Los autores desean reconocer las fuentes de financiación, incluyendo la AHA (13GRNT16990019 a WT) y NHLBI (HL097246 y HL119371 de WT).

1. Silanización y Biomolécula funcionalización de diapositivas o policarbonato Membrana Nota: Muchos de los productos químicos y soluciones dentro de este protocolo tienen altas tasas de evaporación (etanol (EtOH), acetona, etc.). Otros pasos implican largos tiempos de incubación para bajas tasas de evaporación. Se recomienda película de parafina para sellar los contenedores. Precaución: Muchos de los productos químicos (incluyendo: ácido sulfúrico, acetona, (3-aminopropil) trietoxisilano, glutaraldehído, EtOH) se consideran peligrosos, o volátil. Consulte la hoja de datos de seguridad de materiales (MSDS) de cada material para el almacenamiento, manejo y disposición antes de su uso. <ol><li> Coloca nueva lámina de vidrio que mide 75 mm por 50 mm por 1 mm, en limpio, portaobjetos de vidrio plato de tinción sin tener en cuenta la orientación, garantizar la plena inmersión. Utilice contenedores para los pasos 1.1-1.12. Nota: Para el co-cultivo, incluyen policarbonato (PC) de la membrana con 0,4 micras de tamaño de poro, cortado a la medida de 75 mm por 50 mm, para todos ste posteriorps para funcionalización PC y siembra CE. </li><li> Sumerja diapositivas en ácido sulfúrico (20%), O / N. Precaución: Consulte MSDS para el ácido sulfúrico antes de su uso. </li><li> Lavar portaobjetos sumergiéndolo en agua desionizada (DI) durante 5 minutos, tres veces, cambiando DI cada vez. </li><li> Sumergir diapositivas en acetona durante 30 min. Precaución: Consulte MSDS para la acetona antes de su uso. </li><li> Sumergir diapositiva en 6% (3-aminopropil) trietoxisilano solución / acetona O / N. Precaución: Consulte MSDS para (3-aminopropil) trietoxisilano y acetona antes de su uso. </li><li> Sumergir diapositivas en acetona durante 5 min, tres veces, cambiando acetona cada vez. Precaución: Consulte MSDS para la acetona antes de su uso. </li><li> Lavar portaobjetos sumergiéndolo en DI durante 5 minutos, tres veces, cambiando DI cada vez. </li><li> Sumerja diapositiva en solución de glutaraldehído / DI 1,5% durante 60 min. Precaución: Consulte MSDS para glutaraldehído antes de su uso. </li><li> Lavar portaobjetos sumergiéndolo en DI durante 5 minutos, dos veces, cambiando DI cada vez. </li><li> Lugar de diapositivass en 70% de etanol (EtOH) durante 30 min en, campana de flujo laminar estéril. </li><li> Eliminar EtOH y permitir que se evapore residuo restante. Sumergir los portaobjetos en DI estéril y de drenaje con el fin de rehidratar las diapositivas. Nota: Los portaobjetos o membrana PC se puede sellar en el soporte de portaobjetos de vidrio y se almacenó a 4 ° C durante hasta una semana. Tras el uso para el cultivo celular, repita los pasos 1.10 y 1.11. </li><li> Retire la diapositiva del soporte de diapositivas y colocarlo en un 100 mm por 100 mm placa de Petri cuadrado en la campana de flujo laminar. Nota: Este contenedor se utiliza para todos los pasos restantes. <ol><li> Preparar diapositiva o PC para la siembra de células endoteliales para el experimento monocultivo. <ol><li> Escudo de la diapositiva funcionalizado o PC (paso 1,11) con 1 ml de solución de fibronectina (25 mg / ml), en un lado, cubriendo el área aproximada expuesto a la cámara de cultivo celular. </li><li> Incubar diapositivas o PC en la incubadora estéril a 37 ° C durante 1-2 horas. </li><li> Después de la incubación, aspirar la solución restante utilizando una glass pipeta aspirador conectado a un vacío. Nota: Las diapositivas puede ahora ser almacenada O / N a 4 ° C para su uso futuro. </li></ol></li><li> Siga 1.12.2 pasos sólo para preparar CE / SMC co-cultivo. Preparar y sembrar la cultura de células de músculo liso (SMC) para el experimento de co-cultivo. <ol><li> Place junta de silicona en la parte superior de la corredera (etapa 1.11), con dimensiones de 75 mm por 50 mm de diámetro exterior, diámetro interior de 50 mm por 30 mm, espesor de 0,5 mm, y perforaciones que se alinean con vacío de la cámara de flujo. </li><li> Prepare 1 ml de SMC en el 10% de FBS / DMEM suspensión. Neutralizar 1 ml de solución de 2 mg / ml de colágeno de tipo I con 7% de NaHCO3 y solución 0,1 M de NaOH a pH de 7,4, y mezclar con la suspensión de SMC con la densidad celular final de 2 x 10 6 células / ml. </li><li> Corre solución SMC dentro de la junta e incubar diapositivas a 37 ° C y CO 2 al 5% durante 30 min. </li><li> Después de la incubación, cubrir la diapositiva 25 ml con suero bovino fetal al 0,1% (FBS) mezclado en modificado por DulbeccoMedio Eagle (DMEM) durante 72 horas. </li></ol></li></ol></li><li> Células endoteliales Cultura (ECS) de membrana de vidrio deslizante / policarbonato. <ol><li> Semilla de 1 ml ECs en 10% de FBS / DMEM, con concentración inicial de 6,0 x 10 5 células / ml, en las superficies de fibronectina de portaobjetos de vidrio o membrana de policarbonato. </li><li> Se incuban las células en una incubadora a 37 ° C, 5% de CO 2, y 10% de FBS durante 120 min. </li><li> Toboganes cubierta que contienen células con adicional del 10% de FBS / DMEM y lugar en la incubadora de 37 ° C, 5% de CO 2 O / N, hasta el 70% y el 80% de confluencia. </li></ol></li></ol> 2. Determinación de la viscosidad del fluido y volumétrico Caudal Nota: Los viscosímetros giratorias son equipos sensibles, y el manual de usuario viscosímetro deben ser consultados antes de la calibración, puesta a cero, o la realización de mediciones. <ol><li> Determinar la cizalladura de fluido deseada (τ) a partir de la literatura de la vasculatura objetivo del experimento. </li><li> Measure 1% FBS / DMEM viscosidad (μ), usando un viscosímetro rotacional. </li><li> Determinar la tasa de flujo volumétrico requerido (Q) de la ecuación de Poiseuille: <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/53224/53224eq1.jpg" /> , donde τ = esfuerzo cortante del fluido, μ = viscosidad, Q = vol. caudal, w = cámara de anchura, y h = altura de la cámara). </li><li> Bomba de Ajuste a la tasa derivada en el paso 2.3 fluya, y el uso de todos los pasos posteriores. </li></ol> 3. Determinación del Índice de pulsatilidad Nota: Todos los puertos de conexión dentro del sistema se deben conectar con la lengüeta de bloqueo-ring-a-tamaño adecuado, o las conexiones hembra luer-a púa. Conexión de tubos de PVC puede entonces conectarse a accesorios de lengüeta, y el circuito completo. <ol><li> Conectar circuito de flujo como en la Figura 2, con amortiguación cámara (Figura 3) y medidor de flujo ultrasónico en la dirección del flujo correcto. Nota: caudalímetro ultrasónico es una pieza sensible del equipo, yel manual del usuario debe ser consultado antes de su uso. </li><li> Rellene circuito de flujo y el depósito con agua DI, asegurando tubo de salida del depósito (bombear) se sumerge dentro del volumen del depósito. Visualizar la forma de onda de flujo usando un medidor de flujo. </li><li> Válvula de escape de aire libre en la cámara de amortiguación para cambiar la relación de volumen de líquido / aire. Cerrar la válvula de liberación de aire en diferentes intervalos de nivel de líquido y calcular el índice de pulsatilidad (PI = (V Max - V Min) / V Mean) mediante el uso de pico de la forma de onda de flujo (V Max), depresión (V Min), y la media (V media). Valores de PI de Registros en el cuaderno. </li><li> Marcos resultante del nivel de fluido y PI en la cámara de amortiguación, con un fieltro de punta, pluma de tinta permanente para uso futuro. Determinar los niveles de PI deseados de la literatura patología 11. </li><li> Tubo de silicona de formaciones opcional, el método más avanzado de pulsatilidad control <ol><li> Mezclar la base de elastómero de silicona y agente de curado a diferentes relaciones (por ejemplo, una basrelación de e-reticulante a partir de 10: 1 a 36: 1.) para variaron módulos elásticos dirigidos, como se ilustra previamente 2 </li><li> Fabrique tubos de silicona por repetida proceso de inmersión-cura, sumergiendo brevemente cánula de acero (14 G) en la mezcla de prepolímero de silicona con una relación base-reticulante predeterminado. </li><li> Coloque la cánula prepolímero recubierto en un horno a 60 ° C durante 4 horas para curar el revestimiento de polímero sobre la cánula, el cambio de la dirección en el medio de proceso de curado. </li><li> Repetir el proceso de inmersión con la misma mezcla de elastómero de silicona y colocarlo de nuevo en el horno durante 4 h adicionales, lo que resulta en ~ 0,3 mm tubos de espesor. </li><li> Retire el tubo de silicona ultrafina de la cánula de acero inoxidable. </li><li> Conecte los tubos al circuito en lugar de cámara de amortiguación, y PI prueba para cada flujo como en 3.3. </li></ol></li></ol> Esterilización 4. Bomba <ol><li> Sumergir la cámara de flujo (Figura 2), tubos de PVC, y las juntas en 1Peróxido de hidrógeno 0% (H 2 O 2). Lavar con DI estéril antes del paso 4. </li><li> Coloque la bomba de sangre en un estante incubadora de repuesto. Nota: Los estantes Incubadora deben ser de acero inoxidable, y ser capaz de soportar el peso del circuito de flujo entero. </li><li> Llenar el circuito de flujo y el depósito con 10% H 2 O 2, garantizando tubo de salida del depósito (para bombear) está sumergido dentro del volumen del depósito. Circule H 2 O 2 por bombeo a través del circuito durante 20 minutos en la campana de flujo laminar con luz UV en. </li><li> Aspire todo el H 2 O 2 de la tubería, y lavar con PBS estéril por bombeo a través del circuito de flujo. </li></ol> 5. Flow conjunto de la cámara Nota: La cámara de flujo consta de un acrílico, placa hecha a medida, con los puertos de vacío y de entrada y puertos de flujo de salida (ver Figura 2). Conjunto de la cámara consiste en colocar la cámara de flujo y las juntas en la parte superior de las diapositivas de la cultura, proPerly alineado, y se describe a continuación. <ol><li> Calentar 1% FBS / DMEM en un baño de agua a 37 ° C y preparar la cámara de flujo. <ol><li> Tome diapositivas CE fuera de los medios de comunicación (del paso 1.13) y el lugar de junta en la parte superior con el lado celular para arriba. </li><li> (Opcional) Tome membrana PC de los medios de comunicación (del paso 1.13) y el lugar de junta en la parte superior con el lado celular para arriba. Coloque diapositivas co-cultivo con cabeza de serie SMC (paso 1.12.2) por debajo de la membrana PC. </li></ol></li><li> Alinear canal de vacío de la cámara de flujo con los orificios de la junta (Figura 2). </li><li> Conecte el tubo de vacío a los puertos de vacío (Figura 2), lo que garantiza no hay fugas de los medios de comunicación a vacío. </li><li> Place lámina de policarbonato debajo portaobjetos de vidrio y conjunto de cámara de flujo de abrazadera con abrazaderas de resorte, uno a cada lado de la cámara de flujo (Figuras 2 y 5). </li><li> Sistema de Place de flujo en incubadora a 37 ° C y 5% de CO 2, y llenar el circuito con los medios de comunicación mediante el bombeo desde el depósito lleno a baja pulsatilidad.Mantener este flujo durante 4 horas para el acondicionamiento previo células. </li><li> Ajuste el volumen de fluido en la amortiguación de cámara a nivel PI marcada, y la cultura para el tiempo deseado. </li></ol>

<ol>
	<li>Scott-Drechsel, D., Su, Z., Hunter, K., Li, M., Shandas, R., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+flow+co-culture+system+for+studying+mechanobiology+effects+of+pulse+flow+waves.">A new flow co-culture system for studying mechanobiology effects of pulse flow waves.</a> Cytotechnology. 64 (6), 649-666 (2012).</li><li>Tan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stiffening-Induced+High+Pulsatility+Flow+Activates+Endothelial+Inflammation+via+a+TLR2/NF-&#954;B+Pathway.">Stiffening-Induced High Pulsatility Flow Activates Endothelial Inflammation via a TLR2/NF-&#954;B Pathway.</a> PLoS ONE. 9 (7), e102195 (2014).</li><li>Wexler, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+Artery+Calcification:+Pathophysiology,+Epidemiology,+Imaging+Methods,+and+Clinical+Implications+A+Statement+for+Health+Professionals+From+the+American+Heart+Association.">Coronary Artery Calcification: Pathophysiology, Epidemiology, Imaging Methods, and Clinical Implications A Statement for Health Professionals From the American Heart Association.</a> Circulation. 94 (5), 1175-1192 (1996).</li><li>Lan, T. -. H., Huang, X. -. Q., Tan, H. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+fibrosis+in+atherosclerosis.">Vascular fibrosis in atherosclerosis.</a> Cardiovasc Pathol. 22 (5), 401-407 (2013).</li><li>Lee, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+endothelial+recovery+and+reducing+neointimal+hyperplasia+using+sequential-like+release+of+acetylsalicylic+acid+and+paclitaxel-loaded+biodegradable+stents.">Promoting endothelial recovery and reducing neointimal hyperplasia using sequential-like release of acetylsalicylic acid and paclitaxel-loaded biodegradable stents.</a> Int J Nanomedicine. 9, 4117-4133 (2014).</li><li>Intengan, H. D., Schiffrin, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+Remodeling+in+Hypertension+Roles+of+Apoptosis+Inflammation,+and+Fibrosis.">Vascular Remodeling in Hypertension Roles of Apoptosis Inflammation, and Fibrosis.</a> Hypertension. 38 (3), 581-587 (2001).</li><li>Greil, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+carotid+artery+flow+velocities+after+stent+implantation:+a+fluid+dynamics+study+with+laser+Doppler+anemometry.">Changes in carotid artery flow velocities after stent implantation: a fluid dynamics study with laser Doppler anemometry.</a> J Endovasc Ther. 10 (2), 275-284 (2003).</li><li>Egorova, A. D., van der Heiden, K., Poelmann, R. E., Hierck, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cilia+as+biomechanical+sensors+in+regulating+endothelial+function.">Primary cilia as biomechanical sensors in regulating endothelial function.</a> Differentiation. 83 (2), S56-S61 (2012).</li><li>Liu, S. Q., Goldman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+blood+shear+stress+in+the+regulation+of+vascular+smooth+muscle+cell+migration.">Role of blood shear stress in the regulation of vascular smooth muscle cell migration.</a> IEEE T Bio-Med Eng. 48 (4), 474-483 (2001).</li><li>Scott, D., Tan, Y., Shandas, R., Stenmark, K. R., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+pulsatility+flow+stimulates+smooth+muscle+cell+hypertrophy+and+contractile+protein+expression.">High pulsatility flow stimulates smooth muscle cell hypertrophy and contractile protein expression.</a> AJP: Lung C. 304 (1), L70-L81 (2013).</li><li>Panaritis, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsatility+Index+of+Temporal+and+Renal+Arteries+as+an+Early+Finding+of+Arteriopathy+in+Diabetic+Patients..">Pulsatility Index of Temporal and Renal Arteries as an Early Finding of Arteriopathy in Diabetic Patients..</a> Ann Vasc Surg. 19 (1), 80-83 (2005).</li><li>Miao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Flow+Patterns+on+the+Localization+and+Expression+of+VE-Cadherin+at+Vascular+Endothelial+Cell+Junctions:+In+vivo+and+in+vitro+Investigations.">Effects of Flow Patterns on the Localization and Expression of VE-Cadherin at Vascular Endothelial Cell Junctions: In vivo and in vitro Investigations.</a> J Vasc Res. 42 (1), 77-89 (2005).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo describe un método de reproducción de flujo pulsátil in vitro, y puede ser el primer paso decisivo en la determinación de la contribución de las condiciones de flujo a las patologías de la enfermedad. Estudios anteriores utilizando este protocolo han encontrado condiciones de flujo contribuyen a. La respuesta inflamatoria vascular 1, 10 Además, este protocolo está destinado a laboratorios con experiencia. Como tal, ni en la mecánica de fluidos de profundidad, ni el análisis b...

Las tasas de morbilidad de las enfermedades cardiovasculares son las más grandes de América, con muchas resultante de la vasculatura poco saludable. Las arterias sanas consisten en tejido elástico, con la superficie luminal suave revestido con una célula endotelial (CE) monocapa. Flujo arterial puede ser modelado como una función de onda oscilante con caudal medio positivo. El índice de pulsatilidad (PI) es el cociente de la magnitud de oscilación y la media de flujo (PI = (Max -.. Min) / media), 1 y ha sido modelada in vitro con elasticidad de los vasos variable de 2 elasticidad arterial es importante en el almacenamiento de flujo. energía a partir de las contracciones del corazón, la dilatación bajo presión sistólica, y juega un papel importante en la modulación de PI flujo sanguíneo. Debido a que el corazón mantiene una constante, pulsátil, flujo volumétrico, la expansión arterial aumenta el área de la sección transversal, la mejora de la estabilidad del flujo mediante la reducción de la velocidad del flujo, esfuerzo cortante, y PI. Con frecuencia, las arterias saludables presentes los cambios en la elasticidado cumplimiento, mostrando rigidez de la remodelación vascular, el tejido cicatricial o calcificación 3, 4. Además, otros trastornos vasculares, tales como la hiperplasia neointimal (NIH), 5 aneurisma y la hipertensión 6 y fibrosis vascular 4, pueden constreñir el diámetro del vaso. Sin embargo, el tratamiento actual de medicamentos y el tratamiento de las enfermedades vasculares dispositivo menudo descuidan la importancia de cumplimiento pared del vaso o del flujo sanguíneo en la dinámica de la enfermedad vascular, que a menudo se complica por los cambios en la morfología y las propiedades del vaso. Ni la angioplastia con balón, ni la colocación de stents responder a la complicación de la elasticidad de la pared 7. Por lo tanto, el modelado in vitro de la sangre fluye resultante de enfermedad arterial y los tratamientos es importante en la investigación de enfermedades y patologías futuro eficacia del tratamiento. En este documento, se describe un método de reproducir el flujo de sangre fisiológicos y patológicos diseñado para determinar la respuesta celular en Pathol enfermedad vasculargías. El flujo de fluido hace que la tensión de cizallamiento en la pared del vaso, que es una señal mecánica importante en la salud de los vasos, que afecta a todas las células dentro de la vasculatura. Varios sensores mecánicos en el endotelio vascular para cizallamiento de fluido han sido identificados, incluyendo cilio primario demostrado en estudios recientes para endotelial mechanosensing 8. Actividad de las células endoteliales y la morfología se ven afectados por la velocidad del flujo, la dirección y la pulsatilidad. Además, células de músculo liso (SMC) la migración puede verse afectada por mecano-señales de flujo de baja velocidad a través de fluido intersticial 9, y también puede ser a través de la señalización paracrina de las células endoteliales a través de su respuesta a fluir y mecano-transducción de señales de flujo a través de citoquinas liberar 10. La &quot;dosis&quot; dependencia de la cizalladura media, PI, y la señalización paracrina también puede ser interdependientes. Con este fin, la determinación de la respuesta celular vascular a un cizallamiento de fluido con variada &quot;dosificación&quot; en cultivo en monocapao co-cultivo in vitro podría proporcionar ideas mecanicistas en el remodelado vascular y mejorar la enfermedad y la predicción del tratamiento. El sistema de flujo utilizada en este experimento consiste en una bomba de sangre, una amortiguación de flujo aguas arriba del depósito de aire, un medidor de flujo aguas abajo sólo se utiliza durante la configuración experimental, un cultivo celular aguas abajo, la cámara de flujo de placas paralelas, y el depósito de medios de comunicación. El control de las variables de flujo vasculares tales como media velocidad de flujo, latidos por minuto, y PI se puede lograr a través de control de la velocidad de flujo, la frecuencia del pulso, y la introducción de presión de amortiguación. Bombas de sangre pulsátil están disponibles con desplazamiento de carrera variable, en frecuencia de carrera controlada, directamente relacionados con el sentido de caudal volumétrico, y la frecuencia del pulso. La introducción de un depósito de aire en el circuito de flujo permite la amortiguación de presión, reduciendo la magnitud de oscilación de flujo. Media es un fluido incompresible, mientras que el aire dentro de la cámara de amortiguación es compresible, permitiendo que el exceso de presión de la onda de flujo para serabsorbida por la compresión del aire. La relación de aire a los medios de comunicación permite el control sobre cómo se produce con mucha amortiguación. Un cultivo celular cámara de flujo a medida de 75 mm de largo por 50 mm de ancho fue creado a partir de acrílico. Flow entra a través del orificio de entrada, y se expande a través del colector de entrada, proporcionando un flujo consistente a través de la totalidad de la cámara de flujo. Flujo y estructuras similares están presentes en salida de la cámara. Las células se sembraron en portaobjetos funcionalizados, y posteriormente unidos a la cámara de flujo. Esto permite una gran población, fácilmente recuperados después del estudio. Experimentos de co-cultivo pueden utilizar una membrana de policarbonato porosa para eliminar el contacto de célula a célula entre las culturas al tiempo que permite el transporte de citoquinas / flujo. Este sistema se ha utilizado anteriormente para modelar el flujo de alta PI y su efecto en cultivo en monocapa endotelial y EC / SMC co-cultivo 1, 10, para investigar la respuesta celular a la enfermedad patológicamente alta PI. Al describir el protocolo utilizado para modelar el flujo de éstos concondiciones, esperamos ayudar a los demás en la determinación de la contribución de la señal de flujo a la celda de respuesta.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl)trethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>459844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Slide (70mm x 50mm)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS294775X50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Membrane</td>
			<td>Millipore Corp.</td>
			<td>HTTP09030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Gasket</td>
			<td>Grace Bio-Labs</td>
			<td>RD 475464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin (25 &#956;g/mL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type-I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>36486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Damping Chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This chamber is custom made, and may be requested using the engineering drawing of Figure 3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>529552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Vinyl Carbonate Tubing</td>
			<td>US Plastic</td>
			<td>65066, 65063, 65062</td>
			<td>Various sizes may be required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Connections</td>
			<td>Nordson Medical</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various sizes will be required, and a number of parts should be purchased for replacement use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Chamber</td>
			<td>Machined in-house</td>
			<td>Custom</td>
			<td>Acrylic may be purchased in sheets and machined for intended use. The engineering drawing shown in Figure 2 may be used to recreate this chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Petri Dish</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-14007-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Slide Holder</td>
			<td>Capitol Scientific</td>
			<td>WHE-900303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Mediatech, Inc.</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Mediatech, Inc.</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Meter</td>
			<td>Sonotec, GmbH</td>
			<td>Sonoflow co.55/060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard Elastomer Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>761036-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 G Steel Cannula</td>
			<td>General Laboratory Supply</td>
			<td>S8365-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro model of physiological and pathological blood flow with application to investigations of vascular cell remodeling

La enfermedad vascular es una causa común de muerte en los Estados Unidos. En este documento, se presenta un método para examinar la contribución de la dinámica del flujo hacia las patologías de enfermedades vasculares. Arterias no saludables a menudo presentan rigidez de la pared, la cicatrización, o estenosis parcial que todos puedan afectar las tasas de flujo de fluido, y la magnitud de flujo pulsátil, o índice de pulsatilidad. La replicación de diversas condiciones de flujo es el resultado de un ajuste de presión de flujo cámara aguas abajo de una bomba de sangre de amortiguación. La introducción de aire dentro de un sistema cerrado de flujo permite un medio compresible para absorber la presión pulsátil de la bomba, y por lo tanto varía el índice de pulsatilidad. El método descrito en este documento es simplemente reproducida, con la entrada altamente controlable, y los resultados fácilmente medibles. Algunas limitaciones son recreación de la compleja forma de onda de pulso fisiológico, que sólo se aproxima por el sistema. Las células endoteliales, células musculares lisas y fibroblastos se ven afectados por el flujo de sangre thrOugh la arteria. El componente dinámico del flujo de sangre se determina por la salida y la pared arterial cumplimiento cardíaco. Vascular celular mecano-transducción de la dinámica de flujo puede desencadenar la liberación de citoquinas y la diafonía entre los tipos de células dentro de la arteria. Co-cultivo de células vasculares es una imagen que refleja la interacción célula-célula más precisa sobre la pared del vaso sanguíneo y la respuesta vascular a la señalización mecánica. Contribución de la dinámica de flujo, incluyendo la respuesta de las células a los componentes dinámicos y medias (o constantes) de flujo, por lo tanto es una métrica importante para determinar patología de la enfermedad y la eficacia del tratamiento. A través de la introducción de un modelo de co-cultivo in vitro y la presión de amortiguación aguas abajo de la bomba de sangre que produce el gasto cardíaco simulado, diversas patologías de enfermedades arteriales pueden ser investigados.

El mantenimiento de las condiciones de flujo depende de un correcto montaje del circuito de flujo (Figura 1). Tubo de diámetro es una importante selección en el montaje, con diámetros mayores reduciendo la resistencia al flujo y caída de presión posterior antes y después de la cámara de cultivo. Para garantizar la velocidad de presión y caudal previsto, montar el sistema con medidor de flujo antes de experimentar con la tubería prevista. Alineación de cámara de cultivo canal de vacío <strong...

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In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

Este protocolo se replica el flujo de sangre fisiológica o patológica in vitro para ayudar en la determinación de la respuesta celular en patologías de enfermedades. Mediante la introducción de una cámara de presión aguas abajo de una bomba de sangre de amortiguación, el flujo de sangre a través de la vasculatura puede recapituló e impuso en una monocapa de endotelio vascular o un compañero de la cultura mimética.

En Vitro Modelo de fisiológicos y patológicos de flujo de sangre con aplicación a las investigaciones de remodelado vascular celular

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

9.5K vistas.  University of Colorado at Boulder.  Este protocolo se replica el flujo de sangre fisiológica o patológica in vitro para ayudar en la determinación de la respuesta celular en patologías de enfermedades. Mediante la introducción de una cámara de presión aguas abajo de una bomba de sangre de amortiguación, el flujo de sangre a través de la vasculatura puede recapituló e impuso en una monocapa de endotelio vascular o un compañero de la cultura mimética. 

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Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

Método mejorado para la preparación de una base de células, Contacto Modelo Humano de la barrera hematoencefálica

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Investigación

Bioingeniería

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell homing and tumor metastasis. The three-dimensional flow chamber device (hereafter the 3D device) is a novel in vitro technology that recreates physiological shear stress and allows each step of the cell extravasation cascade to be quantified. The 3D device consists of an upper compartment in which the cells of interest circulate under shear stress, and a lower compartment of static wells that contain the chemoattractants of interest. The two compartments are separated by porous inserts coated with a monolayer of endothelial cells (EC). An optional second insert with microenvironmental cells of interest can be placed immediately beneath the EC layer. A gas exchange unit allows the optimal CO2 tension to be maintained and provides an access point to add or withdraw cells or compounds during the experiment. The test cells circulate in the upper compartment at the desired shear stress (flow rate) controlled by a peristaltic pump. At the end of the experiment, the circulating and migrated cells are collected for further analyses. The 3D device can be used to examine cell rolling on and adhesion to EC under shear stress, transmigration in response to chemokine gradients, resistance to shear stress, cluster formation, and cell survival. In addition, the optional second insert allows the effects of crosstalk between EC and microenvironmental cells to be examined. The translational applications of the 3D device include testing of drug candidates that target cell migration and predicting the in vivo behavior of cells after intravenous injection. Thus, the novel 3D device is a versatile and inexpensive tool to study the molecular mechanisms that mediate cellular extravasation.

The three-dimensional flow chamber device is a novel in vitro technology for the quantitative and step-wise evaluation of the extravasation cascade of cells circulating under conditions of physiological shear stress. The device therefore fills a critical need for basic, preclinical, and clinical studies of cell migration.

Un dispositivo de cámara de flujo tridimensional Novel para el Estudio de quimioquinas-dirigida extravasación de células circulantes en condiciones de flujo fisiológicas

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

Shock Wave Application to Cell Cultures

Shock waves nowadays are well known for their regenerative effects. Basic research findings showed that shock waves do cause a biological stimulus to target cells or tissue without any subsequent damage. Therefore, in vitro experiments are of increasing interest. Various methods of applying shock waves onto cell cultures have been described. In general, all existing models focus on how to best apply shock waves onto cells.
However, this question remains: What happens to the waves after passing the cell culture? The difference of the acoustic impedance of the cell culture medium and the ambient air is that high, that more than 99% of shock waves get reflected! We therefore developed a model that mainly consists of a Plexiglas built container that allows the waves to propagate in water after passing the cell culture. This avoids cavitation effects as well as reflection of the waves that would otherwise disturb upcoming ones. With this model we are able to mimic in vivo conditions and thereby gain more and more knowledge about how the physical stimulus of shock waves gets translated into a biological cell signal (&#8220;mechanotransduction&#34;).

Shock waves nowadays are well known for their regenerative effects. Therefore in vitro experiments are of increasing interest. We therefore developed a model for in vitro shock wave trials (IVSWT) that enables us to mimic in vivo conditions thereby avoiding distracting physical effects.

Shock Wave aplicación a los cultivos celulares

Shock waves nowadays are well known for their regenerative effects. Basic research findings showed that shock waves do cause a biological stimulus to ...

Tissue Engineering of Tumor Stromal Microenvironment with Application to Cancer Cell Invasion

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and invasion. Rat tail type I collagen and/or matrix derived from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells have been traditionally employed as the substrates to model the matrix or stromal microenvironment into which mesenchymal cells (usually fibroblasts) are populated. Although experiments using such matrices are very informative, it can be argued that due to an overriding presence of a single protein (such as in type I Collagen) or a high content of basement membrane components and growth factors (such as in matrix derived from mouse sarcoma cells), these substrates do not best reflect the contribution to matrix composition made by the stromal cells themselves. To study native matrices produced by primary dermal fibroblasts isolated from patients with a tumor prone, genetic blistering disorder (recessive dystrophic epidermolysis bullosa), we have adapted an existing native matrix protocol to study tumor cell invasion. Fibroblasts are induced to produce their own matrix over a prolonged period in culture. This native matrix is then detached from the culture dish and epithelial cells are seeded onto it before the entire coculture is raised to the air-liquid interface. Cellular differentiation and/or invasion can then be assessed over time. This technique provides the ability to assess epithelial-mesenchymal cell interactions in a 3D setting without the need for a synthetic or foreign matrix with the only disadvantage being the prolonged period of time required to produce the native matrix. Here we describe the application of this technique to assess the ability of a single molecule expressed by fibroblasts, type VII collagen, to inhibit tumor cell invasion.

Tissue engineered fibroblast-derived native matrix is an emerging tool to generate a stromal substrate which supports epithelial cell proliferation and differentiation. Here a protocol applying this methodology to assess the impact of different stromal cell types on tumor cell biology is presented.

Ingeniería de tejidos de tumor del estroma Microambiente con Aplicación a la invasión de células cancerosas

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and ...

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to model well differentiated human airway epithelium and heart muscle cells. This could be an invaluable tool to study the deleterious effects of toxic inhaled chemicals, such as chlorine, that can normally interact with the cell surfaces, and form various byproducts upon reacting with water, and limiting their effects in submerged cultures. Our model using well differentiated human airway epithelial cell cultures at air-liqiuid interface circumvents this limitation as well as provides an opportunity to evaluate critical mechanisms of toxicity of potential poisonous inhaled chemicals. We describe enhanced loss of membrane integrity, caspase release and death upon toxic inhaled chemical such as chlorine exposure. In this article, we propose methods to model chlorine exposure in mammalian heart and airway epithelial cells in culture and simple tests to evaluate its effect on these cell types.

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

This protocol is designed to demonstrate exposure method of cell cultures to inhaled toxic chemicals. Exposure of differentiated air-liquid&#160;interface (ALI) cultures of airway epithelial cells provides a unique model of airway exposure to toxic gases such as chlorine. In this manuscript we describe effect of chlorine exposure on air-liquid&#160;interface cultures of epithelial cells and submerged culture of cardiomyocytes. In vitro exposure systems allow important mechanistic studies to evaluate pathways that could then be utilized to develop novel therapeutic agents.

In vitro modelo de cultivo celular para Toxic inhalado Prueba química

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

Utilizando Impedancia Cell-sustrato y imágenes de células vivas para medir los cambios en tiempo real en la adhesión celular y De-adhesión inducidas por Matrix Modificación

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Irritación de los ojos de prueba (IET) para la identificación del peligro de los ojos: Irrita los productos químicos que utilizan Reconstruido humana Córnea-como epitelial (RHCE) Modelo de Tejidos

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.

Flujo de microfluidos Cámaras utilizando sangre reconstituida a Modelo Hemostasia y Transfusión de Plaquetas<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is restricted to platelet deposition only. The intricate relationship between Ca2+-dependent coagulation and platelet function requires careful and controlled recalcification of blood prior to analysis. Our setup uses a Y-shaped mixing channel, which supplies concentrated Ca2+/Mg2+ buffer to flowing blood just prior to perfusion, enabling rapid recalcification without sample stasis. A ten-fold difference in flow velocity between both reservoirs minimizes dilution. The recalcified blood is then perfused in a collagen-coated analysis chamber, and differential labeling permits real-time imaging of both platelet and fibrin deposition using fluorescence video microscopy. The system uses only commercially available tools, increasing the chances of standardization. Reconstitution of thrombocytopenic blood with platelets from banked concentrates furthermore models platelet transfusion, proving its use in this research domain. Exemplary data demonstrated that coagulation onset and fibrin deposition were linearly dependent on the platelet concentration, confirming the relationship between primary and secondary hemostasis in our model. In a timeframe of 16 perfusion min, contact activation did not take place, despite recalcification to normal Ca2+ and Mg2+ levels. When coagulation factor XIIa was inhibited by corn trypsin inhibitor, this time frame was even longer, indicating a considerable dynamic range in which the changes in the procoagulant nature of the platelets can be assessed. Co-immobilization of tissue factor with collagen significantly reduced the time to onset of coagulation, but not its rate. The option to study the tissue factor and/or the contact pathway increases the versatility and utility of the assay.

This paper describes an experimental model of hemostasis that simultaneously measures platelet function and coagulation. Platelet and fibrin fluorescence is measured in real-time, and platelet adhesion rate, coagulation rate, and onset of coagulation are determined. The model is used to determine platelet procoagulant properties under flow in concentrates for transfusion.

Una Cámara de microfluidos Modelo de Flujo de Transfusión de Plaquetas y hemostasia Medidas de deposición de plaquetas y la formación de fibrina en tiempo real

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Órgano Cultura Modelo Murino del disco intervertebral

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...