אנחנו אסירי תודה ל- C ז&#39;ובר, V נוויל, V Barroca, J טיליאט וכל צוות של מתקני בעלי חיים; לJ Baijer וN Dechamps למיון תא; O. אטיין לקבלת סיוע טכני, וא Gouret לסיועה המנהלי. Cytometry זרימה ומיון תא בוצעה בiRCM cytometry הזרימה המשותפת למשאב, שהוקמה על ידי מענקי ציוד מDIM-גזע-קוטב, INSERM, Fondation ARC, וCEA. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של חברת חשמל הצרפתי (EDF). יש MD מלגה מLa הליגה העל Contre le הסרטן וLM מאזור איל-דה-פראנס (DIM Biothérapies). מארק-אנדרה Mouthon ופרנסואה ד Boussin מחבר מניות שותף בכיר.

<ol>
	<li>Morshead, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+in+the+adult+mammalian+forebrain+a+relatively+quiescent+subpopulation+of+subependymal+cells.">Neural stem cells in the adult mammalian forebrain a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells.</a> Neuron. 13, 1071-1082 (1994).</li><li>Pastrana, E., Cheng, L. C., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+prospective+purification+of+adult+subventricular+zone+neural+stem+cells+and+their+progeny.">Simultaneous prospective purification of adult subventricular zone neural stem cells and their progeny.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 6387-6392 (2009).</li><li>Doetsch, F., Caille, I., Lim, D. A., Garcia Verdugo, J. M., Alvarez Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subventricular+zone+astrocytes+are+neural+stem+cells+in+the+adult+mammalian+brain.">Subventricular zone astrocytes are neural stem cells in the adult mammalian brain.</a> Cell. 97, 703-716 (1999).</li><li>Kriegstein, A., Alvarez Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glial+nature+of+embryonic+and+adult+neural+stem+cells.">The glial nature of embryonic and adult neural stem cells.</a> Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).</li><li>Lois, C., Garcia Verdugo, J. M., Alvarez Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chain+migration+of+neuronal+precursors.">Chain migration of neuronal precursors.</a> Science. 271, 978-981 (1996).</li><li>Fuentealba, L. C., Obernier, K., Alvarez Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neural+stem+cells+bridge+their+niche.">Adult neural stem cells bridge their niche.</a> Cell stem cell. 10, 698-708 (2012).</li><li>Rietze, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+a+pluripotent+neural+stem+cell+from+the+adult+mouse+brain.">Purification of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain.</a> Nature. 412, 736-739 (2001).</li><li>Fischer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+isolation+of+adult+neural+stem+cells+from+the+mouse+subependymal+zone.">Prospective isolation of adult neural stem cells from the mouse subependymal zone.</a> Nat Protoc. 6, 1981-1989 (2011).</li><li>Daynac, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quiescent+neural+stem+cells+exit+dormancy+upon+alteration+of+GABAAR+signaling+following+radiation+damage.">Quiescent neural stem cells exit dormancy upon alteration of GABAAR signaling following radiation damage.</a> Stem Cell Res. 11, 516-528 (2013).</li><li>Codega, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification+and+purification+of+quiescent+adult+neural+stem+cells+from+their+in+vivo+niche.">Prospective identification and purification of quiescent adult neural stem cells from their in vivo niche.</a> Neuron. 82, 545-559 (2014).</li><li>Mich, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification+of+functionally+distinct+stem+cells+and+neurosphere-initiating+cells+in+adult+mouse+forebrain.">Prospective identification of functionally distinct stem cells and neurosphere-initiating cells in adult mouse forebrain.</a> Elife. 3, e02669 (2014).</li><li>Capela, A., Temple, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LeX+ssea+1+is+expressed+by+adult+mouse+CNS+stem+cells+identifying+them+as+nonependymal.">LeX ssea 1 is expressed by adult mouse CNS stem cells identifying them as nonependymal.</a> Neuron. 35, 865-875 (2002).</li><li>Calaora, V., Chazal, G., Nielsen, P. J., Rougon, G., Moreau, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mCD24+expression+in+the+developing+mouse+brain+and+in+zones+of+secondary+neurogenesis+in+the+adult.">mCD24 expression in the developing mouse brain and in zones of secondary neurogenesis in the adult.</a> Neuroscience. 73, 581-594 (1996).</li><li>Pineda, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+derived+TGF-beta+increases+in+the+stem+cell+niche+and+perturbs+neurogenesis+during+aging+and+following+irradiation+in+the+adult+mouse+brain.">Vascular derived TGF-beta increases in the stem cell niche and perturbs neurogenesis during aging and following irradiation in the adult mouse brain.</a> EMBO Mol Med. 5, 548-562 (2013).</li><li>Lugert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quiescent+and+active+hippocampal+neural+stem+cells+with+distinct+morphologies+respond+selectively+to+physiological+and+pathological+stimuli+and+aging.">Quiescent and active hippocampal neural stem cells with distinct morphologies respond selectively to physiological and pathological stimuli and aging.</a> Cell stem cell. 6, 445-456 (2010).</li><li>Blackmore, D. G., Golmohammadi, M. G., Large, B., Waters, M. J., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise+increases+neural+stem+cell+number+in+a+growth+hormone+dependent+manner++augmenting+the+regenerative+response+in+aged+mice.">Exercise increases neural stem cell number in a growth hormone dependent manner augmenting the regenerative response in aged mice.</a> Stem cells. 27, 2044-2052 (2009).</li><li>Bouab, M., Paliouras, G. N., Aumont, A., Forest Berard, K., Fernandes, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+of+the+subventricular+zone+neural+stem+cell+niche+evidence+for+quiescence+associated+changes+between+early+and+mid+adulthood.">Aging of the subventricular zone neural stem cell niche evidence for quiescence associated changes between early and mid adulthood.</a> Neuroscience. 173, 135-149 (2011).</li><li>Enwere, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+results+in+reduced+epidermal+growth+factor+receptor+signaling+diminished+olfactory+neurogenesis+and+deficits+in+fine+olfactory+discrimination.">Aging results in reduced epidermal growth factor receptor signaling diminished olfactory neurogenesis and deficits in fine olfactory discrimination.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 8354-8365 (2004).</li><li>Maslov, A. Y., Barone, T. A., Plunkett, R. J., Pruitt, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cell+detection+characterization+and+age+related+changes+in+the+subventricular+zone+of+mice.">Neural stem cell detection characterization and age related changes in the subventricular zone of mice.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 1726-1733 (2004).</li><li>Tropepe, V., Craig, C. G., Morshead, C. M., van der Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor+alpha+null+and+senescent+mice+show+decreased+neural+progenitor+cell+proliferation+in+the+forebrain+subependyma.">Transforming growth factor alpha null and senescent mice show decreased neural progenitor cell proliferation in the forebrain subependyma.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 17, 7850-7859 (1997).</li><li>Costa, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+live+imaging+of+adult+neural+stem+cell+division+and+lineage+progression+in+vitro.">Continuous live imaging of adult neural stem cell division and lineage progression in vitro.</a> Development. 138, 1057-1068 (2011).</li><li>Ponti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+and+lineage+progression+of+neural+progenitors+in+the+ventricular-subventricular+zones+of+adult+mice.">Cell cycle and lineage progression of neural progenitors in the ventricular-subventricular zones of adult mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1045-1054 (2013).</li><li>Sakaue Sawano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+spatiotemporal+dynamics+of+multicellular+cell+cycle+progression.">Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell cycle progression.</a> Cell. 132, 487-498 (2008).</li><li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+the+adult+mouse+neural+stem+cells+using+the+neurosphere+assay.">Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay.</a> Journal of visualized experiments JoVE. , (2010).</li><li>Daynac, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFbeta+lengthens+the+G1+phase+of+stem+cells+in+aged+mouse+brain.">TGFbeta lengthens the G1 phase of stem cells in aged mouse brain.</a> Stem cells. 32, 3257-3265 (2014).</li><li>Roccio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+stem+cell+fate+changes+by+differential+cell+cycle+progression+patterns.">Predicting stem cell fate changes by differential cell cycle progression patterns.</a> Development. 140, 459-470 (2013).</li><li>Walker, T. L., Kempermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+mouse+two+cultures+isolation+and+culture+of+adult+neural+stem+cells+from+the+two+neurogenic+zones+of+individual+mice.">One mouse two cultures isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice.</a> Journal of visualized experiments JoVE. , e51225 (2014).</li><li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+neurospheres+re+evaluating+the+relationship.">Neural stem cells and neurospheres re evaluating the relationship.</a> Nat Methods. 2, 333-336 (2005).</li><li>Pastrana, E., Silva Vargas, V., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyes+wide+open+a+critical+review+of+sphere+formation+as+an+assay+for+stem+cells.">Eyes wide open a critical review of sphere formation as an assay for stem cells.</a> Cell stem cell. 8, 486-498 (2011).</li><li>Spella, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Licensing+regulators+Geminin+and+Cdt1+identify+progenitor+cells+of+the+mouse+CNS+in+a+specific+phase+of+the+cell+cycle.">Licensing regulators Geminin and Cdt1 identify progenitor cells of the mouse CNS in a specific phase of the cell cycle.</a> Neuroscience. 147, 373-387 (2007).</li></ol>

The authors declare that they have no conflict of interest.

טכניקת מיון התא המתוארת במסמך זה מאפשרת אפליה בין NSCs אמין השקטים, NSCs מופעל ומחקרי הצאצאים מאפשרים של הנכסים שלהם ואת הדינמיקה במוח הבוגר 9. בשילוב עם טכנולוגית FUCCI המאפשר ההדמיה של התקדמות מחזור התא בתאים חיים 23, שפתחנו טכניקה מהירה ויעילה למעקב G 1 וSG 2 / M השלבים של מחזור התא ממבוגרים צעירים ותאי מוח עכבר גילאים. טכניקת תא מיון שימוש בפרוטוקול זה הייתה שילוב תוקף הראשון של סמנים המאפשרים טיהור של חמש האוכלוסיות עצביות העיקריות מSVZ 9. זה היה גם הטכניקה הראשונה תוקף מאפשרת את ההבחנה של NSCs שקט והופעל. ראוי לציין כי טכניקה זו אינה דורשת שימוש בעכברים מהונדסים כשלעצמה, אשר הוא הכרחי כאשר מותאם לדגמי עכבר מהונדסים suפרק כFUCCI. מאז, קודגה et al. 10 השתמשו שילוב תיוג משולש GFAP-GFP / CD133 / EGFR להבחין NSCs שקט מעמיתו הופעל אבל זה לא יכול להיות מותאם לטכנולוגית FUCCI כפי שהוא דורש שימוש בעכברים מהונדסים GFAP-GFP. מישיגן et al. 11 פיתחו / EGFR / אסטרטגית Glast CD24 משולשת תיוג שמחולקת תוצאות משותפות עם הטכניקה המשמשת במחקר זה 9. ואכן, מתאם גבוה בין לקס וסמני Glast NSCs כבר נצפה באל Daynac et. ללמוד 9. עם זאת, נוגדני Glast משמשים במישיגן et al. הטכניקה הוא מצמידים את Phycoerythrin ולכן לא יכולים להיות מותאמים לשימוש בעכברים FUCCI-אדומים. יש כמה נקודות טכניות חשובות שדורשות תשומת לב לפני מיון תאי SVZ. ראשית, צעד הניתוק הוא מאוד חשוב כמו רקמת המוח יש ניתק לתוך תאים בודדים תוך שמירה על המבנה בטגריטי של החלבונים המשמשים לאסטרטגית תיוג נוגדן. 0.05% טריפסין-EDTA הוכח כיעיל מאוד בdissociating רקמת SVZ 27 אבל אנטיגן לקס נמצא רגיש מאוד שכן כמעט כל immunofluorescence LEX-FITC היה אבוד (מידע לא מוצג). לפיכך, פפאין שימש כזה היה יותר יעיל ופחות הרסני מאשר פרוטאזות אחרת ברקמת המוח. יתר על כן, לא לקס ולא EGFR ולא CD24 הושפע טיפול פפאין. יש לציין כי תיוג הנוגדן שונו אם טיפול פפאין עלה 15 דקות. השגנו תוצאות אופטימליות עם טיפול פפאין 10 דקות הקשורים ניתוק מכאני (פיפטה למעלה ולמטה 20 פעמים). ציפוי פולי-D-ליזין מאפשר תרבות של תאים חסיד והיווצרות המושבות לאחר מספר ימים בתרבות. עכשיו זה מקובל כי במבחני חוץ גופית מגיע עם המגבלות שלהם 28,29. אנו ממליצים קביעת מחזור התא הראשון רק להתאים עוברים החלוקה לפחות אחד לאחר להישאר קרוב ככל האפשר לin vivo פנוטיפ התא. ראוי לציין להזכיר כי חלבוני Geminin (הקרינה ירוקה) וCdt1 (הקרינה אדומה) המשמשים לעיצוב מערכת FUCCI 23 הוצגו בעבר לבוא לידי ביטוי בשפע על ידי אבות עצביים במהלך הנוירוגנזה מוקדמת בעכברים 30 וברקמות מוח בוגר 9,25 . למרות מבנה mKO2-hCdt1 (30/120) היה בעיקר בשימוש במחקר הנוכחי לעקוב שלב G1 עם הקרינה אדומה, השימוש בשני המבנים [mKO2-hCdt1 (30/120) וMAG-hGem (1/110) ] יכול להיות שחזה כדי לאפשר ההדמיה של השלבים העיקריים של מחזור התא (1 G וSG 2 / M), כמו גם את המעבר / S G 1 23. החסרון העיקרי של ההדמיה כפול הצבע הוא הסטים תואמים המוגבלים של הקרינה שעדיין יכול לשמש לתיוג התא. פתרון אחד הוא להשתמש separatiעל עמודים. לדוגמא, יש לנו בהצלחה מדולדלת חלק CD24 חיובי מהתאים באמצעות עמודות הפרדה לפני תא מיון ולחיות הדמיה כפי שנהגנו נוגדן CD24-PE שחלק את אותו אורך גל הפליטה מקרינת FUCCI-האדומה 25. מחקרים מעטים בחנו את אורך מחזור התא של אוכלוסיות SVZ העכבר מבוגרות. אורך מחזור התא הכולל שהושג עם הטכניקה שלנו הוא קרוב לאחד מוערך במבחנה על ידי קוסטה et al. 21, אבל הצלחנו בפעם הראשונה להבחין שלבי מחזור התא השונים. במחקר in vivo, פונטי et al. 22 השתמש בשילוב של תחליפי תימידין כדי לקבוע את דינמיקת ההתפשטות של אוכלוסיות תאי SVZ השונות. עם זאת, הם יכולים גם לבצע ניטור רציף של מחזור התא ולא לעקוב אחר התאים ברמת התא הבודד. זה יכול להיות נושא כפי שהראה כי ההטרוגניות חזקה קיימת שנינותהין אוכלוסיית תאי SVZ נתון 22,25. אנו מתארים כאן חלופיים בטכניקת מבחנה, קל להתקנה, המאפשר ההדמיה החיה של שלבי מחזור התא של אוכלוסיות עצביות מבוגרות שונה ברמת תא בודד. הבנת הרגולציה של מחזור התא של תאי גזע עצביים ואת אבות עדיין מהווה אתגר לפיתוח גישות טיפוליות חדשות בהקשר של פתולוגיות הזדקנות או מוח. כך הפרוטוקול שלנו יכול להיות מגוון רחב של יישומים. בהקשר של הזדקנות, טכניקה זו יכולה להיות יעילה גם כדי להבין את ההשפעות של הזדקנות על בידול NSCs. ואכן, ניתן לזהות תאי גזע / עצביים נכנסו בידול כעוצמת הניאון האדום שלהם היא במובהק גבוהה יותר 26. לבסוף, זה יכול להיות גם עניין לנצל את ההדמיה לחיות רציפה ברמת תא בודד ללמוד תהליכים פנימיים וחיצוניים התא אחראים לפרו השושלתgression של NSCs המבוגר.

תאי גזע עצביים רגיעה (NSCs) הם המקור לneurogenesis מבוגרת 1 ויכולים להמיר שגשוגם &quot;מופעל&quot; צורה המבטאת את EGFR (aNSCs) 2. לאחר הפעלה, הם להצמיח תאי מעבר הגברה (TACs) 3 ולאחר מכן neuroblasts שנודדים לנורות חוש הריח (OB) דרך צינור של האסטרוציטים ולבסוף להתמיין נוירונים 4,5. NSCs וצאצאיהם מאורגנים ב&quot; נישות &quot;מיוחדות ארכיטקטורות לאורך החדרים לרוחב, לסבך את מספר עצום של גורמי שליטה התפשטותם 6. הבידוד והטיהור של תאים עצביים SVZ יש צורך להאיר את הרגולציה המולקולרית המורכבת של ההפצה שלהם, אבל נשאר אתגר במשך זמן רב בשל חוסר סמנים ספציפיים וטכניקות מותאמות. גישות חדשות באמצעות cytometry זרימה שניתנו אפשריות הבידוד של NSCs וtheiצאצאי r מהמבוגרים SVZ 2,7-11. באמצעות סמן תאי גזע 12 LEX יחד עם CD24 neuroblast סמן 13 וEGF הקרינה לתייג EGFR בתאים מתרבים 2, לאחרונה פיתחו אסטרטגית FACS מאפשרת הטיהור של חמש מהאוכלוסיות העצביות SVZ העיקריות: שקטה והופעלה NSCs, TACs, neuroblasts לא בוגר כמו גם הנודד 9. כאן אנו מתארים בפרטי תא זה מיון טכניקה ואיך לקס / EGFR / הכתמה משולשת CD24 אפשרה בפעם הראשונה את הבידוד של שני NSCs שקט והופעל. למרות neurogenesis נמשכת בבגרות, הייצור של תאי עצב חדשים הוא ירד באופן דרסטי במוח המזדקן 14. רוב המחקרים מסכימים על ירידה הדרגתית במספר מתרבים תאים בSGZ וSVZ 15-20. ההשלכות הן לא תמימות כמו הירידה הקשורות לגיל בהנוירוגנזה בSVZ מעוררת הפחתה של nנוירונים ewborn בנורות חוש הריח של המוח בגיל, סופו של דבר מוביל לירידת ערך באפליה חוש הריח בעכברים בגיל 18. הבהרת קינטיקה מחזור התא של אבות עצביים היא צעד מפתח להבנת מנגנוני ההתפתחות של neurogenesis למבוגרים במהלך הזדקנות. מחקרים שנעשו לאחרונה חקרו את מחזור התא והתקדמות שושלת של תאי גזע עצביים מבוגרים במבחנה 21 וin vivo 22 אבל אף אחד מהם ניצל טכניקות תא מיון ובדיקות מחזור תא ניאון מקודדים גנטיים כדי להמחיש את שלבי מחזור התא של תאים מבודדים ברמת תא בודד. כאן אנו מתארים פרוטוקול שמנצל את העכברים מהונדסים FUCCI שבו תאים הם פלורסנט במהלך מחזור התא שלהם, המאפשר ההבחנה בין G 1 וSG 2 / M שלבים 23. פרוטוקול זה מראה כיצד בידוד פוטנציאלי של NSCs וצאצאיהם ממבוגרי FUCCI מילCE בשילוב עם מיקרוסקופ וידאו הזמן לשגות מאפשר המחקר של דינמיקת מחזור התא ברמת תא בודד.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well uncoated glass bottom culture plates&#160;</td>
			<td>MatTek Corp.</td>
			<td>P96G-1.5-5-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Plates 96-well</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>89626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>A003E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuroCult NSC Basal Medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuroCult NSC Proliferation Supplement&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GF144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-2</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GF003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBSS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>24010-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V4231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025-15KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor type II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9128</td>
			<td>Ovomucoid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM:F12 medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31330-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;m filter&#160;</td>
			<td>BD Medimachine Filcon</td>
			<td>340622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microtubes 3810X</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z606340-1000EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1595</td>
			<td>Bovine serum albumin solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD24 phycoerythrin-cyanine7 conjugate [PC7]</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A14776</td>
			<td>Mouse IgM; clone MMA. 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD15/LeX fluorescein isothiocyanate [FITC] - conjugated</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>332778</td>
			<td>Rat IgG2b; clone M1/69.&#160; 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human LeX antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>559045</td>
			<td>Mouse IgM; clone MAM.&#160; 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa647 - conjugated EGF ligand</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>E35351</td>
			<td>1:200; Ax647-conjugated EGF ligand in the text</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CompBeads</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>644204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS LS separation columns&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>separation columns (in the manuscript)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgM microbeads&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-047-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>861405</td>
			<td>HO (in the manuscript)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INFLUX cell sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>FACS sorter (in the text)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R confocal laser scanning microscope system attached to an inverted ECLIPSE Ti</td>
			<td>Nikon Corp.</td>
			<td></td>
			<td>confocal laser scanning microscope (in the manuscript)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR.4.13.01 64-bit software</td>
			<td>Nikon Corp.</td>
			<td></td>
			<td>NIS-Elements software (in the manuscript)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Apo VC 20x DIC objective (NA: 0.75)</td>
			<td>Nikon Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECLIPSE Ti thermostated chamber</td>
			<td>Nikon Corp.</td>
			<td></td>
			<td>thermostated chamber (in the manuscript)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>RBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>Tree Star, Ashland, OR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FUCCI mice</td>
			<td>RIKEN BioResource Center, JAPAN</td>
			<td></td>
			<td>Sakaue-Sawano et al. 2008</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell sorting of neural stem and progenitor cells from the adult mouse subventricular zone and live-imaging of their cell cycle dynamics

תאי גזע עצביים (NSCs) באזור subventricular של החדרים לרוחב (SVZ) לקיים neurogenesis חוש הריח לאורך כל חיים במוח של היונקים. הם ברציפות לייצר תאי מעבר הגברה (TACs) וneuroblasts שלהתמיין נוירונים ברגע שהם לשלב נורות חוש הריח. תא הניאון מתעורר מיון פעיל טכניקות (FACS) אפשרו את הבידוד של NSCs כמו גם צאצאיהם והחלו לשפוך אור על רשתות רגולציה גן בנישות עצביות מבוגרות. אנו מדווחים כאן טכניקת מיון תא שמאפשרת לעקוב ולהבחין דינמיקת מחזור התא של אוכלוסיות תאים הנ&quot;ל מSVZ המבוגר עם לקס / EGFR / הכתמה משולשת CD24. לאחר מכן תאים מבודדים הם מצופים כמו תאים חסיד לחקור בפרטי התקדמות מחזור התא שלהם על ידי מיקרוסקופ וידאו הזמן לשגות. לשם כך, אנו משתמשים בעכברים מהונדסים מחוון סלולארי מחזור הקרינה Ubiquitination (FUCCI) שבו תאים אדומים-ניאון דוריןG G שלב 1 בשל כתב אדום-Cdt1 ספציפי G 1. שיטה זו חשפה לאחרונה כי NSCs מתרבים בהדרגה להאריך שלב G 1 במהלך הזדקנות, שהוביל לירידת ערך neurogenesis. שיטה זו היא בקלות transposable למערכות אחרות ויכולה להיות עניין רב ללימוד דינמיקת מחזור התא של תאי מוח בהקשר של פתולוגיות מוח.

היכולת להבחין באופן מהימן בין אוכלוסיות תאים השונות של שושלת תאי גזע SVZ העכבר הבוגר היא קדמונית לחקור תכונות הפונקציונליות שלהם. לשם כך, פיתחנו לקס / EGFR / אסטרטגיה משולש תיוג CD24 המאפשרת הטיהור של אוכלוסיות תאים ספציפיות מSVZ המבוגר: NSCs שקט (בהיר לקס), NSCs מופעל (LEX + EGFR +), TACs (+ EGFR) , Neuroblasts בוגר והנודד (CD24 + + EGFR וCD24 +, בהתאמה) 9 (איור 1). מוחל על עכברים הטרנסגניים FUCCI, מיון התא טכניקה מאפשר ההדמיה החיה של שלבי מחזור התא של האוכלוסיות העצביות השונות ברמת התא הבודד 25. עכברי FUCCI-אדומים שמשו למעקב השלב G 1 עם מיקרוסקופיה זמן לשגות וידאו באמצעות הקרינה אדומה (איור 2 א). תאי נג FUCCI-אדומים מייצגים את התאים בS-G 2 / M שלבים של מחזור התא, תאי קופה FUCCI-אדומים הם תאי G 1 ותאים בהירים FUCCI-אדומים הם תאי יציאה או ממחזור התא (איור 2) 23,26. לקס + + EGFR וEGFR + תאים ממבוגרים צעירים (איור 2 ג) ועכברים בגיל העמידה (איור 2 ד) היו מצופים כתאים חסיד על צלחות תרבות מצופים פולי-D ליזין. שלב SG 2 / M הראשון זוהה בתאים בודדים פעם אחת את הקרינה האדומה מכבה עד שהתא מתחלק. כפי שנצפה בעבר SG אורך שלב 2 / M לא הראה שום הבדל בין לקס + + EGFR וEGFR + תאים, או בעכברים צעירים או בגיל העמידה. אז חישבנו את אורך שלב G 1 הבא מהליגה הראשונה עד הקרינה האדומה מכבה. מעניין לציין, התארכות שלב G 1 נמצאה במהלך ההזדקנות בקס + EGFR אך לא תאים +בEGFR + תאים 25 (איור 2 ג, ד). כתוצאה מכך, neurospheres השיג 5 ימים לאחר ציפוי הם קטנים יותר בתאי קס + EGFR + התקבלו מעכברים בגילים כפי שמוצג באיור 2E. גם עכברים-ירוקים FUCCI יכולים לשמש כדי לחזות SG שלב 2 / M עם הקרינה ירוקה (איור 3 א &#39;, ב&#39;), אבל תאים צריכים להיות מראש מסודרים באמצעות עמודות הפרדה כנוגדן לקס-FITC משותף אותו גל הפליטה מFUCCI- הקרינה ירוקה (איור 3 ג). דוגמא לקרינת FUCCI-ירוקה לSG הראשון שלב 2 / M של מבוגרים צעירים לקס + EGFR + ותאי EGFR + מוצגת באיור 3D. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53247/53247fig1.jpg" /> איור 1:. אסטרטגיה של תא בחירה על ידי FACS תאים (א) היו ראשון שנבחרו על פי tמורפולוגיה יורש באמצעות פיזור בצד (SSC) לעומת פיזור קדימה פרמטרים (FSC). לפרטים נוספים על בחירת שער מורפולוגיה, מתייחס לDaynac et al. 9 (א &#39;) תאים מתים תויגו באמצעות סמן HO ולא נכללו בבחירה. (&#39; &#39;) כפילויות הוצאו באמצעות פרמטר רוחב דופק. כדי להגדיר את השערים, הקרינה מיון מינוס אחד (FMO) שולט לCD24-PC7 (LEX-FITC / FUCCI-אדום / EGF-Ax647 תיוג; B) ולקס-FITC (FUCCI-אדום / EGF-Ax647 / CD24 תיוג -PC7; ב &#39;) שימש (C, C. &quot;) ואז, שערי מיון נקבעו בקס-FITC / FUCCI-אדום צינורות שכותרתו / EGF-Ax647 / CD24-PC7 יחד עם בקרות FMO. האחוזים הממוצעים של תאים כולל מיוצגים בשערי. אם בחירת CD24 + תאים (neuroblasts), להיזהר שלא לכלול תאים לבטא בהירים CD24 מהשער. ואכן, המתאים בהיר CD24 לספירת ependymalLLS 2,9. ג &#39;מייצג את התאים השליליים CD24 (ריבוע שחור בC). רק לקס + + EGFR וEGFR + (ג &#39;) שערי מיון שמשו למחקר זה. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53247/53247fig2.jpg" /> איור 2: ניתוחים בשידור חי של מחזור תא באמצעות עכברי FUCCI-אדומים ייצוג סכמטי של מחזור תא FUCCI-האדום שבו תאים אדומים-ניאון בשלב G1 וחסר צבע בSG 2 / M שלבים 23 ייצוג (B) FACS של (א).. הקרינה FUCCI-אדומה על תאי SVZ. (C, D) מיקרוסקופיה וידאו עם לקס + + EGFR וEGFR + תאים ממוינים מצעיר (C) וגיל העמידה (ד) עכברים FUCCI-אדומים מאפשרת המעקב של השלב G 1 עם הקרינה אדומה ואילו SG ניתן להסיק 2 / M שלבים when הקרינה האדומה מכבה. תמונות רצופות מוצגות בקנה מידת זמן שהוצג בD. (E) נציג תמונות של מושבות (neurospheres) השיגו 5 ימים לאחר ציפוי. בר סולם:. 10 מיקרומטר (C, D), 30μm (E) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53247/53247fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53247/53247fig3.jpg" /> איור 3:.. אסטרטגיה לניתוחים חיים של מחזור תא באמצעות עכברים FUCCI-ירוקים ייצוג סכמטי של מחזור תא FUCCI-הירוק שבו תאים ירוקים בSG 2 / M שלב וחסר צבע בשלב G 1 23 (א) ייצוג FACS (ב) של הקרינה FUCCI-ירוקה: תאי נג FUCCI-ירוקים מייצגים את התאים בשלב G 1 של מחזור התא ואילו FUCCI-Green תאי קופה הם תאים בSG 2 / M 23. (ג) על מנת לעקוב אחרי SG הירוק-ניאון 2 / M שלבים של לקס + EGFR + ותאי EGFR +, תאי SVZ היו צריכים מראש מסודרים עם עמודות הפרדה. תאים תויגו עם אנטי עכבר נוגדן לקס ולקס + חלק נשמרו על העמודה באמצעות microbeads אנטי עכבר (ראה פרוטוקול 4.). ואז, לקס + ולקס - שברים היו eluted ושכותרתו עם EGF-Ax647 ונוגדני CD24-PC7 למיון FACS (ד &#39;) במיקרוסקופ וידאו של לקס + + EGFR וEGFR + תאים ממוינים מעכברי FUCCI-ירוקים צעירים מאפשר המעקב של. SG 2 / M שלבים עם הקרינה ירוקה. תמונות רצופות מוצגות בקנה מידת זמן שהוצג בD. בר סולם: 10 מיקרומטר (ד).

Watch this Scientific Journal Video about Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics at JoVE.com

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.

מיון תא של תאי גזע ועצביים ממבוגרי עכבר Subventricular האזור וחי-הדמיה של Dynamics תא המחזור שלהם

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

cell-sorting-neural-stem-progenitor-cells-from-adult-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.1K Views.  CEA DSV iRCM SCSR, Laboratoire de Radiopathologie, UMR 967. We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.

Video: Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

The Subventricular Zone En-face: Wholemount Staining and Ependymal Flow

The walls of the lateral ventricles contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. The subventricular zone (SVZ) in these walls is an extensively studied model system for understanding the behavior of neural stem cells and the regulation of adult neurogenesis. Traditionally, these studies have relied on classical sectioning techniques for histological analysis. Here we present an alternative approach, the wholemount technique, which provides a comprehensive, en-face view of this germinal region. Compared to sections, wholemounts preserve the complete cytoarchitecture and cellular relationships within the SVZ. This approach has recently revealed that the adult neural stem cells, or type B1 cells, are part of a mixed neuroepithelium with differentiated ependymal cells lining the lateral ventricles. In addition, this approach has been used to study the planar polarization of ependymal cells and the cerebrospinal fluid flow they generate in the ventricle. With recent evidence that adult neural stem cells are a heterogeneous population that is regionally specified, the wholemount approach will likely be an essential tool for understanding the organization and parcellation of this stem cell niche.

The lateral ventricle walls contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. Traditionally, studies on neurogenesis in this region have relied on classical sectioning techniques for histological analysis. Here we present an alternative approach, the wholemount technique, which provides a comprehensive, en-face view of this germinal region.

אזור Subventricular En פנים: מכתים Wholemount ושפל Ependymal

The walls of the lateral ventricles contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. The subventricular zone (SVZ) in these walls is an ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Live-תא הדמיה של תאים מבשר חושי האיברים אינטקט תסיסנית גלמים

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

בידוד והתרבות של תאים עצביים לפסגה מהצינור עובריים עצבית Murine

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a pseudostratified epithelium lining the lateral ventricles of the embryonic brain. Genotoxic stresses, such as ionizing radiation, have highly deleterious effects on the developing brain related to the high sensitivity of NSPC. Elucidation of the cellular and molecular mechanisms involved depends on the characterization of the DNA damage response of these particular types of cells, which requires an accurate method to determine NSPC progression through the cell cycle in the damaged tissue. Here is shown a method based on successive intraperitoneal injections of EdU and BrdU in pregnant mice and further detection of these two thymidine analogues in coronal sections of the embryonic brain. EdU and BrdU are both incorporated in DNA of replicating cells during S phase and are detected by two different techniques (azide or a specific antibody, respectively), which facilitate their simultaneous detection. EdU and BrdU staining are then determined for each NSPC nucleus in function of its distance from the ventricular margin in a standard region of the dorsal telencephalon. Thus this dual labeling technique allows distinguishing cells that progressed through the cell cycle from those that have activated a cell cycle checkpoint leading to cell cycle arrest in response to DNA damage.
An example of experiment is presented, in which EdU was injected before irradiation and BrdU immediately after and analyzes performed within the 4 hr&#160;following irradiation. This protocol provides an accurate analysis of the acute DNA damage response of NSPC in function of the phase of the cell cycle at which they have been irradiated. This method is easily transposable to many other systems in order to determine the impact of a particular treatment on cell cycle progression in living tissues.

Administration of two analogs of thymidine, EdU and BrdU, in pregnant mice allows the analysis of cell cycle progression in neural and progenitor cells in the embryonic mouse brain. This method is useful to determine the effects of genotoxic stress, including ionizing radiation, during brain development.

התקדמות מחזור תא הערכה של גזע עצבי ובתאים במוח המתפתח העכבר, למרות מתח genotoxic

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

גזירה ללא מזין של תאים עצביים קרסט אב קדמון מפלוריפוטנטיים אדם בתאי גזע

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Derivation of Adult Human Fibroblasts and their Direct Conversion into Expandable Neural Progenitor Cells

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides fascinating prospects for the derivation of autologous transplants that circumvent histocompatibility barriers. However, progression through a pluripotent state and subsequent complete differentiation into desired lineages remains a roadblock for the clinical translation of iPSC technology because of the associated neoplastic potential and genomic instability. Recently, we and others showed that somatic cells cannot only be converted into iPSCs but also into different types of multipotent somatic stem cells by using defined factors, thereby circumventing progression through the pluripotent state. In particular, the direct conversion of human fibroblasts into induced neural progenitor cells (iNPCs) heralds the possibility of a novel autologous cell source for various applications such as cell replacement, disease modeling and drug screening. Here, we describe the isolation of adult human primary fibroblasts by skin biopsy and their efficient direct conversion into iNPCs by timely restricted expression of Oct4, Sox2, Klf4, as well as c-Myc. Sox2-positive neuroepithelial colonies appear after 17 days of induction and iNPC lines can be established efficiently by monoclonal isolation and expansion. Precise adjustment of viral multiplicity of infection and supplementation of leukemia inhibitory factor during the induction phase represent critical factors to achieve conversion efficiencies of up to 0.2%. Thus far, patient-specific iNPC lines could be expanded for more than 12 passages and uniformly display morphological and molecular features of neural stem/progenitor cells, such as the expression of Nestin and Sox2. The iNPC lines can be differentiated into neurons and astrocytes as judged by staining against TUJ1 and GFAP, respectively. In conclusion, we report a robust protocol for the derivation and direct conversion of human fibroblasts into stably expandable neural progenitor cells that might provide a cellular source for biomedical applications such as autologous neural cell replacement and disease modeling.

Generation of induced pluripotent stem cells provides fascinating prospects for the derivation of autologous transplants. However, progression through a pluripotent state and laborious re-differentiation still hinders clinical translation. Here we describe the derivation of adult human fibroblasts and their direct conversion into induced neural progenitor cells and the subsequent differentiation into neural lineages.

גזירה של fibroblasts אדם הבוגר וההמרה ישירה שלהם לתאים להרחבה עצבי אב

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation into three types of cells: neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Identifying aNSC-derived regions and characterizing the aNSC properties are critical for the potential use of aNSCs and for the elucidation of their role in neural regeneration. The subcallosal zone (SCZ), located between white matter and the hippocampus, has recently been reported to contain aNSCs and continuously give rise to neuroblasts. A low percentage of aNSCs from the SCZ is differentiated into neurons; most cells are differentiated into glial cells, such as oligodendrocytes and astrocytes. These cells are suggested to have a therapeutic potential for traumatic cortical injury. This protocol describes in detail the process to generate SCZ-aNSCs from an adult mouse brain. A brain matrix with intervals of 1 mm is used to obtain the SCZ-containing coronal slices and to precisely dissect the SCZ from the whole brain. The SCZ sections are initially subjected to a neurosphere culture. A well-developed culture system allows for the verification of their characteristics and can increase research on NSCs. A neurosphere culture system provides a useful tool for determining proliferation and collecting the genuine NSCs. A monolayer culture is also an in vitro system to assay proliferation and differentiation. Significantly, this culture system provides a more homogenous environment for NSCs than the neurosphere culture system. Thus, using a discrete brain region, these culture systems will be helpful for expanding our knowledge about aNSCs and their applications for therapeutic uses.

Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described.

בידוד והתרבות של תאי גזע בוגרים עצביים מאזור העכבר Subcallosal

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

Neurodegenerative disorders are common and heterogeneous in terms of their symptoms and cellular affectation, making their study complicated due to the lack of proper animal models that fully mimic human diseases and the poor availability of post-mortem human brain tissue. Adult human nervous tissue culture offers the possibility to study different aspects of neurological disorders. Molecular, cellular, and biochemical mechanisms could be easily addressed in this system, as well as testing and validating drugs or different treatments, such as cell-based therapies. This method combines long-term organotypic cultures of the adult human cortex, obtained from epileptic patients undergoing resective surgery, and ex vivo intracortical transplantation of induced pluripotent stem cell-derived cortical progenitors. This method will allow the study of cell survival, neuronal differentiation, the formation of synaptic inputs and outputs, and the electrophysiological properties of human-derived cells after transplantation into intact adult human cortical tissue. This approach is an important step prior to the development of a 3D human disease modeling platform that will bring basic research closer to the clinical translation of stem cell-based therapies for patients with different neurological disorders and allow the development of new tools for reconstructing damaged neural circuits.

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

This protocol describes long-term organotypic cultures of adult human cortex combined with ex vivo intracortical transplantation of induced pluripotent stem cell-derived cortical progenitors, which present a novel methodology to further test stem cell-based therapies for human neurodegenerative disorders.

תרביות אורגנוטיפיות של קליפת המוח האנושית הבוגרת כמודל Ex vivo להשתלה ואימות של תאי גזע אנושיים

Neurodegenerative disorders are common and heterogeneous in terms of their symptoms and cellular affectation, making their study complicated due to the ...

חולדה "חליבה מוחית" לבידוד תאי גזע עצבי ואוליגודנדרוציטים

The "Brain Milking" Method for the Isolation of Neural Stem Cells and Oligodendrocyte Progenitor Cells from Live Rats

Tissue-specific neural stem cells (NSCs) remain active in the mammalian postnatal brain. They reside in specialized niches, where they generate new neurons and glia. One such niche is the subependymal zone (SEZ; also called the ventricular-subventricular zone), which is located across the lateral walls of the lateral ventricles, adjacent to the ependymal cell layer. Oligodendrocyte progenitor cells (OPCs) are abundantly distributed throughout the central nervous system, constituting a pool of proliferative progenitor cells that can generate oligodendrocytes.
Both NSCs and OPCs exhibit self-renewal potential and quiescence/activation cycles. Due to their location, the isolation and experimental investigation of these cells is performed postmortem. Here, we describe in detail &#34;brain milking&#34;, a method for the isolation of NSCs and OPCs, amongst other cells, from live animals. This is a two-step protocol designed for use in rodents and tested in rats. First, cells are &#34;released&#34; from the tissue via stereotaxic intracerebroventricular (i.c.v.) injection of a &#34;release cocktail&#34;. The main components are neuraminidase, which targets ependymal cells and induces ventricular wall denudation, an integrin-&#946;1-blocking antibody, and fibroblast growth factor-2. At a second &#34;collection&#34; step, liquid biopsies of cerebrospinal fluid are performed from the cisterna magna, in anesthetized rats without the need of an incision.
Results presented here show that isolated cells retain their endogenous profile and that NSCs of the SEZ preserve their quiescence. The denudation of the ependymal layer is restricted to the anatomical level of injection and the protocol (release and collection) is tolerated well&#160; by the animals. This novel approach paves the way for performing longitudinal studies of endogenous neurogenesis and gliogenesis in experimental animals.

מחבר זרקור: איסוף תאי גזע עצביים ותאי אב מבעלי חיים באמצעות פרוטוקול חליבה מוחי חדשני 

A method for the isolation of neural stem cells and oligodendrocyte progenitor cells from the brains of live rats is presented here in experimental detail. It allows multiple collections of these cells from the same animals without compromising their well-being.

שיטת "חליבת המוח" לבידוד תאי גזע עצביים ותאי אב אוליגודנדרוציטים מחולדות חיות

Tissue-specific neural stem cells (NSCs) remain active in the mammalian postnatal brain. They reside in specialized niches, where they generate new ...