Estamos en deuda con C Joubert, V Neuville, V Barroca, J Tilliet y todo el personal de las instalaciones de los animales; a J Baijer y N Dechamps de clasificación de células; O. Etienne para la asistencia técnica, y A. Gouret por su asistencia administrativa. La citometría de flujo y clasificación de células se llevaron a cabo en la citometría de flujo de recursos compartidos IRCM, establecido por donaciones de equipos de DIM-Stem-Pôle, INSERM, Fundación ARCO, y CEA. Este trabajo fue apoyado por becas de Electricité de France (EDF). MD tiene una beca de La Liga Contra el Cáncer y LM de la región Ile-de-France (DIM bioterapias). Marc-André Mouthon y François D. Boussin autoría cuota de co-mayor.

Este protocolo ha sido diseñado de acuerdo con las Comunidades Europeas Directiva del Consejo, de 24 de noviembre de 1986 (86/609 / CEE) y ha sido aprobado por nuestro bienestar animal comité institucional (CETEA-CEA DSV IDF). 1. Configuración básica Antes de la cultura y videomicroscopia <ol><li> Utilice vidrio placas de cultivo de fondo o mu-placas para microscopía confocal de vídeo. 1 - 5 x 10 3 células / así, utilizar placas de 96 pocillos y las placas de 24 pocillos durante más de 5 x 10 3 células / pocillo. </li><li> Al menos un día antes de comenzar el experimento, preparar poli-D-lisina (PDL) estéril placas recubiertas para cultivos monocapa adherentes. Agregar suficiente PDL (10 mg / ml en dH2O) para cubrir el fondo de cada pocillo e incubar O / N a 37 ° C. Retire la solución PDL y enjuagar tres veces con dH2O antes de permitir que la placa se seque en la campana durante al menos 2 horas bajo un flujo laminar. Si no se utiliza inmediatamente, almacenar la placa recubierta en-20 ° C. </li><li> Preparar medio de cultivo mediante la mezcla de NSC Basal Medium y NSC proliferación Suplemento en una relación 9: 1 (ver tabla de materiales), junto con 2 mg / ml de heparina, 20 ng / factor humano purificado ml de crecimiento epidérmico recombinante (EGF), y 10 ng / ml factor de crecimiento de fibroblastos humano recombinante 2 (FGF-2). Calentar el medio de cultivo a 37 ° C en un baño de agua antes de su uso. </li><li> Para la disociación SVZ, preparar la solución de papaína: 1 mg / ml de papaína (15 UI / ml) en el equilibrio salino Solución de Earl (EBSS) que contenía 0,2 mg / ml de L-cisteína, 0,2 mg / ml de EDTA, y 0,01 mg / ml de DNasa I en PBS. Esterilizar la solución haciéndola pasar a través de un filtro de 0,2 micras. Equilibrar la solución a 37 ° C antes de su uso. </li><li> Para detener la reacción enzimática, preparar una solución de inhibidor de proteasa (ovomucoide): medio F12 que contiene 0,7 mg / ml de tripsina inhibidor de tipo II: DMEM. Filtrar la solución usando un filtro de 0,2 micras. </li><li> Preparar PBS 0,6% solución de glucosa para recoger los cerebros y PBS 0,15% de BSA sOLUCIÓN para los pasos de lavado y para la tinción de anticuerpos. </li><li> Preparar herramientas de disección: tijeras, disección y atando unas pinzas, bisturí. Remojar en etanol al 70%. </li></ol> 2. La recolección de Adult ratón cerebros y SVZ microdisecciones <ol><li> Sacrificio adultos FUCCI ratones 23 (2 a 3 meses de edad y / o de 12 meses de edad, para el envejecimiento de estudios) la realización de una dislocación cervical de conformidad con las directrices institucionales apropiados. </li><li> Rocíe el ratón usando el 70% de etanol y cortar la cabeza con unas tijeras afiladas. </li><li> Hacer una incisión a lo largo del cuero cabelludo para revelar el cráneo. </li><li> Realizar un corte en la línea media longitudinal a partir de la base del cráneo hacia los bulbos olfatorios utilizando un pequeño par de tijeras. Asegúrese de no dañar el cerebro subyacente con las hojas de las tijeras. Retire la parte abierta superior del cráneo con pinzas curvas para exponer el cerebro. </li><li> Recoger el cerebro en una placa de Petri de 15 mm que contiene 0,6% de glucosa en PBS. </li><li> Dissect distancia los bulbos olfatorios. Coloque el cerebro en su superficie dorsal y hacer una sección coronal a través del quiasma óptico utilizando un bisturí. </li><li> Bajo un microscopio de disección, coloque la parte rostral de la sección del cerebro con la superficie coronal corte hacia arriba hacia el experimentador. </li><li> Para diseccionar la SVZ, quitar el tabique con unas pinzas finas curvas a continuación, insertar un consejo de una multa con fórceps en el cuerpo estriado inmediatamente adyacente al ventrículo y separar la SVZ del tejido circundante. Para más detalles, consulte Azari et al. 24. Coloque la SVZ diseccionado en una placa de Petri que contiene 1 ml de PBS-0,6% de glucosa. </li></ol> 3. SVZ Tissue Disociación <ol><li> Picar la SVZ diseccionado en la placa de Petri hasta que no haya piezas grandes se mantienen. </li><li> Transferir el tejido picado junto con el% de glucosa PBS-0,6 a un tubo de 15 ml y centrifugar a 200 xg durante 5 min. </li><li> Descartar el sobrenadante y añadir 1 ml de papaína precalentado (1mg / ml, preparado en la etapa 1.4) suplementado con 0,01 mg / ml de DNasa I. Incubar durante 10 min en un baño de agua a 37 ° C. Utilice 1 ml de papaína por ratón. </li><li> Centrifugar a 200 xg durante 5 min y descartar el sobrenadante. </li><li> Añadir 1 ml de pre-calentado ovomucoide (0,7 mg / ml, preparado en el paso 1.5) para detener la actividad de la papaína. Mecánicamente disociar el tejido picado aún más en una suspensión de una sola célula pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo 20 veces a través de una punta de la micropipeta p1000. Evite las burbujas de aire. </li><li> Pasar la suspensión celular a través de un filtro de 20 micras estéril en un nuevo tubo de 15 ml. Asegúrese de lavar el filtro de células con PBS 0,15% BSA para evitar la pérdida de células. </li><li> Centrifugar a 200 xg durante 10 min y descartar el sobrenadante. Vuelva a suspender las células en 100 l de PBS que contenía 0,15% de BSA. </li></ol> 4. La tinción de inmunofluorescencia para la clasificación de células Para la clasificación celular usando-FUCCI Red ratones (Figura 2), utilice la siguienteanticuerpos CD24 conjugado con ficoeritrina:-cyanine7 [PC7]; CD15 / LeX isotiocianato de fluoresceína [FITC] conjugados y Ax647 ligando EGF conjugado. Nota: Las células LeX + EGFR + y células EGFR + no son abundantes en la SVZ adultos: ≈ ​​600 y 1500 células / ratón, respectivamente 9. Se recomienda poner en común las células SVZ de 2 a 3 ratones para tener suficiente material. No trabaje con más de 12 ratones en el mismo día por lo que la duración de clasificación de células no exceda de 3 horas. Tenga en cuenta que el trabajo con demasiados ratones en el mismo día dará lugar a un aumento de la duración de la clasificación celular, posiblemente, lo que resulta en aumento de la muerte celular y / o diferenciación celular. <ol><li> Realice la tinción FACS en 100 l de PBS 0,15% de BSA por ratón (o en 200 l para un grupo de 2 a 3 ratones para la tinción óptima). </li><li> Preparar los tubos de control. Utilice cuentas de compensación para preparar los tubos individuales de control de color de acuerdo con el fabricante9; s protocolo. Seleccionar una fracción de células (1/10 de las células extraídas de un ratón es suficiente) y separarlo en 4 tubos para preparar tubo 1 control negativo (células sin marcar) y 3 fluorescencia menos uno (FMO) tubos de control. Resuspender las células en 200 l de PBS 0,15% de BSA por tubo. Sugerencia: Para un control LEX-FITC FMO, etiquetar las células con CD24-PC7 (1:50) y el ligando EGF Ax647 conjugado (1: 200); para el control de CD24-PC7 FMO, etiquetar las células con CD15 / LEX-FITC (1:50) y Ax647 conjugado ligando EGF (1: 200) y para conjugado Ax647 control de FMO ligando EGF, etiquetar las células con CD15 / LEX FITC (1:50) y CD24-PC7 (01:50). </li><li> Para los tubos utilizados para la clasificación de células, utilice los siguientes anticuerpos a la dilución indicada en PBS 0,15% de BSA: CD24-PC7 (01:50), CD15 / LEX-FITC (1:50) y el ligando EGF Ax647 conjugado (1: 200). </li><li> Incubar durante 20 min a 4 ° C en la oscuridad. Lavar con 1 ml de PBS 0,15% de BSA y centrifugar a 200 xg durante 10 min. Resuspender las células en 20081; l de PBS 0,15% BSA por cerebro. Mantenga los tubos de clasificación de células en hielo y proceder de inmediato a la clasificación de células. </li><li> Si el uso de ratones FUCCI-Verdes, fracciones LEX-positivas y Lex-negativas separadas utilizando columnas de separación antes de clasificación de células como las acciones de anticuerpos LEX-FITC la misma longitud de onda de emisión de la fluorescencia FUCCI-verde (Figura 3A, B). <ol><li> En primer lugar, etiquetar las células con un ratón LEX-anticuerpo anti-humano (1:50) durante 15 minutos a 4 ° C en la oscuridad en 100 l de PBS 0,15% de BSA. </li><li> Lavar las células con 1 ml de PBS 0,15% de BSA y centrifugar a 200 xg durante 10 min, a continuación, marcar las células con microperlas de IgM anti-ratón (1:10) durante 15 minutos a 4 ° C en la oscuridad. </li><li> Lavar las células con 1 ml de PBS 0,15% de BSA y centrifugar a 200 xg durante 10 min. Resuspender las células en 500 l de PBS 0,15% de BSA y se vierte a través de las células de la columna de separación en el campo magnético como se esquematiza en la Figura 3 C. Lavar la columna con 1 ml de PBS 0,15% BSA para obtener la fracción negativa LeX. </li><li> Para obtener fracción LEX-positivo, retire la columna de separación del campo magnético y eluir las células con 2 ml de PBS 0,15% de BSA. </li><li> Proceda a las manchas ligando EGF CD24-PC7 y Ax647 conjugado como se indica en 4.2. </li></ol> </li></ol> 5. Cell Sorting Nota: Las células fueron ordenados en un clasificador FACS a 40 psi con un 86 micras noozle. La fluorescencia se recogió mediante el siguiente conjunto de filtro: 520/35 nm (FITC), 575 / 26nm (PE), 670 / 20nm (Ax647) y 740LP (PC7). La compensación es necesaria para evitar que las señales de falsos positivos como una superposición se encuentra entre los espectros de emisión de la fluorescencia FUCCI rojo y el tinte PC7. <ol><li> Inmediatamente antes de la clasificación de células, añadir un colorante vital para discriminar en vivo de las células muertas. Utilizamos HO (ver tabla de materiales) a / ml de concentración final de 2 mg. Ejecute el tubo de control negativo (células no marcadas) a través del clasificador FACS y seleccione ªcélulas correos utilizando dispersión lateral (SSC) y la dispersión frontal (FSC) parámetros (Figura 1A). NOTA: Las células muertas se excluyeron por gating sólo la fracción HO-negativo (Figura 1A &#39;) y luego dobletes fueron excluidos por la selección de la fracción de ancho de pulso negativo (Figura 1A&#39; &#39;). </li><li> Ejecutar los controles individuales de color preparados en la etapa 4.2 y ajustar el tubo fotomultiplicador (PMT) tensiones (es decir, células escala población negativa demasiado alta y / o positivos off) si es necesario. Realizar compensación de color en la ventana de compensación del software. </li><li> Ejecutar FMO controla preparado en el paso 4.2 (control LEX-FITC FMO, CD24-PC7 control de FMO y Ax647 conjugado de control FMO ligando EGF) y dibujar las puertas de clasificación (Figura 1). Ordenar las células directamente en 100 l de medio de cultivo en microtubos de 1,5 ml. </li></ol> 6. Preparación de las células para microscopía <ol><li> Placa de la célula recién ordenadoss a una densidad de 1 - 3 x 10 3 células / pocillo en poli-D-Lisina recubiertas de 96 pocillos μ-Plate con 300 l de medio de cultivo. </li><li> Antes de la microscopía de video, se incuban las placas de cultivo a 37 ° C y 5% de CO 2 al menos por 1 hora para permitir la adhesión celular. </li></ol> Configuración 7. Microscopio y Adquisición de imágenes <ol><li> Realizar imágenes en vivo usando un objetivo del Plan Apo VC 20x DIC (NA: 0.75) en un sistema de microscopio de barrido láser confocal conectado a una cámara con termostato invertida a 37 ° C en 5% de CO 2 atmósfera. </li><li> Coloque el 96 pocillos μ-Placa interior de la cámara con termostato precalentado y se equilibró y reemplace la tapa por una cubierta con termostato. </li><li> Abra el software de NIS-Elements y haga clic en la barra de menú en &quot;Adquirir / Adquisición controla / ND adquisición&quot; para seleccionar las opciones del time-lapse (longitud, posiciones de la etapa, z secciones confocal, ...), &quot;Adquirir controles / Adquisición / Ti Pad221; para seleccionar los objetivos y &quot;Adquirir / controles de adquisición / A1plus Configuración&quot; para seleccionar el nivel de PMT para cada fluorescencia en la barra de menú. Seleccione una carpeta para guardar los archivos de datos. </li><li> Uso de la ventana de adquisición ND, establezca el centro de cada uno, así como una posición escenario y seleccione la opción de imagen de gran tamaño de 7 x 7 mm ². Esto creará una imagen de mosaico alrededor del centro de cada pocillo. Ajuste el solapamiento de la gran imagen de mosaico y el 5%. Hacer fotos cada 20 minutos durante 24 horas. Seleccione el objetivo del Plan Apo VC 20x DIC (NA: 0,75) en la ventana de Ti Pad. </li><li> En la ventana A1plus Configuración, adquirir imágenes utilizando el escáner de resonancia de alta velocidad en un formato de 512 x 512 píxeles con una resolución de 1,26 m / pixel. Use campo claro de visualizar formas celulares. En el caso de los ratones FUCCI-Rojas, excitar la fluorescencia roja de 561 nm y recoger usando un 595/50 nm filtro. En el caso de los ratones FUCCI-Green, excitar la fluorescencia verde a 488 nm y recoger usando un 530/40 nm filtro. Determinar la PM óptimaNivel T, offset y la potencia del láser para cada longitud de onda. NOTA: Recomendamos el uso de la función de enfoque automático para el canal de campo claro para que el software para el enfoque automático en cada posición de la etapa antes de cada adquisición. Sugerencia: Un Plan Apo VC 20x objetivo DIC (NA: 0,75) fue utilizado por su excelente resolución, sin necesidad de aceite. Otros objetivos pueden ser utilizados dependiendo de la resolución óptica deseada. </li><li> Seleccione el botón &quot;Ejecutar ahora&quot; en la ventana de adquisición ND para empezar adquisición. Sugerencia: Siga el equipo de trabajo de 1 lazo para asegurarse de que todo en el trabajo correctamente. </li></ol> 8. Procesamiento y Análisis de Imágenes <ol><li> Analizar los datos directamente en el software de NIS-Elements mediante el seguimiento de las células de forma individual. Sugerencia: Para ganar tiempo, ahorrar cada posición en formato .avi utilizando software NIS-Elements y analizar las películas con ImageJ. </li><li> En el software ImageJ, realizar un seguimiento de las células individuales se someten a por lo menos 2 divisiones (es decir, una célula auna colonia de cuatro celdas). Recortar una pequeña área alrededor de la celda y seleccione &#39;Imagen / Duplicar&#39;. </li><li> Seleccione &quot;Imagen / Pilas / Hacer Montage &#39;en la barra de menú para hacer un montaje. Especifique los marcos que se incluirán, el tamaño de las imágenes y guardar el montaje como un archivo .tif de resolución óptima. </li><li> Para el cálculo de la primera SG 2 / M fase de longitud (Figura 2 C, D), seleccione una sola célula fluorescente roja (en G 1) y luego ponga t = 0 (fase S se iniciará una vez que la fluorescencia roja se apaga). Contar el número de fotogramas hasta que la célula se divide para estimar la longitud SG 2 / M. NOTA: El tiempo calculado depende del intervalo de tiempo entre cada fotograma. </li><li> Para calcular la siguiente fase G1 (Figura 2C, D), continúe para realizar un seguimiento de la célula que simplemente dividido. Si la célula dividida entra en la fase G1, habrá una acumulación de la proteína fluorescente de color rojo-Cdt1. Calcular el número de fotogramas hasta rojo-fluorescencia se apaga agaen para cada celda. Sugerencia: Al comienzo de G 1 la fluorescencia roja podría ser débil así que elige el inicio de la fase G 1 en el marco donde la célula se ha dividido para evitar aproximaciones. </li></ol>

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+the+adult+mouse+neural+stem+cells+using+the+neurosphere+assay.">Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay.</a> Journal of visualized experiments JoVE. , (2010).</li><li>Daynac, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFbeta+lengthens+the+G1+phase+of+stem+cells+in+aged+mouse+brain.">TGFbeta lengthens the G1 phase of stem cells in aged mouse brain.</a> Stem cells. 32, 3257-3265 (2014).</li><li>Roccio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+stem+cell+fate+changes+by+differential+cell+cycle+progression+patterns.">Predicting stem cell fate changes by differential cell cycle progression patterns.</a> Development. 140, 459-470 (2013).</li><li>Walker, T. L., Kempermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+mouse+two+cultures+isolation+and+culture+of+adult+neural+stem+cells+from+the+two+neurogenic+zones+of+individual+mice.">One mouse two cultures isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice.</a> Journal of visualized experiments JoVE. , e51225 (2014).</li><li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+neurospheres+re+evaluating+the+relationship.">Neural stem cells and neurospheres re evaluating the relationship.</a> Nat Methods. 2, 333-336 (2005).</li><li>Pastrana, E., Silva Vargas, V., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyes+wide+open+a+critical+review+of+sphere+formation+as+an+assay+for+stem+cells.">Eyes wide open a critical review of sphere formation as an assay for stem cells.</a> Cell stem cell. 8, 486-498 (2011).</li><li>Spella, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Licensing+regulators+Geminin+and+Cdt1+identify+progenitor+cells+of+the+mouse+CNS+in+a+specific+phase+of+the+cell+cycle.">Licensing regulators Geminin and Cdt1 identify progenitor cells of the mouse CNS in a specific phase of the cell cycle.</a> Neuroscience. 147, 373-387 (2007).</li></ol>

The authors declare that they have no conflict of interest.

La técnica de clasificación celular descrito en este documento permite la discriminación fiable entre NSCs reposo, NSCs activados y sus estudios progenie permitiendo de sus propiedades y la dinámica en el cerebro adulto 9. Junto con la tecnología FUCCI que permite la visualización de la progresión del ciclo celular en las células vivas 23, hemos desarrollado una técnica rápida y eficiente para seguir las fases G 1 y 2 SG / M del ciclo celular a partir de células de cerebro de ratón adulto joven y de edad. La técnica de clasificación de células utilizadas en este protocolo fue la primera combinación validado de marcadores que permiten la purificación de los cinco principales poblaciones neurogénica de la SVZ 9. También fue la primera técnica validada que permite la distinción de NSCs en reposo y activadas. Es de destacar que esta técnica no requiere el uso de ratones transgénicos per se, que es necesaria cuando se adapta a modelos de ratones transgénicos such como FUCCI. Desde entonces, Codega et al. 10 han utilizado una combinación triple etiquetado GFAP-GFP / CD133 / EGFR distinguir NSCs reposo de su contraparte activada pero no se puede adaptar a la tecnología FUCCI ya que requiere el uso de ratones transgénicos GFAP-GFP. Mich et al. 11 han desarrollado un / EGFR / CD24 estrategia de etiquetado de triple Glast que comparte resultados comunes con la técnica utilizada en este estudio 9. De hecho, una alta correlación entre LeX y marcadores Glast NSC ya se observó en Daynac et al. Estudio 9. Sin embargo, el anticuerpo Glast utilizado en la técnica Mich et al. Está acoplado a ficoeritrina y por lo tanto no se puede adaptar con el uso de ratones FUCCI-RED. Hay varios puntos técnicos importantes que requieren atención antes de la clasificación células SVZ. En primer lugar, la etapa de disociación es muy importante como el tejido cerebral tiene que ser disociado en células individuales preservando al mismo tiempo la estructural enintegridad de las proteínas utilizadas para la estrategia de etiquetado de anticuerpos. 0,05% de tripsina-EDTA ha demostrado ser muy eficaz en la SVZ disociar el tejido 27, pero el antígeno LeX se encontró que era altamente sensible como casi todos LEX-FITC inmunofluorescencia fue perdido (datos no mostrados). Por lo tanto, se usó papaína ya que era más eficiente y menos destructivo que otras proteasas en el tejido cerebral. Además, ni LeX ni EGFR ni CD24 se vieron afectados por el tratamiento papaína. Cabe señalar que el etiquetado de anticuerpos fue alterado si el tratamiento papaína superó 15 min. Se obtuvieron resultados óptimos con un tratamiento de la papaína 10 min asociado a una disociación mecánica (pipeta arriba y abajo de 20 veces). El recubrimiento con poli-D-lisina permite cultivo de células adherentes y la formación de colonias después de varios días en cultivo. Ahora es ampliamente aceptado que en ensayos in vitro viene con sus limitaciones 28,29. Le recomendamos determinar sólo el primer ciclo celular paralas células se someten a por lo menos una división posterior permanecer lo más cerca posible del fenotipo de células en vivo. Vale la pena mencionar que las proteínas geminin (fluorescencia verde) y Cdt1 (fluorescencia roja) utilizados para diseñar el sistema FUCCI 23 fueron previamente demostrado ser expresado abundantemente por progenitores neurales durante la neurogénesis temprana en ratones 30 y en el cerebro adulto tejidos 9,25 . Aunque el mKO2-hCdt1 (30/120) construcción se utiliza principalmente en el presente estudio para seguir la fase G1 con fluorescencia roja, el uso de ambas construcciones [mKO2-hCdt1 (30/120) y MAG-hGem (1/110) ] podría ser previsto para permitir la visualización de las fases principales del ciclo celular (G 1 y SG 2 / M) así como el G 1 / S transición 23. El principal inconveniente de la proyección de imagen de dos colores es los limitados conjuntos compatibles de fluorescencia que todavía pueden utilizarse para el etiquetado de la célula. Una solución es utilizar separatien columnas. Por ejemplo, hemos agotado con éxito la fracción CD24-positivo de células por medio de columnas de separación antes de la clasificación celular y vivir de imágenes ya que utilizamos un anticuerpo CD24-PE que compartió la misma longitud de onda de emisión de la fluorescencia FUCCI-Red 25. Pocos estudios han investigado la duración del ciclo celular de las poblaciones SVZ ratón adulto. La duración del ciclo celular total obtenido con nuestra técnica está cerca de la estimada in vitro por Costa et al. 21, pero hemos sido capaces por primera vez de distinguir las diferentes fases del ciclo celular. En un estudio in vivo, Ponti et al. 22 utiliza la incorporación de análogos de timidina para determinar la dinámica de proliferación de las diferentes poblaciones celulares SVZ. Sin embargo, no podían ni realizar una monitorización continua del ciclo celular ni realizar un seguimiento de las células a nivel de una sola célula. Esto podría ser un problema, ya que se demostró que una fuerte heterogeneidad existe ingeniohin una población celular SVZ dada 22,25. Se describe aquí una alternativa en la técnica in vitro, fácil de instalar, que permite la formación de imágenes en directo de las fases del ciclo celular de las poblaciones neurogénicos diferente adultos a nivel de una sola célula. La comprensión de la regulación del ciclo celular de las células madre neuronales y progenitores sigue siendo un reto para el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos en el contexto del envejecimiento o cerebrales patologías. Nuestro protocolo puede pues tener una amplia gama de aplicaciones. En el contexto del envejecimiento, esta técnica también podría ser útil para comprender los efectos del envejecimiento en NSCs diferenciación. De hecho, es posible identificar las células madre / progenitoras neurales que entran en la diferenciación como su intensidad fluorescente roja es claramente más alto 26. Por último, también podría ser de interés para explotar la formación de imágenes en vivo continua a un nivel de célula única para estudiar la célula procesos intrínsecos y extrínsecos responsables de la pro linajeprogresión de NSCs adultas.

Las células madre neurales (NSC) de reposo son la fuente de la neurogénesis adulta 1 y se pueden convertir en su proliferativa &quot;activado&quot; forma expresa los EGFR (aNSCs) 2. Una vez activado, que dan lugar a células de tránsito amplificar (TAC) 3 y luego neuroblastos que migran a los bulbos olfatorios (OB) a través de un tubo de astrocitos y, finalmente, se diferencian en neuronas 4,5. NSC y su progenie se organizan en &quot;nichos&quot; especializados arquitecturas lo largo de los ventrículos laterales, lo que implica una gran cantidad de factores que controlan su proliferación 6. El aislamiento y purificación de las células SVZ neurogénicos es necesaria para iluminar la compleja regulación molecular de su proliferación, pero han seguido siendo un reto para un largo tiempo debido a la falta de marcadores específicos y las técnicas adaptadas. Nuevos enfoques utilizando citometría de flujo han hecho posible el aislamiento de NSC y their progenie del adulto SVZ 2,7-11. Con el marcador de células madre LeX 12 junto con neuroblast marcador CD24 13 y un EGF de fluorescencia para etiquetar EGFR en células proliferantes 2, recientemente hemos desarrollado una estrategia de FACS que permite la purificación de cinco de las principales poblaciones neurogénicos SVZ: quiescente y activado NSCs, TAC, inmaduros, así como la migración de los neuroblastos 9. A continuación, describimos los detalles en esta célula técnica de clasificación y cómo un LeX / EGFR / CD24 de triple tinción permitido por primera vez el aislamiento de ambos NSCs quiescentes y activados. Aunque la neurogénesis persiste en la edad adulta, la producción de nuevas neuronas disminuye drásticamente en el envejecimiento cerebral 14. La mayoría de los estudios coinciden en una reducción progresiva del número de la proliferación de células progenitoras en la SGZ y SVZ 15-20. Las consecuencias no son inocuos como el declive relacionado con la edad en la neurogénesis en la SVZ provoca una disminución de nneuronas ewborn en los bulbos olfatorios del cerebro envejecido, en última instancia conduce a un deterioro en la discriminación olfativa en ratones de 18 años. Elucidar cinética del ciclo celular de progenitores neurales es un paso clave para entender los mecanismos subyacentes a la evolución de la neurogénesis adulta durante el envejecimiento. Estudios recientes han investigado el ciclo celular y la progresión del linaje de células madre neurales adultas in vitro 21 e in vivo 22, pero ninguno de ellos se aprovecharon de las técnicas de clasificación de células y sondas del ciclo celular fluorescentes codificadas genéticamente para visualizar las fases del ciclo celular de células aisladas a un nivel de una sola célula. Aquí se describe un protocolo que se aprovecha de los ratones transgénicos en los que Fucci células son fluorescentes durante su ciclo celular, lo que permite la distinción entre G 1 y 2 SG / M fases 23. Este protocolo prospectivo muestra cómo el aislamiento de NSC y su progenie de adultos FUCCI mice combinado con microscopía de vídeo time-lapse permite el estudio de la dinámica del ciclo celular a nivel de una sola célula.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well uncoated glass bottom culture plates&#160;</td>
			<td>MatTek Corp.</td>
			<td>P96G-1.5-5-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Plates 96-well</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>89626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>A003E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuroCult NSC Basal Medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuroCult NSC Proliferation Supplement&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GF144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-2</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GF003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBSS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>24010-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V4231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025-15KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor type II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9128</td>
			<td>Ovomucoid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM:F12 medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31330-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;m filter&#160;</td>
			<td>BD Medimachine Filcon</td>
			<td>340622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microtubes 3810X</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z606340-1000EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1595</td>
			<td>Bovine serum albumin solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD24 phycoerythrin-cyanine7 conjugate [PC7]</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A14776</td>
			<td>Mouse IgM; clone MMA. 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD15/LeX fluorescein isothiocyanate [FITC] - conjugated</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>332778</td>
			<td>Rat IgG2b; clone M1/69.&#160; 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human LeX antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>559045</td>
			<td>Mouse IgM; clone MAM.&#160; 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa647 - conjugated EGF ligand</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>E35351</td>
			<td>1:200; Ax647-conjugated EGF ligand in the text</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CompBeads</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>644204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS LS separation columns&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>separation columns (in the manuscript)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgM microbeads&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-047-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>861405</td>
			<td>HO (in the manuscript)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INFLUX cell sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>FACS sorter (in the text)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R confocal laser scanning microscope system attached to an inverted ECLIPSE Ti</td>
			<td>Nikon Corp.</td>
			<td></td>
			<td>confocal laser scanning microscope (in the manuscript)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR.4.13.01 64-bit software</td>
			<td>Nikon Corp.</td>
			<td></td>
			<td>NIS-Elements software (in the manuscript)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Apo VC 20x DIC objective (NA: 0.75)</td>
			<td>Nikon Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECLIPSE Ti thermostated chamber</td>
			<td>Nikon Corp.</td>
			<td></td>
			<td>thermostated chamber (in the manuscript)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>RBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>Tree Star, Ashland, OR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FUCCI mice</td>
			<td>RIKEN BioResource Center, JAPAN</td>
			<td></td>
			<td>Sakaue-Sawano et al. 2008</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell sorting of neural stem and progenitor cells from the adult mouse subventricular zone and live-imaging of their cell cycle dynamics

Las células madre neurales (NSC) en la zona subventricular de los ventrículos laterales (SVZ) sostienen neurogénesis olfativa durante toda la vida en el cerebro de los mamíferos. Generan sucesivamente células tránsito amplificar (TAC) y neuroblastos que se diferencian en neuronas, una vez que se integran los bulbos olfatorios. Emergiendo de células activadas por fluorescencia (FACS) técnicas han permitido el aislamiento de NSCs, así como sus descendientes y han comenzado a arrojar luz sobre las redes de regulación de genes en nichos neurogénicos adultos. Presentamos aquí una técnica de clasificación de células que permite seguir y distinguir la dinámica del ciclo celular de las poblaciones de células antes mencionadas de la SVZ adulto con una LeX / EGFR / CD24 de triple tinción. Las células aisladas se sembraron como células adherentes para explorar en detalle la progresión del ciclo celular por el vídeo time-lapse microscopía. Con este fin, utilizamos transgénico fluorescencia Ubiquitination Indicador del ciclo celular (FUCCI) ratones en los que las células son de color rojo fluorescente During G 1 fase debido a un reportero de color rojo-Cdt1 específica G 1. Este método ha revelado recientemente que NSCs proliferan alargan progresivamente su fase G 1 durante el envejecimiento, lo que lleva a un deterioro de la neurogénesis. Este método es fácilmente extrapolable a otros sistemas y podría ser de gran interés para el estudio de la dinámica del ciclo celular de las células cerebrales en el contexto de patologías cerebrales.

La capacidad de discriminar de manera fiable entre las diferentes poblaciones celulares del ratón adulto linaje de células madre SVZ es primordial para investigar sus propiedades funcionales. Para tal fin, se ha desarrollado un CD24 estrategia LeX / EGFR / etiquetado triple de lo que permite la purificación de poblaciones específicas de células de la SVZ adultos: NSCs quiescentes (LEX brillantes), NSCs activados (LEX + EGFR +), TAC (EGFR +) , neuroblastos inmaduros y migratorias (CD24 + CD24 + y EGFR +, respectivamente) 9 (Figura 1). Aplicado a ratones transgénicos Fucci, la clasificación de células técnica permite la formación de imágenes en vivo de las fases del ciclo celular de las diferentes poblaciones neurogénicos a nivel de una sola célula 25. Ratones FUCCI-rojas se utilizan para seguir la fase G 1 con fluorescencia roja utilizando time-lapse de video microscopia (Figura 2). Células neg FUCCI-rojas representan las células en SG 2 / M fases del ciclo celular, las células pos FUCCI-rojos son células G 1 y células brillantes FUCCI-rojos son células que salen o fuera del ciclo celular (Figura 2B) 23,26. LeX + EGFR + y EGFR + células de adulto joven (Figura 2C) y los ratones de mediana edad (Figura 2D) se sembraron como células adherentes en placas de cultivo revestidas con poli-D-lisina. La primera fase de SG 2 / M fue identificado en las células individuales una vez que la fluorescencia roja se apaga hasta que la célula se divide. Como ya se observó la SG longitud 2 / M fase no mostró diferencias entre LeX + EGFR + y células EGFR +, ya sea en ratones jóvenes o de mediana edad. Luego se calculó la longitud siguiente fase G 1 de la primera división hasta que la fluorescencia roja se apaga. Curiosamente, una fase de alargamiento G 1 se encontró durante el envejecimiento en células LeX + EGFR + pero noen EGFR + células 25 (Figura 2 C, D). En consecuencia, neuroesferas obtuvieron 5 días después de la siembra son más pequeñas en las células LeX + EGFR + obtenidas de ratones de edad como se muestra en la Figura 2E. FUCCI-Green ratones también se puede utilizar para visualizar el SG fase 2 / M con fluorescencia verde (Figura 3A, B), pero las células tienen que ser pre-ordenados usando columnas de separación como anticuerpo LEX-FITC comparte la misma longitud de onda de emisión que el FUCCI- fluorescencia verde (Figura 3C). Un ejemplo de la fluorescencia FUCCI-verde para la primera fase de SG 2 / M de adulto joven LeX + EGFR + y células EGFR + se muestra en la figura 3D. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53247/53247fig1.jpg" /> Figura 1:. Estrategia de la selección celular por FACS Las células (A) se seleccionaron primero de acuerdo con tmorfología heredero utilizando dispersión lateral (SSC) vs dispersión frontal parámetros (FSC). Para más detalles sobre la selección puerta morfología, se refieren a Daynac et al. 9 (a &#39;) Las células muertas fueron etiquetados utilizando HO marcador y excluidos de la selección. (A&#39; &#39;) dobletes fueron excluidos con el parámetro de ancho de pulso. (Etiquetado LEX-FITC / FUCCI-Rojo / EGF-Ax647; B) Con el fin de establecer la clasificación de puertas, Fluorescencia menos uno (FMO) controla para CD24-PC7 y Lex-FITC (FUCCI-Rojo / EGF-Ax647 / CD24 &#39;fueron utilizados) (C, C&#39;. B) A continuación, puertas de clasificación se determinaron en LEX-FITC / FUCCI-Rojo / EGF-Ax647 / CD24-PC7 tubos etiquetados, junto con los controles de FMO; etiquetado -PC7. Los porcentajes medios de células totales se representan dentro de las puertas. Si la selección de CD24 + células (neuroblastos), tenga cuidado de excluir a las células que expresan CD24 brillantes de la puerta. De hecho, CD24 corresponden brillante para ce ependimarialls 2,9. C &quot;representa las células CD24 negativas (cuadrados negro en C). Sólo LeX + EGFR + y EGFR + (C &#39;) puertas de clasificación se utilizaron para este estudio. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53247/53247fig2.jpg" /> Figura 2: análisis directo del ciclo celular utilizando ratones FUCCI-Rojas (A) Representación esquemática del ciclo celular FUCCI-Rojo, donde las células son de color rojo fluorescente durante la fase G1 y sin color durante SG 2 / M fases 23 representación (B) FACS de.. fluorescencia FUCCI-Rojo en células SVZ. (C, D) microscopía de vídeo con LeX + EGFR + y EGFR + células ordenados desde joven (C) y de mediana edad (D) los ratones FUCCI-Red permite el seguimiento de la fase G 1 con fluorescencia roja mientras que la SG 2 / M fases pueden deducirse cuando planeesn la fluorescencia roja se apaga. Imágenes sucesivas se muestran con una escala de tiempo se presenta en D. (E) Imágenes representativas de colonias (neuroesferas) obtenidas de 5 días después de la siembra. Barra de escala:. 10 micras (C, D), 30μm (E) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53247/53247fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53247/53247fig3.jpg" /> Figura 3:.. Estrategia para el análisis directo de ciclo celular utilizando ratones FUCCI-verde (A) Representación esquemática del ciclo celular FUCCI-Verde donde las células son de color verde durante SG 2 / M fase y sin color durante la fase G 1 23 (B) Representación FACS de la fluorescencia FUCCI-Verde: células neg FUCCI-verdes representan las células en la fase G1 del ciclo celular mientras FUCCI-Green células pos son células en SG 2 / M 23. (C) Con el fin de seguir el SG-verde fluorescente 2 / M fases de LeX + EGFR + y células EGFR +, células SVZ tuvieron que ser pre-ordenado con columnas de separación. Las células se marcaron con anticuerpo anti-ratón de LEX y fracción LeX + se retuvo en la columna usando microperlas anti-ratón (véase el protocolo 4.). Entonces, Lex + y Lex - fracciones se eluyeron y se marcaron con anticuerpos CD24-PC7 para FACS clasificación EGF-Ax647 y (D) la microscopía de vídeo de LeX + EGFR + y EGFR + células ordenados desde jóvenes ratones FUCCI-Green permite el seguimiento de. la SG 2 / M fases con fluorescencia verde. Imágenes sucesivas se muestran con una escala de tiempo se presenta en D. Barra de escala: 10 mm (D).

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Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.

Clasificación celular del Neuronales madre y progenitoras Las células del adulto Ratón zona subventricular y Live-imágenes de sus Dinámica del Ciclo Celular

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

cell-sorting-neural-stem-progenitor-cells-from-adult-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.1K vistas.  CEA DSV iRCM SCSR, Laboratoire de Radiopathologie, UMR 967. We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.

Video: Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

The Subventricular Zone En-face: Wholemount Staining and Ependymal Flow

The walls of the lateral ventricles contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. The subventricular zone (SVZ) in these walls is an extensively studied model system for understanding the behavior of neural stem cells and the regulation of adult neurogenesis. Traditionally, these studies have relied on classical sectioning techniques for histological analysis. Here we present an alternative approach, the wholemount technique, which provides a comprehensive, en-face view of this germinal region. Compared to sections, wholemounts preserve the complete cytoarchitecture and cellular relationships within the SVZ. This approach has recently revealed that the adult neural stem cells, or type B1 cells, are part of a mixed neuroepithelium with differentiated ependymal cells lining the lateral ventricles. In addition, this approach has been used to study the planar polarization of ependymal cells and the cerebrospinal fluid flow they generate in the ventricle. With recent evidence that adult neural stem cells are a heterogeneous population that is regionally specified, the wholemount approach will likely be an essential tool for understanding the organization and parcellation of this stem cell niche.

The lateral ventricle walls contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. Traditionally, studies on neurogenesis in this region have relied on classical sectioning techniques for histological analysis. Here we present an alternative approach, the wholemount technique, which provides a comprehensive, en-face view of this germinal region.

En la zona subventricular cara: tinción wholemount y flujo ependimarios

The walls of the lateral ventricles contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. The subventricular zone (SVZ) in these walls is an ...

Investigación

Neurociencias

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Células vivas imágenes de células de los órganos sensoriales Precursor en Intacto Drosophila Las pupas

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Aislamiento y cultivo de células de la cresta neural de embriones murinos del Tubo Neural

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a pseudostratified epithelium lining the lateral ventricles of the embryonic brain. Genotoxic stresses, such as ionizing radiation, have highly deleterious effects on the developing brain related to the high sensitivity of NSPC. Elucidation of the cellular and molecular mechanisms involved depends on the characterization of the DNA damage response of these particular types of cells, which requires an accurate method to determine NSPC progression through the cell cycle in the damaged tissue. Here is shown a method based on successive intraperitoneal injections of EdU and BrdU in pregnant mice and further detection of these two thymidine analogues in coronal sections of the embryonic brain. EdU and BrdU are both incorporated in DNA of replicating cells during S phase and are detected by two different techniques (azide or a specific antibody, respectively), which facilitate their simultaneous detection. EdU and BrdU staining are then determined for each NSPC nucleus in function of its distance from the ventricular margin in a standard region of the dorsal telencephalon. Thus this dual labeling technique allows distinguishing cells that progressed through the cell cycle from those that have activated a cell cycle checkpoint leading to cell cycle arrest in response to DNA damage.
An example of experiment is presented, in which EdU was injected before irradiation and BrdU immediately after and analyzes performed within the 4 hr&#160;following irradiation. This protocol provides an accurate analysis of the acute DNA damage response of NSPC in function of the phase of the cell cycle at which they have been irradiated. This method is easily transposable to many other systems in order to determine the impact of a particular treatment on cell cycle progression in living tissues.

Administration of two analogs of thymidine, EdU and BrdU, in pregnant mice allows the analysis of cell cycle progression in neural and progenitor cells in the embryonic mouse brain. This method is useful to determine the effects of genotoxic stress, including ionizing radiation, during brain development.

La evaluación de la progresión del ciclo celular de la madre neurales y células progenitoras en el cerebro en desarrollo del ratón después de estrés genotóxico

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

Derivación-Feeder libres de Células Progenitoras de la cresta neural Pluripotentes Células Madre

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Derivation of Adult Human Fibroblasts and their Direct Conversion into Expandable Neural Progenitor Cells

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides fascinating prospects for the derivation of autologous transplants that circumvent histocompatibility barriers. However, progression through a pluripotent state and subsequent complete differentiation into desired lineages remains a roadblock for the clinical translation of iPSC technology because of the associated neoplastic potential and genomic instability. Recently, we and others showed that somatic cells cannot only be converted into iPSCs but also into different types of multipotent somatic stem cells by using defined factors, thereby circumventing progression through the pluripotent state. In particular, the direct conversion of human fibroblasts into induced neural progenitor cells (iNPCs) heralds the possibility of a novel autologous cell source for various applications such as cell replacement, disease modeling and drug screening. Here, we describe the isolation of adult human primary fibroblasts by skin biopsy and their efficient direct conversion into iNPCs by timely restricted expression of Oct4, Sox2, Klf4, as well as c-Myc. Sox2-positive neuroepithelial colonies appear after 17 days of induction and iNPC lines can be established efficiently by monoclonal isolation and expansion. Precise adjustment of viral multiplicity of infection and supplementation of leukemia inhibitory factor during the induction phase represent critical factors to achieve conversion efficiencies of up to 0.2%. Thus far, patient-specific iNPC lines could be expanded for more than 12 passages and uniformly display morphological and molecular features of neural stem/progenitor cells, such as the expression of Nestin and Sox2. The iNPC lines can be differentiated into neurons and astrocytes as judged by staining against TUJ1 and GFAP, respectively. In conclusion, we report a robust protocol for the derivation and direct conversion of human fibroblasts into stably expandable neural progenitor cells that might provide a cellular source for biomedical applications such as autologous neural cell replacement and disease modeling.

Generation of induced pluripotent stem cells provides fascinating prospects for the derivation of autologous transplants. However, progression through a pluripotent state and laborious re-differentiation still hinders clinical translation. Here we describe the derivation of adult human fibroblasts and their direct conversion into induced neural progenitor cells and the subsequent differentiation into neural lineages.

Derivación de adultos fibroblastos humanos y de su conversión directa en células progenitoras neurales expandible

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation into three types of cells: neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Identifying aNSC-derived regions and characterizing the aNSC properties are critical for the potential use of aNSCs and for the elucidation of their role in neural regeneration. The subcallosal zone (SCZ), located between white matter and the hippocampus, has recently been reported to contain aNSCs and continuously give rise to neuroblasts. A low percentage of aNSCs from the SCZ is differentiated into neurons; most cells are differentiated into glial cells, such as oligodendrocytes and astrocytes. These cells are suggested to have a therapeutic potential for traumatic cortical injury. This protocol describes in detail the process to generate SCZ-aNSCs from an adult mouse brain. A brain matrix with intervals of 1 mm is used to obtain the SCZ-containing coronal slices and to precisely dissect the SCZ from the whole brain. The SCZ sections are initially subjected to a neurosphere culture. A well-developed culture system allows for the verification of their characteristics and can increase research on NSCs. A neurosphere culture system provides a useful tool for determining proliferation and collecting the genuine NSCs. A monolayer culture is also an in vitro system to assay proliferation and differentiation. Significantly, this culture system provides a more homogenous environment for NSCs than the neurosphere culture system. Thus, using a discrete brain region, these culture systems will be helpful for expanding our knowledge about aNSCs and their applications for therapeutic uses.

Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described.

Aislamiento y cultivo de células madre adultas neural de la Zona subcallosal Ratón

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

Neurodegenerative disorders are common and heterogeneous in terms of their symptoms and cellular affectation, making their study complicated due to the lack of proper animal models that fully mimic human diseases and the poor availability of post-mortem human brain tissue. Adult human nervous tissue culture offers the possibility to study different aspects of neurological disorders. Molecular, cellular, and biochemical mechanisms could be easily addressed in this system, as well as testing and validating drugs or different treatments, such as cell-based therapies. This method combines long-term organotypic cultures of the adult human cortex, obtained from epileptic patients undergoing resective surgery, and ex vivo intracortical transplantation of induced pluripotent stem cell-derived cortical progenitors. This method will allow the study of cell survival, neuronal differentiation, the formation of synaptic inputs and outputs, and the electrophysiological properties of human-derived cells after transplantation into intact adult human cortical tissue. This approach is an important step prior to the development of a 3D human disease modeling platform that will bring basic research closer to the clinical translation of stem cell-based therapies for patients with different neurological disorders and allow the development of new tools for reconstructing damaged neural circuits.

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

This protocol describes long-term organotypic cultures of adult human cortex combined with ex vivo intracortical transplantation of induced pluripotent stem cell-derived cortical progenitors, which present a novel methodology to further test stem cell-based therapies for human neurodegenerative disorders.

Cultivos organotípicos de corteza humana adulta como modelo ex vivo para el trasplante y validación de células madre humanas

Neurodegenerative disorders are common and heterogeneous in terms of their symptoms and cellular affectation, making their study complicated due to the ...

"Ordeño cerebral" de ratas para el aislamiento de células progenitoras de oligodendrocitos y tronco neural

The "Brain Milking" Method for the Isolation of Neural Stem Cells and Oligodendrocyte Progenitor Cells from Live Rats

Tissue-specific neural stem cells (NSCs) remain active in the mammalian postnatal brain. They reside in specialized niches, where they generate new neurons and glia. One such niche is the subependymal zone (SEZ; also called the ventricular-subventricular zone), which is located across the lateral walls of the lateral ventricles, adjacent to the ependymal cell layer. Oligodendrocyte progenitor cells (OPCs) are abundantly distributed throughout the central nervous system, constituting a pool of proliferative progenitor cells that can generate oligodendrocytes.
Both NSCs and OPCs exhibit self-renewal potential and quiescence/activation cycles. Due to their location, the isolation and experimental investigation of these cells is performed postmortem. Here, we describe in detail &#34;brain milking&#34;, a method for the isolation of NSCs and OPCs, amongst other cells, from live animals. This is a two-step protocol designed for use in rodents and tested in rats. First, cells are &#34;released&#34; from the tissue via stereotaxic intracerebroventricular (i.c.v.) injection of a &#34;release cocktail&#34;. The main components are neuraminidase, which targets ependymal cells and induces ventricular wall denudation, an integrin-&#946;1-blocking antibody, and fibroblast growth factor-2. At a second &#34;collection&#34; step, liquid biopsies of cerebrospinal fluid are performed from the cisterna magna, in anesthetized rats without the need of an incision.
Results presented here show that isolated cells retain their endogenous profile and that NSCs of the SEZ preserve their quiescence. The denudation of the ependymal layer is restricted to the anatomical level of injection and the protocol (release and collection) is tolerated well&#160; by the animals. This novel approach paves the way for performing longitudinal studies of endogenous neurogenesis and gliogenesis in experimental animals.

Autor destacado: Recolección de células madre neurales y progenitoras de animales vivos utilizando un novedoso protocolo de ordeño cerebral 

A method for the isolation of neural stem cells and oligodendrocyte progenitor cells from the brains of live rats is presented here in experimental detail. It allows multiple collections of these cells from the same animals without compromising their well-being.

El método de "ordeño cerebral" para el aislamiento de células madre neurales y células progenitoras de oligodendrocitos de ratas vivas

Tissue-specific neural stem cells (NSCs) remain active in the mammalian postnatal brain. They reside in specialized niches, where they generate new ...