciclo se repite hasta que se cargan todas las líneas de píxeles del chip CCD. El chip se lee a continuación lentamente con marcadamente reduruido de lectura ced. Por ejemplo en un chip de 1000 x 1300 píxeles, 20 ROIs de 50x50 píxeles se pueden grabar en una sucesión rápida. Debido a que las imágenes permanecen en el chip durante un tiempo considerable antes de ser leído, es crítico para asegurar el enmascaramiento de alta calidad y para enfriar la cámara (por ejemplo, con nitrógeno líquido) como un medio para reducir el ruido térmico excesivo. Algunas cámaras EMCCD también soportan el modo de cinética. Software: El tiempo de los láseres, persianas, AOMS y exposición de la cámara, así como el almacenamiento de imágenes adecuado son esenciales para cualquier experimento de imágenes exitosa. En principio muchas operaciones definidas se pueden programar con paquetes de software disponibles que vienen con la cámara. Paquetes de software comerciales soportan un gran número de periféricos de hardware, que pueden ser implementadas con poco conocimiento técnico. Generador de impulsos, adquisición de datos (DAQ) (con canales analógicos y digitales de salida) y el osciloscopio: Un generador de pulso es unexcelente elección para convertir impulsos de disparo en impulsos de tiempo y tensión definida. De esta manera los láseres pueden ser controladas precisamente por la potencia de salida y sincronizados en el milisegundo de rango sub-milisegundo. Tarjetas DAQ con salidas analógicas lograr lo mismo y se integran fácilmente en la placa base del ordenador a través de las ranuras PCI. La duración del impulso, amplitud y frecuencia se verifican con un osciloscopio. Recinto de toda la trayectoria del haz de excitación: Para evitar las fluctuaciones en el perfil de excitación debido a convecciones de aire la ruta completa haz de excitación debe ser encerrado de su entorno de laboratorio. Esta medida es especialmente importante cuando se realiza la microscopía TIRF. Componentes ópticos también están protegidos del polvo y el ojo humano de exposición a la luz láser. Recintos pueden construir fácilmente de cartón negro, que se puede comprar en las tiendas de artes. Para determinar la fluidez de la recuperación SLB fluorescencia después Photobleaching (FRAP) medidas 12 se llevan a cabo. Para FRAP la existencia de dos trayectorias de rayos de excitación es aconsejable (véase la Figura 3). La primera trayectoria de rayos está diseñado para la imagen de la fluorescencia de la bicapa. Esto se puede hacer en la configuración TIRF y con baja intensidad de luz. La segunda trayectoria del haz debe permitir una breve pero intensa pulso blanqueador y debe ser configurado en modo no TIRF, para que salga el objetivo a lo largo del eje óptico. Una abertura redonda se puede colocar en la trayectoria del haz de excitación (véase la figura 8) para proyectar un perfil blanqueador perfectamente redondo con bordes definidos. Con el fin de imagen de esta abertura sobre el plano de objeto, su posición óptima sería en el plano focal de la lente 3 (véase la Figura 3). Sin embargo, debido a la longitud focal larga de esta lente, una imagen de abertura de suficiente calidad puede también ser generado, cuando la abertura se coloca en posiciones ligeramente desplazadas. Después de haber realizado tque la formación de imágenes experimento los datos en bruto deben ser analizados apropiadamente. Varios protocolos paso a paso se ofrecen, que cubre el ajuste de los parámetros principales (por ejemplo, potencia de iluminación y de tiempo, ángulo TIRF), adquisición y análisis de los datos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 glass slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250ml round bottom flask</td>
			<td>VWR</td>
			<td>201-1357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50:50 beam splitter cubes</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BS013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acousto-opitcal modulator C1205-2</td>
			<td>Isomet</td>
			<td>-</td>
			<td>only necessary if CW lasers, which cannot be modulated, are used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488-NHS</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-20000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555-NHS</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-20009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647-NHS</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-20006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoclave tape</td>
			<td>VWR</td>
			<td>489-1312</td>
			<td>or any other heat-stable sticky tabe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti Mini-Extruder</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>610000</td>
			<td>alternative to the bath sonicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bath sonicator QSONICA Q700</td>
			<td>QSONICA</td>
			<td>Q700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beam splitter</td>
			<td>Cairn</td>
			<td>P280/210/MLS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B&#252;chi rotary evaporator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>531-0837</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon Ultra 897</td>
			<td>see manuscript text for alternatives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>concentarted hydrogenperoxide</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9683.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>concentrated sulfuric acid</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X944.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epoxy glue</td>
			<td>Uhu</td>
			<td>45705</td>
			<td>Uhu plus sofortfest 2min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter wheel</td>
			<td>Sutter instruments</td>
			<td>Lambda 10-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabTek chambers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser&#160;</td>
			<td>Toptica</td>
			<td>-</td>
			<td>different variants (wavelengths 375 - 785 nm) are available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lens</td>
			<td>Thorlabs, Newport</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DGS NTA-Ni (lipid)</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>790404C</td>
			<td>already in Choroform-solved delivered version of the nicekl salt variant is recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC (lipid)</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>850457C</td>
			<td>already in Choroform-solved delivered version is recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope Zeiss Axiovert 200</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mirrors</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BB1-E02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>optical filters</td>
			<td>AHF, Chroma, Semrock</td>
			<td>-</td>
			<td>filter sets are available for many different combinations of dyes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oscilloscope</td>
			<td>BK Precision&#160;</td>
			<td>2120C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14190-136</td>
			<td>degas before usage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>periscope</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RS99/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>picodent twinsil 22</td>
			<td>Picodent</td>
			<td>13001000</td>
			<td>alternative to the epoxy glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>power meter Lasermate-Q</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>-</td>
			<td>any powermeter sensitive in the used spectral range will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pulse generator</td>
			<td>Stanford Research Systems</td>
			<td>SRS DG535&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spatial filter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KT310/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe filter 0.2&#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GVWP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIRF-capable apochromat objective 100x, NA 1.46</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>440782-9800-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trichloromethane/chloroform</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3313.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubes forultracentrifugation polycarbonate 1.00 mm, 11 mm x 32 mm&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>45237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ultracentrifuge&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>RC M150GX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultracentrifuge rotor</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S120-AT2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV spectrophotometer Nanodrop 2000c</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vacuum pump</td>
			<td>VWR</td>
			<td>181-0248</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single molecule fluorescence microscopy on planar supported bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

La arquitectura del sistema de microscopía de fluorescencia de una sola molécula se describe en considerable detalle en la figura 2. Las piezas individuales tales como los componentes ópticos y otros componentes de hardware se explican en la introducción. Las trayectorias de los rayos ópticos de excitación, que dan lugar de una manera definida de TIRF y la iluminación no TIRF, se muestran y explican en las figuras 3 a 5. Nota la ubicación del divisor de haz 50:50 delante del espejo colocado en primera periscopio una etapa traducible micrómetro (Figura 5). Este divisor de haz superpone el haz TIRF utilizado para la formación de imágenes (indicado en verde) y la viga no TIRF (indicado en rojo) que se utiliza para el blanqueo o la activación de la muestra luz mediada por la abertura definida por el local (tal como se indica en la Figura 3). Los caminos combinados de luz (Figura 5, indicados en naranja) se reflejan a través del segundo espejo periscopio en el puerto posterior de la micr invertidaoscope. Como se explica en la Figura 4 y se indica en la Figura 2, la implementación de dos o tres lentes convexas ensancha los perfiles de rayo láser y se enfoca los rayos láser en el plano focal posterior del objetivo de dar lugar a dos haces colimados iluminando la muestra en TIRF y , respectivamente, en no TIRF. Un ejemplo para los valores de intensidad medidos requeridos para el cálculo de la densidad de potencia sobre el espécimen se muestra en la Figura 6. La media de la señal de fondo que se sustrae de intensidades medidas en la zona iluminada y central (utilizado para la formación de imágenes), se determina en una región dentro de la campo de visión, que no está iluminada por el haz de láser (en este caso 7089 cuentas). Los antecedentes corregido intensidades medias de los recuentos de iluminación (1684) y el área central (4830 cuentas) se multiplican por los tamaños región correspondiente para dar lugar a intensidades integradas (1,471x 10 8 conteos de la zona iluminada y 3.424 x 10 7 recuentos de la zona central). La relación de las intensidades integradas dentro de las regiones central y sistema de iluminación produce la fracción de la potencia total que ilumina la zona central (0,23 o 23%). Como se muestra en la película, la potencia total tiene que ser determinada en el objetivo con el uso de un medidor de potencia en el modo de iluminación no TIRF. En nuestro ejemplo se ajusta a 5 mW, lo que daría lugar a una potencia de 5 mW x 0,23 = 1,15 mW dentro de la zona central. Desde 41,5 píxeles cantidad en nuestro ejemplo a 1 m 2, el área central tiene un tamaño de 7089 pixeles /41.5 píxeles x 2 micras = 170,8 m 2. La división de la potencia de la luz que ilumina el área central (1,15 mW) por esta área (170,8 m 2) se obtiene una potencia mediadensidad de 0,7 kW / cm 2 dentro de la zona central. Figura 7 muestra imágenes y resultados de intensidad correspondientes de fluoróforos individuales adquiridos en rápida sucesión (100 fotogramas por segundo, es decir, con un marco de tiempo de 10 ms). Para la cuantificación de intensidad de la señal media de una región rectangular de siete por siete (= 49) píxeles, que cubre la señal de fluorescencia, se determina. Además, la media de la señal del fondo se determina dentro de una región rectangular de siete por siete píxeles en las proximidades de la señal de una sola molécula. La señal de fondo media corregida se multiplica por el número de píxeles dentro de la región (= 49) para dar lugar a la señal de una sola molécula (marcada en negrita). Un experimento FRAP representante diseñado para evaluar la movilidad de las proteínas marcadas con fluorescencia asociados-SLB se muestra en la Figura 8. Nota en la figura 8A la repetitiva uso de un haz de formación de imágenes de baja intensidad ensanchado y el uso individual de un segundo más estrecho y la abertura definida luz alta intensidad para la ablación fluorocromo rápida en el segundo punto de tiempo cero. Intensidades media de fondo-resta dentro del círculo amarillo, que han sido normalizado por el valor de intensidad media inicial antes del pulso lejía, se representan gráficamente en la Figura 8B contra el tiempo para registrar la velocidad y grado en el que la fluorescencia se ha recuperado. Como se muestra, más del 90% (indicado por la línea verde) de la intensidad inicial bicapa se ha recuperado dentro de 75 segundos después de la ablación fluorocromo. Como consecuencia de menos de 10% de las proteínas embebidas en el SLB mostrado son inmóviles. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema Esquema de un sistema SLB. SLBS (A) están hechos de POPC (90-99%) y el lípido sintético DGS NTA-Ni (1-10%). Ellos forman espontáneamente cuando las superficies de vidrio limpias están acusados ​​de los SUV que consisten en los lípidos correspondientes. (B) Una vez formados, estos SLBS pueden ser fácilmente decoradas con proteínas solubles extendidas, ya sea con un solo C- o etiqueta N-terminal que contiene doce histidinas (12H, por ejemplo la molécula co-estimuladoras B7-1 y la molécula de adhesión ICAM-1 dímeros) o proteínas ampliar con dos etiquetas que contiene seis histidinas cada uno (2x6H, por ejemplo, un dímero αβMHC clase II). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig2.jpg" /> Figura 2. Visión general de las trayectorias de excitación y de emisión. Haz láseres de iones gas (por ejemplo Ar + o Kr +) puede ser operado para cerrar rápido con el uso de mo óptico acústico<html> dulators. Láseres diodos son hoy en día disponibles en muchas longitudes de onda y representan una excelente alternativa, ya que pueden ser moduladas por vía electrónica en el microsegundo-rabia. Tenga en cuenta que los rayos láser se pueden ajustar fácilmente con dos (dicroicas) espejos y dividir y combinar con el uso de divisores de haz simples para dar lugar a dos o más trayectorias de rayos. En este ejemplo un haz de formación de imágenes TIRF (a supervisar los eventos) y un haz de blanqueo (a uno o fluoróforos de blanqueo foto-activar las moléculas enjaulado en una manera definida por la abertura) se utilizan. Ambos caminos de excitación pueden ser operados independientemente uno de otro mediante el uso de obturadores adicionales. El periscopio permite la traducción de los rayos láser enfocados en el plano focal posterior del objetivo para generar iluminación TIRF de la muestra. La imagen fluorescente se puede dividir espectralmente con el uso de un divisor de haz de emisión antes de la adquisición con el uso de una cámara ultra-sensibles (por ejemplo EM-CCD o una cámara CMOS científica)..com / files / ftp_upload / 53158 / 53158fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig3.jpg" /> Figura 3. Ajuste de iluminación TIRF traduciendo el haz enfocado dentro del plano focal posterior del objetivo. Como se muestra en el punto focal del haz de láser se desplaza dentro del plano focal posterior del objetivo desde el centro hacia la periferia a través de la translocación de la viga (usando una disposición de espejos periscopio). Como resultado, un haz paralelo sale del objetivo en una iluminación inclinada hasta que se alcanza un ángulo crítico en el cual ocurre la reflexión interna total. El campo evanescente se genera en la interfase vidrio-media, donde se produce la reflexión total. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig3large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta fi</a><html> gura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig4.jpg" /> Figura 4. sistemas ópticos sencillos para enfocar el haz láser en el plano focal posterior del objetivo. Cualquiera de tres o dos lentes son necesarios para ensanchar el haz de láser y para enfocar en el plano focal posterior del objetivo TIRF. Dos sistemas de lentes contienen menos errores de lente asociado que los sistemas de tres lentes y podrían ser más adecuados para generar el haz de formación de imágenes TIRF. Tres lentes podrían ser preferible cuando el objetivo de la ampliación del haz definido y un punto de iluminación con bordes afilados, como sería necesario para los estudios que emplean la foto-activación o -bleaching. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> /53158fig5.jpg &quot;/&gt; Figura 5. anotado fotografía de la trayectoria del haz en la parte posterior del microscopio de fluorescencia. Como ya se indica en la Figura 2 una caña de una implementar fácilmente dos haces de excitación, uno en TIRF (indicado en verde) la otra en modo no TIRF (indicado en rojo). Estos se convierten en superpuesta con el uso de un divisor de haz de 50:50 (BS). Las lentes convexas (L1 y L2) están situadas en los respectivos haces de ellos para centrarse en el plano focal posterior del objetivo (no mostrados). Un periscopio que consiste en dos espejos (M1 y M2) guía ambos haces a través del puerto de entrada en el microscopio. El primer espejo (M1) puede ser movido con el uso de una etapa de traducción (TS) (girando un tornillo micrométrico como se indica) para mover una de las vigas en su posición TIRF. Una vez TIRF se ha establecido, el segundo haz (utilizado para la foto-blanqueo o-activación, aquí se indica en rojo) se puede ajustar independientemente de la viga TIRF que salir del objetivo en la no-TIRFde modo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig6.jpg" /> Figura 6. Medir el poder dentro de la zona central del punto de iluminación. Como se indica eligió regiones apropiadas de interés, que reflejan el fondo, toda la zona iluminada (IA) y la zona central (CA), donde más tarde se registraron eventos. Restar los valores de fondo de los registrados para IA y CA e integrar las intensidades multiplicando intensidades medias corregidas con el número de píxeles presentes dentro de cada área (= intensidades integradas). Divida la intensidad integrada de CA por el de IA para llegar a la proporción de la potencia del haz de iluminación de la CA (en este ejemplo: 23%). Determine la potencia de la luz que ilumina el CA multiplicando la potencia del haz global (en este caso: 5 mW) con la proporción iluminando el CA (aquí: 0,23). Para determinar el tamaño de la zona central multiplicar el área (aquí: 7.089 pixel) con un factor de píxel a la zona de conversión del tamaño (aquí: 1 / 41,5 m 2 -1 pixel). Para llegar a la densidad de potencia media de la luz de excitación que ilumina la CA, divida el poder (en este caso: 1,15 mW) por el tamaño de la entidad emisora. (Aquí: 170,8 m 2) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig7.jpg" /> Figura 7. La cuantificación de las señales de una sola molécula. (A) Evolución temporal de fluoróforos individuales en una SLB. Una región de tamaño 7 x 7 píxel de interés (ROI, amarillo) se coloca alrededor de la señal para la cuantificación. Antecedentes se determina a partir del píxel vecino un 7 x 7roi (verde). (B) cuantificado intensidades promedio de píxeles se enumeran. Para determinar la señal de una sola molécula, los valores de fondo (ROI verde) se restan de los valores de señal (ROI amarillo) y se multiplicaron por 49. (C) intensidades de moléculas individuales de un fluoróforo se representan gráficamente contra el tiempo. Tenga en cuenta, que el punto de tiempo de 90 ms se omite como el fluoróforo está en el proceso de blanqueo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig7large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig8.jpg" /> Figura 8. La recuperación de fluorescencia Después de Photobleaching (FRAP) análisis para determinar la integridad de la SLB. (A) FRAP se realizó en una bicapa llevar a CEA / MCC-Alexa Fluor 647. Cada imagen de la décimo experimento se muestra. (B) la cuantificación FRAP del experimento se muestra en (A). Los valores indican las intensidades promedio (i) dentro de la ROI amarilla se muestra en (A) dividida por la intensidad inicial (I) o antes del blanqueo. Puntos de datos rojas se muestran en (A), la línea verde denota 0,9 recuperación de intensidades originales. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig8large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

Bilayers Individual Molécula microscopía de fluorescencia en planar compatibles

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

single-molecule-fluorescence-microscopy-on-planar-supported-bilayers

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.8K vistas.  Vienna University of Technology. Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution. 

Video: Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

The generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology, with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 and wound healing3. In each of these examples, cells both exert force on their surroundings and simultaneously enzymatically remodel the extracellular matrix (ECM). The effect of forces on ECM has thus become an area of considerable interest due to its likely biological and medical importance4-7.
	Single molecule techniques such as optical trapping8, atomic force microscopy9, and magnetic tweezers10,11 allow researchers to probe the function of enzymes at a molecular level by exerting forces on individual proteins. Of these techniques, magnetic tweezers (MT) are notable for their low cost and high throughput. MT exert forces in the range of ~1-100 pN and can provide millisecond temporal resolution, qualities that are well matched to the study of enzyme mechanism at the single-molecule level12. Here we report a highly parallelizable MT assay to study the effect of force on the proteolysis of single protein molecules. We present the specific example of the proteolysis of a trimeric collagen peptide by matrix metalloproteinase 1 (MMP-1); however, this assay can be easily adapted to study other substrates and proteases.

In this article we describe the use of magnetic tweezers to study the effect of force on enzymatic proteolysis at the single molecule level in a highly parallelizable manner.

Multiplexado de una sola molécula de mediciones de la Fuerza proteólisis utilizando pinzas magnéticas

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Investigación

Bioingeniería

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

De alta resolución espacio-temporal Análisis de la Dinámica del receptor por Casa molécula de microscopía de fluorescencia

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

Rastreo Orbital 3D en un microscopio de dos fotones Modificado: una aplicación para el Seguimiento de vesículas intracelulares

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

De Fluorescencia Fast Imaging a la Ley de Difusión Molecular en membranas de células vivas en un microscopio Comercial

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

Preparación de Mica Soportado bicapa lipídica de Alta Resolución Microscopía Óptica de Imagen

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Fuerza Atómica Microscopía Imaging y Fuerza Espectroscopia de admitidos Bilayers lípidos

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions are likely affected by the mechanical environment in which binding and signaling take place. A recent study demonstrated that mechanical force can regulate antigen recognition by and triggering of the T-cell receptor (TCR). This was made possible by a new technology we developed and termed fluorescence biomembrane force probe (fBFP), which combines single-molecule force spectroscopy with fluorescence microscopy. Using an ultra-soft human red blood cell as the sensitive force sensor, a high-speed camera and real-time imaging tracking techniques, the fBFP is of ~1 pN (10-12 N), ~3 nm and ~0.5 msec in force, spatial and temporal resolution. With the fBFP, one can precisely measure single receptor-ligand binding kinetics under force regulation and simultaneously image binding-triggered intracellular calcium signaling on a single live cell. This new technology can be used to study other membrane receptor-ligand interaction and signaling in other cells under mechanical regulation.

We describe a technique for concurrently measuring force-regulated single receptor-ligand binding kinetics and real-time imaging of calcium signaling in a single T lymphocyte.

Fluorescencia Biomembranas Fuerza Sonda: La cuantificación simultánea de Cinética-Receptor ligando y encuadernación inducida Señalización Intracelular en una sola célula

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

Individual Detección Molecule-Label gratis con Microtoroid ópticos Resonadores

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

Visualizar la formación de adherencias en las células por medio de avanzados Spinning microscopía de fluorescencia de reflexión interna Total de disco

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes all liposomes of the ensemble to be identical. However, new experimental platforms able to observe liposomes at the single-particle level have made it possible to perform highly sophisticated and quantitative studies on protein-membrane interactions or drug carrier properties on individual liposomes, thus avoiding errors from ensemble averaging. Here we present a protocol for preparing, detecting, and analyzing single liposomes using a fluorescence-based microscopy assay, facilitating such single-particle measurements. The setup allows for imaging individual liposomes in a massive parallel manner and is employed to reveal intra-sample size and compositional inhomogeneities. Additionally, the protocol describes the advantages of studying liposomes at the single liposome level, the limitations of the assay, and the important features to be considered when modifying it to study other research questions.

This protocol describes the fabrication of liposomes and how these can be immobilized on a surface and imaged individually in a massive parallel manner using fluorescence microscopy. This allows for the quantification of the size and compositional inhomogeneity between single liposomes of the population.

Un ensayo de liposomio único basado en microscopía de fluorescencia cuantitativa para detectar la inhomogeneidad compositiva entre liposomas individuales

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...