Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencia de Suiza y por el Estado de Ginebra.

Una vez que el SCBA se ensambla, el crecimiento de los embriones se monitoriza durante varios días. Por lo tanto, antes de que el procedimiento de disección de semillas y el montaje de la SCBA, hay que esterilizar las semillas para evitar contaminaciones futuras que podrían impedir la correcta valoración del efecto del material de cubierta de la semilla en el crecimiento embrionario. 1. Esterilización de semillas <ol><li> Vierta 50-60 l de semillas de Arabidopsis maduras y secas en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y preparar una solución de etanol al 70%. </li><li> Añadir 1 ml de solución de etanol al 70% al tubo de microcentrífuga que contiene las semillas y agitar a temperatura ambiente durante 10 min a 1200 rpm en un agitador de vórtice. </li><li> Tubo de microcentrífuga Centrifugar durante 3 segundos a 4000 xg para concentrarse semillas en la parte inferior del tubo. </li><li> Aspirar la solución de etanol al 70% utilizando una punta de succión de vacío dejando cuidadosamente las semillas en la parte inferior del tubo de microcentrífuga. </li><li> Añadir 1 ml de agua destilada estéril para t<html> él tubo de microcentrífuga que contiene todavía las semillas. </li><li> Agitar a temperatura ambiente durante 10 min a 1200 rpm. </li><li> Tubo de microcentrífuga Centrifugar durante 3 segundos a 4000 xg para concentrarse semillas en la parte inferior del tubo. Aspirar el sobrenadante de agua usando una punta de succión de vacío dejando cuidadosamente las semillas en la parte inferior del tubo. </li><li> Añadir 1 ml de agua estéril agua destilada al tubo de microcentrífuga que contiene todavía las semillas. Asegúrese de que el flujo de agua suspende homogéneamente las semillas en el interior del tubo. El objetivo aquí es evitar una mayor agitación a fin de preservar la integridad de las semillas. </li><li> Deje que las semillas se depositan por gravedad en la parte inferior del tubo por el que sale del tubo inmóvil durante 30 seg. Aspirar el sobrenadante de agua usando una punta de succión de vacío dejando cuidadosamente las semillas en la parte inferior del tubo. </li><li> Repita cuatro veces los pasos 1.8 a 1.9. En general, el procedimiento de esterilización dura alrededor de 30 min. </li></ol> 2. Semilla Plating ontenido &quot;&gt; Todas las etapas subsiguientes se llevan a cabo dentro de una cabina de flujo laminar para preservar condiciones estériles. <ol><li> Preparar una placa de placa de Petri (100 mm de diámetro, 20 mm de altura) que contiene 30 ml de medio de germinación preparado por tratamiento en autoclave de una solución que contiene 4,3 g / l de Murashige y Skoog en 2,5 mM de 2 - (N-morfolino) etanosulfónico (MES-KOH , pH 5,7) y 0,8 g / l de agar. Deje que la solución se enfríe en un baño de agua a 50 ° C antes de verterla en la placa de placa de Petri. </li><li> Añadir 200 l de agua destilada estéril al tubo que contiene las semillas. Resuspender las semillas y transferirlos sobre la superficie del medio de germinación utilizando una pipeta estándar con una punta de 1 ml. </li><li> Eliminar el agua que rodea las semillas en la superficie del medio de germinación utilizando una punta de succión de vacío. </li><li> Deje la placa de Petri que contiene las semillas sin su tapa interior de la cabina de flujo laminar durante 2 horas para su posterior secado. Cierre la caja de Petri con la tapa y se deja reposar bajo el laminarCabina de flujo durante unos 90 min de manera que han pasado cerca de 4 horas desde el inicio del procedimiento de esterilización de semillas (paso 1.2). </li></ol> 3. Disección de Semillas Los siguientes pasos requieren trabajar con un estereomicroscopio colocado en el interior del gabinete de la campana de flujo laminar. Un fórceps Dumont # 5 con truncadas (es decir, romo) consejos facilita en gran medida el manejo de las semillas (Figura 1A). <ol><li> Prepare una nueva placa de placa de Petri que contiene 30 ml de medio de germinación. Coloque sobre la superficie de las dos medianas papeles rectangulares yuxtapuestas estériles Whatman 3MM (1,5 cm x 1,0 cm; Figura 1B, paso 1). Whatman 3MM de papel se esteriliza en un autoclave. </li><li> Traslado semillas en los papeles Whatman 3MM utilizando pinzas estériles (Figura 1B, paso 2). </li><li> Celebrar una semilla individual contra el papel Whatman 3MM presionando suavemente la semilla utilizando las puntas romas yuxtapuestas de las pinzas truncadas ( <strong&gt; Figura 1B, paso 3). </li><li> Cortar la cubierta de la semilla (testa y el endospermo) de la semilla usando una aguja de jeringa (por ejemplo, insulina U100 + jeringa jeringa de 1 ml, 0,33 mm (29 G) x 12,7 mm) (Figura 1B, etapa 4). La forma de las semillas de Arabidopsis es elipsoidal y se recomienda cortar la cubierta de la semilla a lo largo de los semi-eje principal más largas lo más cerca posible del lugar donde los cotiledones se unen a la radícula (es decir, lejos de la punta radical). Esto ayuda a la liberación segura del embrión en el siguiente paso del procedimiento de disección. </li><li> Empuje la semilla contra el papel Whatman 3MM usando las puntas romas yuxtapuestas de las pinzas truncado (Figura 1B, paso 5). Este paso libera el embrión a cabo la cubierta de la semilla a través de la abertura creada en el paso 3.4 (Figura 1B, paso 6). Se recomienda aplicar el empuje sobre la semilla donde la punta de los cotiledones son en más cercana a la punta de la radícula (es decir, alejado FRom la apertura). </li></ol> 4. Asamblea de la cubierta de la semilla de cama Assay (SCBA) Véase el análisis de la adecuada elección de la cantidad de cubiertas de las semillas y embriones. <ol><li> Prepare una nueva placa de placa de Petri que contiene 30 ml de medio de germinación. Lugar en la superficie del medio de una pieza rectangular estéril (3,5 cm x 5,0 cm) de malla de nylon (Figura 2, paso 1). </li><li> Para evitar daños, embriones y cubiertas de las semillas se pueden mover a la superficie de los bordes metálicos de la pinza empujando suavemente usando la aguja de la jeringa (figura 2, paso 2). Embriones de transferencia y las cubiertas de las semillas en la malla de nylon (figura 2, paso 3). </li><li> Montar una capa circular y única de cubiertas de las semillas utilizando las pinzas romas y la aguja asegurándose de que revestimientos de semillas están en la proximidad como mucho más cerca posible (figura 2, paso 4). Trate de exponer tanto como sea posible la apertura cubierta de la semilla generada por elaguja hacia arriba. Este paso no fue probado sistemáticamente. Sin embargo, se podría aumentar la eficiencia de la SCBA ya que se espera sustancias difusibles que inhiben el crecimiento del embrión para difundir directamente hacia el embrión en lugar de fuera de ella. </li><li> Coloque los embriones como una capa única circular en el centro de la cama cubierta de la semilla montado en el paso 4.3 (Figura 2, paso 5). Asegúrese de que los embriones se encuentran en la proximidad como mucho más cerca posible. </li><li> Incubar los SCBAs bajo luz continua (40 mmol / m 2 s ec) a 20-21 ° C. En el caso en que se utiliza un pulso de FR para detener la germinación, ensamble el SCBA con la luz normal, aplique el pulso FR como se describe 9 y dejar placa de Petri en la oscuridad. </li></ol>

<ol>
	<li>Debeaujon, I., Leon-Kloosterziel, K. M., Koornneef, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+testa+on+seed+dormancy,+germination,+and+longevity+in+Arabidopsis.">Influence of the testa on seed dormancy, germination, and longevity in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 122, 403-414 (2000).</li><li>Baroux, C., Spillane, C., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+origins+of+the+endosperm+in+flowering+plants.">Evolutionary origins of the endosperm in flowering plants.</a> Genome Biol. 3, reviews1026 (2002).</li><li>Debeaujon, I., Lepiniec, L., Pourcel, L., Routaboul, J. -. M., Bradford, K., Nonogaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Seed development, dormancy and germination. , 25-43 (2007).</li><li>Finch-Savage, W. E., Leubner-Metzger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seed+dormancy+and+the+control+of+germination.">Seed dormancy and the control of germination.</a> New Phytol. 171, 501-523 (2006).</li><li>Bethke, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+aleurone+layer+responds+to+nitric+oxide,+gibberellin,+and+abscisic+acid+and+is+sufficient+and+necessary+for+seed+dormancy.">The Arabidopsis aleurone layer responds to nitric oxide, gibberellin, and abscisic acid and is sufficient and necessary for seed dormancy.</a> Plant Physiol. 143, 1173-1188 (2007).</li><li>Lee, K. P., Piskurewicz, U., Tureckova, V., Strnad, M., Lopez-Molina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+seed+coat+bedding+assay+shows+that+RGL2-dependent+release+of+abscisic+acid+by+the+endosperm+controls+embryo+growth+in+Arabidopsis+dormant+seeds.">A seed coat bedding assay shows that RGL2-dependent release of abscisic acid by the endosperm controls embryo growth in Arabidopsis dormant seeds.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19108-19113 (2010).</li><li>Reed, J. W., Nagatani, A., Elich, T. D., Fagan, M., Chory, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytochrome+A+and+Phytochrome+B+Have+Overlapping+but+Distinct+Functions+in+Arabidopsis+Development.">Phytochrome A and Phytochrome B Have Overlapping but Distinct Functions in Arabidopsis Development.</a> Plant Physiol. 104, 1139-1149 (1994).</li><li>Shinomura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+spectra+for+phytochrome+A-+and+B-specific+photoinduction+of+seed+germination+in+Arabidopsis+thaliana.">Action spectra for phytochrome A- and B-specific photoinduction of seed germination in Arabidopsis thaliana.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 8129-8133 (1996).</li><li>Lee, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+and+genetically+distinct+control+of+seed+germination+by+phytochromes+A+and+B.">Spatially and genetically distinct control of seed germination by phytochromes A and B.</a> Genes Dev. 26, 1984-1996 (2012).</li><li>Lee, K. P., Lopez-Molina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+seed+germination+in+the+shade.">Control of seed germination in the shade.</a> Cell Cycle. 11, 4489-4490 (2012).</li><li>Piskurewicz, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gibberellic+acid+signaling+repressor+RGL2+inhibits+Arabidopsis+seed+germination+by+stimulating+abscisic+acid+synthesis+and+ABI5+activity.">The gibberellic acid signaling repressor RGL2 inhibits Arabidopsis seed germination by stimulating abscisic acid synthesis and ABI5 activity.</a> Plant Cell. 20, 2729-2745 (2008).</li><li>Piskurewicz, U., Tureckova, V., Lacombe, E., Lopez-Molina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Far-red+light+inhibits+germination+through+DELLA-dependent+stimulation+of+ABA+synthesis+and+ABI3+activity.">Far-red light inhibits germination through DELLA-dependent stimulation of ABA synthesis and ABI3 activity.</a> EMBO J. 28, 2259-2271 (2009).</li><li>Debeaujon, I., Koornneef, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gibberellin+requirement+for+Arabidopsis+seed+germination+is+determined+both+by+testa+characteristics+and+embryonic+abscisic+acid.">Gibberellin requirement for Arabidopsis seed germination is determined both by testa characteristics and embryonic abscisic acid.</a> Plant Physiol. 122, 415-424 (2000).</li><li>Sun, T. P., Kamiya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+GA1+locus+encodes+the+cyclase+ent-kaurene+synthetase+A+of+gibberellin+biosynthesis.">The Arabidopsis GA1 locus encodes the cyclase ent-kaurene synthetase A of gibberellin biosynthesis.</a> Plant Cell. 6, 1509-1518 (1994).</li><li>Alonso, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+insertional+mutagenesis+of+Arabidopsis+thaliana.">Genome-wide insertional mutagenesis of Arabidopsis thaliana.</a> Science. 301, 653-657 (2003).</li><li>Rook, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+sucrose-induction+mutants+reveal+the+modulation+of+sugar-induced+starch+biosynthetic+gene+expression+by+abscisic+acid+signalling.">Impaired sucrose-induction mutants reveal the modulation of sugar-induced starch biosynthetic gene expression by abscisic acid signalling.</a> Plant J. 26, 421-433 (2001).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Procedimiento El ensayo de cama cubierta de la semilla (SCBA) descrito aquí es en principio aplicable a cualquier circunstancia en la que se bloquea la germinación de semillas de Arabidopsis (o atrasados) y donde el endospermo se sospecha de implementar este arresto. Este último puede ser evidenciado por la eliminación de la cubierta de la semilla (testa y el endospermo) y observando que avanza el crecimiento de embriones más rápidas respecto a la observada cuando los embriones están rodeadas por la cubi...

En semillas maduras de Arabidopsis, la cubierta de la semilla se compone de la testa, una capa externa de tejido muerto de origen materno, y el endospermo, una sola capa de células de tejido vivo que rodea directamente el embrión 1. El endospermo y el embrión se derivan de acontecimientos de fertilización separados: el endospermo es un tejido triploide con dos materna y uno genoma paterno mientras que el embrión es un tejido diploide con uno materna y uno genoma paterno 2. La función principal tradicionalmente asignado al endospermo es la de un tejido nutritivo. Sin embargo, cada vez es más evidente que el endospermo también juega un papel central para el control de la germinación de semillas. Esta idea se convirtió en la primera patente en el caso de inactividad, un rasgo exhibido por semillas de nueva producción. Las semillas en dormancia no germinan a pesar de la presencia de condiciones de germinación favorables. Las semillas pierden su letargo después de un período de maduración y se convierten en nondormant, es decir que van a germinar cuando se expone a condiciones de germinación favorables. En muchas especies de plantas, incluyendo la planta modelo Arabidopsis, la cubierta de la semilla es absolutamente necesaria para evitar la germinación de las semillas latentes desde la extracción cubierta de la semilla desencadena el crecimiento embrionario y la ecologización de 3,4. En Arabidopsis, Bethke et al. Observó que la germinación se mantuvo reprimida después de la eliminación de la testa, manteniendo el endospermo que rodea el endospermo 5. Estas observaciones indican fuertemente que el endospermo es el tejido dentro de la cubierta de la semilla ejerciendo una actividad represiva en el embrión. Sin embargo, los experimentos de remoción de semillas capa no necesariamente ayudan a aclarar la naturaleza de la actividad represiva de germinación proporcionada por la cubierta de la semilla, ni la identificación de los genes que lo implementan. Recientemente hemos introducido un ensayo de la ropa de cama cubierta de la semilla (SCBA) en caso de cubiertas de las semillas y embriones están físicamente separados pero mantienen en estrecha proximidad de modo que la actividad represiva de germinación proporcionado por el endospermo se mantiene 6. El SCBA permite el uso combinatorio de cubierta de la semilla latente, nondormant y modificada genéticamente y los materiales embrionarias. Como resultado, las vías genéticas que controlan la germinación y operar específicamente en el endospermo y el embrión pueden ser diseccionados. El SCBA se utiliza en el contexto de la latencia para mostrar que el endospermo libera la fitohormona ácido abscísico (ABA) hacia el embrión a reprimir su crecimiento 6. Además podemos usar el SCBA para identificar las vías de señalización que actúan en el endospermo y tejidos embrionarios para promover la latencia. El papel del endospermo para controlar la germinación se fortaleció aún más al considerar el caso de las semillas nondormant expuestas a un pulso de rojo lejano (FR) de luz. Temprano en imbibición de la semilla se conoce un pulso de luz FR para inhibir la germinación de 7,8. Cuando cubiertas de las semillas se extrajeron a partir de semillas de un pulso de luz FRfue incapaz de inhibir la germinación, lo que sugiere fuertemente que el endosperma también puede reprimir la germinación de semillas nondormant 9. Sorprendentemente, el ERA también se podría utilizar para recapitular la inhibición FR-dependiente de la germinación. Esto permitió demostrar que la inhibición que FR-dependiente de la germinación de la semilla es también un proceso que implica la liberación de ABA del endospermo 9. Además, el SCBA permitió identificar las diferentes vías de señalización luminosa que funciona en el endospermo y el embrión para controlar la germinación de semillas nondormant en respuesta a señales de luz de 9,10. Por consiguiente, el SCBA parece ser una técnica fiable para explorar la función del endospermo en el contexto del control de la germinación de la semilla. También es una herramienta poderosa para evaluar in vitro si los genes sospechosos para controlar la germinación operan en el endospermo, el embrión o ambos tejidos. A continuación te detallamos los distintos pasos necesarios para montar un SCBA.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>To refer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer Comfort</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>5355 000.011</td>
			<td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacusafe Comfort</td>
			<td>INTEGRA Biosciences AG</td>
			<td>158 310</td>
			<td>Integra Biosciences AG, Zizers, Switzerland</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish plate (100 mm x 20 mm)</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH</td>
			<td>664 102</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5524</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar (plant agar)</td>
			<td>Duchefa Biochemie B.V.</td>
			<td>P1001</td>
			<td>Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps #5</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle</td>
			<td>BD Micro-Fine</td>
			<td>324827</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh (SEFAR NYTEX)</td>
			<td>SEFAR AG</td>
			<td>03-50/31</td>
			<td>Sefar AG, Heiden, Switzerland</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth chamber</td>
			<td>CLF Plant Climatics</td>
			<td>Percival I-30BLLX</td>
			<td>CLF plant Climatics, Wertingen, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclobutrazol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46046</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a seed coat bedding assay to genetically explore in vitro how the endosperm controls seed germination in arabidopsis thaliana

El endospermo de Arabidopsis consta de una sola capa de células que rodea el embrión maduro y que juega un papel esencial para prevenir la germinación de semillas latentes o que de semillas nondormant irradiados por un pulso de luz roja lejana (FR). Con el fin de obtener una mayor comprensión de los mecanismos genéticos moleculares que subyacen a la actividad represiva de germinación ejercida por el endospermo, se ideó un ensayo de &quot;ropa de cama cubierta de la semilla&quot; (SCBA). El SCBA es un procedimiento de disección separar físicamente las cubiertas seminales y embriones de las semillas, que permite monitorizar el crecimiento de los embriones sobre una capa subyacente de cubiertas de las semillas. Sorprendentemente, el ERA reconstituye las actividades de represión de germinación de la cubierta de la semilla en el contexto de la latencia de las semillas y el control FR-dependiente de la germinación de la semilla. Desde la SCBA permite el uso combinatorio de cubierta de la semilla latente, nondormant y modificada genéticamente y los materiales embrionarias, las vías genéticas que controlan la germinación y específicamente operating en el endospermo y el embrión puede ser diseccionado. Aquí detallamos el procedimiento para ensamblar un SCBA.

El trabajo previo mostró que las semillas mutantes incapaces de sintetizar GA fueron incapaces de germinar como resultado de la acumulación de ABA alta en las semillas 11,12. Sin embargo, la incapacidad para germinar requiere la cubierta de la semilla desde su extracción provoca embrionario 13 crecimiento. Esto indica claramente que el endospermo de semillas que no pueden sintetizar GA es la liberación de ABA para bloquear el crecimiento embrionario. Por tanto, esperamos revestimientos de semil...

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A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

Se presenta el procedimiento para montar un ensayo de la ropa de cama cubierta de la semilla (SCBA) a partir de semillas de Arabidopsis thaliana. El SCBA ha demostrado ser una herramienta poderosa para explorar genéticamente in vitro y la forma en la germinación de los controles del endospermo de semillas de semillas latentes y en respuesta a las señales de luz. El SCBA es, en principio, aplicable en virtud de cualquier situación en la que se sospecha que el endospermo de influir en el crecimiento embrionario.

Un Abrigo Ropa de cama de Ensayo de Semillas para explorar Genéticamente<em&gt; In Vitro</em&gt; ¿Cómo la germinación de semillas en Controles Endosperma<em&gt; Arabidopsis thaliana</em

The Arabidopsis endosperm consists of a single cell layer surrounding the mature embryo and playing an essential role to prevent the germination of ...

a-seed-coat-bedding-assay-to-genetically-explore-vitro-how-endosperm

Research

JoVE Journal

Biology

A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

13.2K vistas.  Université de Genève.  Se presenta el procedimiento para montar un ensayo de la ropa de cama cubierta de la semilla (SCBA) a partir de semillas de Arabidopsis thaliana. El SCBA ha demostrado ser una herramienta poderosa para explorar genéticamente in vitro y la forma en la germinación de los controles del endospermo de semillas de semillas latentes y en respuesta a las señales de luz. El SCBA es, en principio, aplicable en virtud de cualquier situación en la que se sospec...

Video: A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

Use of Arabidopsis eceriferum Mutants to Explore Plant Cuticle Biosynthesis

The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation, but is also an important barrier against the entry of pathogenic microorganisms.  The cuticle is made up of a tough crosslinked polymer called "cutin" and a protective wax layer that seals the plant surface.  The waxy layer of the cuticle is obvious on many plants, appearing as a shiny film on the ivy leaf or as a dusty outer covering on the surface of a grape or a cabbage leaf thanks to light scattering crystals present in the wax.  Because the cuticle is an essential adaptation of plants to a terrestrial environment, understanding the genes involved in plant cuticle formation has applications in both agriculture and forestry. Today, we'll show the analysis of plant cuticle mutants identified by forward and reverse genetics approaches.


The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation but is also an important barrier against the entry of pathogenic microorganisms. In this video, we demonstrate the analysis of plant cuticle mutants identified by forward and reverse genetics approaches.

El uso de mutantes de Arabidopsis eceriferum para explorar Biosíntesis planta de cutícula

The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation, but is also an important barrier against the entry of ...

Investigación

Biología

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA methyltransferases is viable, thus providing a system to study how loss of DNA methylation in a genome affects growth and development. Imprinting refers to differential expression of maternal and paternal alleles and plays an important role in reproduction development in both mammal and plants. DNA methylation is critical for determining whether the maternal or paternal alleles of an imprinted gene is expressed or silenced. In flowering plants, there is a double fertilization event in reproduction: one sperm cell fertilizes the egg cell to form embryo and a second sperm fuses with the central cell to give rise to endosperm. Endosperm is the tissue where imprinting occurs in plants. MEDEA, a SET domain Polycomb group gene, and FWA, a transcription factor regulating flowering, are the first two genes shown to be imprinted in endosperm and their expression is controlled by DNA methylation and demethylation in plants. In order to determine imprinting status of a gene and methylation pattern in endosperm, we need to be able to isolate endosperm first. Since seed is tiny in Arabidopsis, it remains challenging to isolate Arabidopsis endosperm and examine its methylation. In this video protocol, we report how to conduct a genetic cross, to isolate endosperm tissue from seeds, and to determine the methylation status by bisulfite sequencing.

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Imprinting is a phenomenon in plant and mammal reproduction. DNA methylation plays an important role in mechanisms of imprinting. Isolating endosperm and determining methylation status of imprinted genes in Arabidopsis can be difficult. In this protocol, we describe how to isolate endosperm and determine methylation by bisulfite sequencing.

Determinación de la metilación del ADN de los genes impresos en Arabidopsis Endospermo

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA ...

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

Signal transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain proliferation and differentiation and requires tight control. Signal transduction is initiated by binding of an external ligand to a transmembrane receptor and activation of downstream signaling cascades. A key regulator of mitogenic signaling is Grb2, a modular protein composed of an internal SH2 (Src Homology 2) domain flanked by two SH3 domains that lacks enzymatic activity. Grb2 is constitutively associated with the GTPase Son-Of-Sevenless (SOS) via its N-terminal SH3 domain. The SH2 domain of Grb2 binds to growth factor receptors at phosphorylated tyrosine residues thus coupling receptor activation to the SOS-Ras-MAP kinase signaling cascade. In addition, other roles for Grb2 as a positive or negative regulator of signaling and receptor endocytosis have been described. The modular composition of Grb2 suggests that it can dock to a variety of receptors and transduce signals along a multitude of different pathways1-3.
	Described here is a simple microscopy assay that monitors recruitment of Grb2 to the plasma membrane. It is adapted from an assay that measures changes in sub-cellular localization of green-fluorescent protein (GFP)-tagged Grb2 in response to a stimulus4-6. Plasma membrane receptors that bind Grb2 such as activated Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) recruit GFP-Grb2 to the plasma membrane upon cDNA expression and subsequently relocate to endosomal compartments in the cell. In order to identify in vivo protein complexes of Grb2, this technique can be used to perform a genome-wide high-content screen based on changes in Grb2 sub-cellular localization. The preparation of cDNA expression clones, transfection and image acquisition are described in detail below. Compared to other genomic methods used to identify protein interaction partners, such as yeast-two-hybrid, this technique allows the visualization of protein complexes in mammalian cells at the sub-cellular site of interaction by a simple microscopy-based assay. Hence both qualitative features, such as patterns of localization can be assessed, as well as the quantitative strength of the interaction.

A high-content screening method for the identification of novel signaling competent transmembrane receptors is described. This method is amenable to large-scale automation and allows predictions about in vivo protein binding and the sub-cellular localization of protein complexes in mammalian cells.

Un alto contenido de imágenes de flujo de trabajo para estudiar Grb2 complejos de señalización por clonación de expresión

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light conditions, which are preferably variable in quantity and quality so that studies under different setups can be conducted. These requirements are met by climatic chambers featuring light emitting diodes (LED) lights, which can &#8211; in contrast to fluorescent lights &#8211; be set to different wavelengths. LEDs are energy conserving and emit virtually no heat even at light intensities, which often constitutes a problem with other light sources. The presented protocol provides a step-by-step guidance of how to program a climatic chamber equipped with variable LED lights as well as describing several approaches for in depth analysis of growth phenotypes. Depending on the experimental set-up various characteristics of the growing plants can be observed and analyzed. Here we describe how to determine fresh weight, leaf area, photosynthetic activity, and stomatal density. We demonstrate that in order to obtain reliable data and draw valid conclusions it is mandatory to use a sufficient number of individuals for statistical evaluation. Taking too few plants for this kind of analysis results in high statistical errors and consequently in less clear interpretations of the data.

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Here, we present a protocol for studying plant growth behavior and especially phenotypes in a reproducible manner. We show how to provide variable and at the same time stable light conditions. Proper analyses depend on sufficient sample numbers and valid statistical evaluations.

Análisis del comportamiento de crecimiento de Arabidopsis thaliana en diferentes calidades de luz

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light ...

A Simple Dry Sectioning Method for Obtaining Whole-Seed-Sized Resin Section and Its Applications

The morphology, size and quantity of cells, starch granules&#160;and protein bodies in seed determine the weight and quality of seed. They are significantly different among different regions of seed. In order to view the morphologies of cells, starch granules and protein bodies clearly, and quantitatively analyze their morphology parameters accurately, the whole-seed-sized section is needed. Though the whole-seed-sized paraffin section can investigate the accumulation of storage materials in seeds, it is very difficult to quantitatively analyze the morphology parameters of cells and storage materials due to the low resolution of the thick section. The thin resin section has high resolution, but the routine resin sectioning method is not suitable to prepare the whole-seed-sized section of mature seeds with a large volume and high starch content. In this study, we present a simple dry sectioning method for preparing the whole-seed-sized resin section. The technique can prepare the cross and longitudinal whole-seed-sized sections of developing, mature, germinated, and cooked seeds embedded in LR White resin, even for large seeds with high starch content. The whole-seed-sized section can be stained with fluorescent brightener 28, iodine, and Coomassie brilliant blue R250 to specifically exhibit the morphology of cells, starch granules, and protein bodies clearly, respectively. The image obtained can also be analyzed quantitatively to show the morphology parameters of cells, starch granules, and protein bodies in different regions of seed.

This technique allows for the fast and simple preparation of whole-seed-sized resin section for the observation and analysis of cells, starch granules, and protein bodies in different regions of the seed.

Un método de seccionamiento simple y seco para obtener la sección de resina de tamaño de semilla completa y sus aplicaciones

The morphology, size and quantity of cells, starch granules&#160;and protein bodies in seed determine the weight and quality of seed. They are ...

Analysis of Effect of Compound Salt Stress on Seed Germination and Salt Tolerance Analysis of Pepper (Capsicum annuum L.)

To determine the salt tolerance and physiological mechanism of pepper (Capsicum annuum L.) at the germination stage, the Hongtianhu 101 and Xinxiang 8 varieties, which have large differences in salt tolerance, are employed as the study materials. Six mixed salt concentrations of 0, 3, 5, 10, 15, and 20 g/L derived using equal molar ratios of Na2CO3, NaHCO3, NaCl, CaCl2, MgCl2, MgSO4, and Na2SO4 are used. To determine their effects, the related indexes of seed germination, seedling growth, and physiology are measured, and salt tolerance is comprehensively evaluated using membership function analysis. The results show that as the mixed salt concentration increases, the germination potential, germination index, germination rate, seed germination vigor index, root length, and root fresh weight of the two cultivars significantly decrease, whereas the relative salt rate gradually increases. The hypocotyl length and fresh weight aboveground increase first and then decrease, while the malondialdehyde (MDA), proline (Pro) content, catalase (CAT), peroxidase (POD), and superoxide dismutase (SOD) activity decrease and then increase. The germination potential, germination index, germination rate, seed germination vigor index, root length, root fresh weight, MDA and Pro content, and CAT activity of the Hongtianhu 101 seeds are higher than those of Xinxiang 8 for all salt concentrations employed here. However, hypocotyl length, fresh weight aboveground, and relative salt rate are lower in Hongtianhu 101 than in Xinxiang 8. The comprehensive evaluation of salt tolerance reveals that the total weighted values of the two membership function indexes increase first and then decrease as the mixed salt concentration increases. Compared with 5 g/L, which has the highest membership function value, the index under salt concentrations of 3 g/L, 10 g/L, and 15 g/L decreases by 4.7%-11.1%, 25.3%-28.3%, and 41.4%-45.1%, respectively. This study provides theoretical guidance for the breeding of salt-tolerant varieties of pepper and an analysis of the physiological mechanisms involved in salt tolerance and salt-tolerant cultivation.

Analysis of Effect of Compound Salt Stress on Seed Germination and Salt Tolerance Analysis of Pepper Capsicum annuum L.

The paper below presents a protocol for measuring seed germination, seedling growth, and physiological indexes of two pepper varieties with salinity tolerance differences in response to six mixed salt concentrations. This protocol can be used to evaluate the salt tolerance of pepper varieties.

Análisis del efecto del estrés salino compuesto en la germinación de semillas y análisis de tolerancia a la sal de la pimienta (Capsicum annuum L.)

To determine the salt tolerance and physiological mechanism of pepper (Capsicum annuum L.) at the germination stage, the Hongtianhu 101 and Xinxiang 8 ...

Investigación espacio-temporal de la dinámica de ERL1 mediante imágenes confocales

Image-Based Methods to Study Membrane Trafficking Events in Stomatal Lineage Cells

In eukaryotic cells, membrane components, including proteins and lipids, are spatiotemporally transported to their destination within the endomembrane system. This includes the secretory transport of newly synthesized proteins to the cell surface or the outside of the cell, the endocytic transport of extracellular cargoes or plasma membrane components into the cell, and the recycling or shuttling transport of cargoes between the subcellular organelles, etc. Membrane trafficking events are crucial to the development, growth, and environmental adaptation of all eukaryotic cells and, thus, are under stringent regulation. Cell-surface receptor kinases, which perceive ligand signals from the extracellular space, undergo both secretory and endocytic transport. Commonly used approaches to study the membrane trafficking events using a plasma membrane-localized leucine-rich-repeat receptor kinase, ERL1, are described here. The approaches include plant material preparation, pharmacological treatment, and confocal imaging setup. To monitor the spatiotemporal regulation of ERL1, this study describes the co-localization analysis between ERL1 and a multi-vesicular body marker protein, RFP-Ara7, the time series analysis of these two proteins, and the z-stack analysis of ERL1-YFP treated with the membrane trafficking inhibitors brefeldin A and wortmannin.

Autor destacado: Métodos basados en imágenes para estudiar los eventos de tráfico de membrana en células de linaje estomática  

Several commonly used methods are introduced here to study the membrane trafficking events of a plasma membrane receptor kinase. This manuscript describes detailed protocols including the plant material preparation, pharmacological treatment, and confocal imaging setup.

Métodos basados en imágenes para estudiar los eventos de tráfico de membrana en células de linaje estomática

In eukaryotic cells, membrane components, including proteins and lipids, are spatiotemporally transported to their destination within the endomembrane ...

Investigación del mecanismo de transporte de zinc en células de mamíferos con el ensayo FluoZin-3

Characterizing Mammalian Zinc Transporters Using an In Vitro Zinc Transport Assay

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured indirectly by determining the expression level of the transporter under different concentrations of Zn2+. This was done by utilizing immunohistochemistry, measuring mRNA in the tissue, or determining the cellular Zn2+ levels. With the development of intracellular Zn2+ sensors, the activities of zinc transporters are currently primarily determined by correlating changes in intracellular Zn2+, detected using fluorescent probes, with the expression of the Zn2+ transporters. However, even today, only a few labs monitor dynamic changes in intracellular Zn2+ and use it to measure the activity of zinc transporters directly. Part of the problem is that out of the 10 zinc transporters of the ZnT family, except for ZnT10 (transports manganese), only zinc transporter 1 (ZnT1) is localized at the plasma membrane. Therefore, linking the transport activity to changes in the intracellular Zn2+ concentration is hard. This article describes a direct way to determine the zinc transport kinetics using an assay based on a zinc-specific fluorescent dye, FluoZin-3. This dye is loaded into mammalian cells in its ester form and then trapped in the cytosol due to cellular di-esterase activity. The cells are loaded with Zn2+ by utilizing the Zn2+ ionophore pyrithione. The ZnT1 activity is assessed from the linear part of the reduction in fluorescence following the cell washout. The fluorescence measured at an excitation of 470 nm and emission of 520 nm is proportional to the free intracellular Zn2+. Selecting the cells expressing ZnT1 tagged with the mCherry fluorophore allows for monitoring only the cells expressing the transporter. This assay is used to investigate the contribution of different domains of ZnT1 protein to the transport mechanism of human ZnT1, a eukaryotic transmembrane protein that extrudes excess zinc from the cell.

Autor destacado: Explorando la regulación celular del zinc a través de la funcionalidad de ZnT1 

Zinc transport has proven challenging to measure due to the weak causal links to protein function and the low temporal resolution. This protocol describes a method for monitoring, with high temporal resolution, Zn2+ extrusion from living cells by utilizing a Zn2+ sensitive fluorescent dye, thus providing a direct measure of Zn2+ efflux.

Caracterización de transportadores de zinc en mamíferos mediante un ensayo de transporte de zinc in vitro

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured ...