Los receptores P2X7 son extremadamente versátiles y funcionan de manera diferente dependiendo de la cantidad de agonista presente. De esta manera, P2X7 tiene diferentes funciones y puede regular la fisiología de muchos sistemas diferentes. Este protocolo permite la investigación de las tres funciones principales del receptor P2X7.
Es un método rápido, reproducible y cuantificable para entender su función. Nuestro enfoque en cómo los receptores P2X7 pueden modular en las células progenitoras neuronales. Sin embargo, este método se puede adaptar fácilmente para adaptarse a cualquier tipo de celda.
Los estudiantes que han leído suficiente literatura antes de probar este procedimiento pueden aprender que en un solo día y ser capaces de ejecutar esto solo después de dos o tres intentos. Comience este procedimiento obteniendo células progenitoras neuronales de la zona subventricular y el hipocampo de ratones adultos como se describe en el protocolo de texto. Mantener los cultivos a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono.
Las neuroesferas deben formarse después de siete a 10 días es el paso cero cultivo de zona subventricular y después de 15 a 20 días en el cultivo del hipocampo. Después de la fase inicial de cultivo cero de paso, pasa cada siete a 10 días según sea necesario utilizando un gabinete de seguridad biológica y prácticas estándar de cultivo de tejidos. Pasaje de las esferas cuando alcancen 150 a 200 micras de diámetro.
Recoger las esferas y el medio en un tubo de 15 mililitros y girar a baja velocidad durante dos minutos. Retire el medio e incubar las células con reactivo de disociación durante siete a 10 minutos a 37 grados centígrados dependiendo del tamaño de las esferas. Por último, cuente las células utilizando un hemocitoómetro o un contador automático de celdas.
Suspendemos las células individuales en un mililitro de medio sódico libre de calcio. A continuación, cargue las células con dos ninigras por mililitro de tinte indicador de calcio y 10 microlitros de 5% de ácido plurónico. Incubar las células durante 30 minutos a 37 grados centígrados.
Lave las células añadiendo de tres a cinco mililitros de medio de sodio sin calcio y centrifugando suavemente. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en un medio de sodio libre de calcio, lavándose por segunda vez. Vuelva a suspender las células en un mililitro de medio sódico libre de calcio.
Luego coloque las células sobre hielo y dé las des-esterifes durante 30 minutos. Lavar las células una vez más añadiendo de tres a cinco mililitros de medio de potasio y centrifugando como antes. Después de volver a suspender las células en medio de potasio, elicquate en la clasificación celular activada por fluorescencia o tubos FACS a una concentración de un millón de células por cada 500 microlitros por tubo FACS.
Coloque los tubos FACS sobre hielo hasta que las células estén listas para ser analizadas. No deje las células sobre hielo durante un período prolongado, pero comience el ensayo lo antes posible. Para algunas muestras, pre-incubar las células con inhibidor específico del receptor P2X7 como se describe en el protocolo de texto.
Unos minutos antes de ejecutar la primera muestra, añadir cloruro de calcio a una concentración final de un milimolar y colocar el tubo en un baño de agua celsius de 37 grados para recuperar. Suelte un pequeño agitador magnético limpio en el tubo FACS y coloque el tubo en el módulo de tiempo que está conectado a un baño de agua de 37 grados Celsius circulante para controlar la temperatura de la muestra. Seleccione una velocidad de agitación baja para garantizar el movimiento de la muestra sin introducir un efecto de vórtice.
Coloque la jarra de agua y el adaptador de tubo en la plataforma de muestra y cierre el brazo de la palanca de la máquina FACS. Inicie la adquisición de muestras y ejecute el ejemplo durante tres minutos en alrededor de 1.000 eventos por segundo. En la marca de 40 segundos, retire rápidamente el tubo y agregue el agonista P2X7.
Un ATP mili evolucionador o 300 micromolares BzATP. A continuación, reemplace el tubo para continuar la adquisición. Mientras se registra la primera muestra, prepare la segunda muestra con cloruro de calcio.
Colóquelo en 37 grados celsius para dar tiempo suficiente para que las células se calienten antes del análisis. Una vez finalizada la primera muestra, limpie la ingesta ejecutando una muestra de agua. A continuación, la adquisición de la segunda muestra puede comenzar como antes.
Limpie siempre la ingesta entre muestras. Cree una suspensión de una sola celda como antes y ahorre algunos mililitros del medio acondicionado. Utilice el medio para volver a suspender las células a una concentración de un millón de células por cada 100 microlitros por tubo FACS y coloque las células sobre hielo hasta que estén listas.
Antes de ejecutar el ensayo, agregue 900 microlitros de medio de potasio para un volumen final de un mililitro. Coloque los tubos en un baño de agua Celsius de 37 grados durante 10 minutos para recuperarse. Si procede, pre-incubar las células con tratamientos incluyendo los inhibidores específicos de P2X7.
Inmediatamente antes de ejecutar el ensayo, agregue 25 bromuro de etidio micromolar al tubo FACS. A continuación, agregue el agitador magnético, coloque el tubo en la máquina FACS y comience la adquisición como antes. Para inducir la formación de poros en la membrana celular, añadir un ATP milimolar o 100 micromolar BzATP 40 segundos después del inicio de la adquisición.
Ejecute los ejemplos en alrededor de 1.000 eventos por segundo durante seis minutos. Mientras se ejecuta la primera muestra, tome la segunda muestra del hielo y colóquela en el baño de agua de 37 grados Celsius para permitir que las células se recuperen antes del análisis. Una vez finalizada la primera adquisición de la muestra y limpiada la toma, la segunda muestra se puede colocar en la máquina para comenzar a grabar.
Suspendimos las células individuales en medio acondicionado y las elquaquate en tubos FACS a una concentración de al menos un millón de células por cada 100 microlitros por tubo FACS. Diluir las células a una concentración final de un millón de células por mililitro con medio de sodio y colocar las células sobre hielo hasta que se realice el análisis. Utilice una micra ancha de perlas G como dianas fagocíticas para ensayos de fagocitosis en tiempo real.
Antes de ejecutar la primera muestra, transfiera las células a un baño de agua de 37 grados Celsius e in incubarlas durante aproximadamente siete a 10 minutos para permitir que las células se recuperen. Añadir cualquier tratamiento que requiera pre-incubación a sus respectivos tubos incluyendo ATP, ATP oxidado, citokelisina D y 4%paraformaldehído. No se requiere pre-incubación para 5% de suero humano.
Si los tratamientos se añaden aproximadamente al mismo tiempo, las muestras se pueden ejecutar consecutivamente mientras que otras continúan incubando porque sus tiempos de incubación varían. Coloque la muestra en el citometro con el agitador magnético e inicie la adquisición de la muestra como antes. Retire el tubo de muestra de la máquina de 15 a 20 segundos después del inicio de la adquisición y agregue cinco microlitros de perlas YG sin diluir.
Devuelva el tubo FACS de muestra al instrumento y continúe con la adquisición. Ejecute las muestras durante siete a ocho minutos en torno a 1.000 eventos por segundo. Mientras se ejecuta la primera muestra, tome la segunda muestra del hielo y colóquela en un baño de agua Celsius de 37 grados para permitir que las células se recuperen antes del análisis.
Una vez finalizada la primera muestra y limpiada la ingesta, comience la adquisición en la segunda muestra. Cuando se traza con el tiempo, la afluencia de calcio fue generalmente similar en las células progenitoras neurales de la zona hipoalalra y subventricular. Agonistas fueron añadidos en la marca 42.
BzATP activa rápidamente los receptores P2X7, abriendo el canal iónico y permitiendo la afluencia de calcio que se une a fluo-8 y fluoresces. La aplicación de ATP generalmente resulta en una afluencia de calcio más gradual. Tiene una menor afinidad a P2X7 en comparación con BzATP y también resultará en la activación del receptor acoplado de proteína G.
Después de la aplicación del ATP y BzATP del agonista, la citometría de flujo de resolución de tiempo captura el bromuro de etidio que entra en las células a través de los poros transmembranas en tiempo real. Este efecto fue atenuado por el inhibidor específico de P2X7. Los ensayos de respuesta a la concentración de ATP ilustran los efectos de la concentración agonista en la formación de poros P2X7 utilizando el cambio en la fluorescencia del bromuro de etidio con el tiempo.
Aquí la fagocitosis implicada por el receptor P2X7 por las células progenitoras neurales de la zona hiporreal y subventricular se muestra en tiempo real. Los niveles de fagocitosis desinhibidas de las cuentas de látex YG se establecieron como el control positivo. ATP inhibió la fagocitosis de las cuentas de YG en la misma medida que los inhibidores no específicos, a saber, la fijación de paraformaldehído y el inhibidor de la polimerización de actina citoquelina D.5% suero abolió toda la fagocitosis innata.
Mantener una población celular sana y reducir el tiempo en el hielo es vital para obtener resultados reproducibles. La variabilidad se puede minimizar mediante el mismo lote de ATP para todo el ensayo de celda. Nuestro resultado cronomecutado de la citometría de flujo que se muestra aquí es el único mensaje que puede continuar seleccionando cantidades para flujos y cambios en una subcuarción objetivo.
El método alternativo es un microscopio fluorescente y un lector de bandejas fluorescentes. Sin embargo, este método no puede medir continuamente los cambios fluorescentes debido al programa de afinidad fluorescente. P2X7 es multimodal único.
Descubrir su expresión en una celda de interés abre una serie de preguntas únicas para que los investigadores exploren.
