Agradecemos a Dr. Jessica Habashi para la lectura crítica del manuscrito. Agradecemos a Dr. Xianyong Sheng de la centro de la imagen, Facultad de Ciencias de la vida, Capital Normal University (Beijing, China), para realizar la localización de ensayo DR5-GFP . Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación de Ciencias de Gobierno Municipal de Beijing (CIT &#38; TCD20150102) y de la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (31600248).

Nota: Este protocolo tiene tres partes: 1) observando la formación de patrones en embriones de Arabidopsis de tipo salvaje utilizando microscopía DIC; 2) caracterizar el embrión patrón formación a través de la observación de la expresión de la proteína del marcador mediante láser confocal de barrido microscopía; y 3) determinar el papel de un gen específico en la embriogénesis (usando el mutante de naa10 como ejemplo).
1. el óvulo claro
<ol>
	<li>Preparación de material de planta Nota: El protocolo descrito aquí es un ejemplo de cómo hacer crecer plantas sanas; otras maneras de crecer plantas sanas también trabajan.<ol>
		<li>Añade 100 a un tubo de 1,5 mL y luego añadir 1 mL de hipoclorito de sodio 1.5% (15 mL de 10% de cloro con 85 mL de agua de la mezcla) para esterilizar las semillas durante 5 minutos invertir el tubo varias veces para asegurar que las semillas y la solución bien mezcladas para esterilizar las superficie semillas completamente.</li>
		<li>Forzar las semillas en la parte inferior del tubo de centrifugación durante 30 s a 1.200 x g, eliminar el sobrenadante y lavar las semillas con agua destilada cuatro veces en un banco para eliminar el hipoclorito residual.</li>
		<li>Añadir a 1 L de agua ultrapura 4,4 g de mezcla sal basal Murashige y Skoog (MS) y 10 g de sacarosa. Revolver la mezcla para disolver las sales y la sacarosa. Ajustar la solución a pH 5.8 con 1 M de KOH, añadir 3 g de agente gelificante, como Phytagel, a la solución de sacarosa de MS y para esterilizar la solución a 121 ° C durante 15 min hacer MS medio.</li>
		<li>Vierta 30 mL de medio MS en una placa de cultivo de 12 cm para generar placas de medio MS.</li>
		<li>Coloque las semillas estériles en la placa MS. Transferir la placa a una cámara de crecimiento y mantenga la placa bajo condiciones de día largo (22 ° C por 16 h en la luz y 18 ° C durante 8 h en la oscuridad) después de la estratificación de la semilla (3 días a 4 ° C en la oscuridad).</li>
		<li>Después de 8 días de crecimiento, transferir las plantas al suelo (mezcla rica en nutrientes suelo y vermiculita en una proporción 1:1) en una bandeja, cubrir la bandeja con una tapa blanca, transparente por 5 días evitar pérdida de agua y deje un espacio para evitar la vitrificación de las plantas.</li>
		<li>Tomar la tapa de la bandeja y cultivar las plantas en una cámara independiente bajo condiciones de día largo (ver 1.1.5). Encender la luz en 6:00 y fuera a 22:00. Después de 20 días de crecimiento en la cámara de cabina, las plantas habrán floreció y produjo silicuas.</li>
		<li>Marca de tallos de brotes de la flor con un hilo en la posición de la semilla en la inflorescencia en 20:00 (no utilice la primera a la tercera flor; las silicuas generados a partir de estos capullos generalmente desarrollan algunas semillas abortadas, y esto puede alterar la proporción de normales a anormales óvulos). Definir el inicio de la polinización el óvulo como cuando el brote marcado se abre en flor en 8:00 la mañana siguiente.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparación de solución de Hoyer
	<ol>
		<li>Añadir a un tubo de 50 mL 24 g de hidrato de cloral y envuelva el tubo completamente con papel de aluminio (no son estables bajo luz soluciones de hidrato de cloral).</li>
		<li>A continuación, añadir 9 mL de agua ultrapura y 3 mL de glicerol a la solución anterior y agitar el tubo para disolver el hidrato de cloral. Para hacer solución de Hoyer, dejar que el tubo soporte de la noche a temperatura ambiente para eliminar cualquier burbuja.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Separación y separación del óvulo
	<ol>
		<li>Coloque un pedazo de cinta adhesiva de doble cara a un portaobjeto de microscopio. Coloque una silicua crecido para el número deseado de días después de la polinización (DAP) de la diapositiva con la pseudoseptum perpendicular a la superficie; Esto hará fácil dividir los carpelos (figuras 1A y 1B).</li>
		<li>Dividir los carpelos en ambos lados de la pseudoseptum con una aguja de jeringa y coloque los dos carpelos disecados a la diapositiva para que los óvulos en la silicua son visibles bajo un estereoscopio (figuras 1C y 1D).</li>
		<li>Dispensar de 70 μl de solución de Hoyer en el portaobjetos de cristal y luego humedecer la punta de un par de pinzas de punta fina con solución de Hoyer por inmersión. Usando el estereoscopio, mover los óvulos en la solución de Hoyer en el portaobjetos con las pinzas para limpiar los embriones. Se aplica un cubreobjetos a la diapositiva suavemente para evitar la generación de burbujas.</li>
		<li>Colocar la corredera acabada en una caja en un cuarto oscuro de 2-12 h (cuanto más madura un óvulo es, cuanto más tiempo se necesitará) a temperatura ambiente. Embriones en la etapa de 2/4-cell (DAP de 1-2) pueden observarse microscópicamente después de 2 h, mientras que los embriones entre el octante y estadios globulares (DAP 3) se observan después de 4 h. Embriones más maduros (4-8 UTA) pueden observarse después de 12 h.</li>
		<li>Examinar los óvulos hayan borrado usando la función DIC de un microscopio. Coloque los embriones en un campo de baja potencia (10 X) y luego cambiar a un campo de alta potencia (objetivo de inmersión del aceite del X 100) para observar el patrón celular en los embriones desarrollados.</li>
		<li>Examinar los embriones en diferentes etapas de desarrollo.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Caracterización de patrones de embrión e identidad de la célula a través de la observación de la expresión de la proteína de marcador
<ol>
	<li>Preparación de materiales de planta
	<ol>
		<li>Clonar el promotor y la secuencia del marcador gene u hormona respuesta elemento de codificación y luego fusionarlo con una proteína fluorescente (como GFP); a continuación, inserte el construir el vector binario (por ejemplo, pCambia1300). Aquí, el elemento de respuesta a auxinas DR5 se presenta como un ejemplo10.</li>
		<li>Introducir el plásmido resultante del DR5-GFP en las plantas de tipo silvestre por tumefaciens de la agrobacteria-mediado transformación11. Seleccione las plantas de T1 utilizando placas de medio de MS con Higromicina (50 mg/mL de licor de madre, diluido 1:1, 000). Las plantas transgénicas se exhiben largas raíces y generar dos hojas de la roseta después de 8 días de crecimiento bajo las condiciones descritas en 1.1.5.</li>
		<li>Transferir las plantas transgénicas a tierra y cultivarlos como se indica en 1.1.6 y 1.1.7.</li>
		<li>Recoger las semillas de la T2 de las líneas T1 independiente. Sembrar las semillas en las placas de EM-Higromicina, seleccionar las plantas portadoras de una copia de la inserción del DR5-GFP (la proporción de plantas resistentes a las plantas sensibles será aproximadamente 3:1) y transferencia al suelo.</li>
		<li>Cultivar las plantas de T2 como se indica en 1.1.6 y 1.1.7.</li>
		<li>Recoger las semillas de la T3 de las plantas de T2. Sembrar las semillas en las placas de EM-Higromicina, seleccionar las plantas transgénicas homocigóticas (todas las plantas de una sola línea muestran resistencia Higromicina) y transferir al suelo.</li>
		<li>Marque los botones florales de las plantas homocigóticas de T3 como se indica en 1.1.8.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Observación de señal GFP
	<ol>
		<li>Mezclar 3 mL de glicerol con 47 mL de agua ultrapura para generar una solución de glicerol 6%.</li>
		<li>Adhiera un pedazo de cinta adhesiva de doble cara a un portaobjetos de vidrio y fijar una silicua como se indica en 1.3.1.</li>
		<li>Dividir los carpelos en ambos lados de la pseudoseptum con una aguja de jeringa y coloque los dos carpelos disecados en el portaobjetos bajo un estereoscopio como se indica en 1.3.2.</li>
		<li>Dispensar 30 μl de 6% de glicerol en el portaobjetos de cristal y colocar todos los óvulos de los carpelos disecados en la solución con unas pinzas de punta fina. Colocar suavemente un cubreobjetos sobre el portaobjetos.</li>
		<li>Como la capa de semilla y endospermo en cada óvulo pueden impedir la observación de las señales de la GFP en el embrión, extraer el embrión el óvulo. Puntee la diapositiva rápidamente y suavemente a extraer el embrión desde el óvulo (más madura un óvulo es, menos fuerza se debe aplicar a la diapositiva).</li>
		<li>Examinar el portaobjetos usando microscopía de láser confocal de la fluorescencia de GFP. Encontrar los embriones aislados en un campo de baja potencia (10 X) y registrar su ubicación, luego cambiar a un campo de alta potencia (objetivo de inmersión del aceite del X 100) para observar la expresión DR5-GFP en los embriones mediante el establecimiento de la fuente de luz de excitación de 488 nm para la detección de la señal de la GFP.</li>
		<li>Detectar la expresión de GFP en los embriones para seleccionar la línea T3 adecuada para su posterior análisis.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Caracterización de la formación embrionaria en un mutante letal embrión mediante separación del óvulo y marcador proteína observación: Naa10 como ejemplo
<ol>
	<li>Dibujo del embrión en plantas mutantes naa10
	<ol>
		<li>Preparar los materiales de planta como se indica en 1.1.1-1.1.7.</li>
		<li>Identificar la naa10+ / − plantas por PCR utilizando cebadores específicos del gen5y marca luego los capullos de la naa10+ / − plantas como se indica en 1.1.8.</li>
		<li>Realizar la separación del óvulo y la examinación microscópica del naa10+ / − embriones como se indica en 1.2 y 1.3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Análisis de la proteína del marcador naa10 embriones
	<ol>
		<li>Obtener convenientes líneas transgénicas DR5-GFP utilizando el procedimiento descrito en 2.1-2.2.</li>
		<li>Cruzar una línea transgénica homocigótica de DR5-GFP con un naa10+ / − planta para obtener naa10+ / − plantas que son homocigóticas para el marcador de la fluorescencia de GFP en la generación F2 (identificada por PCR de genes específicos) caracterizar naa10+ / −5 y observe la señal GFP bajo el microscopio utilizando una línea homocigótica del DR5-GFP .</li>
		<li>Marcar los botones florales de naa10+ / − plantas que son homocigóticas para DR5-GFP como se indica en 2.1.7.</li>
		<li>La búsqueda de la señal de la GFP en naa10 los embriones que son homocigotos para DR5-GFP como se indica en 2.2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Jenik, P. D., Gillmor, C. S., Lukowitz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+patterning+in+Arabidopsis+thaliana.">Embryonic patterning in Arabidopsis thaliana.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 207-236 (2007).</li><li>Lau, S., Slane, D., Herud, O., Kong, J., Jurgens, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+embryogenesis+in+flowering+plants:+setting+up+the+basic+body+pattern.">Early embryogenesis in flowering plants: setting up the basic body pattern.</a> Annu Rev Plant Biol. 63, 483-506 (2012).</li><li>Wendrich, J. R., Weijers, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+embryo+as+a+miniature+morphogenesis+model.">The Arabidopsis embryo as a miniature morphogenesis model.</a> New Phytol. 199 (1), 14-25 (2013).</li><li>ten Hove, C. A., Lu, K. J., Weijers, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+plant:+cell+fate+specification+in+the+early+Arabidopsis+embryo.">Building a plant: cell fate specification in the early Arabidopsis embryo.</a> Development. 142 (3), 420-430 (2015).</li><li>Feng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+N-terminal+acetylation+is+required+for+embryogenesis+in+Arabidopsis.">Protein N-terminal acetylation is required for embryogenesis in Arabidopsis.</a> J Exp Bot. 67 (15), 4779-4789 (2016).</li><li>Berleth, T., Jurgens, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+monopteros+gene+in+organising+the+basal+body+region+of+the+Arabidopsis+embryo.">The role of the monopteros gene in organising the basal body region of the Arabidopsis embryo.</a> Development. 118, 575-587 (1993).</li><li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D-myo-inositol-3-phosphate+affects+phosphatidylinositol-mediated+endomembrane+function+in+Arabidopsis+and+is+essential+for+auxin-regulated+embryogenesis.">D-myo-inositol-3-phosphate affects phosphatidylinositol-mediated endomembrane function in Arabidopsis and is essential for auxin-regulated embryogenesis.</a> Plant Cell. 23 (4), 1352-1372 (2011).</li><li>Nodine, M. D., Yadegari, R., Tax, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPK1+and+TOAD2+are+two+receptor-like+kinases+redundantly+required+for+Arabidopsis+embryonic+pattern+formation.">RPK1 and TOAD2 are two receptor-like kinases redundantly required for Arabidopsis embryonic pattern formation.</a> Dev Cell. 12 (6), 943-956 (2007).</li><li>Ulmasov, T., Murfett, J., Hagen, G., Guilfoyle, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aux/IAA+proteins+repress+expression+of+reporter+genes+containing+natural+and+highly+active+synthetic+auxin+response+elements.">Aux/IAA proteins repress expression of reporter genes containing natural and highly active synthetic auxin response elements.</a> Plant Cell. 9 (11), 1963-1971 (1997).</li><li>Friml, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efflux-dependent+auxin+gradients+establish+the+apical-basal+axis+of+Arabidopsis.">Efflux-dependent auxin gradients establish the apical-basal axis of Arabidopsis.</a> Nature. 426 (6963), 147-153 (2003).</li><li>Clough, S. J., Bent, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Floral+dip:+a+simplified+method+for+Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana.">Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.</a> Plant J. 16 (16), 735-743 (1998).</li><li>Fiume, E., Fletcher, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Arabidopsis+embryo+and+endosperm+development+by+the+polypeptide+signaling+molecule+CLE8.">Regulation of Arabidopsis embryo and endosperm development by the polypeptide signaling molecule CLE8.</a> Plant Cell. 24 (3), 1000-1012 (2012).</li><li>Jurkuta, R. J., Kaplinsky, N. J., Spindel, J. E., Barton, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+the+apical+domain+of+the+Arabidopsis+embryo+requires+the+BOBBER1+NudC+domain+protein.">Partitioning the apical domain of the Arabidopsis embryo requires the BOBBER1 NudC domain protein.</a> Plant Cell. 21 (21), 1957-1971 (2009).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Óvulo es un método útil para detectar la división celular y la evaluación de morfología durante la embriogénesis en Arabidopsis; usando esta técnica, embriones pueden ser observados directamente bajo DIC microscopía5,12. El paso crítico para la remoción del óvulo es paso 1.3.4. El tiempo requerido para la remoción del óvulo en el paso 1.3.4 es variable. Embriones en la etapa de 2/4-cell pueden observarse claramente después de 2 h en soluci...

Embriogénesis es el evento más temprano en el desarrollo de las plantas superior. Una forma de embriones maduros de un cigoto por división celular y diferenciación bajo estricto control genético1,2. Embriones de Arabidopsis son un modelo útil para estudiar el control de la morfogénesis porque la secuencia de divisiones celulares durante la embriogénesis sigue un patrón esperado3,4. Sin embargo, un embrión de Arabidopsis con una a varias células es demasiado pequeño para ser observado y analizado. Además, la mutación de ciertos genes puede causar embrión letalidad5, que indica el papel clave de estos genes en la embriogénesis. La caracterización de la formación de patrones en los mutantes letales para el embrión constituye una base para entender el mecanismo molecular por el que genes esenciales regulan el desarrollo embrionario.
Un método detallado se describe aquí para la caracterización de la formación de patrón del embrión en la planta modelo Arabidopsis por observación microscópica directa. El método implica la separación del óvulo seguido por la observación microscópica de un embrión. También se describe la caracterización de un mutante letal para el embrión.
La morfología de los embriones en diferentes etapas de desarrollo se puede determinar directamente por microscopia con los óvulos que han sido borrados solución6,7 de Hoyer. Estos óvulos exhiben un alto índice de refracción; así, este óvulo claro método es especialmente ventajoso para las muestras que deben ser observadas por microscopia de interferencia diferencial (DIC) de contraste.
Además, los genes que se expresan en una celda determinada o un número limitado de células durante la embriogénesis pueden utilizarse como marcadores para identificar las células en un embrión. Por lo tanto, la especificación de identidad celular durante la embriogénesis se puede anotar mediante el control de la expresión de proteínas del marcador etiquetado GFP utilizando microscopía de láser confocal. Por el contrario, observando el patrón de expresión de un gen funcional desconocida -GFP fusion durante la embriogénesis puede proporcionar un vínculo entre patrones de embrión y la expresión de ese gen y facilitar la identificación de nuevos genes que se requieren para la embriogénesis en Arabidopsis.
El método aquí descrito puede utilizarse también para caracterizar el fenotipo de un mutante letal para el embrión y para determinar el impacto del gen afectado en la embriogénesis a nivel celular. Además, en combinación con una comparación de los patrones de expresión de genes marcadores durante la embriogénesis entre plantas tipo salvaje y mutantes, el método puede producir pistas sobre los mecanismos moleculares y las vías de señalización implicadas en la embriogénesis8,9. De hecho, el método fue aplicado a las plantas de naa10 , y se encontró que la división anormal de la hipófisis en el mutante puede ser causada por un cambio en la distribución de la auxina durante embriogénesis5.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="847">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Chloral Hydrate</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">15307</td>
			<td style="width:293px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Murashige and Skoog Basal Medium</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td>M5519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Phytagel</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td>P8169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Hygromycin&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10843555001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Growth chamber&#160;</td>
			<td>Percival</td>
			<td style="width:119px;">CU36L5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss Oberkochen</td>
			<td>Zeiss Image M2</td>
			<td>camera: AxioCam 506 color</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal Laser Scanning Microscopy</td>
			<td>Zeiss Oberkochen</td>
			<td>Zeiss LSM 5</td>
			<td>filters: BP 495-555 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereoscope</td>
			<td>Zeiss Oberkochen</td>
			<td>Axio Zoom V16</td>
			<td>camera: AxioCam MRc5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">nutrient-rich&#160;soil</td>
			<td colspan="2">KLASMANN, Germany</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50-ml tube</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5-ml tube</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">10% sodium hypochlorite solution</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>&#160;Domestic analytical reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sucrose</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>&#160;Domestic analytical reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KOH</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>&#160;Domestic analytical reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glycerol</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>&#160;Domestic analytical reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">culture dish</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>&#160;Domestic supplies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">vermiculite</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>&#160;Domestic supplies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glass slide</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>&#160;Domestic supplies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">syringe needle</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>&#160;Domestic supplies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fine-tipped tweezers</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>&#160;Domestic supplies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">super clean bench</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>&#160;Domestic equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for characterizing embryogenesis in arabidopsis

Dada la naturaleza altamente predecible de su desarrollo, embriones de Arabidopsis se han utilizado como modelo de estudios de morfogénesis en plantas. Sin embargo, embriones en fase temprana de plantas son pequeños y contienen pocas células, haciéndolas difíciles de observar y analizar. Aquí se describe un método para caracterizar la formación de embriones de la planta bajo el microscopio utilizando el organismo modelo Arabidopsis. Tras la separación de óvulos frescos usando solución de Hoyer, pudieran observarse el número de celular de y morfología de los embriones, y su etapa de desarrollo podría ser determinado por microscopía de contraste de interferencia diferencial usando un 100 X lente de inmersión de aceite. Además, la expresión de proteínas del marcador específico etiquetadas con proteína fluorescente verde (GFP) fue supervisada para anotar la especificación de identidad de la célula durante el dibujo de embrión por microscopía de láser confocal. Así, este método puede utilizarse para observar la formación de embriones de la planta de tipo salvaje a nivel celular y molecular y caracterizar el papel de genes específicos en modelar embrionario mediante la comparación de la formación de patrones en los embriones de las plantas de tipo silvestre y mutantes letales para el embrión. Por lo tanto, el método puede utilizarse para caracterizar la embriogénesis en Arabidopsis.

El método descrito en este documento puede utilizarse para observar la embriogénesis directamente bajo un microscopio, anotar la especificación de identidad celular durante la embriogénesis con marcadores específicos y caracterizar el papel de un gen en particular durante la embriogénesis.
Resultados representativos a partir del análisis de patrones (de la etapa de cigoto alargada a la etapa madura del bastón) en el tipo...

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A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Este protocolo describe un método para la observación de embriogénesis en Arabidopsis vía separación de óvulo, seguido por la inspección de la formación de patrones de embrión bajo un microscopio.

Un método para la caracterización de embriogénesis en Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

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Video: A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that adheres to form the midline epithelial seam (MES). The theories suggest that MES cells follow an epithelial to mesenchymal transition (EMT), apoptosis and migration, making a fused palate 1. Complete disintegration of the MES is the final essential phase of palatal confluence with surrounding mesenchymal cells. We provide a method for palate organ culture. The developed in vitro protocol allows the study of the biological and molecular processes during fusion. The applications of this technique are numerous, including evaluating responses to exogenous chemical agents, effects of regulatory and growth factors and specific proteins. Palatal organ culture has a number of advantages including manipulation at different stages of development that is not possible using in vivo studies.

Studies of palate development are motivated by the incidence of cleft palate, a birth defect that imposes a tremendous health burden and can leave lasting disfigurement. We demonstrate here a technique to culture palatal shelves that can be used to study different signaling pathways involved in palatal development and fusion.

Método de estudio palatina Fusión usando estático Organ Culture

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that ...

Investigación

Biología del Desarrollo

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. However, it is still unknown whether stem and progenitor cells exist in the adult pancreas. Research strategies using cre-lox lineage-tracing in adult mice have yielded results that either support or refute the idea that beta cells can be generated from the ducts, the presumed location where adult pancreatic progenitors may reside. These in vivo cre-lox lineage-tracing methods, however, cannot answer the questions of self-renewal and multi-lineage differentiation-two criteria necessary to define a stem cell. To begin addressing this technical gap, we devised 3-dimensional colony assays for pancreatic progenitors. Soon after our initial publication, other laboratories independently developed a similar, but not identical, method called the organoid assay. Compared to the organoid assay, our method employs methylcellulose, which forms viscous solutions that allow the inclusion of extracellular matrix proteins at low concentrations. The methylcellulose-containing assays permit easier detection and analyses of progenitor cells at the single-cell level, which are critical when progenitors constitute a small sub-population, as is the case for many adult organ stem cells. Together, results from several laboratories demonstrate in vitro self-renewal and multi-lineage differentiation of pancreatic progenitor-like cells from mice. The current protocols describe two methylcellulose-based colony assays to characterize mouse pancreatic progenitors; one contains a commercial preparation of murine extracellular matrix proteins and the other an artificial extracellular matrix protein known as a laminin hydrogel. The techniques shown here are 1) dissociation of the pancreas and sorting of CD133+Sox9/EGFP+ ductal cells from adult mice, 2) single cell manipulation of the sorted cells, 3) single colony analyses using microfluidic qRT-PCR and whole-mount immunostaining, and 4) dissociation of primary colonies into single-cell suspensions and re-plating into secondary colony assays to assess self-renewal or differentiation.

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In vitro colony assays to detect self-renewal and differentiation of progenitor cells isolated from adult murine pancreas are devised. In these assays, pancreatic progenitors give rise to cell colonies in 3-dimensional space in methylcellulose-containing semi-solid medium. Protocols for handling single cells and characterization of individual colonies are described.

Los ensayos in vitro de colonias para la caracterización de células progenitoras Tri-potentes Aislado de los murinos adultos Páncreas

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and behavioral phenotypes. The remarkably diverse phenotypes that have evolved as marine populations adapt to countless freshwater environments, combined with the ability to cross marine and freshwater forms, provide a rare vertebrate system in which genetics can be used to map genomic regions controlling evolved traits. Excellent genomic resources are now available, facilitating molecular genetic dissection of evolved changes. While mapping experiments generate lists of interesting candidate genes, functional genetic manipulations are required to test the roles of these genes. Gene regulation can be studied with transgenic reporter plasmids and BACs integrated into the genome using the Tol2 transposase system. Functions of specific candidate genes and cis-regulatory elements can be assessed by inducing targeted mutations with TALEN and CRISPR/Cas9 genome editing reagents. All methods require introducing nucleic acids into fertilized one-cell stickleback embryos, a task made challenging by the thick chorion of stickleback embryos and the relatively small and thin blastomere. Here, a detailed protocol for microinjection of nucleic acids into stickleback embryos is described for transgenic and genome editing applications to study gene expression and function, as well as techniques to assess the success of transgenesis and recover stable lines.

Transgenic manipulations and genome editing are critical for functionally testing the roles of genes and cis-regulatory elements. Here a detailed microinjection protocol for the generation of genomic modifications (including Tol2-mediated fluorescent reporter transgene constructs, TALENs, and CRISPRs) is presented for the emergent model fish, the threespine stickleback.

La microinyección de transgénesis y Genoma edición en tres espinas espinosos

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. Recent advances in confocal microscopy, combined with the development of numerous fluorophores, have overcome these issues and opened the possibility to study the expression of several genes simultaneously, with a good cellular resolution, in live samples. Live confocal imaging provides plant biologists with a powerful tool to study development, and has been extensively used to study root growth and the formation of lateral organs on the flanks of the shoot apical meristem. However, it has not been widely applied to the study of flower development, in part due to challenges that are specific to imaging flowers, such as the sepals that grow over the flower meristem, and filter out the fluorescence from underlying tissues. Here, we present a detailed protocol to perform live confocal imaging on live, developing Arabidopsis flower buds, using either an upright or an inverted microscope.

Live confocal imaging provides biologists with a powerful tool to study development. Here, we present a detailed protocol for the live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers.

Vivir Imagen confocal de desarrollo de Arabidopsis Flores

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. In particular, posterior body elongation is an essential process in embryonic development by which multiple tissue deformations act together to direct the formation of a large part of the body axis. In order to observe this process by long-term time-lapse imaging it is necessary to utilize a mounting technique that allows sufficient support to maintain samples in the correct orientation during transfer to the microscope and acquisition. In addition, the mounting must also provide sufficient freedom of movement for the outgrowth of the posterior body region without affecting its normal development. Finally, there must be a certain degree in versatility of the mounting method to allow imaging on diverse imaging set-ups. Here, we present a mounting technique for imaging the development of posterior body elongation in the zebrafish D. rerio. This technique involves mounting embryos such that the head and yolk sac regions are almost entirely included in agarose, while leaving out the posterior body region to elongate and develop normally. We will show how this can be adapted for upright, inverted and vertical light-sheet microscopy set-ups. While this protocol focuses on mounting embryos for imaging for the posterior body, it could easily be adapted for the live imaging of multiple aspects of zebrafish development.

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Un método de montaje versátil para largo plazo de imágenes de Desarrollo de pez cebra

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper vessel development and homeostasis. However, studies on endothelial lineage hierarchy remain elusive due to the lack of tools to gain access as well as to directly evaluate their behavior in vivo. To address this shortcoming, a new tissue model to study angiogenesis using the mammary fat pad has been developed. The mammary gland develops mostly in the postnatal stages, including puberty and pregnancy, during which robust epithelium proliferation is accompanied by extensive vascular remodeling. Mammary fat pads provide space, matrix, and rich angiogenic stimuli from the growing mammary epithelium. Furthermore, mammary fat pads are located outside the peritoneal cavity, making them an easily accessible grafting site for assessing the angiogenic potential of exogenous cells. This work also describes an efficient tracing approach using fluorescent reporter mice to specifically label the targeted population of vascular endothelial stem cells (VESCs) in vivo. This lineage tracing method, coupled with subsequent tissue whole-mount microscopy, enable the direct visualization of targeted cells and their descendants, through which the proliferation capability can be quantified and the differentiation commitment can be fate-mapped. Using these methods, a population of bipotent protein C receptor (Procr) expressing VESCs has recently been identified in multiple vascular systems. Procr+ VESCs, giving rise to both new ECs and pericytes, actively contribute to angiogenesis during development, homeostasis, and injury repair. Overall, this manuscript describes a new mammary fat pad transplantation and in vivo lineage tracing techniques that can be used to evaluate the stem cell properties of VESCs.

This work demonstrates a novel approach to assess the proliferation, differentiation, and vessel-forming potential of vascular endothelial stem cells (VESCs) through mammary fat pad transplantation followed by whole-mount tissue preparation for microscopic observation. A lineage tracing strategy to investigate the behavior of VESCs in vivo is also presented.

Una nueva técnica de trasplante de grasa mamaria para visualizar la generación de vasos de células madre endoteliales vasculares

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

In Vitro Cultivo de óvulos para la proyección de imagen de cigoto polarización de Live-celular y patrones del embrión en Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, especially, in plant reproductive biology. However, plant morphological, anatomical, and ultrastructural analyses traditionally involve time-consuming embedding and sectioning procedures for bright field, scanning, and electron microscopy. Recent progress in confocal fluorescence microscopy, state-of-the-art 3-D computer-aided microscopic analyses, and the continuous refinement of molecular techniques to be used on minimally processed whole-mount specimens, has led to an increased demand for developing efficient and minimal sample processing techniques. In this protocol, we describe techniques for properly dissecting Arabidopsis flowers and siliques, basic clearing techniques, and some staining procedures for whole-mount observations of reproductive structures.

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

In this protocol, we describe techniques for the proper dissection of Arabidopsis flowers and siliques, some basic clearing techniques, and selected staining procedures for whole-mount observations of reproductive structures.

Whole-mount y coloración de silicuas y órganos flor de Arabidopsis

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis

Congenital ocular coloboma is a genetic disorder that is typically observed as a cleft in the inferior aspect of the eye resulting from incomplete choroid fissure closure. Recently, the identification of individuals with coloboma in the superior aspect of the iris, retina, and lens led to the discovery of a novel structure, referred to as the superior fissure or superior ocular sulcus (SOS), that is transiently present on the dorsal aspect of the optic cup during vertebrate eye development. Although this structure is conserved across mice, chick, fish, and newt, our current understanding of the SOS is limited. In order to elucidate factors that contribute to its formation and closure, it is imperative to be able to observe it and identify abnormalities, such as delay in the closure of the SOS. Here, we set out to create a standardized series of protocols that can be used to efficiently visualize the SOS by combining widely available microscopy techniques with common molecular biology techniques such as immunofluorescent staining and mRNA overexpression. While this set of protocols focuses on the ability to observe SOS closure delay, it is adaptable to the experimenter&#39;s needs and can be easily modified. Overall, we hope to create an approachable method through which our understanding of the SOS can be advanced to expand the current knowledge of vertebrate eye development.

Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis

Here, we present a standardized series of protocols to observe the superior ocular sulcus, a recently-identified, evolutionarily-conserved structure in the vertebrate eye. Using zebrafish larvae, we demonstrate techniques necessary to identify factors that contribute to the formation and closure of the superior ocular sulcus.

Visualización del surco Ocular Superior durante la embriogénesis de Danio rerio

Congenital ocular coloboma is a genetic disorder that is typically observed as a cleft in the inferior aspect of the eye resulting from incomplete choroid ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during heart development using ventricular specific fluorescent reporter knock-in mice (MLC-2v-tdTomato mice). Heart development involves a linear heart tube formation, the heart tube looping, and four chamber septation. These complex processes are highly conserved in all vertebrates. The mouse embryonic heart has been widely used for heart developmental studies. However, due to their extremely small size, dissecting mouse embryonic hearts is technically challenging. In addition, visualization of cardiac chamber formation often needs in situ hybridization, beta-galactosidase staining using LacZ reporter mice, or immunostaining of sectioned embryonic hearts. Here, we describe how to dissect mouse embryonic hearts and directly visualize ventricular chamber formation of MLC-2v-tdTomato mice using whole mount epifluorescent microscopy. With this method, it is possible to directly examine heart tube formation and looping, and four chamber formation without further experimental manipulation of mouse embryos. Although the MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mouse line is used in this protocol as an example, this protocol can be applied to other heart-specific fluorescent reporter transgenic mouse lines.

We present the protocols to examine mouse heart development using whole mount epifluorescent microscopy on mouse embryos dissected from ventricular specific MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mice. This method allows us to directly visualize each stage of the ventricular formation during mouse heart development without labor-intensive histochemical methods.

Análisis del desarrollo de la cámara cardiaca durante la embriogénesis de ratón usando todo de Monte de epifluorescencia

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...