Este protocolo ayudará a los investigadores nuevos en el trabajo con aptámeros a poder usarlos en sus proyectos y también a comprender los pequeños pasos individuales que se requieren para completar el protocolo. Los aptámeros son muy versátiles, y este protocolo demuestra lo fáciles y simples que son en un ensayo de inmunofenotipado. Los aptámeros se pueden utilizar tanto para aplicaciones diagnósticas como terapéuticas.
Este protocolo es el primer paso dado para confirmar su especificidad y sensibilidad. Si bien este ensayo en particular demuestra la tinción de un receptor de superficie celular, los aptámeros se pueden usar muy fácilmente para la citometría de flujo multiparamétrica, proporcionando un alto nivel de conocimiento fenotípico. Los aspectos importantes de trabajar con aptámeros son asegurarse de que estén plegados correctamente antes de su uso, y también que las condiciones de tampón y fuerza iónica sean las mismas que cuando fueron seleccionados.
Después de recoger y desechar el medio en el matraz, añadir tres mililitros de PBS y extenderlo sobre las células. Después de añadir un mililitro de 0,25% de tripsina-EDTA a cada matraz, incubar durante cinco a 10 minutos a 37 grados centígrados y visualizar el desprendimiento de células bajo un microscopio. A continuación, agregue un mililitro de medio completo a las células y pipetear las células hacia arriba y hacia abajo para hacer una suspensión de una sola celda.
Pipetear las células en un tubo apropiado y centrifugar a 200 G durante cinco minutos. Después de desechar el sobrenadante, resuspenda las células en un mililitro de medio fresco y cuente las células usando tinción de azul de tripano diluyendo cierto volumen de suspensión celular con azul de tripano. Distribuir aproximadamente 15 microlitros de la mezcla entre un hemocitómetro y un vidrio de cubierta para contar las células.
Recopile el número requerido de células, asegurándose de tener cien mil células por muestra de prueba. Luego incubar las células a 37 grados centígrados durante dos horas para permitir la estabilización de la proteína de interés en la membrana celular después del desprendimiento enzimático. Después de las dos horas de incubación, centrifugar las células a 500 G durante cinco minutos.
Después de desechar el sobrenadante, resuspenda las células en 500 microlitros de tampón de bloqueo. Incubar las células a cuatro grados centígrados durante 30 minutos con mezcla intermitente. Durante esta incubación de 30 minutos, realice el plegamiento del aptámero preparando el doble de las concentraciones de aptámeros que se describen en el manuscrito.
A continuación, mezcle e incube los aptámeros con la máquina termocicladora de acuerdo con las condiciones de plegado requeridas, asegurándose de proteger los aptámeros de la luz. Después de la incubación de 30 minutos, centrifugar las células como se demostró anteriormente y eliminar el sobrenadante. Luego agregue un mililitro de tampón de lavado y centrifugar las celdas nuevamente.
Después de retirar el sobrenadante, resuspenda las células en un volumen adecuado del tampón de unión. A continuación, pipetear 50 microlitros de las células resuspendidas en cada pocillo de una placa negra helada de 96 pocillos. Luego pipetear 50 microlitros de los aptámeros sobre un volumen de células de 50 microlitros, mezclar e incubar en la oscuridad a cuatro grados centígrados durante 30 minutos.
Después de centrifugar y retirar el sobrenadante, vuelva a suspender cuidadosamente el pellet en tampón de lavado y vuelva a centrifugar a 500 G durante cinco minutos. Luego vuelva a suspender en 100 microlitros de tampón de lavado para el análisis citométrico de flujo mientras repite el paso de lavado dos veces. Primero, encienda el citómetro de flujo y luego la computadora.
A continuación, abra el software de análisis de citometría de flujo, inicie sesión en el programa y, en la pestaña del citómetro, ejecute el inicio del fluido. Para crear un nuevo experimento, en la pestaña experimento, haga clic en nueva carpeta y asigne al experimento de barra diagonal el nombre adecuado. Haga clic en la nueva carpeta para resaltarla.
A continuación, en la pestaña experimento de nuevo, haga clic en nuevo experimento y asigne al experimento el nombre adecuado. Para agregar la primera muestra de barra, en la pestaña experimento, haga clic en nueva muestra y asigne el nombre apropiado a la muestra. Para agregar una muestra de tubo, resalte la muestra y, en la pestaña experimento, haga clic en nuevo tubo.
A continuación, agregue el número apropiado de tubos y el nombre. Para preparar los gráficos necesarios, en una pestaña de hoja de cálculo, abra una nueva hoja de cálculo. Una vez que aparezca la nueva ventana de la hoja de cálculo, prepare un gráfico de borrado de puntos de dispersión lateral versus dispersión directa para seleccionar la población de interés.
Prepare un gráfico de borrado de puntos de la altura de dispersión hacia adelante frente al área de dispersión hacia adelante para seleccionar la población de una sola celda. A continuación, prepare un histograma del número de eventos contra el fluoróforo de interés. Asegúrese de que el panel de adquisición para controlar la adquisición de muestras, el inspector y el citómetro para ajustar los parámetros de voltaje, así como la hoja de trabajo con todos los gráficos, estén abiertos antes de comenzar la citometría de flujo.
Primero, ejecute las células no tratadas. Asegúrese de que la flecha que apunta al tubo sea verde. Si esta flecha no es verde, haga clic en la flecha para que sea verde.
Con una pipeta, transfiera cada muestra de la placa negra de 96 pocillos a un tubo de citometría de flujo. En el panel de adquisiciones, elija un número adecuado de eventos para registrar, cambie el caudal a bajo y haga clic en Adquirir datos. Ajuste el voltaje para los parámetros FSC y SCC, asegurando que la población de celdas esté centralizada dentro del diagrama de puntos y que ninguna celda toque ninguno de los ejes del gráfico para evitar perder las celdas de interés.
Defina la primera puerta identificando y seleccionando la población de interés en una gráfica de densidad dispersa hacia adelante y hacia los lados, excluyendo los escombros, que constituyen la población con la señal de dispersión hacia adelante más baja. Defina la segunda puerta excluyendo las poblaciones de células dobles, ya que las células dobletes afectan considerablemente los resultados y las conclusiones. Aumente la velocidad de adquisición a media o alta para analizar las muestras más rápido, pero no exceda más de 200 a 300 eventos por segundo.
A continuación, haga clic en grabar datos. Después de ajustar el voltaje y la activación y registrar los datos, saque la muestra y haga clic en Next Tube (Siguiente tubo). Inserte la siguiente muestra y repita los datos de grabación para todas las muestras de control y prueba.
Una vez recopilados todos los datos, lave el citómetro de flujo haciendo funcionar tres tubos de lejía al 50%, FACSRinse y agua ultrapura, cada uno durante cinco minutos a un caudal alto. Luego, en el menú desplegable del citómetro, haga clic en Apagado de fluidos. Exporte el resultado como archivos fsc a una unidad USB para transferir.
Analícelos utilizando el software de análisis presionando el botón nuevo para crear un nuevo documento y una ventana para manejar el análisis, y arrastre los archivos de muestra a la nueva ventana. Haga doble clic para abrir la muestra sin teñir. Para bloquear la población de una sola célula, elija la población P1 y haga doble clic en la población P1 para crear un gráfico FSCH versus FSCA.
Haga doble clic en las celdas individuales cerradas para crear un histograma de eventos contra el fluorocromo utilizado. En la ventana original, seleccione P1 y celdas individuales y arrástrelas a todas las muestras para que todas las muestras ahora contengan el mismo gating. A continuación, haga clic en el botón del editor de diseño para abrir la ventana de diseños y arrastre dos muestras una sobre la otra para crear un histograma de superposición.
En las células MDA-MB-231 positivas para EpCAM, la superposición de los histogramas que representan las células tratadas con TEPP y TENN muestra que las células tratadas con TEPP se desplazan hacia la derecha, en comparación con las células tratadas con TENC, lo que demuestra que la unión del aptámero TEPP se produce a la proteína de interés. En el control negativo, las células HEK 293T que superponen histogramas de TEPP y TENN no reflejan ningún cambio, lo que indica que en las células que expresan EpCAM TEPP es el aptámero EpCAM unido a su receptor. Y además, no se observó unión en células EpCAM negativas, lo que confirma la selectividad y especificidad del aptámero desarrollado.
Asegúrese de que los aptámeros estén protegidos de la luz, que los aptámeros y las células se mezclen en la placa y que se establezcan los voltajes correctos en el citómetro de flujo. Esto depende en gran medida de futuras aplicaciones para los aptámeros. Por ejemplo, estamos enfocados en la administración de medicamentos.
Así que el siguiente paso para nosotros sería evaluar si los aptámeros se internalizan mediante microscopía fluorescente. Este protocolo ha demostrado lo fácil que es para los aptámeros reemplazar los anticuerpos monoclonales y policlonales en los ensayos de inmunofenotipado.
