El laboratorio Yeh es apoyado por fondos de investigación de la Sociedad Americana del Cáncer Institucional de Becas de Investigación (GRI-97-219-14) otorgado al Centro de Cáncer Hollings en MUSC, mediante financiación de la investigación de una subvención del Departamento de Defensa (W81XWH-11-2- 0229) en MUSC, y por un premio de la Fundación La preocupación (a ESY).

El protocolo sigue las directrices y normas de cuidado de los animales de la Universidad Médica de Carolina del Sur (MUSC) y su Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC). 1. Disección de pulmón <ol><li> La disección del tumor mamario (opcional, dependiendo de los objetivos del estudio y si se realizó un análisis del tumor primario o vena de la cola de la inyección). <ol><li> La eutanasia del ratón utilizando una dosis letal de anestesia con isoflurano según IACUC y la regulación de la universidad. Confirme la eutanasia por dislocación quirúrgica. </li><li> El tablero de la espuma, el pin con alfileres de disección mediante la colocación del ratón sobre la espalda con los miembros propagación. </li><li> Pulverizar ratón con etanol al 70%. </li><li> El uso de pinzas, sujete la parte inferior del animal en el centro. </li><li> El uso de tijeras, corte hacia arriba, hacia el cuello a través de la piel, teniendo cuidado de no perforar la cavidad peritoneal del ratón. </li><li> Reduzca la piel en las extremidades para revelar el tejido tumoral. </li><li> Diseccionar tejido tumoral y preserva por método preferido, como la congelación o la fijación, para su posterior análisis (no se analiza en este protocolo). </li></ol></li><li> Disección de tejido pulmonar. <ol><li> Si el tejido tumoral fue cosechada como se describe anteriormente, precisar cualquier exceso de piel. </li><li> El uso de pinzas, sujete el peritoneo en el extremo inferior del animal y empezar a cortar hacia arriba, hacia la base del cuello. </li><li> Cuidadosamente corte a lo largo de los lados izquierdo y derecho de la caja torácica teniendo cuidado de evitar la ruptura de cualquier vasos sanguíneos que pueden sangrar en la cavidad torácica. Quitar los huesos de las costillas por corte a la izquierda y derecha a través de las porciones de diafragma y superior de la caja torácica. </li><li> Con unas pinzas captar la tráquea del ratón y tire hacia adelante. </li><li> Sever la tráquea con tijeras de disección y quitar los pulmones del ratón. Nota: El corazón puede permanecer unido al pulmón. Si esto ocurre, diseccionar cuidadosamente corazón lejos de los pulmones teniendo cuidado de recoger todos los cinco lóbulos (véase la Figura 1 </strong&gt;). </li><li> Lavar suavemente con PBS para eliminar el exceso de sangre. </li></ol></li><li> Evaluación bruto del tejido pulmonar. <ol><li> Opción 1: En imágenes in vivo. <ol><li> Para imágenes de la luciferasa, ~ 10 min antes de la imagen, dar a los animales a / kg dosis 150 mg de luciferina por inyección intraperitoneal (ip). Pulmones de la imagen en vivo en animales anestesiados o si se retira después de la disección (Figura 2) 5. </li></ol></li><li> Opción 2: Evaluación Bruto. <ol><li> Examinar los pulmones bajo microscopio estereoscópico para visualizar nódulos tumorales. Nota: Si las células son GFP marcado, un estereomicroscopio de fluorescencia capaz contiene un cubo de luz con los máximos de excitación / emisión apropiado (por ejemplo cerca de 470/510 nm) para detectar GFP puede ser utilizado para examinar los pulmones estereoscópica para la fluorescencia antes del procesamiento. </li></ol></li><li> Si los pulmones se van a analizar inmediatamente, proceda a la sección &quot;Aislamiento de ARN &#39;. De lo contrario, romper el tejido congelado usando jabón lIdentificación del nitrógeno o hielo seco. Almacenar a -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Aislamiento de ARN Nota: Para el análisis representativo, el RNA se aisló utilizando un kit de aislamiento de ARN (ver Lista de Materiales). Mientras que el análisis actual utiliza productos de un fabricante específico, una variedad de kits de aislamiento están disponibles de varios proveedores de confianza. Además, los métodos de centrifugación no basados ​​en kit son también una opción. cDNA también debe prepararse a partir de una muestra positiva de ARN de control, tal como una línea celular o plásmido, por análisis de la curva estándar. Por otra parte, un control positivo específico para el conjunto de sonda cebador puede ser comprado (ver Lista de Materiales). <ol><li> Si el uso de tejido previamente congelado, recopilar tejido congelado en hielo seco. </li><li> Homogeneizar tejido usando uno de los siguientes métodos tales como: mortero y una maja de molienda realizado por mano sobre hielo seco después de la congelación del tejido en nitrógeno líquido; homogeneizador de tejidos o dispositivo disociación mecánicapor sugerencia del fabricante; sonicación, u otro método preferido. Nota: Para el análisis representativo, el método preferido de homogeneización es sonicación. <ol><li> Para el análisis que se presenta en la Figura 3, preparar tampón de lisis (proporcionado en el kit de aislamiento de ARN) y 2-mercaptoetanol en una proporción de 20 l 2-mercaptoetanol por cada 1 ml de tampón de lisis. Tejido Resuspender en 300 l de tampón de lisis suplementado con 2-mercaptoetanol por cada 30 g de tejido y someter a ultrasonidos durante 10 s con sonicador fijado en 30% de la amplitud. </li><li> Si el uso de mortero, tejido fundamental resuspende en tampón de lisis 300 l después de la molienda. </li></ol></li><li> Añadir 10 l de proteinasa K a 590 l de tampón TE (Tris-HCl 10, pH 8,0; EDTA 1 mM). Añadir solución de 600 l de proteinasa K a cada 300 l (es decir, por cada 30 mg) de tejido. Incubar durante 10 min a TA. Nota: El tiempo de digestión puede variar. </li><li> Centrifugar las muestras en ≥13000 g durante 10 min para eliminar los residuos. </li><li> Transferir el sobrenadante a nuevos tubos. </li><li> Añadir 450 l de etanol (96% -100%) por cada 900 l de sobrenadante para precipitar el ARN. </li><li> Transferir 700 l de la mezcla de lisado / etanol a la columna. </li><li> Centrifugar las muestras en ≥13,000 g durante 1 minuto para unir ARN a la columna. </li><li> Deseche los residuos líquidos y añadir restante sobrenadante a la columna y girar de nuevo. </li><li> Una vez que todo el lisado se centrifuga a través de la columna, añadir 350 l de tampón de lavado 1 a la porción superior de las muestras de la columna y centrifugar a ≥13,000 g durante 30 seg. </li><li> Deseche el líquido de la columna y reemplazar parte superior. </li><li> Preparar DNasa mediante la mezcla de 5 unidades de DNasa I enzima con 5 l de 10x DNasa y 40 l de DNasa / RNasa libre de agua por muestra (volumen total de 50 l / muestra). </li><li> Añadir 50 l de DNasa mezclan a cada columna y se incuba durante 15 min a TA. </li><li> Añadir 350 l de tampón de lavado 1 a la columna y centrifugar samples en ≥13,000 g durante 30 segundos. </li><li> Deseche el líquido de la columna y reemplazar parte superior. </li><li> Añadir 600 l de tampón de lavado 2 a la columna y girar 30 segundos a ≥13,000 g. </li><li> Deseche el líquido de la columna y reemplazar parte superior. </li><li> Añadir 250 l de tampón de lavado 2 y centrifugar durante 2 minutos a ≥13,000 g. </li><li> Ponga parte de la columna en un nuevo tubo de recogida y desechar el tubo de recogida de edad. </li><li> Añadir 50-100 l de RNasa / DNasa agua libre a la columna y se incuba durante 1 min. </li><li> Haga girar durante 1 min a ≥13,000 g. </li><li> Vuelva a ejecutar eluato recogido a través de la columna para aumentar el rendimiento de ARN. </li><li> Para su uso inmediato, mantener las muestras en hielo y proceder a la cuantificación. Para su uso posterior, snap congelado en hielo seco o nitrógeno líquido. Conservar a -80 ° C congelador hasta que sea necesario. </li></ol> 3. Primer capítulo de síntesis Nota: Para el análisis representativo, la transcriptasa inversa (RT) se llevó a cabo una reacción Fkit de síntesis de ADNc rimer Strand diseñado para QRT-PCR (véase la Lista de Materiales). <ol><li> Si se recogieron muestras previamente, descongelar tubos en hielo. </li><li> Medir la cantidad de ARN usando un espectrofotómetro. </li><li> El uso de 0,5-2 g de ARN total, realice primera síntesis de la cadena utilizando transcriptasa inversa para generar ADNc de valores. <ol><li> En, tubos de RNasa / PCR libre de DNasa / placas estériles, preparar la mezcla de reacción (Tabla 1). Mezclar suavemente y centrifugar. Programar una máquina de PCR estándar (Tabla 2). </li></ol></li><li> Diluir la reacción final de volumen deseado (generalmente 50 a 100 l) con agua libre de nucleasa estéril. </li></ol> 4.-PCR en tiempo real Nota: Para el análisis representativo, se utilizó SYBR verde. Sin embargo, cualquier método preferido puede estar sustituido en la discreción del usuario. <ol><li> El uso de un ADNc control positivo, configure una curva estándar para cada conjunto de cebadores. <ol><li> Para el análisis muestra in la figura 3, preparar la curva patrón para HER2 humano utilizando el fabricante recomienda ADNc control positivo (ver Lista de Materiales). Para GAPDH de ratón, utilice el ADNc de pulmón control negativo para generar una curva estándar. Para cada sonda, en serie diluir el ADNc de 1: 4 para generar 5 estándares. </li></ol></li><li> Calcular el número de muestras en total, que debe incluir la curva estándar y las muestras experimentales. Nota: Para el análisis se describe aquí, se analizaron 2-3 repeticiones experimentales por muestra. Se realizó análisis de la curva estándar para generar un modelo de regresión lineal simple que se puede aplicar para determinar la cantidad relativa de HER2 y GAPDH por muestra para calcular la cantidad normalizada final. Este análisis también se asegurará de que la eficiencia de imprimación es adecuada para el análisis que nos ocupa. </li><li> En un / tubo estéril libre de DNasa, RNasa, preparar mezcla maestra (Tabla 3). <ol><li> Calcula master mix amount por muestra. Escala para más de una muestra. Utilice una mezcla maestra para cada gen de interés experimental, así como un control interno como GAPDH. Utilice cebadores para GAPDH a una concentración final de 200 nM. Nota: El control interno es particularmente útil cuando se trata de distinguir entre el origen de células humanas y de ratón. Nota: Concentración Primer para HER2 se optimizó y determinado por el fabricante. </li></ol></li><li> Preparar la placa de ensayo que contiene 1 mu l cDNAs correspondientes a cada muestra estándar o experimental. Asigne al menos 1 cDNA muestra / pocillo para cada sonda de imprimación. Añadir 19 l de mezcla maestra por pozo para cada sonda de imprimación. Nota: Para los datos representativos en la figura 3, se analizaron las muestras de cDNA por duplicado para cada sonda de imprimación y se representan como la media de las dos muestras. </li><li> Reacción Ejecutar en máquina de QRT-PCR utilizando recomienda o previamente probado protocolo de PCR. Ver Tabla 4 </strong&gt; para el protocolo de PCR utilizado para los datos representativos en la Figura 3 y la Figura 4. </li></ol>

<ol>
	<li>Gupta, G. P., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+metastasis:+building+a+framework.">Cancer metastasis: building a framework.</a> Cell. 127 (4), 679-695 (2006).</li><li>Bos, P. D., Nguyen, D. X., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+metastasis+in+the+mouse.">Modeling metastasis in the mouse.</a> Curr Opin Pharmacol. 10 (5), 571-577 (2010).</li><li>Kim, I. S., Baek, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+breast+cancer+metastasis.">Mouse models for breast cancer metastasis.</a> Biochem Biophys Res Commun. 394 (3), 443-447 (2010).</li><li>Saxena, M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rebuilding+cancer+metastasis+in+the+mouse.">Rebuilding cancer metastasis in the mouse.</a> Mol Oncol. 7 (2), 283-296 (2013).</li><li>Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+tumor+metastasis.">Mouse models for tumor metastasis.</a> Methods Mol Biol. 928, 221-228 (2012).</li><li>Rampetsreiter, P., Casanova, E., Eferl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+modified+mouse+models+of+cancer+invasion+and+metastasis.">Genetically modified mouse models of cancer invasion and metastasis.</a> Drug Discov Today Dis Models. 8 (2-3), 67-74 (2011).</li><li>Condeelis, J., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+cell+movement+in+tumours.">Intravital imaging of cell movement in tumours.</a> Nat Rev Cancer. 3 (12), 921-930 (2003).</li><li>Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+in+living+subjects:+seeing+fundamental+biological+processes+in+a+new+light.">Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light.</a> Genes Dev. 17 (5), 545-580 (2003).</li><li>Zinn, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+bioluminescence+imaging+in+small+animals.">Noninvasive bioluminescence imaging in small animals.</a> ILAR J. 49 (1), 103-115 (2008).</li><li>Tseng, J. C., Kung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bioluminescence+imaging+of+mouse+tumor+models.">Quantitative bioluminescence imaging of mouse tumor models.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2015 (1), (2015).</li><li>Radonic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guideline+to+reference+gene+selection+for+quantitative+real-time+PCR.">Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR.</a> Biochem Biophys Res Commun. 313 (4), 856-862 (2004).</li></ol>

ESY y MAA no son empleados por FirstString Research Inc. y no tienen ningún interés financiero en la compañía. FirstString Research Inc. proporcionó los datos de imagen de la luciferasa que fue presentado en este manuscrito. GSG es presidente y CEO de FirstString Investigación. CLG es un empleado de FirstString Investigación. GSG y CLG tienen opciones de acciones emitidas por FirstString Investigación.

Este protocolo describe el uso de QRT-PCR para evaluar mamaria metástasis de células tumorales al pulmón utilizando un modelo de xenoinjerto de ratón. Se reconoce que otras técnicas, incluyendo bioluminiscente de imágenes, están disponibles y también son eficaces para la detección de metástasis a pesar de tener sus propios valores y limitaciones. Los datos presentados sugieren que QRT-PCR proporciona una medida eficaz de detectar mRNA derivadas de tumores en el tejido pulmonar para la cuantificación de la met...

Análisis de QRT-PCR se propone como un método para evaluar la metástasis del tumor. Este método se propone como una alternativa para los usuarios que están interesados ​​en la evaluación de la metástasis, pero no pueden tener acceso a equipos específicos, como in vivo equipos de imagen o un estereoscopio capaz de fluorescencia. Una discusión de los métodos comúnmente utilizados se muestra seguido por una demostración de cómo el análisis de QRT-PCR se puede utilizar ya sea como un separado o como un método compañero para evaluar la metástasis. Este procedimiento tiene el potencial de proporcionar un análisis cuantitativo de la carga metastásica. Los métodos estándar de análisis bruto, incluyendo la visualización de los pulmones bajo un microscopio estereoscópico, así como seccionamiento en serie seguida de hematoxilina y eosina (H &amp; E) tinción del tejido pulmonar, son cuantificables, pero dependen en gran medida de los parámetros definidos por el usuario para el recuento de 2-5. Al evaluar los pulmones enteros utilizando un microscopio estereoscópico, sólo las grandes metástasis superficiales son visible y análisis requiere que el investigador tenga conocimiento razonable de la estructura anatómica pulmonar para determinar lo que constituye una lesión metastásica. Etiquetado fluorescente de las células tumorales con un marcador tal como GFP y el uso de un microscopio estereoscópico que contiene un cubo de luz con los máximos apropiados de excitación / emisión (por ejemplo, cerca de 470/510 nm para GFP) ayuda en este proceso, pero sólo nódulos tumorales superficie son detectables . Además, la fluorescencia de la contaminación de la sangre, que es visible bajo los mismos parámetros que las buenas prácticas agrarias, puede conducir a la falsa identificación de posibles lesiones metastásicas. Seccionamiento del pulmón seguido por tinción con H &amp; E para visualizar metástasis de pulmón es un método útil para evaluar las micrometástasis y otros procesos microscópicos incluyendo infiltración de células inmunes, pero a menudo requiere el uso de todo el tejido pulmonar para inclusión en parafina, seccionando, y los procedimientos de tinción. Por lo tanto, los procedimientos posteriores no son ideales siguiendo ese methore. Aunque cuantificable, este procedimiento requiere que el investigador para evaluar un gran número de secciones de pulmón teñidas por animal para asegurar que el análisis representa toda la estructura 3D del pulmón. En consecuencia, este tipo de examen es mucho tiempo, puede conducir a error a contar, y el análisis se basa principalmente en la discreción del investigador. Varias de las técnicas de imagen in vivo (por ejemplo, MRI, PET, SPECT) se utilizan actualmente para llevar a cabo o probar los procesos biológicos en modelos de roedores experimentales 8. En bioluminiscente de imágenes in vivo es un método común utilizado para adquirir una visión bruto de metástasis 9. Esta técnica se aplica generalmente para evaluar la presencia de actividad de informador de luciferasa debido a la acumulación de las células tumorales, que están diseñados para contener un elemento de respuesta de la luciferasa, que residen en órganos específicos, como la glándula mamaria después de la implantación de células tumorales y el pulmón a metástasis espontánea 10. La visualización de la actividad de informador de luciferasa se ​​induce por la presencia de sustrato de luciferina (D-luciferina). Luciferasa cataliza la descarboxilación oxidativa de D-luciferina a oxiluciferina la generación de bioluminiscencia. Aunque informativa, este método está limitado por varios factores, incluyendo la estabilidad del sustrato (es decir, la vida media corta), la distribución adecuada de sustrato que depende de cómo se entrega a los animales de experimentación, y la baja sensibilidad de detección 9. Un mérito principal de esta técnica es que es no invasivo, se puede realizar en animales vivos, y puede conducir a la detección de metástasis de células tumorales en múltiples órganos que pueden no haber sido normalmente cosechadas en la disección 9,10. Un aspecto positivo de la in vivo las técnicas de imagen es que el tejido pulmonar no perturbado permitiendo procedimientos secundarios como la inclusión en parafina o como se presenta aquí, el análisis QRT-PCR. Sin embargo, debido QRT-PCR es theoreticaLLY una medida más sensible de detección, evaluación bruto no puede revelar un número bajo de células tumorales presentes en el pulmón. Si bien es útil, las técnicas de imagen descritos anteriormente pueden ser sustituidos o complementarse con el método de QRT-PCR descrito actualmente. QRT-PCR tiene el potencial de proporcionar una medida sensible de mRNA derivados del tumor dentro de un pulmón.

<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP176-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EN0521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJet RNA Isolation Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K0732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Reverse Transcription Supermix for QRT-PCR</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal SYBR Green Supermix&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>172-5121&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimePCR SYBR Green Assay: ERBB2, Human&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>100-25636&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimePCR Template for SYBR Green Assay: ERBB2, Human&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>100-25716&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gapdh Primer Sequence</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of lung metastasis in mouse mammary tumor models by quantitative real-time pcr

La enfermedad metastásica es la propagación de las células tumorales malignas desde el sitio del cáncer primario a un órgano distante y es la causa principal de muerte de cáncer asociado 1. Los sitios comunes de diseminación metastásica incluyen pulmón, ganglios linfáticos, el cerebro y la médula 2. Mecanismos que impulsan la metástasis son áreas intensas de la investigación del cáncer. En consecuencia, los ensayos eficaces para medir la carga metastásica en sitios distantes de las metástasis son instrumentales para la investigación del cáncer. Evaluación de metástasis de pulmón en modelos tumorales mamarias se realiza generalmente mediante la observación cualitativa bruto de tejido pulmonar después de la disección. Los métodos cuantitativos de evaluación de metástasis se limitan actualmente a ex vivo y en técnicas de imagen basadas vivo que requieren parámetros definidos por el usuario. Muchas de estas técnicas se encuentran en todo el nivel de organismo en lugar del nivel celular 3-6. Aunque los métodos de imagen más recientes que utilizan microscopía de múltiples fotones son capaces de evaluar MetasTasis a nivel celular 7, estos procedimientos altamente elegantes son más adecuadas para la evaluación de los mecanismos de difusión en lugar de la evaluación cuantitativa de la carga metastásica. Aquí, se presenta un método simple in vitro para evaluar cuantitativamente la metástasis. Usando cuantitativa en tiempo real PCR (QRT-PCR), el ARNm de células específicas de tumor se puede detectar en el tejido de pulmón de ratón.

Más allá del tiempo necesario para realizar la inoculación inicial de las células tumorales en el animal experimental y, si la realización, el análisis primario del tumor in vivo, la cosecha de tejidos, aislamiento de ARN, y el análisis de QRT-PCR es un procedimiento en 1-2 día (Figura 1) . Un ejemplo de análisis bruto es bioluminiscente de imágenes para evaluar las células tumoral...

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Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Este protocolo describe cómo utilizar cuantitativa en tiempo real PCR (QRT-PCR) para detectar ARNm específicos de células tumorales que representan la metástasis en el tejido pulmonar de ratón.

Evaluación de pulmón metástasis en el ratón mamarias modelos tumorales mediante PCR cuantitativa en tiempo real

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

evaluation-lung-metastasis-mouse-mammary-tumor-models-quantitative

Research

JoVE Journal

Medicine

9.8K vistas.  Medical University of South Carolina.  Este protocolo describe cómo utilizar cuantitativa en tiempo real PCR (QRT-PCR) para detectar ARNm específicos de células tumorales que representan la metástasis en el tejido pulmonar de ratón. 

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Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle uptake in tumors at the microscopic level1,2,3, highlighting the utility of a suitable xenograft model in which to perform detailed uptake analyses. Here, we use high-resolution intravital imaging to evaluate nanoparticle uptake in human tumor xenografts in a modified, shell-less chicken embryo model. The chicken embryo model is particularly well-suited for these in vivo analyses because it supports the growth of human tumors, is relatively inexpensive and does not require anesthetization or surgery 4,5. Tumor cells form fully vascularized xenografts within 7 days when implanted into the chorioallantoic membrane (CAM) 6. The resulting tumors are visualized by non-invasive real-time, high-resolution imaging that can be maintained for up to 72 hours with little impact on either the host or tumor systems. Nanoparticles with a wide range of sizes and formulations administered distal to the tumor can be visualized and quantified as they flow through the bloodstream, extravasate from leaky tumor vasculature, and accumulate at the tumor site. We describe here the analysis of nanoparticles derived from Cowpea mosaic virus (CPMV) decorated with near-infrared fluorescent dyes and/or polyethylene glycol polymers (PEG) 7, 8, 9,10,11. Upon intravenous administration, these viral nanoparticles are rapidly internalized by endothelial cells, resulting in global labeling of the vasculature both outside and within the tumor7,12. PEGylation of the viral nanoparticles increases their plasma half-life, extends their time in the circulation, and ultimately enhances their accumulation in tumors via the enhanced permeability and retention (EPR) effect 7, 10,11. The rate and extent of accumulation of nanoparticles in a tumor is measured over time using image analysis software. This technique provides a method to both visualize and quantify nanoparticle dynamics in human tumors.

We present a novel approach to quantify nanoparticle localization in the vasculature of human xenografted tumors using dynamic, real-time intravital imaging in an avian embryo model.

Evaluación de la absorción de nanopartículas en los tumores en tiempo real utilizando intravital imagen

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Investigación

Medicina

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There is little knowledge about in situ, in vivo, tumor hypoxia during intracranial development of malignant brain tumors because of lack of efficient means to monitor it in these deep-seated orthotopic tumors. Bioluminescence imaging (BLI), based on the detection of light emitted by living cells expressing a luciferase gene, has been rapidly adopted for cancer research, in particular, to evaluate tumor growth or tumor size changes in response to treatment in preclinical animal studies. Moreover, by expressing a reporter gene under the control of a promoter sequence, the specific gene expression can be monitored non-invasively by BLI. Under hypoxic stress, signaling responses are mediated mainly via the hypoxia inducible factor-1&alpha; (HIF-1&alpha;) to drive transcription of various genes. Therefore, we have used a HIF-1&alpha; reporter construct, 5HRE-ODD-luc, stably transfected into human breast cancer MDA-MB231 cells (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay is performed by incubating the transfected cells in a hypoxic chamber (0.1% O2) for 24 hr before BLI, while the cells in normoxia (21% O2) serve as a control. Significantly higher photon flux observed for the cells under hypoxia suggests an increased HIF-1&alpha; binding to its promoter (HRE elements), as compared to those in normoxia. Cells are injected directly into the mouse brain to establish a breast cancer brain metastasis model. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics is initiated 2 wks after implantation and repeated once a week. BLI reveals increasing light signals from the brain as the tumor progresses, indicating increased intracranial tumor hypoxia. Histological and immunohistochemical studies are used to confirm the in vivo imaging results. Here, we will introduce approaches of in vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay, surgical establishment of a breast cancer brain metastasis in a nude mouse and application of in vivo bioluminescence imaging to monitor intracranial tumor hypoxia.

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Bioluminescence imaging of hypoxia inducible factor-1&alpha; activity is applied to monitor intracranial tumor hypoxia development in a breast cancer brain metastasis mouse model.

Imágenes in vivo de tumores bioluminiscencia Dinámica hipoxia de la metástasis cerebral cáncer de mama en un modelo de ratón

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process including development1, apoptosis2, and cell cycle regulation3. MiRNAs are estimated to regulate the expression of 30% to 90% of human genes4 by binding to their target messenger RNAs (mRNAs)5. Widespread dysregulation of miRNAs has been reported in various diseases and cancer subtypes6. Due to their prevalence and unique structure, these small molecules are likely to be the next generation of biomarkers, therapeutic agents and/or targets.
Methods used to investigate miRNA expression include SYBR green I dye- based as well as Taqman-probe based qPCR. If miRNAs are to be effectively used in the clinical setting, it is imperative that their detection in fresh and/or archived clinical samples be accurate, reproducible, and specific. qPCR has been widely used for validating expression of miRNAs in whole genome analyses such as microarray studies7. The samples used in this protocol were from patients who underwent radical prostatectomy for clinically localized prostate cancer; however other tissues and cell lines can be substituted in. Prostate specimens were snap-frozen in liquid nitrogen after resection. Clinical variables and follow-up information for each patient were collected for subsequent analysis8.
Quantification of miRNA levels in prostate tumor samples. The main steps in qPCR analysis of tumors are: Total RNA extraction, cDNA synthesis, and detection of qPCR products using miRNA-specific primers. Total RNA, which includes mRNA, miRNA, and other small RNAs were extracted from specimens using TRIzol reagent. Qiagen's miScript System was used to synthesize cDNA and perform qPCR (Figure 1). Endogenous miRNAs are not polyadenylated, therefore during the reverse transcription process, a poly(A) polymerase polyadenylates the miRNA. The miRNA is used as a template to synthesize cDNA using oligo-dT and Reverse Transcriptase. A universal tag sequence on the 5' end of oligo-dT primers facilitates the amplification of cDNA in the PCR step. PCR product amplification is detected by the level of fluorescence emitted by SYBR Green, a dye which intercalates into double stranded DNA. Specific miRNA primers, along with a Universal Primer that binds to the universal tag sequence will amplify specific miRNA sequences. 
The miScript Primer Assays are available for over a thousand human-specific miRNAs, and hundreds of murine-specific miRNAs. Relative quantification method was used here to quantify the expression of miRNAs. To correct for variability amongst different samples, expression levels of a target miRNA is normalized to the expression levels of a reference gene. The choice of a gene on which to normalize the expression of targets is critical in relative quantification method of analysis. Examples of reference genes typically used in this capacity are the small RNAs RNU6B, RNU44, and RNU48 as they are considered to be stably expressed across most samples. In this protocol, RNU6B is used as the reference gene.

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

Quantitative Real Time polymerase chain reaction (qPCR) is a rapid and sensitive method to investigate the expression levels of various microRNA (miRNA) molecules in tumor samples. Using this method expression of hundreds of different miRNA molecules can be amplified, quantified, and analyzed from the same cDNA template.

Detección de microARN en tumores de próstata por el cuantitativo PCR en tiempo real (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Models of Bone Metastasis

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible for significant morbidity and mortality1. Thus, there is a significant need to understand the molecular mechanisms controlling the establishment, growth and activity of tumors in bone. Several in vivo models have been established to study these events and each has specific benefits and limitations. The most commonly used model utilizes intracardiac inoculation of tumor cells directly into the arterial blood supply of athymic (nude) BalbC mice. This procedure can be applied to many different tumor types (including PC-3 prostate cancer, lung carcinoma, and mouse mammary fat pad tumors); however, in this manuscript we will focus on the breast cancer model, MDA-MB-231. In this model we utilize a highly bone-selective clone, originally derived in Dr. Mundy's group in San Antonio2, that has since been transfected for GFP expression and re-cloned by our group3. This clone is a bone metastatic variant with a high rate of osteotropism and very little metastasis to lung, liver, or adrenal glands. While intracardiac injections are most commonly used for studies of bone metastasis2, in certain instances intratibial4 or mammary fat pad injections are more appropriate. Intracardiac injections are typically performed when using human tumor cells with the goal of monitoring later stages of metastasis, specifically the ability of cancer cells to arrest in bone, survive, proliferate, and establish tumors that develop into cancer-induced bone disease. Intratibial injections are performed if focusing on the relationship of cancer cells and bone after a tumor has metastasized to bone, which correlates roughly to established metastatic bone disease. Neither of these models recapitulates early steps in the metastatic process prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. If monitoring primary tumor growth or metastasis from the primary site to bone, then mammary fat pad inoculations are usually preferred; however, very few tumor cell lines will consistently metastasize to bone from the primary site, with 4T1 bone-preferential clones, a mouse mammary carcinoma, being the exception 5,6.
This manuscript details inoculation procedures and highlights key steps in post inoculation analyses. Specifically, it includes cell culture, tumor cell inoculation procedures for intracardiac and intratibial inoculations, as well as brief information regarding weekly monitoring by x-ray, fluorescence and histomorphometric analyses.

Animal models are frequently utilized to study cancer metastasis to bone. In this protocol we will describe two common methods of tumor inoculation for bone metastasis studies and briefly describe some of the analyses utilized to monitor and quantify these models.

Los modelos de metástasis en los huesos

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional co-culture systems are frequently used to explicate tumor-stroma interactions, including their role in drug responses. However, many of the interactions that occur in vivo in the intact microenvironment cannot be completely replicated in these in vitro settings. Thus, direct visualization of these processes in real-time has become an important tool in understanding tumor responses to therapies and identifying the interactions between cancer cells and the stroma that can influence these responses. Here we provide a method for using spinning disk confocal microscopy of live, anesthetized mice to directly observe drug distribution, cancer cell responses and changes in tumor-stroma interactions following administration of systemic therapy in breast cancer models. We describe procedures for labeling different tumor components, treatment of animals for observing therapeutic responses, and the surgical procedure for exposing tumor tissues for imaging up to 40 hours. The results obtained from this protocol are time-lapse movies, in which such processes as drug infiltration, cancer cell death and stromal cell migration can be evaluated using image analysis software.

We describe a method for imaging response to anti-cancer treatment in vivo and at single cell resolution.

Imágenes en directo de las respuestas de drogas en el microambiente tumoral en modelos de ratón de cáncer de mama

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules that regulate HSCs. In these transplant model systems, the function of HSCs is determined by the ability of these cells to engraft and reconstitute lethally irradiated recipient mice. Commonly, the donor cell contribution/engraftment is measured by antibodies to donor- specific cell surface proteins using flow cytometry. However, this method heavily depends on the specificity and the ability of the cell surface marker to differentiate donor-derived cells from recipient-originated cells, which may not be available for all mouse strains. Considering the various backgrounds of genetically modified mouse strains in the market, this cell surface/ flow cytometry-based method has significant limitations especially in mouse strains that lack well-defined surface markers to separate donor cells from congenic recipient cells. Here, we reported a PCR-based technique to determine donor cell engraftment/contribution in transplant recipient mice. We transplanted male donor bone marrow HSCs to lethally irradiated congenic female mice. Peripheral blood samples were collected at different time points post transplantation. Bone marrow samples were obtained at the end of the experiments. Genomic DNA was isolated and the Y chromosome specific gene, Zfy1, was amplified using quantitative Real time PCR. The engraftment of male donor-derived cells in the female recipient mice was calculated against standard curve with known percentage of male vs. female DNAs. Bcl2 was used as a reference gene to normalize the total DNA amount. Our data suggested that this approach reliably determines donor cell engraftment and provides a useful, yet simple method in measuring hematopoietic cell reconstitution in murine bone marrow transplantation models. Our method can be routinely performed in most laboratories because no costly equipment such as flow cytometry is required.

Determining donor cell engraftment presents a challenge in mouse bone marrow transplant models that lack well-defined phenotypical markers. We described a methodology to quantify male donor cell engraftment in female transplant recipient mice. This method can be used in all mouse strains for the study of HSC functions.

Usando cuantitativa en tiempo real PCR para determinar quimerismo de células donantes en un modelo competitivo Trasplante de médula ósea murina

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

A simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or expensive animal. One of the reasons that this is not done more routinely is that it is relatively difficult, despite there being several published studies that describe ways to achieve it. In this paper we demonstrate a procedure that eliminates one of the major hurdles associated with this intubation, that of visualizing the trachea during the entire time of intubation. The approach uses a 0.5 mm fiberoptic light source that serves as an introducer to direct the intubation cannula into the mouse trachea. We show that it is possible to use this procedure to measure lung mechanics in individual mice over a time course of at least several weeks. The technique can be set up with relatively little expense and expertise, and it can be routinely accomplished with relatively little training. This should make it possible for any laboratory to routinely carry out this intubation, thereby allowing longitudinal studies in individual mice, thereby minimizing the number of mice needed and increasing the statistical power by using each mouse as its own control.

This paper describes a striaghforward and efficient method of intubating mice for pulmonary function measurements or pulmonary instillation, that allows the mice to recover and be studied at later times. The procedure involves an inexpensive fiberoptic light source that directly illuminates the trachea.

Un sencillo método de intubación ratón de pulmón

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in exponential tumor growth and metastasis to distal tissues and the collapse of anti-tumor immunity. Many useful animal models exist to study breast cancer, but none completely recapitulate the disease progression that occurs in humans. In order to gain a better understanding of the cellular interactions that result in the formation of latent metastasis and decreased survival, we have generated an inducible transgenic mouse model of YFP-expressing ductal carcinoma that develops after sexual maturity in immune-competent mice and is driven by consistent, endocrine-independent oncogene expression. Activation of YFP, ablation of p53, and expression of an oncogenic form of K-ras was achieved by the delivery of an adenovirus expressing Cre-recombinase into the mammary duct of sexually mature, virgin female mice. Tumors begin to appear 6 weeks after the initiation of oncogenic events. After tumors become apparent, they progress slowly for approximately two weeks before they begin to grow exponentially. After 7-8 weeks post-adenovirus injection, vasculature is observed connecting the tumor mass to distal lymph nodes, with eventual lymphovascular invasion of YFP+ tumor cells to the distal axillary lymph nodes. Infiltrating leukocyte populations are similar to those found in human breast carcinomas, including the presence of &#945;&#946; and &#947;&#948; T cells, macrophages and MDSCs. This unique model will facilitate the study of cellular and immunological mechanisms involved in latent metastasis and dormancy in addition to being useful for designing novel immunotherapeutic interventions to treat invasive breast cancer.

Activation of latent mutations with adenovirus-Cre into the mammary ductal system results in a clinically relevant metastatic breast cancer. Incorporation of a YFP promoter allows tracking of distal metastatic tumor cells. This model is useful to study latent metastasis, anti-tumor immunity, and for designing novel immunotherapies to treat breast cancer.

Inicio de la metástasis de carcinoma de mama mediante la Focalización del epitelio ductal con adenovirus Cre: Un modelo de ratón transgénico de Novela del Cáncer de Mama

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their translational repression. Changes in miRNA expression have been shown to be involved in the development of all major complex diseases. Furthermore, recent findings showed that miRNAs can be secreted to the extracellular environment and enter the bloodstream and other body fluids where they can circulate with high stability. The function of such circulating miRNAs remains largely elusive, but systematic high throughput approaches, such as miRNA profiling arrays, have lead to the identification of miRNA signatures in several pathological conditions, including neurodegenerative disorders and several types of cancers. In this context, the identification of miRNA expression profile in the cerebrospinal fluid, as reported in our recent study, makes miRNAs attractive candidates for biomarker analysis.
There are several tools available for profiling microRNAs, such as microarrays, quantitative real-time PCR (qPCR), and deep sequencing. Here, we describe a sensitive method to profile microRNAs in cerebrospinal fluids by quantitative real-time PCR. We used the Exiqon microRNA ready-to-use PCR human panels I and II V2.R, which allows detection of 742 unique human microRNAs. We performed the arrays in triplicate runs and we processed and analyzed data using the GenEx Professional 5 software.
Using this protocol, we have successfully profiled microRNAs in various types of cell lines and primary cells, CSF, plasma, and formalin-fixed paraffin-embedded tissues.

We describe a protocol of real time PCR to profile microRNAs in the cerebrospinal fluid (CSF). With the exception of RNA extraction protocols, the procedure can be extended to RNA extracted from other body fluids, cultured cells, or tissue specimens.

Líquido cefalorraquídeo MicroRNA perfiles utilizando cuantitativa en tiempo real PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered genotypes now possess the ability to invade and survive in other tissues. In this protocol, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. The cells isolated from this procedure are then available for gene profiling experiments. For successful metastasis, these cells must be able to intravasate, survive in circulation, extravasate to distant organs, and survive in that new organ system. The lungs are the typical target of breast cancer metastasis. A set of genes have been discovered that mediates the selectivity of metastasis to the lung. Here we describe a method of studying lung metastasis from a genetically engineered mouse model.. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from the mouse embryo is included. MEF cells from the same animal type provide a clue of non-cancer cell gene expression. Together, these techniques are useful in studying mouse mammary tumorigenesis, its associated signaling mechanisms and pathways of the abnormalities in embryos.

The goal of this protocol is to study breast tumorigenesis. With this technique, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. A lung extraction protocol is included for studying lung metastasis. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts from the mouse embryo is included.

Tumor primario y aislamiento de células MEF para el Estudio de pulmón metástasis

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...