This work was supported by the Tau Consortium (M.I.D); National Institutes of Health Grant 1R01NS071835 (M.I.D.), a Department of Defense Grant PT110816 (to M.I.D.), 1F32NS087805 (to J.L.F.), and 1F31NS079039 (to B.B.H.).

NOTA: Este protocolo hace hincapié en el uso de FRET citometría de flujo para detectar la actividad de siembra de muestras biológicas de ratón. También es compatible con fibrillas recombinantes y muestras biológicas humanas. Ratón de la eutanasia y el cerebro recolección se realizó de acuerdo con los procedimientos aprobados por la IACUC. 1. Cerebro Extracción <ol><li> Siguiendo profunda anestesia con isoflurano (2%), perfundir un ratón con PBS enfriado con hielo que contenía 0,03% de heparina, y extraer el cerebro siguiendo las instrucciones descritas en Gage et al. 18 </li><li> Coloque el tejido extraído en un crio-vial, y encaje congelación colocando en nitrógeno líquido. Alternativamente, congelar el tejido en hielo seco. Una vez congelado, transferencia de tejido a -80 ° C y almacenar durante un período prolongado de tiempo, si es necesario. NOTA: Este protocolo es compatible con homogeneizados de cerebro enteros o regiones microdiseccionadas cerebrales. Ver Hagihara et al. Para un detallado protocolo de micro-disección 19. </li></ol&gt; 2. Preparación de Material Biológico de Semillas <ol><li> Preparar tampón de homogeneización mediante la disolución de inhibidores de la proteasa (EDTA libre) en TBS 1x (1 tableta por cada 10 ml). Vortex vigorosamente, y almacenar en hielo. Inhibidores de la proteasa debe ser libre de EDTA a fin de preservar la viabilidad celular biosensor. </li><li> Pesar tejido cerebral congelado en un desechable sopesar barco, y transferir a un tubo cónico de 5 ml. Añadir tampón de homogeneización enfriado con hielo tal que la solución final es 10% peso / volumen. Temporalmente almacenar en hielo. La masa de tejido y el volumen de tampón de homogeneización posterior variarán dependiendo del tamaño y / o regiones del cerebro utilizado. Aquí, un hemibrain ratón adulto que pesa 0,2 g se suspende en 2 ml de una solución al 10% w / vol. </li><li> Muestras de transferencia en una habitación fría, y ajustar un aparato de ultrasonidos sonda para la configuración adecuada. Para sonicación con sonda con un Ruptor Omni (en la imagen), ajuste la potencia al 20%, lo que corresponde a aproximadamente 75 W. Utilice un modo de pulso para asegurar muestras no se OVer-calentado durante el tratamiento con ultrasonidos. Ajuste el generador de impulsos al 30%, correspondiente a aproximadamente 500 mseg. </li><li> Limpiar la punta de la sonda de ultrasonidos por aclarado con agua, isopropanol, y agua de nuevo, limpiar la sonda entre cada solución. Asegúrese de enjuagar y limpiar tanto los lados y el fondo de la sonda con laboratorio-toallitas. </li><li> Trabajar con una muestra a la vez, sumergir la punta de la sonda en el tampón de homogeneización, e iniciar el aparato de ultrasonidos. El uso de la configuración de energía y generador de impulsos descritos anteriormente, entregar 25 pulsos totales. Asegúrese de que el tejido está completamente en suspensión. Tenga cuidado para evitar la formación de espuma de la muestra durante este paso. NOTA: Las muestras son susceptibles a la formación de espuma si: a) el volumen total es baja o b) el homogeneizado se calienta. Con este instrumento específico, no sonicar con un volumen de menos de 250 l. Para asegurarse de muestras se mantienen refrigeradas, tubos pueden ser almacenados en hielo durante este paso. </li><li> Limpie la sonda por enjugándose lisado residual, luego entregar 10 pulsos en un vaso de precipitados oagua limpia f. Enjuague los lados y el fondo de la sonda con agua, isopropanol, y agua de nuevo (como en el paso 2.4), la limpieza en seco entre cada paso. Para evitar la contaminación, enjuague bien la sonda de entre las muestras. NOTA: Con los agregados de tau, no hemos encontrado que los métodos de limpieza más estrictas son necesarias para evitar la contaminación de muestra a muestra. Otros amiloides, sin embargo, pueden requerir atención adicional que ha sido descrito ampliamente en la literatura 20,21. </li><li> Tienda homogeneizados en hielo hasta que se han procesado todas las muestras. </li><li> Haga girar homogeneizados a 21.300 xg durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Transferir el sobrenadante a un tubo limpio, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento. Deseche la pastilla. Alícuota el sobrenadante, y almacenar los lisados ​​a -80 ° C para su uso posterior. Evite los ciclos de congelación / descongelación de los homogeneizados, sin embargo, ya que esto reduce la eficiencia de la siembra. </li></ol> 3. Las células replating Biosensor NOTA:Utilice cuatro líneas celulares para este ensayo: HEK 293T (célula de la línea # 1), RD-P301S-PPC (célula de la línea # 2), RD-P301S-YFP (célula de la línea # 3), y RD-P301S-PPC / YFP ( línea celular # 4). Por favor, consulte la Tabla 1 para la contribución de cada línea celular para el ensayo. <ol><li> En un entorno estéril, medio de cultivo de aspirado. Enjuague las células con PBS caliente, y aspirar. Trypsinize células (3 ml de tripsina-EDTA (0,05%)) para 3 min, saciar con medio de cultivo caliente (9 ml de DMEM, FBS al 10%, 1% penicilina / estreptomicina, 1% Glutamax), y transferir inmediatamente las células a un tubo cónico. </li><li> Células Centrifugar a 1000 xg durante 5 min a TA. Medio Aspirar y sedimento celular se resuspende en medio de cultivo caliente. </li><li> Utilizando un hemocitómetro, determinar la densidad celular para cada línea celular. La densidad celular variará dependiendo de confluencia en el momento de la cosecha y el volumen de resuspensión. Resuspender las células cosechadas a partir de un plato de 10 cm a 90% de confluencia en 10 ml de medio, por la densidad de células a ser aproximadamente 1 millón de células / ml. </li><li> Haceruna mezcla maestra de las células + medios de comunicación de tal manera que cada pocillo de una placa de 96 pocillos contendrá 35.000 células en 130 l de medios (por ejemplo, para hacer una mezcla maestra para 100 pozos, resuspender 3,5 millones de células en 13 ml de medio). Modificar el número de células para adaptarse a diseños y plazos experimentales individuales. Para el tratamiento de células ~ 18 hr después de la siembra, añadir 35.000 células a cada pocillo de una placa de 96 pocillos. </li><li> Usando una pipeta multicanal, una pipeta lentamente 130 l de suspensión celular mezcla maestra en cada pocillo de un fondo plano, el tejido de cultivo tratado-placa de 96 pocillos. Mientras chapado, coloque la punta de la pipeta en el centro del pozo, sin tocar el fondo de la placa. NOTA: Aunque formato de chapado puede ser modificado, se recomienda hacer n = 4 pocillos para cada una de las líneas celulares 1-3 por placa. El resto de la placa (n = 84) está reservado para la línea celular # 4 (células de biosensores). </li><li> Permitir que las células se asienten dejando la placa en reposo durante 10 min a TA. Incubar O / N a 37 ° C, 5% de CO 2, y y# 8805; humedad relativa 80%. </li></ol> 4. Las células Tratamiento NOTA: El siguiente día, cuando las células de biosensores tau son 60-65% confluentes, preparar complejos de transducción de semillas de la siguiente manera: <ol><li> En un tubo, se combinan reactivo de transfección, como Lipofectamina, con los medios de comunicación reducido suero, tales como Opti-MEM, para hacer una mezcla maestra. Por así, añadir 1,25 reactivo de transfección ly 8,75 l de medios de comunicación reducida de suero. Flick tubo suavemente para mezclar, brevemente girar hacia abajo, y se incuba durante 5 minutos a temperatura ambiente. </li><li> En otro tubo, combinar material de siembra (alícuota de lisado de la etapa 2.9) con los medios de comunicación reducida de suero. NOTA: Volumen del material de semilla variará de acuerdo con el experimento individual. Al elegir el volumen de semillas, tener en cuenta: la abundancia de semillas en una muestra y la toxicidad potencial. Homogeneizados brutos pueden ser tóxicos para las células. Como tal, utilice el volumen más bajo posible para controlar su efecto deseado. Anteriormente volúmenes probados de lisado / pocillo fr gamaom 05.01 l, correspondiente a la proteína total 5.20 mg. Asegúrese de que el volumen total por pocillo (semillas + medios reducido suero) es de 10 l. </li><li> Combine el contenido de los dos tubos que se describen en 4.1 y 4.2, flick suavemente para mezclar, brevemente girar hacia abajo (1.000 xg, 5 seg), e incubar a temperatura ambiente durante al menos 20 min y hasta 2 hr. </li><li> Pipetear suavemente 20 l de complejo de transducción en el lado de los pozos de biosensores individuales. Utilice tres repeticiones técnica, si es posible. Volver células tratadas a la incubadora durante 24-48 h. Incubar en las mismas condiciones como se describe en el paso 3.6. NOTA: La condición de control negativo apropiado para esta configuración es biosensores células tratadas con liposomas vacíos (es decir, el reactivo de liposomas + medios de comunicación reducida de suero) porque la aplicación de fosfolípidos introduce un ligero cambio en el perfil de fluorescencia relativa a las células no expuestas al biosensor reactivo de liposomas. </li></ol> 5. Las células Cosecha de FRET Citometría de Flujo <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; NOTA: Antes de cosechar las células-generalmente 24-48 horas post-tratamiento es posible obtener una lectura preliminar de la actividad de siembra utilizando el filtro de GFP en un microscopio de fluorescencia estándar invertida. Las células tratadas y sin material de siembra (es decir, los liposomas vacíos) mostrarán fluorescencia difusa, mientras que las células tratadas con material de siembra mostrarán intensa punteada e inclusiones reticulares intracelulares (Figura 1A - B). <ol><li> Usando una pipeta multicanal, aspirar todo medio celular (150 l). Células de 5 min trypsinize (50 l), y se inactiva con 150 l de medio de cultivo frío. No incluya un enjuague de PBS antes de la tripsinización en este paso, ya que puede causar elevación celular y pérdida celular subsiguiente. Excluir los contaminantes células muertas y los desechos durante la citometría de flujo a través de las estrategias de compuerta. </li><li> Inmediatamente después del temple, las células de transferencia a una placa de fondo redondo de 96 pocillos, y se centrifuga a 1000 xg durante 5 min a RT. </li><li> Aspirar y desechar medio, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento celular. </li><li> Suavemente, pero a fondo, resuspender el botón celular en 50 l 2% de paraformaldehído, y se incuba durante 10 min. Alternativamente, las células dirigidas viven, aunque la fijación proporciona resultados más limpios y más consistentes. </li><li> Células Centrifugar a 1000 xg durante 5 min a TA. Aspirar y desechar paraformaldehído, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento celular. </li><li> Suavemente, pero a fondo, resuspender el botón celular en 200 l de tampón de citometría de flujo frío (HBSS, 1% de FBS, EDTA 1 mM) y ejecutar la placa tan pronto como sea posible para evitar la aglutinación de células. </li></ol> 6. FRET Citometría de Flujo NOTA: Utilice un citómetro de flujo tal como el MACSQuant VYB, que está equipado con FRET-compatible líneas de láser y conjuntos de filtros (Tabla 2). Para cada paso dentro de esta sección, haga clic en el bien de interés utilizando la plantilla 96 y del software, y haga clic en&quot;Jugar&quot; para iniciar la captación de la muestra y el flujo. Hacer parcelas o tablas estadísticas haciendo clic en el icono &quot;nueva ventana de análisis &#39;. Cambiar parámetros de eje en parcelas de dos variables individuales haciendo clic en el título ya sea en el eje X o Y y seleccionar el filtro adecuado. Para desplazar poblaciones celulares o señales de fluorescencia, aumentar o disminuir las tensiones asociadas con los filtros adecuados. Con este instrumento, ejecute &lt;1.000 eventos / seg para garantizar el seguimiento de una sola célula exacta. <ol><li> Hacer una dispersión-Side Area (SSC-A) vs Forward Scatter-Área (FSC-A) trama bivariada, y con la línea celular # 1 en funcionamiento, ajustar los voltajes SSC y FSC hasta que la población de células es en el cuadrante inferior izquierdo. Haga clic en la herramienta polígono, y definir la población de células (Puerta P1). Para todos los parámetros de compuerta véase la Figura 2. </li><li> Haga una FSC-H (altura) vs FSC Un bivariado trama, y ​​aplicar Puerta P1 a esta parcela haciendo clic en &quot;vivo&quot; por encima de la trama, y ​​la selección de P1. Con la línea celular # 1corriendo, haga clic en la herramienta polígono, y definir las células individuales (Puerta P2). </li><li> Haga 3 parcelas de histograma, una para cada uno de los filtros de interés: PPC, YFP y FRET. Aplicar Puerta P2 a todas estas parcelas haciendo clic en &quot;vivo&quot; por encima de las parcelas, y la selección de P2. Con la línea celular # 1 en funcionamiento, ajustar los voltajes de tal manera que la población de células mediana en la PPC, YFP, y FRET histogramas son todos entre 0 y 1. Para medir PPC y FRET, excitar las células con el láser de 405 nm, y la captura de fluorescencia con una 450/50 nm y 525/50 nm filtro, respectivamente. Para medir YFP, excitar las células con un 488 nm láser y captura de fluorescencia con un 525/50 nm filtro. Ajustes del láser y el filtro se describen adicionalmente en la Tabla 2. </li><li> Realice una indemnización por PPC desbordamiento en los canales de FRET y YFP. NOTA: La compensación es el proceso de corrección de derrame de fluorescencia. Desbordamiento de fluorescencia se produce cada vez que se detecta la emisión de fluorescencia de un solo fluorocromo dentro de un filtro desiseñados para medir señal de otro fluorocromo. Con una indemnización adecuada, el desbordamiento de fluorescencia PPC puede ser retirado de los canales de FRET y YFP. NOTA: La compensación requiere la presencia de ambas células positivas y negativos de fluorescencia. Por lo tanto, para compensar en las células de la PPC-positivos (célula de la línea # 2), las células negativas (célula de la línea # 1) debe ser añadido a la muestra antes de la carrera. <ol><li> Spike en 30 l de línea celular # 1 suspensión de un solo pozo en 200 l de línea celular # 2 suspensión inmediatamente antes de la compensación. </li><li> Haga clic en el icono de &quot;Configuración del instrumento&quot;, a continuación, la pestaña &#39;compensación&#39;, y comprobar &quot;matriz&quot; para abrir la tabla de compensación. </li><li> Haga una FRET-A vs PPC-Una parcela bivariado, y aplicar P2 puerta, como se describe en el paso 6.3. Con líneas celulares 1 + 2 en ejecución, haga clic en el icono de &quot;cuadrante&quot; y dibujar cuadrantes de manera que las poblaciones de fluorescencia-negativos y -positivas están separadas por los dos cuadrantes inferiores (Puertas LL3 unnd LR3, respectivamente). </li><li> Crear una tabla de estadísticas que muestra la intensidad media de fluorescencia (MFI) de FRET para el LL3 y puertas LR3. Ajustar el parámetro de FRET en la matriz de compensación hasta que el MFI de la señal de FRET es equivalente entre LL3 y LR3. Después de este paso, la IMF de la señal de FRET es igual entre las células no teñidas y células CFP-positivos, lo que sugiere la ausencia de desbordamiento de la PPC en el canal de FRET. </li><li> Hacer un YFP-A vs PPC-Una parcela bivariado, y aplicar P2 puerta, como se describe en el paso 6.3. Dibuja cuadrantes (LL4 y LR4) similar a la realizada en el paso 6.4.3. </li><li> Crear una tabla de estadísticas que muestra el MFI de YFP para LL4 y LR4. Ajuste el parámetro de YFP en la matriz de compensación hasta que el MFI de la señal de YFP es equivalente entre LL4 y LR4. Después de este paso, la IMF de una señal de YFP es igual entre las células no teñidas y células CFP-positivos, lo que sugiere la ausencia de desbordamiento de la PPC en el canal de YFP. </li></ol></li><li> Folldebido configuración puerta y compensación, resalte pozos de interés y ejecutar el resto de la placa. </li><li> Después de todas las muestras se han ejecutado, archivos de datos de exportación haciendo clic en &#39;archivo&#39;, luego &#39;copia&#39;. Seleccione la pestaña &quot;archivos de datos &#39;, seleccione la carpeta experimento, y haga clic en« copia ». </li></ol> Análisis 7. Datos NOTA: parámetros de eje Cambio en parcelas de dos variables individuales haciendo clic en el título ya sea en el eje X o Y y seleccionar el filtro adecuado. <ol><li> Archivos FCS abiertas en la citometría de flujo programa de análisis. </li><li> Basado en las propiedades de dispersión, utilice una puerta poligonal para definir la población de células (SSC vs FSC) y la población singlete (FSC-H vs FSC-A) de las células tratadas con liposomas vacíos, de manera similar a la descrita en la Sección 6. </li><li> Si se realizó una compensación PPC durante la instalación, no ajuste más PPC. </li><li> Crear un FRET vs YFP bivariado trama. Utilizando la línea celular # 3, Definir una puerta falsa FRET mediante la elaboración de una puerta poligonal que se ejecuta a lo largo de la pendiente de la población de células FRET-positivo. Esta puerta excluye las células de un solo positivo YFP que emiten una señal de FRET dentro del filtro, y se extrae similar a la mostrada anteriormente mediante la prohibición et al. 22 </li><li> Definir una puerta FRET trazando celdas vacías de liposomas tratados PPC / YFP en un FRET vs PPC bivariado trama. Introducir una puerta poligonal a lo largo de la pendiente de la población que se extiende hacia arriba y hacia la izquierda lejos de la población. Esta puerta debe excluir la mayoría de las células (~ 99%), de tal manera que el fondo FRET es ≥1% de las células. Cualquier evento que cambian en esta puerta se consideran FRET-positivo. Nota: Cada una de las puertas se ha descrito anteriormente se aplica a todas las muestras antes de construir puertas posteriores. Tras el análisis, cuatro puertas individuales se definen (población celular; singlete; falsa FRET; FRET). </li><li> Parámetros de análisis de registro de interés, entre ellos: ciento positividad FRET y MFIde las células FRET-positivo. Calcular manualmente la densidad de FRET integrado midiendo el producto del porcentaje de positividad y la IMF. NOTA: Si la densidad de FRET integrado se utiliza como una medida de resultado, establezca FRET de fondo (tal como se define en el paso 7.5) y MFI a mayor que o igual a 1 con el fin de evitar el cálculo de un producto que es menos de sus dos factores individuales. </li></ol>

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This assay has been licensed to Janssen Pharmaceuticals.

La citometría de flujo del sistema FRET descrito aquí es una poderosa herramienta para evaluar de forma rápida y cuantitativamente la actividad de siembra tau. Sólo se requiere la experiencia de cultivo de células moderado y un conocimiento práctico de FRET y citometría de flujo. Otros ensayos de siembra, como tioflavina T - que exhibe fluorescencia aumentada cuando se une a la estructura de lámina beta - son laboriosos y requieren un sustrato de proteína pura, recombinante. Además, los ensayos in vitro</e...

La acumulación intracelular de tau amiloides define tauopatías tales como enfermedad de Alzheimer. En las etapas iniciales de la enfermedad, la patología es generalmente localizada en regiones discretas del cerebro, pero con progresión de la enfermedad, la patología se extiende invariablemente a lo largo de distintas redes neuronales 1-5. La evidencia acumulada sugiere propagación transcelular de agregados de proteínas tóxicas subyace en esta patología (revisado en 6-10). En este modelo, las semillas proteopathic (por ejemplo, tau) se liberan de las células del donante y entran en las células vecinas, la transformación de la proteína tau nativa en la forma mal plegada a través cambio conformacional con plantilla 11-15. El ensayo descrito aquí fue desarrollado para detectar con sensibilidad tal actividad siembra. Es compatible con la proteína recombinante y muestras biológicas y permite la cuantificación de los niveles de minutos de actividad siembra proteopathic 16. Células HEK 293T que expresan de forma estable tau d repeticiónOmain (RD) que contiene la mutación P301S asociado a la enfermedad ya sea fusionado a PPC o YFP (denominado en lo sucesivo como células tau-RD-CFP / YFP) servir como un biosensor estable de la actividad de la siembra. En ausencia de semillas proteopathic, las células mantener tau como un monómero soluble, y no tienen ningún fondo apreciable FRET. Absorción espontánea o transducción mediada por liposomas de las semillas de tau en las células, sin embargo, los resultados en RD-CFP y agregación RD-YFP, que produce una señal de FRET que se mide dentro de las células individuales a través de citometría de flujo. Numerosos componentes de este ensayo fueron diseñados para mejorar la sensibilidad y reducir la variabilidad. Fue seleccionado expresión ratio 1 RD-PPC / YFP, ya que proporciona óptima de la señal: Una línea celular monoclonal con un 1 ruido. Para aumentar la sensibilidad, los fosfolípidos se utilizan para introducir semillas directamente en las células (aunque para estudiar los mecanismos biológicos de la absorción, esto puede ser omitido). Por último, citometría de flujo monitores FRET a nivel de población y de una sola célula<html> nivel, a diferencia de otros ensayos de agregación de proteínas. La medida de resultado final, la densidad de FRET integrado, es altamente cuantitativo y representa tanto por el número de células con la agregación, y el grado en que se ha producido la agregación dentro de cada célula. Todos estos parámetros optimizados aumentar la sensibilidad y asegurar la reproducibilidad. Este sistema fue empleado recientemente en un estudio integral en ratones transgénicos tauopatía P301S 17 que evaluó la aparición temporal y la progresión de la actividad de siembra de tau en relación con otros marcadores patológicos tau uso común (por ejemplo, MC1, AT8, PG5 y tioflavinas). Actividad siembra es, con mucho, el marcador más temprana y más robusta de la patología tau evaluado, precediendo a la detección histológica por al menos 6 semanas. Siembra actividad aparece en 1,5 meses y aumenta progresivamente con la edad, lo que sugiere un papel causal de las semillas proteopathic en la aparición y / o progresión de la neurodegeneración 16. e_content &quot;&gt; cuantificación precisa de los niveles de diminutas de material de semilla a partir de muestras biológicas puede facilitar los estudios que monitorean progresión de la enfermedad temprana. Al acortar la duración del ensayo y permitiendo el uso de los animales más jóvenes, esto podría aumentar la eficiencia y la exactitud de los ensayos preclínicos con animales. Por ejemplo, en el ratón P301S se ha descrito anteriormente, los compuestos de plomo se podrían entregar tan pronto como 4-6 semanas (inmediatamente antes de, o al inicio de la actividad de la siembra), y controlado para la eficacia de 2-4 semanas más tarde. El ensayo debe cuantificar con precisión cualquier reducción de la siembra actividad. FRET citometría de flujo ha in vitro aplicaciones de cribado también. Por ejemplo, los reactivos anti-tau (por ejemplo, anticuerpos, moléculas pequeñas, etc.) se puede probar rápidamente por su capacidad para bloquear la inducción de la siembra directamente en cultivo, utilizando ya sea tau recombinante agregados o lisados ​​derivados del cerebro como una fuente de semilla (Figura 5). Con esta configuración, una vez que se prepara material de siembra, un experimento toma sólo tres días para completar, incluyendo el análisis de datos. La rápida cuantificación de la actividad de siembra proteopathic tanto, puede facilitar muchos estudios de la neurodegeneración.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>TBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5912</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protease Inhibitors (EDTA-free)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693159001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-vials</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.694.006</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>XSE 105DU</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing Boats</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-735-743</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1475-0501</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omni Sonic Ruptor Ultrasonic Homogenizer</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>18-000-115</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Tip for Ultrasonic Homogenizer</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>OR-T-156</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A451</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noise Cancelling Ear Muffs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-145-412</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S47299</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td><a href="http://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube-sterile.aspx">1615-5510</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424 000.215</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-136</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11965-084</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050-061</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300-054</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tubes</td>
			<td>Phenix Research</td>
			<td>SS-PH15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL reagent resevoirs</td>
			<td>VWR</td>
			<td>41428-954</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi channel pipet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>TI13-690-049</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat bottom plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3603</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31985-070</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well round bottom plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3788</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>RT 15710</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ED2SS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14185-052</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST 40 Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004509</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIOLiner Swinging Bucket Rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75003796</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>15170-172</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSQuant VYB Flow Cytomter</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-116</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chill 96 Rack</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-094-459</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Jo analysis software</td>
			<td>Flow Jo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 uL pipet tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>GPS-L10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 uL pipet tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>GPS-250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL pipet tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>GPS-1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 uL pipet tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-1800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipett</td>
			<td>Phenix Research</td>
			<td>SPG-606180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipett</td>
			<td>Phenix Research</td>
			<td>SPG-607180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Serological pipett</td>
			<td>Phenix Research</td>
			<td>SPG-760180</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sensitive detection of proteopathic seeding activity with fret flow cytometry

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and progression of pathology in several neurodegenerative diseases, including Alzheimer's disease and the related tauopathies. The potentially critical role of tau seeds in disease progression strongly supports the need for a sensitive assay that readily detects seeding activity in biological samples. 
By combining the specificity of fluorescence resonance energy transfer (FRET), the sensitivity of flow cytometry, and the stability of a monoclonal cell line, an ultra-sensitive seeding assay has been engineered and is compatible with seed detection from recombinant or biological samples, including human and mouse brain homogenates. The assay employs monoclonal HEK 293T cells that stably express the aggregation-prone repeat domain (RD) of tau harboring the disease-associated P301S mutation fused to either CFP or YFP, which produce a FRET signal upon protein aggregation. The uptake of proteopathic tau seeds (but not other proteins) into the biosensor cells stimulates aggregation of RD-CFP and RD-YFP, and flow cytometry sensitively and quantitatively monitors this aggregation-induced FRET. The assay detects femtomolar concentrations (monomer equivalent) of recombinant tau seeds, has a dynamic range spanning three orders of magnitude, and is compatible with brain homogenates from tauopathy transgenic mice and human tauopathy subjects. With slight modifications, the assay can also detect seeding activity of other proteopathic seeds, such as &#945;-synuclein, and is also compatible with primary neuronal cultures. The ease, sensitivity, and broad applicability of FRET flow cytometry makes it useful to study a wide range of protein aggregation disorders.

FRET citometría de flujo permite sensible, cuantitativa, y la detección rápida de la actividad de la siembra a partir de muestras biológicas o recombinantes. Ensayo de configuración es fácil: líneas celulares estables que expresan monoclonales derivados de tau-RD-CFP / YFP son transducidas con material de siembra, se incubaron durante 24-48 horas, y se sometieron a análisis de citometría de flujo (Figura 1A). En ausencia de semillas, las células mantienen biosensores tau en una forma monoméri...

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Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Cell-to-cell transfer of protein aggregates, or proteopathic seeds, may underlie the progression of pathology in neurodegenerative diseases. Here, a novel FRET flow cytometry assay is described that enables specific and sensitive detection of seeding activity from recombinant or biological samples.

Detección Sensible de Proteopathic Siembra Actividad con FRET Citometría de Flujo

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

sensitive-detection-proteopathic-seeding-activity-with-fret-flow

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.8K vistas.  University of Texas Southwestern Medical Center. Cell-to-cell transfer of protein aggregates, or proteopathic seeds, may underlie the progression of pathology in neurodegenerative diseases. Here, a novel FRET flow cytometry assay is described that enables specific and sensitive detection of seeding activity from recombinant or biological samples.

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Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to antigen presenting cells1-5. Internalization of nanoparticles (NP) by antigen presenting cells is a critical step in generating an effective immune response to the encapsulated antigen. To determine how changes in nanoparticle formulation impact function, we sought to develop a high throughput, quantitative experimental protocol that was compatible with detecting internalized nanoparticles as well as bacteria. To date, two independent techniques, microscopy and flow cytometry, have been the methods used to study the phagocytosis of nanoparticles. The high throughput nature of flow cytometry generates robust statistical data. However, due to low resolution, it fails to accurately quantify internalized versus cell bound nanoparticles. Microscopy generates images with high spatial resolution; however, it is time consuming and involves small sample sizes6-8. Multi-spectral imaging flow cytometry (MIFC) is a new technology that incorporates aspects of both microscopy and flow cytometry that performs multi-color spectral fluorescence and bright field imaging simultaneously through a laminar core. This capability provides an accurate analysis of fluorescent signal intensities and spatial relationships between different structures and cellular features at high speed.
	Herein, we describe a method utilizing MIFC to characterize the cell populations that have internalized polyanhydride nanoparticles or Salmonella enterica serovar Typhimurium. We also describe the preparation of nanoparticle suspensions, cell labeling, acquisition on an ImageStreamX system and analysis of the data using the IDEAS application. We also demonstrate the application of a technique that can be used to differentiate the internalization pathways for nanoparticles and bacteria by using cytochalasin-D as an inhibitor of actin-mediated phagocytosis.

In this article, we describe a method utilizing multi-spectral imaging flow cytometry to quantify the internalization of polyanhydride nanoparticles or bacteria by RAW 264.7 cells.

El análisis de la internalización celular de nanopartículas y bacterias en un Multi-espectral de Citometría de Flujo de imágenes

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Investigación

Bioingeniería

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

La evaluación de la administración de genes nanopartículas poliméricas por nanopartículas de análisis de seguimiento y de alto rendimiento Citometría de Flujo

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Wide-field Fluorescent Microscopy and Fluorescent Imaging Flow Cytometry on a Cell-phone

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general relatively bulky and costly, making them less effective in the resource limited settings. To potentially address these limitations, we have recently demonstrated the integration of wide-field fluorescent microscopy and imaging flow cytometry tools on cell-phones using compact, light-weight, and cost-effective opto-fluidic attachments. In our flow cytometry design, fluorescently labeled cells are flushed through a microfluidic channel that is positioned above the existing cell-phone camera unit. Battery powered light-emitting diodes (LEDs) are butt-coupled to the side of this microfluidic chip, which effectively acts as a multi-mode slab waveguide, where the excitation light is guided to uniformly excite the fluorescent targets. The cell-phone camera records a time lapse movie of the fluorescent cells flowing through the microfluidic channel, where the digital frames of this movie are processed to count the number of the labeled cells within the target solution of interest. Using a similar opto-fluidic design, we can also image these fluorescently labeled cells in static mode by e.g. sandwiching the fluorescent particles between two glass slides and capturing their fluorescent images using the cell-phone camera, which can achieve a spatial resolution of e.g. ~ 10 &mu;m over a very large field-of-view of ~ 81 mm2. This cell-phone based fluorescent imaging flow cytometry and microscopy platform might be useful especially in resource limited settings, for e.g. counting of CD4+ T cells toward monitoring of HIV+ patients or for detection of water-borne parasites in drinking water.

We review our recent results on the integration of fluorescent microscopy and imaging flow cytometry tools on a cell-phone using compact and cost-effective opto-fluidic attachments. These cell-phone based micro-analysis devices might be useful for cytometric analysis, such as performing various cell counting tasks as well as for high-throughput screening of e.g., water samples in resource limited settings.

Wide-field microscopía de fluorescencia y citometría de flujo fluorescente de imágenes en un teléfono móvil

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general ...

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich cell structures and de facto there is still no quantitative method to assess their distribution at cell and tissue levels. What we propose here is an innovative method allowing the detection and quantification of CNTs in cells using a multispectral imaging flow cytometer (ImageStream, Amnis). This newly developed device integrates both a high-throughput of cells and high resolution imaging, providing thus images for each cell directly in flow and therefore statistically relevant image analysis. Each cell image is acquired on bright-field (BF), dark-field (DF), and fluorescent channels, giving access respectively to the level and the distribution of light absorption, light scattered and fluorescence for each cell. The analysis consists then in a pixel-by-pixel comparison of each image, of the 7,000-10,000 cells acquired for each condition of the experiment. Localization and quantification of CNTs is made possible thanks to some particular intrinsic properties of CNTs: strong light absorbance and scattering; indeed CNTs appear as strongly absorbed dark spots on BF and bright spots on DF with a precise colocalization.
This methodology could have a considerable impact on studies about interactions between nanomaterials and cells given that this protocol is applicable for a large range of nanomaterials, insofar as they are capable of absorbing (and/or scattering) strongly enough the light.

In this study, the main purpose was to monitor the cellular uptake and eventual exocytosis of carbon nanotubes (CNTs). From this perspective, we proposed here a unique method using multispectral imaging flow cytometry allowing a quantification and localization of CNTs in a statistically relevant number of cells.

Localización y cuantificación relativa de nanotubos de carbono en las células con multiespectral de imágenes de Citometría de Flujo

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

Flying Insect Detection and Classification with Inexpensive Sensors

An inexpensive, noninvasive system that could accurately classify flying insects would have important implications for entomological research, and allow for the development of many useful applications in vector and pest control for both medical and agricultural entomology. Given this, the last sixty years have seen many research efforts devoted to this task. To date, however, none of this research has had a lasting impact. In this work, we show that pseudo-acoustic optical sensors can produce superior data; that additional features, both intrinsic and extrinsic to the insect&#8217;s flight behavior, can be exploited to improve insect classification; that a Bayesian classification approach allows to efficiently learn classification models that are very robust to over-fitting, and a general classification framework allows to easily incorporate arbitrary number of features. We demonstrate the findings with large-scale experiments that dwarf all previous works combined, as measured by the number of insects and the number of species considered.

We proposed a system that uses inexpensive, noninvasive pseudo-acoustic optical sensors to automatically and accurately detect, count, and classify flying insects based on their flying sound.

Flying detección de insectos y Clasificación con Sensores Barato

An inexpensive, noninvasive system that could accurately classify flying insects would have important implications for entomological research, and allow ...

Fast Enzymatic Processing of Proteins for MS Detection with a Flow-through Microreactor

The vast majority of mass spectrometry (MS)-based protein analysis methods involve an enzymatic digestion step prior to detection, typically with trypsin. This step is necessary for the generation of small molecular weight peptides, generally with MW &#60; 3,000-4,000 Da, that fall within the effective scan range of mass spectrometry instrumentation. Conventional protocols involve O/N enzymatic digestion at 37 &#186;C. Recent advances have led to the development of a variety of strategies, typically involving the use of a microreactor with immobilized enzymes or of a range of complementary physical processes that reduce the time necessary for proteolytic digestion to a few minutes (e.g., microwave or high-pressure). In this work, we describe a simple and cost-effective approach that can be implemented in any laboratory for achieving fast enzymatic digestion of a protein. The protein (or protein mixture) is adsorbed on C18-bonded reversed-phase high performance liquid chromatography (HPLC) silica particles preloaded in a capillary column, and trypsin in aqueous buffer is infused over the particles for a short period of time. To enable on-line MS detection, the tryptic peptides are eluted with a solvent system with increased organic content directly in the MS ion source. This approach avoids the use of high-priced immobilized enzyme particles and does not necessitate any aid for completing the process. Protein digestion and complete sample analysis can be accomplished in less than ~3 min and ~30 min, respectively.

A quick protocol for proteolytic digestion with an in-house built flow-through tryptic microreactor coupled to an electrospray ionization (ESI) mass spectrometer is presented. The fabrication of the microreactor, the experimental setup and the data acquisition process are described.

Tratamiento enzimático rápido de proteínas para la detección MS con un microrreactor de flujo continuo

The vast majority of mass spectrometry (MS)-based protein analysis methods involve an enzymatic digestion step prior to detection, typically with trypsin. ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, including diabetic retinopathy and glaucoma, in addition to normal aging. Despite their importance, RGCs have been extremely difficult to study until now due in part to the fact that they comprise only a small percentage of the wide variety of cells in the retina. In addition, current isolation methods use intracellular markers to identify RGCs, which produce non-viable cells. These techniques also involve lengthy isolation protocols, so there is a lack of practical, standardized, and dependable methods to obtain and isolate RGCs. This work describes an efficient, comprehensive, and reliable method to isolate primary RGCs from mice retinae using a protocol based on both positive and negative selection criteria. The presented methods allow for the future study of RGCs, with the goal of better understanding the major decline in visual acuity that results from the loss of functional RGCs in neurodegenerative diseases.

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Millions of people suffer from retinal degenerative diseases that result in irreversible blindness. A common element of many of these diseases is the loss of retinal ganglion cells (RGCs). This detailed protocol describes the isolation of primary murine RGCs by positive and negative selection with flow cytometry.

Aislamiento de células primarias de ganglio retiniano murino (RGC) por citometría de flujo

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and introduces uncertainty in results due to variability between scorers. To remedy this, automated slide-scanning microscopy as well as conventional flow cytometry methods have been introduced in an attempt to remove scorer bias and improve throughput. However, these methods have their own inherent limitations such as inability to visualize the cytoplasm of the cell and the lack of visual MN verification or image data storage with flow cytometry. Multispectral Imaging Flow Cytometry (MIFC) has the potential to overcome these limitations. MIFC combines the high resolution fluorescent imagery of microscopy with the statistical robustness and speed of conventional flow cytometry. In addition, all collected imagery can be stored in dose-specific files. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the MN assay on MIFC. Human lymphoblastoid TK6 cells were enlarged using a hypotonic solution (75 mM KCl), fixed with 4% formalin and the nuclear content was stained with Hoechst 33342. All samples were run in suspension on the MIFC, permitting acquisition of high resolution images of all key events required for the assay (e.g. binucleated cells with and without MN as well as mononucleated and polynucleated cells). Images were automatically identified, categorized and enumerated in the MIFC data analysis software, allowing for automated scoring of both cytotoxicity and genotoxicity. Results demonstrate that using MIFC to perform the in vitro MN assay allows statistically significant increases in MN frequency to be detected at several different levels of cytotoxicity when compared to solvent controls following exposure of TK6 cells to Mitomycin C and Colchicine, and that no significant increases in MN frequency are observed following exposure to Mannitol.

The in vitro micronucleus assay is a well-established method for evaluating genotoxicity and cytotoxicity but scoring the assay using manual microscopy is laborious and suffers from subjectivity and inter-scorer variability. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the assay using multispectral imaging flow cytometry.

Un método automatizado para realizar el ensayo de micronúcleos In Vitro mediante citometría de flujo de imágenes multiespectral

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies for the detection of CTCs include flow cytometry, microfluidic devices, and real-time polymerase chain reaction (RT-PCR). Despite recent advances, methods for the detection of early ovarian cancer metastasis still lack the sensitivity and specificity required for clinical translation. Here, a novel method is presented for the detection of ovarian circulating tumor cells by photoacoustic flow cytometry (PAFC) utilizing a custom three dimensional (3D) printed system, including a flow chamber and syringe pump. This method utilizes folic acid-capped copper sulfide nanoparticles (FA-CuS NPs) to target SKOV-3 ovarian cancer cells by PAFC. This work demonstrates the affinity of these contrast agents for ovarian cancer cells. The results show NP characterization, PAFC detection, and NP uptake by fluorescence microscopy, thus demonstrating the potential of this novel system to detect ovarian CTCs at physiologically relevant concentrations.

A protocol is presented to detect circulating ovarian tumor cells utilizing a custom-made photoacoustic flow system and targeted folic acid-capped copper sulfide nanoparticles.

Detección de cáncer de ovario mediante citometría de flujo fotoacústico

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. Considering an implant as a foreign body, a hostile and dysregulated immune response may result in the rejection of the implant, while a regulated response and regaining of homeostasis can lead to its acceptance. Analyzing the microenvironments of implants dissected out under in vivo or ex vivo&#160;settings can help in understanding the pattern of immune response, which can ultimately help in developing new generations of biomaterials. Flow cytometry is a well-known technique for characterizing immune cells and their subsets based on their cell surface markers. This review describes a protocol based on manual dicing, enzymatic digestion, and filtration through a cell strainer for the isolation of uniform cell suspensions from dissected implant tissue. Further, a multicolor flow cytometry staining protocol has been explained, along with steps for initial cytometer settings to characterize and quantify these isolated cells by flow cytometry.

Isolation of cells from dissected implants and their characterization by flow cytometry can significantly contribute to understanding the pattern of immune response against implants. This paper describes a precise method for the isolation of cells from dissected implants and their staining for flow cytometric analysis.