המעבדה יה נתמכת על ידי מימון מחקר מאגודה אמריקנית לסרטן מוסדי מענק מחקר (IRG-97-219-14) הוענק למרכז הסרטן הולינגס בMUSC, על ידי מימון מחקר ממענק משרד ההגנה (W81XWH-11-2- 0229) בMUSC, ועל ידי פרסים מדאגת הקרן (לESY).

הפרוטוקול כדלקמן הנחיות ותקני טיפול בבעלי החיים של האוניברסיטה הרפואית של דרום קרוליינה (MUSC) והטיפול בבעלי חיים המוסדי שלה וועדת שימוש (IACUC). 1. ריאות Dissection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתיחת גידול החלב (אופציונאלי בהתאם למטרות מחקר והאם הזרקת ניתוח גידול ראשוני או וריד זנב בוצעה). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכבר באמצעות מנה קטלנית של ההרדמה isoflurane לפי IACUC ורגולצית אוניברסיטה. לאשר מתת חסד, על ידי נקע בניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על לוח הקצף, סיכה עם סיכות לנתיחה על ידי הצבת עכבר על גבה עם גפיים התפשטות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריסוס עכבר עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, לתפוס את החלק התחתון של בעלי החיים במרכז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במספריים, לחתוך כלפי מעלה לכיוון הצוואר דרך העור, נזהר שלא לנקב את חלל הצפק של העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקצץ עור באיברים לחשוף רקמת גידול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את רקמת גידול ויחסי ציבורeserve ידי שיטה מועדפת, כגון הקפאה או קיבעון, לניתוח נוסף (לא נידון בהרחבה בפרוטוקול זה). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתיחת רקמת ריאה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם רקמת גידול הייתה לקצור כפי שתוארה לעיל, להצמיד כל עור עודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, לתפוס הצפק בקצה תחתון של בעלי החיים ולהתחיל לחתוך כלפי מעלה לכיוון בסיס הצוואר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לחתוך לאורך הצדדים שמאל וימין של להיות זהיר, כדי למנוע ניתוק כל כלי דם שעלול לדמם לתוך חלל בית חזה כלוב הצלעות. הסר את עצמות צלעות על ידי חיתוך שמאלה וימינה דרך מנות סרעפת והעליונה של כלוב הצלעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים לתפוס את קנה הנשימה של העכבר ולמשוך קדימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את קנה הנשימה עם מספריים לנתיחה ולהסיר ריאות מעכבר. הערה: הלב עשוי להישאר מחובר לריאות. במקרה זה, לנתח בזהירות לב מריאות להיות זהיר, כדי לאסוף את כל חמש האונות (ראה איור 1 </strong&gt;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בעדינות עם PBS להסיר דם עודף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערכה גסה של רקמת ריאה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשרות 1: in vivo הדמיה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדמיה לוציפראז, ~ 10 דקות לפני הדמיה, נותן חיות 150 מ&quot;ג / קילוגרם מינון של luciferin ידי הזרקת intraperitoneal (IP). ריאות תמונת in vivo בבעלי חיים בהרדמה או על ההסרה לאחר הנתיחה (איור 2) 5. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשרות 2: הערכה גולמית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק ריאות תחת מיקרוסקופ סטריאו לדמיין גושים סרטניים. הערה: אם התאים GFP שכותרתו, מסוגל סטראו הקרינה המכיל קוביית אור עם מקסימום עירור / פליטה המתאימה (למשל ליד 470/510 ננומטר) כדי לזהות GFP ניתן להשתמש כדי לבחון ריאות stereoscopically לקרינה לפני העיבוד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם ריאות הן להיות מנותחות באופן מיידי, המשך לסעיף &quot;בידוד RNA&quot;. אחרת, הצמד רקמות הקפאה באמצעות liquחנקן id או קרח יבש. חנות ב -80 מעלות צלזיוס. </li></ol></li></ol> בידוד 2. RNA הערה: ניתוח הנציג, RNA היה מבודד באמצעות ערכת בידוד RNA (ראה חומרי רשימה). בעוד הניתוח הנוכחי משתמש המוצר של יצרן אחד ספציפי, מגוון רחב של ערכות בידוד זמין ממספר ספקים מכובדים. בנוסף, שיטות צנטריפוגה שאינה מבוססות ערכה הן גם אופציה. צריך גם להיות מוכן cDNA ממדגם RNA השליטה חיובי, כגון קו סלולארי או פלסמיד, לניתוח עקום סטנדרטי. לחלופין, שליטה חיובית ספציפית לסט הבדיקה תחל ניתן לרכוש (ראה חומרי רשימה). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם באמצעות רקמה קפוא בעבר, לאסוף רקמה קפוא בקרח יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize רקמות באמצעות אחת מהשיטות כגון הבאות: מכתש ועלי טחינה שבוצעה על ידי יד על קרח יבש לאחר הקפאת רקמה בחנקן נוזלי; homogenizer רקמות או התקן ניתוק מכאנילהצעתו של היצרן; sonication, או שיטה מועדפת אחרת. הערה: ניתוח הנציג, השיטה המועדפת להומוגניזציה היא sonication. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח שהוצג באיור 3, להכין מאגר תמוגה (בתנאי בערכת בידוד RNA) ו- 2-mercaptoethanol ביחס של 20 μl 2-mercaptoethanol לכל 1 מיליליטר של חיץ תמוגה. רקמה גלולה ב300 חיץ תמוגה μl בתוספת 2-mercaptoethanol לכל 30 גרם של רקמה וsonicate במשך 10 שניות עם sonicator נקבע על משרעת של 30%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם משתמש במכתש ועלי, רקמת קרקע גלולה במאגר תמוגה 300 μl לאחר הטחינה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף K proteinase 10 μl לחיץ 590 μl TE (10 מ&quot;מ טריס-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA). להוסיף פתרון K 600 proteinase μl לכל 300 μl (כלומר לכל 30 מ&quot;ג) של רקמה. דגירה של 10 דקות ב RT. הערה: זמן עיכול עשוי להשתנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות ≥13,000 גרם במשך 10 דקות כדי להסיר שאריות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת supernatant לצינורות חדשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 450 אתנול μl (96% -100%) לכל 900 μl של supernatant כדי לזרז RNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את 700 μl של תערובת lysate / אתנול לעמודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות ≥13,000 גרם דקות 1 כדי לאגד RNA לטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל פסולת נוזלית ולהוסיף supernatant נותר לעמודה ספין שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שכל lysate הוא הסתובב בטור, להוסיף 350 μl של הצפת לשטוף 1 לחלק העליון של דגימות עמודה ו צנטריפוגות ב≥13,000 גרם במשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל נוזל מהטור ולהחליף עליון חלק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן DNase על ידי ערבוב 5 יחידות של DNase אני אנזים עם 5 μl של 10x DNase ו -40 μl של מים חופשיים DNase / RNase לדגימה (נפח כולל של 50 μl / מדגם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של DNase לערבב לכל עמודה והדגירה במשך 15 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 350 μl של הצפת לשטוף 1 לעמודה ו צנטריפוגות סםPles ב≥13,000 גרם במשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל נוזל מהטור ולהחליף עליון חלק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 600 μl של הצפת לשטוף 2 לעמודת ספין 30 שניות ב≥13,000 ז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל נוזל מהטור ולהחליף עליון חלק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 250 μl של הצפת לשטוף 2 ו צנטריפוגות 2 דקות ב≥13,000 ז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים חלק מעמודה לתוך צינור אוסף חדש וזורקים צינור איסוף ישן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 50-100 μl של מים חופשיים RNase / DNase לעמודה ודגירת דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין 1 דקות ב≥13,000 ז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> eluate שנאסף באמצעות עמודה כדי להגדיל את תשואת RNA להפעיל מחדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשימוש מיידי, לשמור על דגימות קרח ולהמשיך לכימות. לשימוש מאוחר יותר, הצמד הקפאת קרח יבש או חנקן נוזלי. חנות במקפיא -80 ° C עד צורך. </li></ol> 3. ראשית סטרנד סינתזה הערה: ניתוח הנציג, טרנסקריפטאז התגובה (RT) בוצעה Fערכת סינתזת irst סטרנד cDNA המיועדת לqRT-PCR (ראה חומרי רשימה). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם דגימות נאספו בעבר, להפשיר צינורות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד כמות RNA באמצעות ספקטרופוטומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות 0.5-2 מיקרוגרם של רנ&quot;א הכל, לבצע סינתזת גדיל ראשונה באמצעות טרנסקריפטאז ליצור מניית cDNA. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב, צינורות RNase / PCR ללא DNase / צלחות סטרילי, להכין את תערובת התגובה (טבלת 1). מערבבים בעדינות וצנטריפוגה. לתכנת מכונה סטנדרטית PCR (טבלה 2). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל תגובה מוגמרת לנפח רצוי (בדרך כלל 50-100 μl) באמצעות nuclease ללא מים סטריליים. </li></ol> 4. בזמן אמת PCR הערה: ניתוח הנציג, ירוק SYBR היה בשימוש. עם זאת, כל שיטה העדיפה ניתן להחליף בהתאם לשיקול דעתו של המשתמש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש cDNA שליטה חיובי, להגדיר עקומה סטנדרטית עבור כל קבוצת פריימר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח הראה שn איור 3, להכין את העקומה סטנדרטית לHER2 האנושי באמצעות היצרן מומלץ cDNA בקרה החיובי (ראה חומרי רשימה). לGAPDH עכבר, להשתמש בcDNA ריאות שליטה השלילי כדי ליצור עקומה סטנדרטית. עבור כל בדיקה, סדרתי לדלל cDNA 1: 4 כדי לייצר 5 תקנים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את מספר הדגימות כוללת, אשר צריך לכלול את העקומה סטנדרטית ודגימות ניסוי. הערה: הניתוח שתואר כאן, 2-3 חזרות ניסיוניות לדגימה נותחו. ניתוח עקום סטנדרטי בוצע כדי ליצור מודל רגרסיה ליניארית פשוט שניתן ליישם על מנת לקבוע את הסכום היחסי של HER2 וGAPDH לדגימה לחשב כמות מנורמלת סופית. ניתוח זה גם יבטיח כי יעילות פריימר היא נאותה לניתוח ביד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בRNase / צינור סטרילי, ללא DNase, להכין תערובת אב (לוח 3). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב עמון תערובת אמןלא לדגימה. בהיקף של עד למדגם אחד או יותר. השתמש בתערובת אב כל גן ניסויי של עניין, כמו גם בקרה פנימית כגון GAPDH. השתמש בצבעי יסוד לGAPDH בריכוז סופי של 200 ננומטר. הערה: הבקרה הפנימית היא שימושית במיוחד כאשר מנסים להבחין בין מקור תא האנושי ועכבר. הערה: ריכוז פריימר לHER2 היה מותאם ונקבע על ידי היצרן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צלחת בדיקה המכילה cDNAs μl 1 מתאים לכל דגימה סטנדרטית או ניסיונית. להקצות מדגם cDNA לפחות 1 / גם עבור כל בדיקה פריימר. להוסיף 19 μl של תערובת אמן בכל טוב עבור כל בדיקה פריימר. הערה: נתוני הנציג באיור 3, דגימות cDNA נותחו בשני עותקים עבור כל בדיקה פריימר וגרף כממוצע של שתי דגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תגובה לרוץ בqRT-PCR מכונה באמצעות מומלצת או נבדקה פרוטוקול PCR בעבר. ראה טבלת 4 </sטרונג&gt; לפרוטוקול PCR משמש לנתונים הנציג באיור 3 ואיור 4. </li></ol>

<ol>
	<li>Gupta, G. P., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+metastasis:+building+a+framework.">Cancer metastasis: building a framework.</a> Cell. 127 (4), 679-695 (2006).</li><li>Bos, P. D., Nguyen, D. X., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+metastasis+in+the+mouse.">Modeling metastasis in the mouse.</a> Curr Opin Pharmacol. 10 (5), 571-577 (2010).</li><li>Kim, I. S., Baek, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+breast+cancer+metastasis.">Mouse models for breast cancer metastasis.</a> Biochem Biophys Res Commun. 394 (3), 443-447 (2010).</li><li>Saxena, M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rebuilding+cancer+metastasis+in+the+mouse.">Rebuilding cancer metastasis in the mouse.</a> Mol Oncol. 7 (2), 283-296 (2013).</li><li>Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+tumor+metastasis.">Mouse models for tumor metastasis.</a> Methods Mol Biol. 928, 221-228 (2012).</li><li>Rampetsreiter, P., Casanova, E., Eferl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+modified+mouse+models+of+cancer+invasion+and+metastasis.">Genetically modified mouse models of cancer invasion and metastasis.</a> Drug Discov Today Dis Models. 8 (2-3), 67-74 (2011).</li><li>Condeelis, J., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+cell+movement+in+tumours.">Intravital imaging of cell movement in tumours.</a> Nat Rev Cancer. 3 (12), 921-930 (2003).</li><li>Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+in+living+subjects:+seeing+fundamental+biological+processes+in+a+new+light.">Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light.</a> Genes Dev. 17 (5), 545-580 (2003).</li><li>Zinn, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+bioluminescence+imaging+in+small+animals.">Noninvasive bioluminescence imaging in small animals.</a> ILAR J. 49 (1), 103-115 (2008).</li><li>Tseng, J. C., Kung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bioluminescence+imaging+of+mouse+tumor+models.">Quantitative bioluminescence imaging of mouse tumor models.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2015 (1), (2015).</li><li>Radonic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guideline+to+reference+gene+selection+for+quantitative+real-time+PCR.">Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR.</a> Biochem Biophys Res Commun. 313 (4), 856-862 (2004).</li></ol>

ESY ומאא אינם מועסק על ידי FirstString המחקר בע&quot;מ ולא מחזיקים שום אינטרס כלכלי בחברה. FirstString ריסרץ &#39;סיפק את נתוני ההדמיה לוציפראז שהוצג בכתב היד הזה. GSG הוא נשיא ומנכ&quot;ל של מחקר FirstString. CLG הנו עובד מחקר FirstString. יש לי GSG וCLG אופציות שהונפקו על ידי מחקר FirstString.

פרוטוקול זה מתאר שימוש בqRT-PCR להעריך גרורות תאים סרטניים החלב לריאות תוך שימוש במודל עכבר xenograft. הוא הכיר בכך שטכניקות אחרות, כוללים הדמיה bioluminescent, זמינות והם גם יעילים לאיתור גרורה למרות שיש ערכים משלהם ומגבלות. הנתונים שהוצגו עולה כי qRT-PCR מספק אמצעי אפקטיבי של גילוי m...

ניתוח qRT-PCR מוצע כשיטת להערכת גרורות סרטנית. שיטה זו מוצע כאלטרנטיבה עבור משתמשים שמעוניינים בהערכת גרורות אבל אין גישה לציוד ספציפי כגון ציוד ההדמיה in vivo או מסוגל stereoscope הקרינה. דיון בשיטות נפוצות הוא שהוצגו אחרי הפגנה לאיך ניתוח qRT-PCR יכול לשמש גם כנפרד או כשיטת לוויה להעריך גרורות. יש הליך זה הפוטנציאל לספק ניתוח כמותי של נטל גרורתי. שיטות סטנדרטית של ניתוח ברוטו, כוללים הדמיה של ריאות תחת סטראו, כמו גם חתך סידורי אחרי hematoxylin ו eosin מכתים (H &amp; E) של רקמת ריאה, הן לכימות, אך מסתמכות במידה רבה על פרמטרים הגדרת משתמש לספירת 2-5. בעת ההערכה כל ריאות באמצעות סטראו, גרורות משטח רק גדולות הם Visible וניתוח דורש חוקר להיות בעל ידע סביר של מבנה האנטומי ריאות כדי לקבוע מה מהווה נגע גרורתי. תיוג ניאון של תאים סרטניים עם סמן כגון GFP ושימוש בסטראו המכיל קוביית אור עם מקסימום עירור / הפליטה המתאימה (למשל ליד 470/510 ננומטר לGFP) מסייע בתהליך זה, אבל הגושים סרטניים משטח רק לזיהוי . בנוסף, הקרינה מזיהום דם, שהוא נראה באותם פרמטרים כמו GFP, עלולה להוביל לזיהוי שגוי של נגעים גרורתי אפשריים. חתך של הריאה ואחרי צביעת H &amp; E לדמיין גרורות ריאות הוא שיטה שימושית להעריך micrometastases ותהליכים מיקרוסקופיים אחרים, כולל חדירת תאי מערכת חיסון, אך לעתים קרובות דורש שימוש בכל רקמת הריאה להטבעת פרפין, חתך, ונהלים מכתים. לכן, נהלים במורד הזרם אינם אידיאליים הבאים metho זהד. למרות כימות, הליך זה דורש החוקר להעריך במספר רב של סעיפי ריאות מוכתמים לכל בעלי חיים על מנת להבטיח שהניתוח מהווה את כל מבנה 3D של הריאות. כתוצאה מכך, זה סוג של בדיקה הוא לצרוך זמן, יכול להוביל לספירת שגיאה, ומסתמך במידה רבה על ניתוח שיקול דעת חוקר. כמה בטכניקות ההדמיה vivo (למשל MRI, PET, SPECT) משמש כיום לבצע או לבדוק תהליכים ביולוגיים במודלים של מכרסמים ניסיוניים 8. בvivo ההדמיה bioluminescent היא שיטה נפוצה המשמשת לרכישת נוף ברוטו של גרורות 9. טכניקה זו מיושמת בדרך כלל על מנת להעריך את הנוכחות של פעילות העיתונאית לוציפראז בשל ההצטברות של תאים סרטניים, שמתוכננים להכיל אלמנט תגובת לוציפראז, שמתגוררים באיברים מסוימים כמו בלוטת החלב לאחר השתלת תאים סרטניים והריאות על גרורות ספונטניות 10. יזואליזציה של פעילות העיתונאית לוציפראז מושרה על ידי הנוכחות של מצע luciferin (D-luciferin). בלוציפראז מזרז decarboxylation חמצוני של D-luciferin לoxyluciferin יצירת פליטת אור. בעוד אינפורמטיבי, שיטה זו מוגבלת על ידי מספר גורמים, כולל יציבות מצע (כלומר מחצית חיים קצרים), הפצה הולמת של מצע שתלוי איך הוא מועבר לחיות ניסוי, ורגישות נמוכה של גילוי 9. הכשרון עיקרי לטכניקה זו הוא שהיא אינה פולשני, יכולה להתבצע על בעלי חיים, ויכולה להוביל לזיהוי של גרורות תאים סרטניים באיברים רבים שאולי לא נקצר בדרך כלל בנתיחת 9,10. היבט חיובי אחד בvivo טכניקות הדמיה הוא שרקמת הריאה היא באין מפריע ומאפשרת לנהלים משניים כמו הטבעת פרפין או כפי שהוצג כאן, ניתוח qRT-PCR. עם זאת, בגלל qRT-PCR הוא theoretically מדד רגיש יותר של זיהוי, הערכה גולמית עשוי שלא לחשוף את המספרים נמוכים של תאי גידול הנוכחיים בריאות. אמנם שימושי, ניתן להחליף את טכניקות ההדמיה שתוארו לעיל או בתוספת שיטת qRT-PCR תיארה כרגע. יש qRT-PCR הפוטנציאל לספק מידה רגישה של mRNA הנגזר גידול בתוך ריאות.

<table><tbody><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Fisher</td><td>BP176-100</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>GeneJet RNA Isolation Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0732</td><td></td></tr><tr><td>iScript Reverse Transcription Supermix for QRT-PCR</td><td>Bio-Rad</td><td>1708841</td><td></td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5121&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PrimePCR SYBR Green Assay: ERBB2, Human&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>100-25636&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PrimePCR Template for SYBR Green Assay: ERBB2, Human&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>100-25716&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>gapdh Primer Sequence</td><td></td><td></td><td>For-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG</td></tr></tbody></table>

evaluation of lung metastasis in mouse mammary tumor models by quantitative real-time pcr

מחלה גרורתית היא ההתפשטות של תאי גידול ממאירים מאתר הסרטן הראשוני לאיבר מרוחק, והוא הגורם העיקרי למוות הקשורים לסרטן 1. אתרים נפוצים של התפשטות גרורה כוללים ריאות, בלוטות לימפה, מוח, ועצם 2. מנגנונים המניעים את גרורות אזורים אינטנסיביים של חקר הסרטן. כתוצאה מכך, מבחני יעילים למדידת נטל גרורתי באתרים מרוחקים של גרורות הם אינסטרומנטלי לחקר הסרטן. הערכה של גרורות ריאה במודלים של גידול החלב מבוצעת בדרך כלל על ידי תצפית איכותית ברוטו של רקמת הריאה הבאה לנתיחה. שיטות כמותיות להערכת גרורות כיום מוגבלות לvivo לשעבר ובטכניקות הדמיה מבוססת vivo הדורשות פרמטרים הגדרת משתמש. רב של טכניקות אלה בכל רמת האורגניזם ולא הרמה התאית 3-6. למרות ששיטות הדמיה חדשות יותר ניצול מיקרוסקופיה רב-פוטון מסוגלות להעריך metastasis ברמה התאית 7, נהלים האלגנטיים ביותר שמתאימים יותר להערכת מנגנוני הפצה ולא הערכה כמותית של נטל גרורתי. הנה, שיטה במבחנה פשוטה להעריך כמותית גרורות מוצגת. שימוש בזמן אמת PCR (qRT-PCR), mRNA הספציפי תאים סרטניים יכול להתגלות בתוך רקמת הריאה עכבר.

מעבר לזמן שנדרש כדי לבצע את החיסון הראשוני של תאי גידול לבעלי החיים הניסיוניים ואם ביצוע, עיקרי בניתוח גידול vivo, קציר הרקמות, בידוד RNA, וניתוח qRT-PCR הוא הליך 1-2 יום (איור 1) . דוגמ?...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR at JoVE.com

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש בזמן אמת PCR (qRT-PCR) כדי לזהות mRNA הספציפי תאים סרטניים המייצג גרורות בתוך רקמת הריאה עכבר.

הערכה של ריאות גרורה במודלי גידול עכבר החלב על ידי בזמן אמת כמותי PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

evaluation-lung-metastasis-mouse-mammary-tumor-models-quantitative

Research

JoVE Journal

Medicine

9.8K Views.  Medical University of South Carolina.  פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש בזמן אמת PCR (qRT-PCR) כדי לזהות mRNA הספציפי תאים סרטניים המייצג גרורות בתוך רקמת הריאה עכבר. 

Video: Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study end-points. Thus, studies focused on elucidating mechanisms of late-stage de novo metastasis are compromised, as are studies examining efficacy of anti-cancer therapies targeting mediators of metastasis in the adjuvant setting. Numerous murine mammary cancer models have been developed via targeted expression of dominant oncoproteins to mammary epithelial cells yielding models variably mimicking histopathologic and transcriptome-defined breast cancer subtypes common in women1. While much has been learned regarding the biology of mammary carcinogenesis with these models, their utility in identifying molecules regulating growth of late-stage metastasis are compromised as mice are typically euthanized at earlier time points due to significant primary tumor burden. Moreover, since a significant percentage of women diagnosed with breast cancer receive adjuvant therapy after surgical resection of primary tumors and prior to presence of detectable metastatic disease, preclinical models of de novo metastasis are urgently needed as platforms to evaluate new therapies aimed at targeting metastatic foci. To address these deficiencies, we developed a murine model of de novo mammary cancer metastasis, wherein primary mammary tumors are surgically resected, and metastatic foci subsequently develop over a 115 day post-surgical period. This long latency provides a tractable model to identify functionally significant regulators of metastatic progression in mice lacking primary tumor, as well as a model to evaluate preclinical therapeutic efficacy of agents aimed at blocking functionally significant molecules aiding metastatic tumor survival and growth.

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

Pre-clinical models evaluating adjuvant therapy targeting breast cancer metastasis are lacking. To address this, we developed a murine model of de novo pulmonary mammary adenocarcinoma metastasis, wherein therapies administered in the adjuvant setting (post surgical resection of primary tumors) can be evaluated for efficacy in impacting previously seeded pulmonary metastases.

כירורגית נהלים ומתודולוגיה עבור מודל Murlin פרה קלינית של<em&gt; דה נובו</em&gt; גרורות סרטן החלב

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study ...

Cancer Research

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast cancer metastasis, and results in poor outcomes with median survival rates of only 4.8 - 15 months. Current rodent models of breast cancer metastasis, including primary tumor cell xenograft and spontaneous tumor models, rarely metastasize to the liver. Intracardiac and intrasplenic injection models do result in liver metastases, however these models can be confounded by concomitant secondary-site metastasis, or by compromised immunity due to removal of the spleen to avoid tumor growth at the injection site. To address the need for improved liver metastasis models, a murine portal vein injection method that delivers tumor cells firstly and directly to the liver was developed. This model delivers tumor cells to the liver without complications of concurrent metastases in other organs or removal of the spleen. The optimized portal vein protocol employs small injection volumes of 5 - 10 &#956;l, &#8805; 32 gauge needles, and hemostatic gauze at the injection site to control for blood loss. The portal vein injection approach in Balb/c female mice using three syngeneic mammary tumor lines of varying metastatic potential was tested; high-metastatic 4T1 cells, moderate-metastatic D2A1 cells, and low-metastatic D2.OR cells. Concentrations of &#8804; 10,000 cells/injection results in a latency of ~ 20 - 40 days for development of liver metastases with the higher metastatic 4T1 and D2A1 lines, and &#62; 55 days for the less aggressive D2.OR line. This model represents an important tool to study breast cancer metastasis to the liver, and may be applicable to other cancers that frequently metastasize to the liver including colorectal and pancreatic adenocarcinomas.

A surgical procedure was developed to deliver mammary tumor cells to the murine liver via portal vein injection. This model permits investigation of late stages of liver metastasis in a fully immune competent host, including tumor cell extravasation, seeding, survival, and metastatic outgrowth in the liver.

מודל הזרקת Portal Vein לחקר גרור בכבד של סרטן השד

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less aggressive breast tumors, the 5-year survival rate of TNBC patients is 77% due to their characteristic drug-resistant phenotype and metastatic burden. Toward this end, murine models have been established aimed at identifying novel therapeutic strategies limiting TNBC tumor growth and metastatic spread. This work describes a practical guide for the TNBC orthotopic model where MDA-MB-231 breast cancer cells suspended in a basement membrane matrix are implanted in the fourth mammary fat pad, which closely mimics the cancer cell behavior in humans. Measurement of tumors by caliper, lung metastasis assessment via in vivo and ex vivo imaging, and molecular detection are discussed. This model provides an excellent platform to study therapeutic efficacy and is especially suitable for the study of the interaction between the primary tumor and distal metastatic sites.

This work presets an advanced protocol to accurately assess tumor loading by detection of green fluorescent protein and bioluminescence signals as well as the integration of quantitative molecular detection technique.

לומדת משולשת סרטן השד שלילי באמצעות אורתובנושא שד סרטן השד מודל

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification and testing of novel therapeutic targets that will facilitate the development of better treatments for metastatic disease requires preclinical in vivo models. Demonstrated here is a syngeneic mouse model for assaying breast cancer metastatic colonization and subsequent growth. Metastatic cancer cells are stably transduced with viral vectors encoding firefly luciferase and ZsGreen proteins. Candidate genes are then stably manipulated in luciferase/ZsGreen-expressing cancer cells and then the cells are injected into mice via the lateral tail vein to assay metastatic colonization and growth. An in vivo imaging device is then used to measure the bioluminescence or fluorescence of the tumor cells in the living animals to quantify changes in metastatic burden over time. The expression of the fluorescent protein allows the number and size of metastases in the lungs to be quantified at the end of the experiment without the need for sectioning or histological staining. This approach offers a relatively quick and easy way to test the role of candidate genes in metastatic colonization and growth, and provides a great deal more information than traditional tail vein metastasis assays. Using this approach, we show that simultaneous knockdown of Yes associated protein (YAP) and transcriptional co-activator with a PDZ-binding motif (TAZ) in breast cancer cells leads to reduced metastatic burden in the lungs and that this reduced burden is the result of significantly impaired metastatic colonization and reduced growth of metastases.

The described approach combines experimental tail vein metastasis assays with in vivo live animal imaging to allow real-time monitoring of breast cancer metastasis formation and growth in addition to the quantification of metastasis number and size in the lungs.

שימוש משולב של הזנב וריד גרורה Assays ובזמן אמת ב Vivo הדמיה כדי לכמת מושבת סרטן השד ונטל בריאות

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous metastasis models are available. Thus, the experimental metastasis model involving tail-vein injection of suitable cell lines is a mainstay of metastasis research. When cancer cells are injected into the lateral tail-vein, the lung is their preferred site of colonization. A potential limitation of this technique is the accurate quantification of the metastatic lung tumor burden. While some investigators count macrometastases of a pre-defined size and/or include micrometastases following sectioning of tissue, others determine the area of metastatic lesions relative to normal tissue area. Both of these quantification methods can be exceedingly difficult when the metastatic burden is high. Herein, we demonstrate an intravenous injection model of lung metastasis followed by an advanced method for quantifying metastatic tumor burden using image analysis software. This process allows for investigation of multiple end-point parameters, including average metastasis size, total number of metastases, and total metastasis area, to provide a comprehensive analysis. Furthermore, this method has been reviewed by a veterinary pathologist board-certified by the American College of Veterinary Pathologists (SEK) to ensure accuracy.

Intravenous injection of cancer cells is often used in metastasis research, but the metastatic tumor burden can be difficult to analyze. Herein, we demonstrate a tail-vein injection model of metastasis and include a novel approach to analyze the resulting metastatic lung tumor burden.

ניתוח פתולוגי של גרורות ריאות בעקבות הזרקת וריד זנב לרוחב של תאים סרטניים

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. The leading cause of breast cancer related deaths is the metastatic burden. Therefore, preclinical models for breast cancer need to analyze metastatic burden to be clinically relevant. The 4T1 breast cancer model provides a spontaneously-metastasizing, quantifiable mouse model for stage IV human breast cancer. However, most 4T1 protocols quantify the metastatic burden by manually counting stained colonies on tissue culture plates. While this is sufficient for tissues with lower metastatic burden, human error in manual counting causes inconsistent and variable results when plates are confluent and difficult to count. This method offers a computer-based solution to human counting error. Here, we evaluate the protocol using the lung, a highly metastatic tissue in the 4T1 model. Images of methylene blue-stained plates are acquired and uploaded for analysis in Fiji-ImageJ. Fiji-ImageJ then determines the percentage of the selected area of the image that is blue, representing the percentage of the plate with metastatic burden. This computer-based approach offers more consistent and expeditious results than manual counting or histopathological evaluation for highly metastatic tissues. The consistency of Fiji-ImageJ results depends on the quality of the image. Slight variations in results between images can occur, thus it is recommended that multiple images are taken and results averaged. Despite its minimal limitations, this method is an improvement to quantifying metastatic burden in the lung by offering consistent and rapid results.

We describe a more consistent and expeditious method to quantify lung metastasis in the 4T1 breast cancer model by using Fiji-ImageJ.

שימוש בניתוח תמונה מבוסס מחשב כדי לשפר את כימות גרורות הריאות במודל סרטן השד 4T1

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

מודל Murine orthotopic של אדם סרטן ערמונית גרורה

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in exponential tumor growth and metastasis to distal tissues and the collapse of anti-tumor immunity. Many useful animal models exist to study breast cancer, but none completely recapitulate the disease progression that occurs in humans. In order to gain a better understanding of the cellular interactions that result in the formation of latent metastasis and decreased survival, we have generated an inducible transgenic mouse model of YFP-expressing ductal carcinoma that develops after sexual maturity in immune-competent mice and is driven by consistent, endocrine-independent oncogene expression. Activation of YFP, ablation of p53, and expression of an oncogenic form of K-ras was achieved by the delivery of an adenovirus expressing Cre-recombinase into the mammary duct of sexually mature, virgin female mice. Tumors begin to appear 6 weeks after the initiation of oncogenic events. After tumors become apparent, they progress slowly for approximately two weeks before they begin to grow exponentially. After 7-8 weeks post-adenovirus injection, vasculature is observed connecting the tumor mass to distal lymph nodes, with eventual lymphovascular invasion of YFP+ tumor cells to the distal axillary lymph nodes. Infiltrating leukocyte populations are similar to those found in human breast carcinomas, including the presence of &#945;&#946; and &#947;&#948; T cells, macrophages and MDSCs. This unique model will facilitate the study of cellular and immunological mechanisms involved in latent metastasis and dormancy in addition to being useful for designing novel immunotherapeutic interventions to treat invasive breast cancer.

Activation of latent mutations with adenovirus-Cre into the mammary ductal system results in a clinically relevant metastatic breast cancer. Incorporation of a YFP promoter allows tracking of distal metastatic tumor cells. This model is useful to study latent metastasis, anti-tumor immunity, and for designing novel immunotherapies to treat breast cancer.

חניכה של סרטן השד גרורתי על ידי מיקוד של האפיתל ductal עם Adenovirus-Cre: דגם רומן מהונדס עכבר של סרטן השד

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

In Vivo Imaging to Measure Spontaneous Lung Metastasis of Orthotopically-injected Breast Tumor Cells

Metastasis remains the primary cause of cancer-related death. The succession of events that characterize the metastatic cascade presents multiple opportunities for therapeutic intervention, and the ability to accurately model them in mice is critical to evaluate their effects. Here, a step-by-step protocol is presented for the establishment of orthotopic primary breast tumors and the subsequent monitoring of the establishment and growth of metastatic lesions in the lung using in vivo bioluminescence imaging. This methodology allows for the evaluation of treatment or its biological effects along the entire range of metastatic development, from primary tumor escape to outgrowth in the lungs. Breast orthotopic tumors are generated in mice via injection of a luciferase-labeled cell suspension in the 4th mammary gland. Tumors are allowed to grow and disseminate for a specific amount of time and are then surgically resected. Upon resection, spontaneous lung metastasis is detected, and the growth over time is monitored using in vivo bioluminescence imaging. At the desired experimental endpoint, lung tissue can be collected for downstream analysis. The treatment of established, clinically evident metastasis is critical to improve outcomes for stage IV cancer patients, and it can be evaluated through tail vein models of experimental lung metastasis. However, metastatic dissemination occurs early in breast cancer, and many patients have latent, subclinical disseminated disease after surgery. Utilization of spontaneous models such as this one provides the opportunity to study the whole spectrum of the disease, especially the systemic effects driven by treatment of the primary tumor such as pre-metastatic niche priming, and evaluate treatments on dormant and subclinical disease after surgery.

<meta charset="utf8"></head><body>In Vivo Imaging למדידת גרורות ריאה ספונטניות של תאי גידול שד בהזרקה אורתוטופית

The manuscript describes a methodology for the establishment as well as longitudinal growth monitoring of spontaneous lung metastasis from orthotopically-injected breast tumors, amenable to intervention at all stages of the metastatic cascade.

הערכה של ריאות גרורה במודלי גידול עכבר החלב על ידי בזמן אמת כמותי PCR

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

כירורגית נהלים ומתודולוגיה עבור מודל Murlin פרה קלינית של